CN103173547A - 一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统及其应用。该报告系统由依次连接的启动子、核糖开关、SD序列和报告基因组成。所述的应用包括：将所述的报告系统转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，至培养液OD₆₀₀值为0.4-0.6，测定重组细胞中报告基因的表达量，根据以下公式计算待测细胞内环二鸟苷酸的含量：环二鸟苷酸含量=-1072ln（miller unit-CK）+793.35；其中，miller unit为重组细胞中报告基因的表达量；CK为待测细胞中报告基因的本底水平表达量。利用本发明报告系统能方便地对活细胞内的c-di-GMP含量进行检测，操作方法简便易行，检测结果真实可信。

Description

一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统及其应用。

背景技术

环二鸟苷酸（cyclic bis(3'-5')diguanylic acid，c-di-GMP）是细菌体内普遍存在的第二信使分子，参与调节细菌的多种生理功能，尤其在细菌生物膜形成和致病因子产生中起着至关重要的调节作用。

细菌生物膜是细菌为抵抗外界不良环境，通过自身产生的胞外多糖等多聚物相互粘连形成的附着在细菌群落表面的膜状物。细菌生物膜可以用于进行水质净化，在维持生态环境特别是水生环境平衡中也占据重要位置，并且能够促进有机物与无机物的相互转化。

细菌生物膜对人们的生产生活也具有一定的危害，如细菌生物膜对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强，从而导致严重的临床问题，尤其是慢性和难治的感染性疾病；细菌生物膜可污染与人类生活相关的设施，如空调系统、供水系统、食品加工设备，甚至医疗用具等，由此造成传染病的流行；除健康问题外，细菌生物膜还可在工业、运输、军事等诸多领域给人类社会带来严重危害，造成巨大经济损失，比如固着在船舶底部造成行进阻力增大、腐蚀金属，堵塞管道等。

研究表明，细胞内c-di-GMP作为一个重要信号分子，控制着大量分泌蛋白或细胞表面相关蛋白基因的表达，细胞内高水平的c-di-GMP导致细胞从浮游的、运动的生活方式向固定的、生物被膜相关的生活方式转变，从而易于形成细菌生物膜。

c-di-GMP通过与核糖开关（riboswitch）结合，从而达到对基因表达的精细调节。核糖开关被定义为一类位于mRNA3'-或5'-非翻译区上，能够结合小分子代谢物以调控基因的转录和翻译的mRNA顺式作用元件，多数核糖开关都可以分成2个结构域：适体结构域（aptamer domain，AD）和表达结构域（expression domain，EPD）。AD是一个高度折叠的结构，能选择性地与特定的代谢产物结合。AD形成高度折叠的二级或者三级结构，选择性地与靶代谢物结合，自身的构象发生变化，导致下游EPD的RNA折叠变化，形成选择性的茎环结构，直接调节基因的表达。目前已证实多个与c-di-GMP特异性结合的riboswitch，c-di-GMP的两个碱基G与核糖开关的特异位点的碱基C形成Watson-Crick配对，从而实现对下游基因表达的调节。

不同浓度的c-di-GMP通过对核糖体开关的调节，使信号级联放大，对细胞的状态产生重大影响。如何检测出细胞内c-di-GMP的含量显得很重要，现有技术中还没有一种方法能用于对活细胞中的c-di-GMP进行检测。

发明内容

本发明提供了一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统，利用该报告系统能对活细胞中c-di-GMP含量进行检测。

一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统，该报告系统由依次连接的启动子、核糖开关、SD序列和报告基因组成。

启动子-核糖开关-SD序列组成基因表达调控序列，核糖开关主要依据其表达结构域的构象变化，在转录和翻译两个水平上调节报告基因的表达。

就转录水平调控而言，核糖开关的适体结构域特异结合细胞内的c-di-GMP，促使表达结构域中形成转录终止子，导致RNA聚合酶从poly U末端脱落，转录终止；G⁺菌的核糖开关倾向于利用此机制。

就翻译水平调控而言，核糖开关的适体结构域特异结合细胞内的c-di-GMP，形成特定的二级结构妨碍核糖体识别SD序列，从而阻断翻译起始；G^－菌的核糖开关倾向于利用此机制。

