CN112080514B - 一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及其应用 - Google Patents

一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c‑di‑GMP水平的报告载体及其应用，该报告载体含有第一启动子、第一报告基因、第二启动子和第二报告基因，所述第一报告基因的表达受第一启动子控制，所述第二报告基因的表达受第二启动子控制，所述第一报告基因和第二报告基因分别为lacZ基因和egfp，两者方向相反，表达互不干扰。利用本发明构建的报告载体可以对恶臭假单胞菌胞内c‑di‑GMP水平进行检测，并且还能检测比较不同外界刺激对恶臭假单胞菌胞内c‑di‑GMP水平的影响，操作简便快捷，结果准确可靠。

Description

一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及 其应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及其应用。
背景技术
环二鸟苷单磷酸(c-di-GMP)是广泛存在于细菌中的一种核酸类第二信使，参与调节多种生理活动，例如生物被膜状态和运动状态的转变、病原菌毒力、DNA复制和修复、细胞分化等。细菌通过响应胞外信号刺激来调节胞内c-di-GMP水平，进而改变下游代谢活动以适应当前环境。因此准确检测和比较细菌胞内c-di-GMP水平对于深入理解c-di-GMP在胞内的功能有重要意义。目前检测c-di-GMP的常用方法是质谱分析，主要过程为：抽提胞内c-di-GMP后通过质谱将其打碎成小片段，然后通过定量特异性片段的含量表征c-di-GMP水平，最后通过与c-di-GMP标准品比较，得出样品中的c-di-GMP浓度。质谱分析法直接、通用，是目前c-di-GMP研究中公认的最优方法，但质谱分析也存在一些缺点，例如抽提c-di-GMP的方法复杂，且用到一些有害的有机物试剂，大规模提取费时费力，对研究者身体健康也有损害；其次，用于质谱分析定量的仪器和c-di-GMP标准品价格昂贵，对于科研条件一般的实验室和需要大规模检测比较c-di-GMP水平的研究工作有局限性。
近年来，有研究者利用c-di-GMP调控的核糖开关或靶基因启动子构建c-di-GMP报告载体，用于在活体胞内检测c-di-GMP水平。通过检测报告基因(如荧光蛋白、氯霉素乙酰基转移酶、荧光素酶、半乳糖苷酶LacZ等)的表达确定细菌胞内c-di-GMP水平。这种方法操作简单，成本低廉，很适合大规模检测胞内c-di-GMP水平，而且可用于检测单个细胞的c-di-GMP水平，已被应用于多种细菌胞内c-di-GMP的检测。
目前使用的报告载体都只含有一个报告基因，即只通过一个报告基因的表达量表征胞内c-di-GMP水平，这种设计可能导致潜在的检测误差：首先，基因表达存在异质性，即同一基因在不同细胞中表达情况不同，当检测单个细胞c-di-GMP水平时，只使用含一个报告基因的报告载体可能因为基因表达异质性造成检测结果有较大误差；其次，细菌DNA复制过程中有一定概率发生突变，如果突变发生在报告基因或启动子区域，会造成报告基因表达混乱或失效，影响检测结果。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及其应用，该报告载体含有两个报告基因(lacZ和egfp)，分别受lapA和bcs启动子控制，c-di-GMP通过受体FleQ直接调控lapA和bcs的表达，高c-di-GMP水平下lapA和bcs表达量上升，低c-di-GMP水平下lapA和bcs表达量下降，因此，本发明通过同时检测两种报告基因的表达量来判断恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平，以降低基因表达异质性和基因突变对检测结果造成的影响，能提高检测的准确性。
本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体，该报告载体含有第一启动子、第一报告基因、第二启动子和第二报告基因，所述第一报告基因的表达受第一启动子控制，所述第二报告基因的表达受第二启动子控制，第一报告基因和第二报告基因的方向相反。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述第一启动子为lapA基因启动子，所述第一报告基因为lacZ基因。
进一步，优选的，所述第一启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示，所述第一报告基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述第二启动子为bcs基因启动子，所述第二报告基因为egfp基因。
进一步，优选的，所述第二启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.14所示，所述第二报告基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.11。
第二方面，本发明提供了一种本发明第一方面所述的报告载体的构建方法，包括如下步骤：以pBBR1MCS-5质粒为模板，以序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，得到的PCR产物包含骨架上的复制元件、结合转移mob基因和庆大霉素抗性基因；分别扩增第一报告基因、第一启动子、第二报告基因和第二启动子，并依次与所述PCR产物进行连接，测序验证，得到所述报告载体。
