CN116286926B - 一种双荧光报告质粒的构建及其在检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种双荧光报告质粒、质粒的构建以及在检测大肠杆菌胞内c‑di‑GMP水平中的应用。该报告质粒由抗性基因、启动子、第一报告基因、终止子、第二报告基因、核糖开关组成。含有的两个报告基因mCherry和EGFP，分别受启动子和核糖开关控制，第一报告基因用于检测质粒本底表达水平，第二报告基因用于检测c‑di‑GMP水平，且第一报告基因和第二报告基因的方向相反，二者的表达互相不受干扰，可消除质粒拷贝数对c‑di‑GMP水平检测结果的影响，检测结果更准确、更可靠。本发明构建的双荧光报告质粒可以对大肠杆菌胞内c‑di‑GMP水平进行快速检测，操作简单，结果可靠。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，涉及一种用于检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的双荧光报告载体及其应用，更具体地涉及pAmCherry-Vc2EGFP(pACVcE)双荧光报告质粒的构建及其在检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平中的应用。
背景技术
环二鸟苷酸(c-di-GMP)是一种广泛存在于细菌中的新型第二信使，细菌胞内c-di-GMP的产生受二鸟苷酸环化酶(diguanylate cyclase，DGC)合成和磷酸二酯酶(phosphodiesterase，PDE)降解两条途径调控。细菌通过感应胞内外的环境信号，调控其c-di-GMP代谢酶活性及胞内c-di-GMP水平，进而调控下游代谢及基因表达以适应环境，促进其生存。作为细菌的第二信使，c-di-GMP在生物学进程的调控中发挥了至关重要的作用，广泛参与调控细菌的生长和分化、群体感应、生物被膜的形成、毒力及感染等功能。因此，准确检测和比较分析细菌胞内c-di-GMP水平对于研究和解析c-di-GMP的调控功能和分子机制具有重要意义。
目前，常用的c-di-GMP检测方法是高效液相色谱(HPLC)，需要预先提取细菌菌体的c-di-GMP，然后用HPLC检测c-di-GMP的含量。其缺点在于，抽提c-di-GMP的方法较为复杂、耗费时间较长、不同批次间差异较大。其次，每次测定均需要以c-di-GMP标准品进行对照。由于高效液相色谱仪和c-di-GMP标准品成本高，操作复杂，给大规模检测和研究工作带来不便。
c-di-GMP通过结合信号受体，改变其空间构象及功能，影响下游基因表达、酶活性和蛋白的亚定位，从而发挥调控作用。目前已鉴定的c-di-GMP信号受体包括转录调控因子、PilZ结构域蛋白、退化的GGDEF和EAL结构域蛋白、核糖开关、多核苷酸磷酸化酶(PNPase)以及新发现的蛋白激酶。因此，有研究者利用c-di-GMP调控的信号受体核糖开关或靶基因启动子构建报告载体，通过检测报告基因(如荧光蛋白、半乳糖苷酶LacZ等)的表达确定细菌胞内c-di-GMP水平。这种方法操作简单，成本低廉，很适合大规模胞内c-di-GMP水平的检测，已被应用于恶臭假单胞菌等细菌胞内c-di-GMP的检测。
但是，目前使用的报告载体仅通过报告基因的表达量判定细菌胞内c-di-GMP水平，这种设计可能导致潜在的检测误差。由于质粒的拷贝数差异及表达异质性，会影响c-di-GMP检测水平。不同细菌中质粒的拷贝数不同，即c-di-GMP信号受体和报告基因的拷贝数存在差异，当检测单个细胞c-di-GMP水平时，可能因为报告载体的拷贝数差异造成检测结果有较大误差，影响检测结果。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的双荧光报告质粒。
本发明的另一目的在于提供上述质粒的构建方法。
本发明的再一目的在于提供上述质粒在检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平中的应用。
