CN112362640B - 一种猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用 - Google Patents

一种猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物靶标筛选领域，具体涉及一种猪链球菌c‑di‑AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用。基于化学发光方法，根据反应体系中相对发光值大小反映DacA酶活性。反应体系是由猪链球菌SC19 c‑di‑AMP合成酶功能结构域DacA(99‑283)、ATP、酶活反应缓冲液和

Description

一种猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用
技术领域
本发明属于药物靶标筛选技术领域，具体涉及一种猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用。本发明涉及一种猪链球菌c-di-AMP合成酶，尤其是涉及一种c-di-AMP合成酶抑制剂的筛选方法及其应用。
背景技术
在革兰氏阳性细菌中存在一种第二信使分子c-di-AMP，它是由c-di-AMP合成酶(DacA)催化两个ATP分子合成,同时生成两个PPi分子,而革兰氏阴性菌缺乏DacA同源蛋白和c-di-AMP。c-di-AMP在多种革兰氏阳性细菌中是必要的，其通过与效应蛋白或核糖体开关结合调控了细菌的钾离子运输、渗透压稳态和细胞壁平衡等生理生化过程(Fahmi T,Port GC,Cho KH.c-di-AMP:An Essential Molecule in the Signaling Pathways thatRegulate the Viability and Virulence of Gram-Positive Bacteria.Genes(Basel).2017；8(8):197.)。在多种革兰氏阳性细菌中DacA是致死基因,革兰氏阳性细菌猪链球菌(Streptococcus suis)该基因不能被缺失，因此其是一种潜在的抗猪链球菌甚至是抗革兰氏阳性菌药物靶标。故以该种蛋白为靶标进行药物筛选是非常值得研究的课题。
现有靶向DacA的药物筛选方法是利用c-di-AMP与甲氧檗因(coralyne)聚合能保护后者的荧光不被卤化物如碘甲胆碱淬灭，从而通过测量反应体系中的荧光值间接反映生成的c-di-AMP的量，进而判断药物小分子对蛋白活性的抑制效率。但是根据文献，很多小分子能够直接淬灭甲氧檗因(coralyne)的荧光，所以会导致假阳性偏高(Zheng Y,Zhou J,Sayre D A,et al.Identification of bromophenol thiohydantoin as an inhibitorof DisA,a c-di-AMP synthase,from a 1000compound library,using the coralyneassay[J].Chemical Communications,2014,50(76):11234-11237.)。
截至目前，尚未发现美国FDA批准上市的靶向DacA的抗菌杀菌药物。
目前有关c-di-MP合成酶活性的测定方法有一下几种：
第二信使c-di-MP合成酶活性测定反应中的三个基本组分为：c-di-MP合成酶、ATP、c-di-AMP,c-di-MP合成酶活性测定的核心问题是测定一定条件下，有多少ATP转化为c-di-AMP。
有关放射性同位素检测法：即在反应体系中加入一定量的α-32P-ATP，然后通过检测α-32P-c-di-AMP的量来检测c-di-MP合成酶活性(Opoku-Temeng C,Sintim H O.Potentinhibition of cyclic diadenylate monophosphate cyclase by the antiparasiticdrug,suramin[J].Chem Commun,2016,52(19):10.1039.C5CC10446G.)。
有关高效液相色谱串联质谱测定法：在加有ATP与c-di-AMP合成酶的反应体系反应一段时间后，通过对反应体系加热终止反应，然后离心出掉变性的合成酶，一定体积的反应液加入到HPLC中，在流动相的洗脱下，会出现不同的峰，同时用c-di-AMP的标准品，在相同的程序下进行分析，最后根据c-di-AMP的浓度来反映c-di-AMP合成酶的和活性(Bai Y,Yang J,Zhou X,et al.Mycobacterium tuberculosis Rv3586(DacA)Is a DiadenylateCyclase That Converts ATP or ADP into c-di-AMP[J].Plos One,2012,7)。