第三方面，本发明提供了本发明第一方面所述的报告载体在检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平中的应用。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述报告载体在检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平中的应用包括：将所述报告载体分别导入待测菌株和恶臭假单胞菌野生型菌株中，置于培养基平板上培养，待长出转化子，挑取单菌落于液体培养基中培养，测定并比较两种重组菌株细胞中报告基因的表达量，判断待测菌株胞内c-di-GMP水平的高低。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述应用包括利用所述报告载体检测比较不同外界刺激对恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的影响。
本发明的用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及其应用相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)本发明构建的报告载体具有两个分别受控于不同启动子的报告基因，两个报告基因的表达互不干扰，同时用两个报告基因检测胞内c-di-GMP水平，能通过内部比较以确定检测结果是否可靠，使得检测结果更准确；
(2)在不影响菌株正常生长的条件下，本发明构建的报告载体可用于筛选比较不同外界刺激对恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的影响，该方法操作简便快捷，结果可靠。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明报告载体pCCPR构建过程的示意图。
图2为本发明实施例2中用报告载体pCCPR中的egfp基因检测恶臭假单胞菌bifA和wspR突变体中的c-di-GMP水平。其中，WT表示野生型恶臭假单胞菌，ΔbifA和ΔwspR分别表示bifA和wspR突变体。
图3为本发明实施例2中用荧光显微镜直接观察含有报告载体pCCPR的恶臭假单胞菌bifA和wspR突变体中的c-di-GMP水平。其中，WT表示野生型恶臭假单胞菌，ΔbifA和ΔwspR分别表示bifA和wspR突变体。
图4为本发明实施例2中用报告载体pCCPR中的lacZ基因检测恶臭假单胞菌bifA和wspR突变体中的c-di-GMP水平。其中，WT表示野生型恶臭假单胞菌，ΔbifA和ΔwspR分别表示bifA和wspR突变体。
图5为本发明实施例3中用报告载体pCCPR检测双氧水对恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的影响。其中，WT表示野生型恶臭假单胞菌，ΔbifA和ΔwspR分别表示bifA和wspR突变体。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
下面实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。
实验用的大肠杆菌DH5α和恶臭假单胞菌KT2440购买于北京全式金生物技术有限公司，恶臭假单胞菌bifA和wspR突变体是实验室前期构建的，均生长于常规的LB培养基，选择生长所用的抗生素浓度为：40μg/mL庆大霉素Gm。实验所用的原始质粒pBBR1MCS-5、MSCV-IRES-EGFP和pSH18-34均购买于生物技术公司，常见于市面。抗生素、培养基、半乳糖苷酶底物X-gal和ONPG、双氧水等常规试剂均买于试剂公司，常见于市面。载体克隆和半乳糖苷酶活性检测的详细步骤参见《分子克隆实验指南》。
实施例1、报告载体pCCPR的构建
本实施构建了一种含lacZ和egfp两个报告基因的报告载体pCCPR，lacZ和egfp基因分别受lapA和bcs启动子控制，lapA和bcs是恶臭假单胞菌中两个生物被膜基质组分编码基因，lapA编码粘附蛋白，bcs编码胞外多糖。报告载体pCCPR的构建是以商业化克隆载体pBBR1MCS-5为骨架，如图1所示，将其原有的lacZ亚基基因(表达产物不具有干乳糖苷酶活性)和tac启动子替换成完整的lacZ基因(表达产物具有干乳糖苷酶活性)，并将lapA基因启动子连接到lacZ基因上游，然后继续将bcs基因启动子和egfp基因也连接到载体上，以实现lapA启动子控制lacZ基因表达，bcs启动子控制egfp基因表达。其中lapA启动子-lacZ与bcs启动子-egfp的方向相反，以免干扰彼此的表达。报告载体pCCPR构建过程如下：
S1、报告载体pBBR1-lapApro-lacZ的构建
报告载体pBBR1-lacZ的构建如图1所示，先利用引物对P1/P2，以pBBR1MCS-5质粒为模板，扩增pBBR1MCS-5上包含庆大霉素抗性基因、复制元件和结合转移mob基因的片段；利用引物对P3/P4，以pSH18-34质粒为模板，扩增lacZ基因(完整lacZ基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5所示)；将上述两种PCR产物用HindIII和XhoI双酶切，并利用T4DNA连接酶连接，测序验证，得到载体pBBR1-lacZ。引物P3上设计有4种常见限制性内切酶的识别序列(XhoI、EcoRI、BamHI和XbaI)，为载体提供多克隆位点，以便后续继续连接其它片段到载体上。所构建pBBR1-lacZ上的lacZ基因上游无启动子，因此不能转录表达。以恶臭假单胞菌KT2440基因组为模板，利用引物对P5/P6扩增lapA基因启动子(包含核糖体识别序列，lapA启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8)，产物用BanHI和XbaI双酶切，并利用T4DNA连接酶连接到载体pBBR1-lacZ上，测序验证，得到载体pBBR1-lapApro-lacZ。
S2、报告载体pCCPR的构建