本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种用于检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的双荧光报告质粒，由依次连接的抗性基因、启动子、第一报告基因、终止子、第二报告基因、核糖开关组成。该报告质粒含有两个报告基因，分别受启动子和核糖开关控制，第一报告基因用于检测质粒本底表达水平，第二报告基因用于检测c-di-GMP水平，且第一报告基因和第二报告基因的方向相反，二者的表达互相不受干扰，可消除质粒拷贝数对c-di-GMP水平检测结果的影响。
进一步，优选的，所述抗性基因片段为氯霉素和四环素抗性片段(序列如SEQ IDNo.11所示)，所述的第一报告基因启动子为Pbla启动子(序列如SEQ IDNo.12所示)，所述第一报告基因和终止子为mCherry和T7终止子(序列如SEQ ID No.13所示)，所述的第二报告基因为EGFP(序列如SEQ ID No.14所示)，所述的核糖开关为Vc2 riboswitches(序列如SEQID No.15所示)。
第一报告基因mCherry用于测定报告质粒本底表达量。核糖开关的适体结构域特异结合细胞内的c-di-GMP从而调控第二报告基因EGFP表达，高c-di-GMP水平EGFP表达量上升，低c-di-GMP水平下EGFP表达量下降。因此，利用本发明提供的报告质粒能快速、准确的对细菌胞中的c-di-GMP水平进行检测，以降低质粒拷贝数及表达异质性对检测结果造成的影响。
本发明的另一方面，所述的pACVcE质粒载体的构建方法，包括以下步骤：
分别以pACYC184、pUC19、pBBR1MCS2-tac-mCherry、pEGFP-N1质粒和Vibriocholerae基因组为模板，采用如下引物对进行扩增：
| 引物 | DNA核苷酸序列Sequence(5’-3’) | 序列编号 |
| F1 | TAATACTCGCACTACATATG ACCCTGCCCTGAACCGACGAC | SEQ ID NO.1 |
| R1 | GTATTTAGAAAAATAAACAAATGCTGGAGATGGCGGACGCGA | SEQ ID NO.2 |
| F2 | GCCATCTCCAGCATTTGTTTATTTTTCTAAAT | SEQ ID NO.3 |
| R2 | CTCCTCGCCCTTGCTCACCAT ACTCTTCCTTTTTCAATA | SEQ ID NO.4 |
| F3 | TATTGAAAAAGGAAGAGT ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG | SEQ ID NO.5 |
| R3 | ACACCTCCCCCTGAACCTG GGATCCGATGTGTGACCGTG | SEQ ID NO.6 |
| F4 | CACGGTCACACATCGGATCC CAGGTTCAGGGGGAGGTGT | SEQ ID NO.7 |
| R4 | AATACTCCGAGACTAACAGC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA | SEQ ID NO.8 |
| F5 | TCCTCGCCCTTGCTCACCAT GCTGTTAGTCTCGGAGTATT | SEQ ID NO.9 |
| R5 | CATATGTAGTGCGAGTATTAT | SEQ ID NO.10 |
F1与R1、F2与R2、F3与R3、F4与R4、F5与R5所用引物均为融合引物，其分别设计为反向互补序列。
包括如下步骤：以pACYC184质粒为模板，以F1与R1为引物，PCR扩增氯霉素和四环素抗性基因片段、复制起始位点p15A；以pUC19质粒为模板，F2与R2为引物，PCR扩增Pbla启动子；以pBBR1MCS2-Tac-mCherry质粒为模板，F3与R3为引物，PCR扩增mCherry基因片段和T7终止子；以pEGFP-N1质粒为模板，F4与R4为引物，PCR扩增EGFP基因片段；以Vibriocholerae基因组为模板，F5与R5为引物，PCR扩增Vc2 riboswitches；胶回收以上PCR产物片段。然后，以胶回收得到的PCR产物Pbla、mCherry、EGFP基因片段为模板，采用F2与R4为引物，进行一轮融合PCR反应，得到Pbla-mCherry-EGFP基因片段，所得片段胶回收后，与PCR扩增获得Vc2riboswitches序列共同作为模板，以F2与R5为引物，进行第二轮融合PCR，得到Pbla-mCherry-EGFP-Vc2 riboswitches基因片段，所得片段胶回收后，经同源重组酶进行自连接成环，测序验证，构建得到所述双荧光报告质粒pACVcE。