最终，通过检测报告基因编码的蛋白的表达量，即可获得细胞内c-di-GMP含量。

组成基因表达调控序列的三个片段（启动子、核糖开关、SD序列）可分别经扩增得到再融合到同一序列上，也可从同时包含有这三个片段（即含有启动子-核糖开关-SD序列）的基因组中经一次扩增得到。

在一个具体实施方式中，所述的基因表达调控序列即是经一次扩增从shewanella oneidensis的基因组得到的。所述的启动子为shewanellaoneidensis中SO-1072基因（GenBank号为NP_716699）的强启动子区域，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。核糖开关（在该基因组中的位置为1112520-1112568）的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。SD序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

所述的报告基因可选用Lac Z基因、荧光素酶基因或荧光蛋白基因；优选为Lac Z基因，核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。Lac Z基因编码β半乳糖苷酶，以邻硝基苯-β-D半乳吡喃糖苷（ONPG）为底物，利用比色法即可检测酶活性，操作简便，且检测动力学范围可达六个数量级。

利用c-di-GMP的结构类似物c-di-AMP分析发现，本发明的报告系统对c-di-GMP具有极高的特异性，c-di-AMP的加入对检测结果无影响。

本发明还提供了含有所述报告系统的重组载体或表达系统。所述重组载体的原始载体可选用pHGR01或pHGR03。

本发明还提供了所述的报告系统在检测活细胞内环二鸟苷酸含量中的应用，包括：

将所述的报告系统转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，至培养液OD₆₀₀值为0.4-0.6，测定重组细胞中报告基因的表达量，根据以下公式计算待测细胞内环二鸟苷酸的含量：

环二鸟苷酸含量=-1072ln（miller unit-CK）+793.35；

其中，miller unit为重组细胞中报告基因的表达量；CK为待测细胞中报告基因的本底水平表达量。

报告基因（以Lac Z基因为例）的表达量的测定方法为：

将V₁体积的OD₆₀₀值为0.4-0.6的重组细胞培养液离心，去上清；加入V₂体积的裂解液，裂解完成后，对细胞裂解液离心、取V₃体积的上清与V₄体积的ONPG反应；反应完成后，测定反应液的OD₄₂₀值；即miller unit的计算公式为：

miller unit=（1000×OD₄₂₀）/（T×V×OD₆₀₀）；

其中，

T为细胞裂解液上清与ONPG的反应时间。

若待测细胞中含有Lac Z操纵子，则所测数据会受到待测细胞Lac Z本底表达的影响。因此，检测时需以未转化所述报告系统的待测细胞为阴性对照，计算其miller united（CK）值。CK值的计算方法与miller unit相同。

所述的公式是将本发明的报告系统转化入shewanella oneidensis菌株内、同时检测该菌株的胞内c-di-GMP含量和miller unit值而拟合得到的。由于shewanella oneidensis能表达多个合成和降解c-di-GMP的酶，外界环境很容易影响菌株胞内c-di-GMP含量，从而影响细菌的生存方式。利用shewanella oneidensis即可获得更为精确的胞内c-di-GMP含量与miller unit值的换算关系，利用该公式计算的菌株胞内c-di-GMP含量更为准确可靠、真实可信。

步骤（1）中，可将含有所述报告系统的表达载体直接转入待测细胞中，也可先将表达载体转化感受态细胞，进而结合入待测细胞。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明利用能与c-di-GMP特异结合的核糖开关、报告基因构建报告系统，并拟合出胞内c-di-GMP含量与报告基因表达水平之间的换算关系，能方便地对活细胞内的c-di-GMP含量进行检测，操作方法简便易行，检测结果真实可信。

附图说明

图1为pHGR01质粒图谱；

图2为pHGR01-1072p重组质粒图谱；

图3为胞内c-di-GMP含量与lac Z表达水平的换算曲线图；其中，带节点的曲线为同一c-di-GMP浓度处理下胞内c-di-GMP含量与米勒单位值的对应关系；平滑曲线为拟合公式的曲线图；

图4为本发明报告系统的特异性测试结果图；

其中，A为空白对照；B为20μM c-di-AMP处理组；C为500μMc-di-AMP处理组。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明。