有关PPi生成量测定法：当反应体系反应一段时间后，加入一定体积的含有钼酸盐和孔雀绿的试剂，15min后测量620nm处的吸光值，通过与对照组中PPi含量来反映c-di-AMP合成酶的活性(Martina,Müller,Tobias,Deimling,Karl-Peter,Hopfner,Gregor,Witte.Structural analysis of the diadenylate cyclase reaction of DNA-integrity scanning protein A(DisA)and its inhibition by 3'-dATP.[J].TheBiochemical journal,2015,469(3):367-74.,Chan C,Paul R,Samoray D,etal.Structural basis of activity and allosteric control of diguanylatecyclase.[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America,2004,101(49):P.17084-17089)。
有关甲氧檗因(coralyne)法：当反应体系反应一段时间后，在体系中加入甲氧檗因(coralyne)，利用c-di-AMP与甲氧檗因(coralyne)聚合能保护后者的荧光不被卤化物如碘甲胆碱淬灭，从而通过测量反应体系中的荧光值间接反映生成的c-di-AMP的量，来测定c-di-AMP合成酶活性(Zhou J,Sayre D A,Zheng Y,et al.Unexpected ComplexFormation between Coralyne and Cyclic Diadenosine Monophosphate Providing aSimple Fluorescent Turn-on Assay to Detect This Bacterial Second Messenger[J].Analytical Chemistry,2014,86(5):2412-2420.)。
除上述方法外，目前尚未见其它测定方法的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种简单的，无需使用特殊仪器的靶向猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂的高通量筛选方法。
本发明还在于对上述高通量筛选方法的应用，利用所述方法筛选出对猪链球菌DacA有抑制作用，同时也能抑制猪链球菌生长的药物。
本发明的技术方案如下所述：
本发明基于化学发光技术，通过相对发光值测量反应体系中剩余ATP的含量来反应猪链球菌DacA的酶活性，通过对反应体系中ATP、蛋白浓度和反应时间的优化使得信号与背景比值达到最大。在后续的筛选过程中，具有高通量筛选的优势，对1240种小分子化合物进行筛选，初筛出3种对DacA酶活抑制率达到80％以上的小分子化合物。
具体地本发明的技术方案如下所述：
一种基于化学发光的猪链球菌c-di-AMP合成酶(DacA)抑制剂IPA-3的高通量筛选方法，
所述抑制剂IPA-3小分子的化学结构式如下所示：
Figure GDA0002881256610000031
所述的筛选方法包括如下步骤：
(1)在黑色的U型底384孔板中加入4.5μL包含终浓度为150mM的NaCl，10mM的MgCl2,50mMl pH7.5的Tris-HC，100μM DacA(99-283)的混合体系，用多通道移液器加0.5μLDMSO溶解的母液浓度为10mM药物，设置阳性对照与阴性对照各10个重复；
(2)将所述384孔板置于4℃孵育30min，然后加5μL 1mM ATP，置于37℃反应2h后取出在室温下冷却5min，加入10μL
Figure GDA0002881256610000032
Reagent，反应10min后，用酶标仪测量相对发光值RLU；
(3)采用如下公式计算药物酶活的抑制率：
药物酶活抑制率＝(待测药物化学发光值–阳性组化学发光平均值)/(阴性组化学发光平均值–阳性组化学发光平均值)；
(4)按照上述步骤对MedChemExpress公司的激酶抑制剂药库HY-L001进行筛选，得到对DacA(99-283)的酶活抑制率为82.33％的抑制剂IPA-3。
上述方法可在猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂IPA-3筛选中的应用。
应用本发明所述方法筛选可以得到猪链球菌c-di-AMP合成酶的抑制剂IPA-3。
附图说明
图1：本发明的质粒构建模式图。
图2：DacA酶活反应体系相关参数的优化。附图标记说明：图2中的A图是ATP浓度与RLU线性关系；图2中的B图是最优ATP浓度确定；图2的C图是最优蛋白浓度确定；图2中的D图是最优反应时间确定。
综合图2中的A图、B图、C图和D图的试验，表明DacA酶活反应体系最优ATP浓度为100μM，最适蛋白浓度为100μM,最适反应时间为2h。
图3：高通量筛选方法Z-factor测定。附图标记说明：Z-factor测量结果。根据高通量方法标准，Z-factor为0.67，说明该方法适合高通量筛选
图4：抑制剂IPA-3小分子与抑制剂IPA-3对DacA IC50的测量结果。附图标记说明：图4中的A图是本发明制的抑制剂IPA-3的分子结构式；图4中的B图是本发明制备的抑制剂IPA-3的IC50的测量结果。