本发明的再一方面，所述报告载体在检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平中的应用。
(1)在以上技术方案的基础上，优选的，将双荧光报告质粒pACVcE用于检测大肠杆菌c-di-GMP代谢基因过表达菌株的c-di-GMP水平。将所述报告载体导入BL21(DE3)表达株后，制成BL21-pACVcE感受态，分别将pET28a-dgcZ、pET28a-pdeK重组质粒电转至感受态细胞，置于氯霉素和卡那霉素双抗培养基平板上培养，待长出转化子，挑取单菌落于液体培养基中培养，加入IPTG诱导c-di-GMP代谢基因表达，测定并比较诱导表达前后大肠杆菌中报告基因的荧光表达量，判断待测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的高低。
(2)在以上技术方案的基础上，优选的，将双荧光报告质粒pACVcE用于检测大肠杆菌缺失株的胞内c-di-GMP水平。将所述双荧光报告质粒导入待测大肠杆菌缺失株和野生型对照菌株中，置于氯霉素和卡那双抗霉素培养基平板上培养，待长出转化子，挑取单菌落于液体培养基中培养，测定并比较待测大肠杆菌缺失株和野生型对照菌株中报告基因的荧光表达量，判断待测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的高低。
本发明用于大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的报告质粒及其应用，相对于现有技术具有以下特点：
(1)本发明构建的双荧光报告质粒含有两个报告基因，分别受启动子和核糖开关控制，第一报告基因用于检测质粒本底表达水平，第二报告基因用于检测c-di-GMP水平，且第一报告基因和第二报告基因的方向相反，二者的表达互相不受干扰，可消除质粒拷贝数对c-di-GMP水平检测结果的影响，检测结果更准确、更可靠。
(2)本发明构建的双荧光报告质粒的检测过程操作简单，可高效地检测细菌胞内c-di-GMP水平。
(3)本发明构建的双荧光报告质粒可用于比较不同大肠杆菌胞内c-di-GMP的含量，以及测定c-di-GMP代谢基因对大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的影响。
附图说明
图1为本发明双荧光报告质粒pACVcE构建过程示意图。
图2为本发明实施例2中荧光显微镜下观察双荧光报告质粒pACVcE用于检测IPTG诱导和不诱导BL21-pET28a-dgcZ、BL21-pET28a-pdeK菌株的荧光报告基因表达水平，即c-di-GMP水平。A为BL21-pACVcE-pET28a-dgcZ无IPTG诱导；B为BL21-pACVcE-pET28a-dgcZ加入0.5mM的IPTG诱导表达；C为BL21-pACVcE-pET28a-pdeK无IPTG诱导；D为BL21-pACVcE-pET28a-pdeK加入0.5mM的IPTG诱导表达。
图3为本发明实施例2中酶标仪定量检测双荧光报告质粒pACVcE用于检测IPTG诱导和不诱导BL21-pET28a-dgcZ、BL21-pET28a-pdeK菌株的荧光报告基因表达水平，即c-di-GMP水平。
图4为本发明实施例3中荧光显微镜下观察双荧光报告质粒pACVcE用于检测大肠杆菌野生株APCE50和缺失株ΔpdeK的荧光报告基因表达水平，即c-di-GMP水平。
图5为本发明实施例3中酶标仪定量检测双荧光报告质粒pACVcE用于检测大肠杆菌野生株APCE50和缺失株ΔpdeK的荧光报告基因表达水平，即c-di-GMP水平。