利用引物对P7/P8，以MSCV-IRES-EGFP质粒为模板，扩增egfp基因片段(egfp基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.11)，产物用EcoRI和XhoI双酶切，并利用T4DNA连接酶连接到载体pBBR1-lapApro-lacZ上，测序验证，得到载体pBBR1-lapApro-lacZ-egfp。以恶臭假单胞菌KT2440基因组为模板，利用引物对P9/P10扩增bcs基因启动子(包含核糖体识别序列，bcs启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.14)，产物用BanHI和EcoRI双酶切，并利用T4DNA连接酶连接到载体pBBR1-lapApro-lacZ-egfp上，测序验证，得到载体pBBR1-lapApro-lacZ-bcspro-egfp，将其重新命名为pCCPR。
表1 本发明所用的引物序列
引物 DNA核苷酸序列Sequence(5’-3’) 序列编号
P1 GG<u>AAGCTT</u>AGGCACGAACCCAGTTGA SEQ ID No.1
P2 GC<u>CTCGAG</u>TGAATCCGTTAGCGAGGTG SEQ ID No.2
P3 GC<u>CTCGAGGAATTCGGATCCTCTAGA</u>GGAGCTTGGCTGTTGCCC SEQ ID No.3
P4 GG<u>AAGCTT</u>TTATTCCGCCGATACTGACGG SEQ ID No.4
P5 CG<u>GGATCC</u>GATACCATTATTCACGCACTCG SEQ ID No.6
P6 GC<u>TCTAGA</u>GATGGCTACAACGCTGCTC SEQ ID No.7
P7 CG<u>GAATTC</u>ATGGTGAGCAAGGGCGAG SEQ ID No.9
P8 CC<u>CTCGAG</u>TTACTTGTACAGCTCGTCCAT SEQ ID No.10
P9 CG<u>GGATCC</u>GCCCAGGAACGCGAATAG SEQ ID No.12
P10 CG<u>GAATTC</u>GGAAATCGCCAACAACTGC SEQ ID No.13
实施例2、用报告载体pCCPR检测不同恶臭假单胞菌突变体中的c-di-GMP水平
WspR是恶臭假单胞菌中的一个c-di-GMP合成酶，有研究表明缺失wspR导致菌株胞内c-di-GMP水平显著下降；BifA是恶臭假单胞菌中的一个c-di-GMP降解酶，有研究表明缺失bifA导致菌株胞内c-di-GMP水平显著上升。本实施例的目的是验证所构建的报告载体pCCPR能否检测出bifA和wspR突变体中的c-di-GMP水平与野生型菌株中的差异。具体操作步骤如下：
S1、通过电转化将报告载体pCCPR分别导入恶臭假单胞菌KT2440的bifA突变体、wspR突变体和野生型菌株中，利用庆大霉素培养平板筛选转化子。
S2、挑取步骤S1中长出的转化子，用LB液体培养基培养至对数中期，取1mL菌液4℃离心后去除上清。加入预冷的生理盐水清洗2遍菌体，最后用2mL预冷的生理盐水重悬菌体，检测重悬的菌液在600nm处的吸光值，用预冷的生理盐水将菌悬液稀释到相同的600nm吸光值，记录此OD值。取0.2mL稀释好的菌液加入黑色不透光96孔板中，每个样品设3个孔重复，用分光光度计检测菌株荧光强度，激发光设置为480nm，发射光设置为520nm，记录其发射光数值G；同时设置不带荧光质粒的野生型菌株对照，检测相同浓度菌株本底的荧光强度，记录其数值G0。菌株荧光强度计算公式为：(G-G0)/OD，以此数值的大小表征菌株胞内的c-di-GMP水平。另外，如果只需要大致判断不同菌株中的c-di-GMP水平，可直接将菌液置于荧光显微镜下观察，根据细胞发出的荧光强度判断菌株胞内c-di-GMP水平。
结果如图2所示，导入报告载体的野生型菌株的荧光强度约为28.13，bifA突变体约为74.04，wspR突变体约为12.47。如图3所示，直接在荧光显微镜下观察的结果趋势与检测结果一致。与之前报道趋势相符，bifA突变体中c-di-GMP水平升高，wspR突变体中c-di-GMP水平下降。
S3、挑取步骤S1中长出的转化子，用LB培养基培养至对数中期，取2mL菌液4℃离心后去除上清。加入2mL预冷的缓冲液Z(60mM Na2HPO4·7H2O，40mM NaH2PO4·H2O，10mM KCl，1mM MgSO4，50mM-巯基乙醇)，将细胞重悬后取0.3mL于2mL离心管中，加入0.7mL缓冲液Z。加入0.1mL氯仿和0.05mL 0.01％(v/v)SDS溶液，颠倒混匀，于28℃静置3min。加入0.2mL4mg/mL的2-硝基苯基-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG)，混匀后28℃静置，开始计时并观察颜色变化。
S4、当反应液颜色变为浅黄色时，加入0.5mL 0.5M的Na2CO3溶液终止反应，记录反应的时间。将反应液离心，取上清检测其在420nm和550nm处的吸光值。菌株胞内LacZ酶活性的计算公式为：
Miller Units＝1000×[(OD420-1.75×OD550)]/(T×V×OD600)
其中OD420和OD550为反应液的吸光值，OD600为用缓冲液Z重悬后菌液在600nm的吸光值，T表示反应时间(min)，V表示分析中使用的重悬菌液的体积(mL)。以此数值的大小表征菌株胞内的c-di-GMP水平。
在没有ONPG的情况下，也可使用平板法比较不同菌株中的c-di-GMP水平，即将菌液点在含有200μg/mL X-gal的LB培养基平板上，然后放置28℃静置培养48-72h，就可根据菌落颜色判断菌株胞内lacZ表达量以确定c-di-GMP水平高低。
结果如图4所示，野生型菌株的LacZ活性约为550，bifA突变体约为1349，wspR突变体约为295。同样观察到，平板菌落的颜色趋势也与检测的酶活趋势一致，bifA突变体蓝色深，wspR突变体蓝色浅，说明bifA突变体中c-di-GMP水平升高，wspR突变体中c-di-GMP水平下降。
综合以上结果，分别用报告基因egfp和lacZ检测比较bifA和wspR突变体中的c-di-GMP水平，结果一致，说明报告载体pCCPR中的两个报告基因功能正常，互不干扰。
实施例3、用报告载体pCCPR检测双氧水对恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的影响