图5：不同浓度抑制剂IPA-3处理条件下菌株生长曲线图。附图标记说明：图5中的A图是不同浓度的IPA-3对猪链球菌SC19菌株生长影响；图5中的B图是不同浓度的IPA-3对金黄色葡萄球菌标准菌株29213生长的影响；图5中的C图是不同浓度的IPA-3对猪丹毒杆菌标准菌株13013生长的影响；图5中的D图是不同浓度的IPA-3对大肠杆菌标准菌株生长的影响。
本发明筛选的抑制剂IPA-3在合适浓度范围内能抑制革兰氏阳性细菌生长，但不能抑制革兰氏阴性细菌生长。
具体实施方式
实施例1猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂IPA-3的筛选步骤：
1.DacA(99-283)重组表达质粒的构建与蛋白纯化
将原核表达载体pET28a经由NcoI与XhoI双酶切处理后，用1％琼脂糖凝胶电泳和纯化回收后，用oligo7软件设计引物(见表1)，以猪链球菌SC19基因组(NZ_CP020863)为模板，扩增DacA的胞内结构域片段，用同源重组酶连接酶切载体和PCR片段(图1)，转化至DH5α感受态大肠杆菌中，若干个小时后，用菌落PCR鉴定阳性克隆，摇菌提取质粒送有关商业测序公司进行测序。
将测序正确的重组质粒转化至BL21(DE3)感受态大肠杆菌中，将转化子细菌接种至LB液体培养基上，置37℃，180rpm摇床条件下生长，待菌液生长至OD600为0.6-0.8之间时，加入1mM IPTG,置于28℃，180rpm摇床中诱导10h，之后用离心机离心去上清，用磷酸盐缓冲液(PBS，常规)溶液重悬菌体，用商购的高压破碎仪破碎细菌，将破碎后的裂解菌体溶液离心，上清用0.45μm滤器过滤后，与镍柱充分反应，然后使用商购的蛋白纯化仪用含有咪唑的缓冲液(常规)洗脱镍柱，根据280nm的吸收峰，将收集到的成分进行取样，跑SDS-PAGE蛋白胶，评价蛋白纯度，同时用超滤管将蛋白浓缩。
2.方法的建立
2.1 ATP与相对发光单位RLU标准曲线的建立
在10μL反应体系中包含150mM NaCl，10mM MgCl2，不同浓度的ATP,每个ATP浓度设置3个重复，将混合体系放入至37℃温箱中，30min后，冷却至室温，加入
Figure GDA0002881256610000051
Reagent，反应10min后，在酶标仪中测量发光值，相对发光单位与不同浓度ATP之间进行线性回归，得到相关系数，如图2可得ATP浓度在0-100μM范围内，相对发光值与ATP含量呈正相关。
2.2最优ATP浓度的确定
在10uL反应体系中包含终浓度150mM NaCl，10mM MgCl2，20μM DacA(99-283)重组蛋白或相同体积的ddH20,然后加入一系列的ATP浓度，每个ATP浓度组设置3个重复，将反应体系混合均匀后放入37℃温箱中，30min后，冷却至室温，加入
Figure GDA0002881256610000053
Reagent，反应10min后，在酶标仪中测量发光值，得出加DacA(99-283)组与不加DacA(99-283)组化学发光值与ATP浓度之间的关系，如图2可得在线性范围内，ATP浓度为100μM时加DacA(99-283)重组蛋白组与不加DacA(99-283)组化学发光值相隔最大，信号与背景噪音比值最大。
2.3最优DacA(99-283)蛋白浓度的确定
在10uL反应体系中包含终浓度150mM NaCl，10mM MgCl2，最适的浓度为100μMATP，加入不同浓度的DacA(99-283)重组蛋白，将反应体系混合均匀放入37℃温箱中，30min后，冷却至室温，加入商品化的
Figure GDA0002881256610000052
Reagent，反应10min后，在酶标仪中测量发光值，计算所有加入蛋白的组与不加蛋白组之间发光值的差值ΔRLU,得出加不同浓度DacA(99-283)组与不加DacA(99-283)组之间的发光值差值ΔRLU与蛋白浓度之间的关系，如图2可得在最优ATP浓度条件下，终浓度100μM蛋白为最佳DacA浓度。
2.4最优反应时间的确定
在10uL反应体系中包含终浓度50mM NaCl，2mM MgCl2，最适的浓度100μM ATP，100μM DacA(99-283)重组蛋白或相同体积ddH20，将反应体系混合均匀后于不同时间点放入37℃温箱中，设置不同反应时间组，同一时间取出，冷却至室温，加入荧光试剂(常规)，反应10min后，在酶标仪中测量发光值，得出反应与蛋白浓度之间的关系，如图2可得反应2h时加DacA(99-283)重组蛋白组与不加DacA(99-283)组化学发光值相隔最大，信号与背景噪音比值最大。
2.5 Z-factor的确定
在10μL反应体系中包含终浓度150mM NaCl，10mM MgCl2，最适的浓度为100μMATP，100μM DacA(99-283)重组蛋白或相同体积ddH20，蛋白组与不加蛋白组每组各设置为100个重复，将液体混合均匀后放入37℃温箱中，反应2h后，冷却至室温，加入
Figure GDA0002881256610000063