具体实施方式
以下结合具体实施例，进一步对本发明进行清楚、完整的描述。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。
本发明中未标注的试剂和原料均为市场上购买所得。
本发明中构建的双荧光报告质粒的序列详见序列表。
实施例1、双荧光报告质粒pACVcE的构建
本实施构建了一种基于核糖开关的双荧光报告质粒，含有两种报告基因且表达互相不受影响。第一报告基因mCherry用于测定报告质粒本底表达量，核糖开关的适体结构域特异结合细胞内的c-di-GMP从而调控第二报告基因EGFP表达，高c-di-GMP水平EGFP表达量上升，低c-di-GMP水平下EGFP表达量下降。因此，利用本发明提供的报告质粒能快速、准确的对细菌胞中的c-di-GMP水平进行检测，以降低质粒拷贝数及表达异质性对检测结果造成的影响。该报告载体中含有氯霉素和四环素抗性基因，以便于进行筛选。
报告载体pACVcE的构建如图1所示，以pACYC184质粒为模板，以F1与R1为引物，PCR扩增氯霉素和四环素抗性基因片段、复制起始位点p15A；以pUC19质粒为模板，F2与R2为引物，PCR扩增Pbla启动子；以pBBR1MCS2-Tac-mCherry质粒为模板，F3与R3为引物，PCR扩增mCherry基因片段和T7终止子；以pEGFP-N1质粒为模板，F4与R4为引物，PCR扩增EGFP基因片段；以Vibrio cholerae基因组为模板，F5与R5为引物，PCR扩增Vc2riboswitches；胶回收以上PCR产物片段。然后，以胶回收得到的PCR产物Pbla、mCherry、EGFP基因片段为模板，采用F2与R4为引物，进行一轮融合PCR反应，得到Pbla-mCherry-EGFP基因片段，所得片段胶回收后，与PCR扩增获得Vc2 riboswitches序列共同作为模板，以F2与R5为引物，进行第二轮融合PCR，得到Pbla-mCherry-EGFP-Vc2 riboswitches基因片段，所得片段胶回收后，经同源重组酶进行自连接成环，构成pACVcE双荧光报告载体。
实施例2、双荧光报告质粒pACVcE用于检测大肠杆菌c-di-GMP代谢基因过表达菌株中c-di-GMP水平
DgcZ(YdeH)是合成c-di-GMP的酶(含有GGDEF结构域)，有研究表明大肠杆菌二鸟苷酸环化酶DgcZ能够高效合成c-di-GMP；PdeK(YhjK)是降解c-di-GMP的酶(同时含有GGDEF和EAL结构域，主要表现PDE活性)，且该蛋白质的核心集合高度保守。本实施例的目的是验证所构建的双荧光报告质粒pACVcE能否检测出BL21-pACVcE-pET28a-pdeK、BL21-pACVcE-pET28a-dgcZ菌株胞内的c-di-GMP水平差异。具体操作步骤如下：
(1)构建pET28a-pdeK、pET28a-dgcZ重组质粒。以APCE50菌株DNA为模板，分别使用dgcZ表达引物SEQ ID No.16和SEQ ID No.17、pdeK表达引物SEQ ID No.18和SEQ ID No.19扩增dgcZ、pdeK基因片段，胶回收目的片段，将回收的目的片段及表达载体pET28a同时进行BamH I和Hind III双酶切，对pET28a载体和pdeK与dgcZ目的片段进行酶切后连接，将酶切产物转化至DH5α感受态中进行克隆。涂布于含有氯霉素的LB琼脂平板中，构建pET28a-pdeK、pET28a-dgcZ重组质粒，送测序。
构建重组质粒所用的表达引物如下：
| 引物 | DNA核苷酸序列Sequence(5’-3’) | 序列编号 |
| dgcZ表达F | CGCGGATCCATGATCAAGAAGACAACGG | SEQ ID No.16 |
| dgcZ表达R | CCCAAGCTTTTAAACTCGGTTAATCAC | SEQ ID No.17 |
| pdeK表达F | CGCGGATCCTTGCGCGTAAGTCGCTCGTT | SEQ ID No.18 |
| pdeK表达R | CCCAAGCTTCTACTTTTCTTCCAGGTAACTC | SEQ ID No.19 |