氧化胁迫是细菌在环境中经常遇到的胁迫刺激，研究氧化胁迫对细菌胞内c-di-GMP水平的影响可帮助理解细菌应对氧化胁迫的机制。本实施例利用报告载体pCCPR检测双氧水对恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的影响，具体操作步骤如下：
S1、通过电转化将报告载体pCCPR导入恶臭假单胞菌KT2440中，利用庆大霉素培养平板筛选转化子。
S2、挑取步骤S1中长出的转化子，用LB培养基培养至对数中期。取5mL菌液，分别加入终浓度为0.1mM、1mM、10mM和20mM的双氧水，培养30min。每个双氧水浓度设置3个重复，同时设置不加双氧水的对照组。
S3、按实施例2中所述的方法检测菌株荧光强度和LacZ活性。
结果如图5所示，用0.1mM和1mM双氧水处理菌株30min后，菌株荧光强度和LacZ活性都有显著上升，而用10mM和20mM的双氧水处理30min后，菌株荧光强度和LacZ活性都大幅下降，说明不同浓度的双氧水胁迫对菌株胞内c-di-GMP水平的影响不同，低浓度双氧水导致菌株胞内c-di-GMP水平上升，高浓度双氧水导致菌株胞内c-di-GMP水平下降。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体及其应用
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
ggaagcttag gcacgaaccc agttga 26
<210> 2
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
gcctcgagtg aatccgttag cgaggtg 27
<210> 3
<211> 44
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
gcctcgagga attcggatcc tctagaggag cttggctgtt gccc 44
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
ggaagctttt attccgccga tactgacgg 29
<210> 5
<211> 3072
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
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cgcctcgcgg tgatggtgct gcgttggagt gacggcagtt atctggaaga tcaggatatg 660
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agcgatttcc atgttgccac tcgctttaat gatgatttca gccgcgctgt actggaggct 780
gaagttcaga tgtgcggcga gttgcgtgac tacctacggg taacagtttc tttatggcag 840
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catggtcagg tcatggatga gcagacgatg gtgcaggata tcctgctgat gaagcagaac 1200
aactttaacg ccgtgcgctg ttcgcattat ccgaaccatc cgctgtggta cacgctgtgc 1260
gaccgctacg gcctgtatgt ggtggatgaa gccaatattg aaacccacgg catggtgcca 1320
atgaatcgtc tgaccgatga tccgcgctgg ctaccggcga tgagcgaacg cgtaacgcga 1380
atggtgcagc gcgatcgtaa tcacccgagt gtgatcatct ggtcgctggg gaatgaatca 1440
ggccacggcg ctaatcacga cgcgctgtat cgctggatca aatctgtcga tccttcccgc 1500
ccggtgcagt atgaaggcgg cggagccgac accacggcca ccgatattat ttgcccgatg 1560
tacgcgcgcg tggatgaaga ccagcccttc ccggctgtgc cgaaatggtc catcaaaaaa 1620
tggctttcgc tacctggaga gacgcgcccg ctgatccttt gcgaatacgc ccacgcgatg 1680
ggtaacagtc ttggcggttt cgctaaatac tggcaggcgt ttcgtcagta tccccgttta 1740
cagggcggct tcgtctggga ctgggtggat cagtcgctga ttaaatatga tgaaaacggc 1800
aacccgtggt cggcttacgg cggtgatttt ggcgatacgc cgaacgatcg ccagttctgt 1860
atgaacggtc tggtctttgc cgaccgcacg ccgcatccag cgctgacgga agcaaaacac 1920
cagcagcagt ttttccagtt ccgtttatcc gggcaaacca tcgaagtgac cagcgaatac 1980
ctgttccgtc atagcgataa cgagctcctg cactggatgg tggcgctgga tggtaagccg 2040
ctggcaagcg gtgaagtgcc tctggatgtc gctccacaag gtaaacagtt gattgaactg 2100
cctgaactac cgcagccgga gagcgccggg caactctggc tcacagtacg cgtagtgcaa 2160
ccgaacgcga ccgcatggtc agaagccggg cacatcagcg cctggcagca gtggcgtctg 2220