Reagent，反应10min后，在酶标仪中测量发光值，根据加DacA(99-283)阳性组与不加DacA(99-283)阴性组之间的发光值差值，计算出Z factor，结果如图3。
2.6综合分析
综合上述最优条件的确定，最终，本发明确定测定c-di-AMP合成酶酶活反应体系，是在100μM ATP浓度，100μM DacA(99-283)重组蛋白浓度下，反应2h时。测量Z-factor为0.67，信号与背景的比值(S/B＝2.13)以及阴、阳试验组信号值的变异系数(CV＝4.3％)，本发明符合高通量筛选方法标准(0.5<Z-factor<1)。
2.7靶标药物的筛选
(1)对MedChemExpress公司的激酶抑制剂药库HY-L001的1240种药物进行了筛选应用验证，具体步骤：在黑色的U型底384孔板中加入4.5uL包含终浓度150mM NaCl，10mMMgCl2,50mM Tris-HCl(pH 7.5),100μM DacA(99-283)的混合体系，用多通道移液器加0.5μL DMSO溶解浓度为10mM的药物，设置阳性对照与阴性对照各10个重复。
(2)将384孔板置于4℃孵育30min，然后加入5μL 1mM ATP.置于37℃反应2h后取出室温冷却5min，加入10μL
Figure GDA0002881256610000061
Reagent,反应10min后，用酶标仪测量相对发光值RLU。
(3)采用以下计算公式计算酶活的抑制率
药物酶活抑制率＝(待测药物化学发光值–阳性组化学发光平均值)/(阴性组化学发光平均值–阳性组化学发光平均值)×100％。
2.8 IC50测量
对筛选的药物(抑制剂)IPA-3进行IC50测量，在96孔板黑色不透明板子中加入44μL包含终浓度150mM的NaCl，10mM的MgCl2,50mM的Tris-HCl(pH7.5),100μM的DacA(99-283)重组蛋白的混合体系，设置一个阳性对照(加DacA)、一个阴性对照(不加DacA)以及药物对照(不加DacA，加药物)，设置一系列浓度DMSO溶解的药物，加入1μLDMSO溶解的药物，置于4℃孵育30min，然后加入5μL 1mM ATP.置于37℃反应2h后取出室温冷却5min，加入10μL
Figure GDA0002881256610000062
Reagent,反应10min后，用酶标仪测量相对发光值RLU。根据计算公式计算的抑制率进行IC50，
采用以下计算公式计算酶活的抑制率
药物酶活抑制率＝(待测药物化学发光值–阳性组化学发光平均值)/(阴性组化学发光平均值–阳性组化学发光平均值)×100％。结果见图4所示。
2.9生长曲线的测量
将199μL初始OD600为0.01的革兰氏阳性菌猪链球菌(Streptococcus suis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus suis)标准菌株(ATCC29213)、猪丹毒杆菌(Erysipelothrixrhusiopathiae)(13013)和革兰氏阴性细菌大肠杆菌(Escherichia coli)标准菌株ATCC25922菌液加入到与生长曲线仪配套的100孔板中，加入一系列浓度梯度的1μL DMSO溶解IPA-3,同时设置加等量DMSO的空白对照与阳性对照，每个组别设置5个重复。置于生长曲线仪中，设置37℃，中等振幅下进行测量，结果如图5。

Claims (3)

1.一种基于化学发光的猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂IPA-3的高通量筛选方法，其特征在于,所述抑制剂IPA-3小分子的化学结构式如下所示：
Figure FDA0003208223680000011
所述的筛选方法包括如下步骤：
(1)在黑色的U型底384孔板中加入4.5μL包含终浓度为150mM的NaCl，10mM的MgCl2,50mMl pH7.5的Tris-HC，100μM c-di-AMP重组蛋白的混合体系，用多通道移液器加浓度为0.5μL，体积为10mM溶于二甲基亚砜的药物，设置阳性对照与阴性对照各10个重复；
(2)将所述384孔板置于4℃孵育30min，然后加5μL 1mM ATP，置于37℃反应2h后取出在室温下冷却5min，加入10μL
Figure FDA0003208223680000012
Reagent，反应10min后，用酶标仪测量相对发光值RLU；
(3)采用如下公式计算药物酶活的抑制率：
药物酶活抑制率＝(待测药物化学发光值–阳性组化学发光平均值)/(阴性组化学发光平均值–阳性组化学发光平均值)；
(4)按照上述步骤对MedChemExpress公司的激酶抑制剂药库HY-L001进行筛选，得到对c-di-AMP酶活抑制率为82.33％的抑制剂IPA-3。
2.权利要求1所述的方法在猪链球菌c-di-AMP合成酶抑制剂IPA-3筛选中的应用。
3.应用权利1所述方法筛选得到的猪链球菌c-di-AMP合成酶的抑制剂IPA-3。
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