(2)将构建的pACVcE报告载体转化至BL21(DE3)菌株中并制成感受态，将测序正确的pET28a-pdeK、pET28a-dgcZ重组质粒电转化至BL21-pACVcE感受态，置于氯霉素和卡那霉素双抗培养基平板上培养，待其长出转化子。
(3)挑取步骤(1)中长出的转化子，用LB(Cm)液体培养基培养至对数生长期，共分为四组：BL21-pACVcE-pET28a-dgcZ无IPTG诱导；BL21-pACVcE-pET28a-dgcZ加入0.5mM的IPTG诱导表达；BL21-pACVcE-pET28a-pdeK无IPTG诱导；BL21-pACVcE-pET28a-pdeK加入0.5mM的IPTG诱导表达。四组菌液均在37℃，220rpm条件下培养6h。
(4)取步骤(3)诱导的菌液1mL，8000rpm离心5min，用PBS/Cm(20μg/mL)清洗两遍后，用1mL的PBS重悬。
(5)取步骤(4)制备的样品，每个样品取5μL涂布于载玻片上，在荧光显微镜下观察。根据红色荧光强度判断菌株质粒拷贝水平，根据绿色荧光强度判断菌株胞内c-di-GMP水平。
(6)结果如图2所示，经IPTG诱导后，BL21-pET28a-dgcZ菌株的绿色荧光强度高于无IPTG诱导的菌株(图A和图B)，表明c-di-GMP合成酶DgcZ诱导表达后胞内c-di-GMP水平升高。BL21-pET28a-pdeK菌株的绿色荧光菌株低于无IPTG诱导的菌株(图C和图D)，表明诱导c-di-GMP降解酶PdeK诱导表达后胞内c-di-GMP水平降低。
(7)取步骤(4)制备的样品200μL，加至黑色不透光96孔板中，用酶标仪检测菌株荧光强度，绿色荧光的激发光设置为485nm，发射光设置为528nm，记录其发射光值为EGFP；红色荧光的激发光设置为552nm，发射光设置为600nm，记录其发射光值为mCherry。每个样品做3个重复。菌株c-di-GMP水平计算公式为：EGFP/mCherry，以此数值的大小表征菌株胞内的c-di-GMP水平。
(8)如图3所示，经IPTG诱导后，在表征c-di-GMP水平数值中，BL21-pET28a-dgcZ菌株的数值较无IPTG诱导的数值增高1.6倍，BL21-pET28a-pdeK的数值较无IPTG诱导的数值显著降低3.2倍。与荧光显微镜观察结果一致，进一步表明c-di-GMP合成酶DgcZ诱导表达后c-di-GMP水平升高，c-di-GMP降解酶PdeK诱导表达后c-di-GMP水平降低。
该实施例利用双荧光报告质粒pACVcE检测大肠杆菌c-di-GMP代谢基因过表达菌株中c-di-GMP水平，说明了双荧光报告质粒的功能正常，结果可靠。
实施例3、双荧光报告载体pACVcE在检测大肠杆菌缺失株的胞内c-di-GMP水平中的应用
PdeK是大肠杆菌中的c-di-GMP降解酶(PDE)，缺失pdeK导致菌株胞内c-di-GMP水平显著升高。本实施例利用双荧光报告质粒pACVcE比较分析大肠杆菌野生株和pdeK缺失株的胞内c-di-GMP水平差异。具体操作步骤如下：
(1)分别制备大肠杆菌野生株APCE50、缺失株ΔpdeK感受态，通过电转化将双荧光报告质粒pACVcE导入大肠杆菌APCE50、ΔpdeK中，置于氯霉素培养基平板上培养，待长出转化子。
(2)挑取步骤(1)中长出的转化子，用LB(Cm)液体培养基培养至对数生长期。
(3)取步骤(2)诱导的菌液1mL，8000rpm离心5min，用PBS/Cm(20μg/mL)清洗两遍后，用1mL的PBS重悬。
(4)取步骤(3)制备的样品，每个样品取5μL涂布于载玻片上，在荧光显微镜下观察。根据红色荧光强度判断菌株质粒拷贝水平，根据绿色荧光强度判断菌株胞内c-di-GMP水平。
(5)结果如图4所示，显微镜观察ΔpdeK缺失株的绿色荧光强度高于野生株APCE50，表明ΔpdeK缺失株的胞内c-di-GMP水平高于野生株APCE50，与之前报道趋势相符。