gcggaaaacc tcagtgtgac gctccccgcc gcgtcccacg ccatcccgca tctgaccacc 2280
agcgaaatgg atttttgcat cgagctgggt aataagcgtt ggcaatttaa ccgccagtca 2340
ggctttcttt cacagatgtg gattggcgat aaaaaacaac tgctgacgcc gctgcgcgat 2400
cagttcaccc gtgcaccgct ggataacgac attggcgtaa gtgaagcgac ccgcattgac 2460
cctaacgcct gggtcgaacg ctggaaggcg gcgggccatt accaggccga agcagcgttg 2520
ttgcagtgca cggcagatac acttgctgat gcggtgctga ttacgaccgc tcacgcgtgg 2580
cagcatcagg ggaaaacctt atttatcagc cggaaaacct accggattga tggtagtggt 2640
caaatggcga ttaccgttga tgttgaagtg gcgagcgata caccgcatcc ggcgcggatt 2700
ggcctgaact gccagctggc gcaggtagca gagcgggtaa actggctcgg attagggccg 2760
caagaaaact atcccgaccg ccttactgcc gcctgttttg accgctggga tctgccattg 2820
tcagacatgt ataccccgta cgtcttcccg agcgaaaacg gtctgcgctg cgggacgcgc 2880
gaattgaatt atggcccaca ccagtggcgc ggcgacttcc agttcaacat cagccgctac 2940
agtcaacagc aactgatgga aaccagccat cgccatctgc tgcacgcgga agaaggcaca 3000
tggctgaata tcgacggttt ccatatgggg attggtggcg acgactcctg gagcccgtca 3060
gtatcggcgg aa 3072
<210> 6
<211> 30
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
cgggatccga taccattatt cacgcactcg 30
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
gctctagaga tggctacaac gctgctc 27
<210> 8
<211> 568
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
gataccatta ttcacgcact cgtcggtcat ctctttgatt tgcgacacat agctgcttgt 60
gactcgcgca gcgttgatag ccgcaagcgc ccccggctct ggctggctat cgacctctgc 120
ctggccgcat tccggcaagg tttgtgctta tttggcaatc agtgtccggg cgattgacag 180
tgacctggat attgacgcca gtaacgctga cattgtcgag taagtcggtc gcgccgcgtg 240
atttacggct gctgaggtgt atgaaaaagt gctaggactg atggcttaac acctttttga 300
tgatgtaaga catttgtcct caggaaacgc ttggctaagg tacaaatatc aatgtgacat 360
tacattgccg attgtttagg atggcatgta taaggtcaat agtttggcag tcaggcaatt 420
ccaaaaagtt atagacggaa tattgacgtc aaaaacgtca agagatcatc gacatagttc 480
cgcctgaagt ggctagcaag cgccgctctg gcagggaagt accccatcgg gtcacacgga 540
gagtccaatg agcagcgttg tagccatc 568
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
cggaattcat ggtgagcaag ggcgag 26
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
ccctcgagtt acttgtacag ctcgtccat 29
<210> 11
<211> 720
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc ccatcctggt cgagctggac 60
ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg gcgagggcga tgccacctac 120
ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc tgcccgtgcc ctggcccacc 180
ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc gctaccccga ccacatgaag 240
cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg tccaggagcg caccatcttc 300
ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga agttcgaggg cgacaccctg 360
gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg acggcaacat cctggggcac 420
aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca tggccgacaa gcagaagaac 480
ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg acggcagcgt gcagctcgcc 540
gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg tgctgctgcc cgacaaccac 600
tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg agaagcgcga tcacatggtc 660
ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca tggacgagct gtacaagtaa 720
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
cgggatccgc ccaggaacgc gaatag 26
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
cggaattcgg aaatcgccaa caactgc 27
<210> 14
<211> 506
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
gcccaggaac gcgaatagcc aggcttcgta tatcgacacc ccggcactga gcagcgccag 60
cgccaggatg tagccacggg cgccgcgggt acaagcccac atgaagcgca acaggccaac 120
gggcggcggt ggtacctcgt cgggtgggaa ggggtcgagc cgacgttcaa agatacgcag 180
catgcttgtc tccggaaaac ggttcttgct tggccaatgc cctgccggct tgcctttgcc 240
gactgttgtt tttaacccgg aaaaggtcgg ccttggggtg tttgttaaca aacctttgca 300
actcattaca tttcagattg atttcattct gccttgatgc tgtataattg acgcaacttt 360
gtgttacgca tcatttttgt cgtttttttg acatgagtca taaagcgtca gcagaggatg 420
tgacacattc cgccttcaaa ccgtttcaat ttaccttttg cagagccagt gttttgacta 480
atggaatgca gttgttggcg atttcc 506

Claims (7)

1.一种用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体，其特征在于：该报告载体含有第一启动子、第一报告基因、第二启动子和第二报告基因，所述第一启动子为lapA基因启动子，所述第一报告基因为lacZ基因，所述第一报告基因的表达受第一启动子控制，所述第二启动子为bcs基因启动子，所述bcs基因启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNo.14所示，所述第二报告基因为egfp基因，所述第二报告基因的表达受第二启动子控制，第一报告基因和第二报告基因的方向相反。
2.如权利要求1所述的用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体，其特征在于：所述第一启动子的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.8所示，所述第一报告基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.5。
3.如权利要求1所述的用于检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的报告载体，其特征在于：所述第二报告基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.11。
4.权利要求1-3任一所述的报告载体的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以pBBR1MCS-5质粒为模板，以序列表中SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列为引物，进行PCR扩增，得到PCR产物；分别扩增第一报告基因、第一启动子、第二报告基因和第二启动子，并依次与所述PCR产物进行连接，测序验证，得到所述报告载体。
5.权利要求1所述的报告载体在检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平中的应用。
6.如权利要求5所述的报告载体在检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平中的应用，其特征在于，包括：将所述报告载体分别导入待测菌株和恶臭假单胞菌野生型菌株中，置于培养基平板上培养，待长出转化子，挑取单菌落于液体培养基中培养，测定并比较两种重组菌株细胞中报告基因的表达量，判断待测菌株胞内c-di-GMP水平的高低。
7.如权利要求5所述的报告载体在检测恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平中的应用，其特征在于：包括利用所述报告载体检测比较不同外界刺激对恶臭假单胞菌胞内c-di-GMP水平的影响。
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