除作特殊说明外，本具体实施方式中所用的生化试剂均购自上海生工生物工程技术有限公司；

质粒pHGR01，菌株Shewanella oneidensis MR-1，Escherichia coliWM3064均为浙江大学生科院保藏。

实施方式中所涉及到的分析结果均为三次实验的平均值±平均误差（SEM）表示，用软件DPS分析处理数据；显著性差异采用双样本等方差t检验进行分析，P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著。

实施例一含报告系统的重组质粒的构建

1含启动子-核糖开关-SD序列片段的PCR扩增

以Shewanella oneidensis MR-1基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，获取含启动子-核糖开关-SD序列的片段（SEQ ID No.4）；

引物序列为：

上游引物1072p-5’：5’-GGAATTCTGGCATTTGACATAAGCACA-3’；下划线处为EcoR I酶切位点（SEQ ID No.6）；

下游引物

下划线处为Hind III酶切位点，方框标示序列为lac Z基因编码序列的前14bp（SEQ ID No.7）；由上海生工生物工程技术有限公司合成。

PCR体系为：

PCR条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s，57℃退火20s；72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存5min。

PCR产物进行电泳检测，并纯化、回收目标片段1072p。

2重组质粒的构建

将目标片段1072p克隆到载体pHGR01（图1），

（1）pHGR01质粒双酶切体系：

37℃下酶切6小时，获得pHGR01质粒双酶切产物；

（2）目标片段1072p双酶切体系：

37℃下酶切6小时，获得1072p双酶切产物；

（3）双酶切产物的连接，连接体系为：

22℃下连接6小时。

最终形成pHGR01-1072p重组质粒（图2），由图2可见，重组质粒中含有本发明的报告系统。

实施例二获取胞内c-di-GMP含量与报告基因表达水平的换算关系

（1）转化WM3064

将预先制备并保存于-80℃冰箱中的感受态细胞WM3064取出，置于冰上5-10min；加入5μL的pHGR01-1072p重组质粒，混匀；冰上放置30min，42℃热激90s，加入1mL液体LB培养基，加入终浓度为300μM二氨基庚二酸（DAP），37℃慢摇60min；涂布到含有50μg/mL卡那霉素（KM）和300μM DAP的LB平板上，37℃培养过夜；

（2）阳性克隆的鉴定

挑取单个克隆置于20μL ddH₂O中，100℃煮5min，作为模板，利用pHGR01通用引物进行PCR扩增，pHGR01通用引物的序列如下：

上游引物R01-F：5’-CAGGCATTTGAGAAGCACACG-3’（SEQ IDNo.8）；

下游引物R01-R：5’-CGGGCCTCTT CGCTATTACG-3’（SEQ ID No.9）。

PCR体系为：

PCR条件为：95℃预变性2min；95℃变性10s，57℃退火20s；72℃延伸15s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存5min。

PCR产物进行电泳检测，并纯化、回收约825bp的扩增片段（该扩增片段包括部分载体序列+启动子-核糖开关-SD序列），将含有该扩增片段的克隆命名为WpHGR01-1072p。

（3）转化shewanella oneidensis MR-1

分别将WpHGR01-1072细胞、shewanella oneidensis MR-1用含有50μg/mL卡那霉素（KM）和300μM DAP的LB液体培养基培养至OD₆₀₀约为0.5，分别收集细胞；取WpHGR01-1072细胞培养液2mL、shewanellaoneidensis MR-1细胞培养液1mL混合，4000r/min离心2min，弃上清，加入1mL LB液体培养基重悬细胞，4000r/min离心2min，加入200μL LB液体培养基重悬细胞，滴于含有300μM DAP的LB平板上，过夜培养；

冲洗混合培养物，用LB液体培养基洗涤一次，加2mL LB液体培养基重悬；取150μL涂布于含有50μg/mL卡那霉素的LB平板上，过夜培养；

挑取单克隆进行PCR验证，方法同步骤（2），挑取阳性转化子命名为S pHGR01-1072。

（4）胞内c-di-GMP含量与Miller unit值的换算关系

在基础培养基中分别加入浓度为0pM，0.1pM，1pM，10pM，100pM，1μM，10μM，100μM，1nM的c-di-GMP培养细胞（WpHGR01-1072和S pHGR01-1072）至OD₆₀₀约为0.4-0.6（记录准确的OD值）；