(6)取步骤(3)制备的样品200μL，加至黑色不透光96孔板中，用酶标仪检测菌株荧光强度，绿色荧光的激发光设置为485nm，发射光设置为528nm，记录其发射光值为EGFP；红色荧光的激发光设置为552nm，发射光设置为600nm，记录其发射光值为mCherry。每个样品做3个重复。菌株c-di-GMP水平计算公式为：EGFP/mCherry，以此数值的大小表征菌株胞内的c-di-GMP水平。
(7)如图5所示，在表征c-di-GMP水平的数值中，ΔpdeK缺失株的c-di-GMP水平高于野生株APCE50，与之前报道趋势相符。
该实施例利用双荧光报告质粒pACVcE检测大肠杆菌缺失株的胞内c-di-GMP水平，可用于分析c-di-GMP代谢基因对大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的影响。
以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。实际上，除了本文所述的内容外，本领域技术人员参照上文的描述和附图可以容易地掌握对本发明的多种改进。所述改进也落入所附权利要求书的范围之内。
Claims (2)
1.一种用于检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的双荧光报告质粒pAmCherry-Vc2EGFP，简称pACVcE，其特征在于，该报告质粒由依次连接的抗性基因、启动子、第一报告基因、终止子、第二报告基因、核糖开关组成；该报告质粒含有两个报告基因，分别受启动子和核糖开关控制，第一报告基因用于检测质粒本底表达水平，第二报告基因用于检测c-di-GMP水平，且第一报告基因和第二报告基因的方向相反，二者的表达互相不受干扰，可消除质粒拷贝数对c-di-GMP水平检测结果的影响；所含的抗性基因为氯霉素和四环素抗性基因，所述的启动子为Pbla启动子，即Amp promoter，所述的第一报告基因为mCherry红色荧光蛋白基因，所述的终止子为T7终止子，所述的核糖开关为c-di-GMP核糖开关，简称Vc2核糖开关，所述的第二报告基因为EGFP绿色荧光蛋白基因；所述的氯霉素和四环素抗性基因片段如序列表中SEQ ID No.11所示，所述的Pbla启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.12所示，所述的mCherry和T7终止子核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.13所示，所述的EGFP绿色荧光蛋白基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.14所示，所述的Vc2核糖开关核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.15所示。
2.权利要求1所述的双荧光报告质粒在检测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平中的应用，其特征在于，将所述双荧光报告质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)菌株BL21-pACVcE，然后分别将待测c-di-GMP代谢基因重组表达质粒及空白对照质粒导入含有双荧光报告质粒的菌株BL21-pACVcE，置于氯霉素和卡那霉素双抗培养基平板上培养，待长出转化子，挑取单菌落于液体培养基中培养，加入IPTG诱导c-di-GMP代谢基因表达，测定并比较诱导表达前后大肠杆菌中报告基因的荧光表达量，判断待测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的高低；
或者为：
将所述双荧光报告质粒导入待测大肠杆菌菌株和野生型对照菌株中，置于氯霉素和卡那双抗霉素培养基平板上培养，待长出转化子，挑取单菌落于液体培养基中培养，测定并比较诱导表达前后大肠杆菌中报告基因的荧光表达量，判断待测大肠杆菌胞内c-di-GMP水平的高低。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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