分别取1mL培养液收集细胞，测定胞内的c-di-GMP含量，测定方法如下：

收集的细胞于4℃下15000r/min离心10min，PBS（pH7.4）洗涤3次，去除胞外残留的c-di-GMP；加入100μL0.6M高氯酸重悬细胞，冰浴30min，于4℃，15000r/min离心5min去除细胞碎片；加入20μL2.5MKHCO₃中和，于4℃，15000r/min离心5min去除杂质；送浙江大学生科院测试室利用LC-MS技术测定胞内c-di-GMP的含量。

同时对不同浓度c-di-GMP处理的细胞测定Lac Z的米勒单位（millerunit）值，测定方法如下：

4℃下12000r/min离心2min，PBS（pH7.4）洗涤两次，加入300μL裂解液（0.25M Tris/HCl（pH7.5）+0.5%Trion-X100），30℃下放置30min；4℃下12000r/min离心5min；取上清100μL，加入100μL ONPG（4mg/mL），37℃反应10min；利用Tecan公司的Sunrise酶标仪，于420nm测定吸收值。

根据测定得到的胞内c-di-GMP含量和miller unit值，绘制曲线（如图3）；得到胞内c-di-GMP含量与miller unit值之间进行换算的拟合公式：

c-di-GMP含量（pM）=-1072ln（miller unit）+793.35；

其中，miller unit=（1000×OD₄₂₀）/（T×V×OD₆₀₀）；

$V=1000\×\frac{100}{300}\×\frac{100}{100+100}=\frac{500}{3}\mathrm{\μL};$ T为10min。

若待测菌株中含有Lac Z操纵子，所测的数据会受到待测细胞的Lac Z的本底表达的影响，因此必须以待测菌株为阴性对照，测定待测菌株中的miller united（CK）值。最终获得胞内c-di-GMP含量与Miller unit值的换算关系为：

c-di-GMP含量（pM）=-1072ln（miller unit-CK）+793.35。

实施例三特异性分析

采用含c-di-GMP的结构类似物c-di-AMP（20μM、500μM）的LB液体培养基培养S pHGR01-1072，检测本发明报告系统是否特异结合胞内c-di-GMP，结果如图4所示。

由图4可见，本发明的报告系统能特异结合胞内c-di-GMP，指示胞内c-di-GMP的含量。

实施例四测定c-di-GMP含量

将实施例一中获得的pHGR01-1072p重组质粒直接电击转化铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）中，命名为PS-pHGR01-1072p，基础培养基培养过夜至OD₆₀₀为0.61，取1mL培养液，与ONPG反应10min，以未转化菌株为空白对照。测得PS-pHGR01-1072p的OD₄₂₀值为1.824，参照实施例二中的相关方法计算其Lac Z的米勒单位1633，参照公式c-di-GMP含量（pM）=-1072ln（miller unit-CK）+793.35计算，获得c-di-GMP含量为0.265737pM。与目前已发表文献（Hickman,J.W.,and Harwood,C.S.(2008)Identification of FleQ from Pseudomonas aeruginosa as ac-di‐GMP‐responsive transcription factor.Molecular microbiology.69,376-389.）相符。

Claims (8)

1.一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统，其特征在于，该报告系统由依次连接的启动子、核糖开关、SD序列和报告基因组成。

2.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，所述的启动子为SO-1072基因的强启动子区域，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

3.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，核糖开关的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，所述的报告基因为Lac Z基因、荧光素酶基因或荧光蛋白基因。

5.如权利要求4所述的报告系统，其特征在于，所述的报告基因为Lac Z基因。

6.含有如权利要求1～5任一所述的报告系统的重组载体。

7.含有如权利要求1～5任一所述的报告系统的表达系统。

8.如权利要求1～5任一所述的报告系统在检测活细胞内环二鸟苷酸含量中的应用，包括：

将所述的报告系统转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，至培养液OD₆₀₀值为0.4-0.6，测定重组细胞中报告基因的表达量，根据以下公式计算待测细胞内环二鸟苷酸的含量：

环二鸟苷酸含量=-1072ln（miller unit-CK）+793.35；

其中，miller unit为重组细胞中报告基因的表达量；CK为待测细胞中报告基因的本底水平表达量。

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