CN111154780A - 一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法 - Google Patents

一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，包括以下步骤：（1）载体构建；（2）细胞转染；（3）双荧光素酶检测。本发明将蜜蜂Dnmt3基因启动子区截短成6个不同长度的DNA片段，将各个片段克隆到pmirGLO载体质粒构建成双荧光素酶报告基因检测载体质粒，随后进行细胞转染及启动子活性检测。本发明操作简单易行，具有较高的可重复性和准确度，不需使用放射性同位素等优点，为研究西方蜜蜂Dnmt3通路及其它基因的转录调控提供了有效的检测工具。

Description

一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动 子活性的方法
技术领域
本发明属于分子生物学检测启动子活性技术领域，具体的说涉及一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法。
背景技术
蜜蜂是重要的经济昆虫，也是典型的社会性昆虫。在正常的蜂群中，通常有一只蜂王，数百至上千只雄蜂（有季节性出现）和数千至数万只工蜂。蜂王和工蜂都是雌性蜂，由遗传物质完全相同的受精卵发育而来，但是二者在生理、行为方面差异很大。蜂王和工蜂的级型分化是一种典型的表观遗传现象。表观遗传是指在基因的DNA序列没有发生改变的情况下，基因功能发生了可遗传的变化，并最终导致了表型的变化。表观遗传和非编码RNA调控、DNA甲基化和组蛋白乙酰化等相关。其中DNA甲基化是一种很广泛的表观遗传学调节机制，它是指在DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferases，Dnmts）的作用下，将甲基添加在DNA分子中的碱基上，从而影响基因的表达。西方蜜蜂体内拥有一套完整的DNA甲基化系统，拥有3种5-甲基胞嘧啶DNA转移酶，分别是Dnmt1、Dnmt2和Dnmt3。DNA甲基化是调节蜜蜂级型分化的一个重要因素，Kucharski等（2008）用显微注射对西方蜜蜂的工蜂幼虫Dnmt3基因进行RNAi，结果表明：降低Dnmt3基因的表达可诱导西方蜜蜂幼虫发育成蜂王，且蜂王Dynactin p62基因的甲基化程度降低。这说明Dnmt3基因是调控蜂王和工蜂级型分化的关键基因。
研究者对蜂王和工蜂间的甲基化差异进行了广泛的研究，发现蜂王幼虫和工蜂幼虫、蜂王脑部和工蜂脑部等均存在着广泛的甲基化差异。这表明由Dnmt3控制的DNA甲基化广泛地影响着蜂王和工蜂之间生殖、行为、寿命等方面的级型差异。目前，Dnmt3基因转录调控的分子机制尚不清楚。所以本申请对Dnmt3基因进行了不同长度启动子转录活性的分析，为以后在养蜂生产中能够更好地利用该启动子培育优良蜂王提供指导。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，它具有灵敏度高、检测速度快等优点。
本发明通过以下技术方案解决上述技术问题，
一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，包括以下步骤：
（1）载体构建
（1.1）从NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载预测的西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1和西方蜜蜂基因组序列，利用Bioedit软件从西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1中找出西方蜜蜂Dnmt3基因编码区序列；
将西方蜜蜂Dnmt3基因编码区序列与西方蜜蜂基因组序列进行比对，确定西方蜜蜂Dnmt3基因翻译起始密码子“ATG”在西方蜜蜂基因组序列上的具体位置；
再在西方蜜蜂基因组序列上选取西方蜜蜂Dnmt3基因翻译起始密码子“ATG”之前2256bp的片段作为启动子区域片段，并进一步将启动子区域片段依次截短成950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段；
将上述启动子片段用EcoRI、NotI进行双酶切，酶切后启动子片段的两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
（1.2）制备酶切后的双荧光素酶报告基因检测载体，其步骤包括，
将双荧光素酶报告基因检测载体质粒用EcoRI、NotI进行双酶切，酶切后双荧光素酶报告基因检测载体质粒的两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
（1.3）将步骤（1.1）获得的酶切后启动子片段与步骤（1.2）获得的酶切后双荧光素酶报告基因检测载体质粒进行连接；
（1.4）筛选重组子，其步骤包括，
（1.4.1）取连接产物直接转化JM109感受态细胞，向转化后的JM109感受态细胞中加入1ml的LB培养基，随后置于恒温摇床中于37°C下200转/分钟摇菌1小时；
然后取200µl转化后的JM109感受态细胞涂在含有氨苄青霉素的培养平板上，将平板置于恒温培养箱中于37°C过夜培养；
（1.4.2）从培养平板上随机挑取菌落于5ml的LB培养基中，37°C下250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，取阳性克隆菌液测序；
（1.4.3）经过测序验证后，使用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆重组子，以备转染；
（1.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段进行步骤（1.3）-步骤（1.4）操作，获得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子；
（2）细胞转染
用于转染的细胞系所使用DNA与lip2000的比值为1µg：2～3µl；
（2.1）转染前24小时，将用于转染的细胞系接种至每孔含有500µl不含抗生素的培养基的24孔细胞培养板中，在转染时用于转染的细胞系可长至90-95%融合；
（2.2）转染液制备，每孔细胞用量如下：
（2.2.1）用50µl的Opti-ME I低血清培养基稀释所述步骤（1.5）获得的阳性克隆重组子，轻轻混匀；
（2.2.2）轻轻摇匀lip2000，之后分别取3µl的lip2000在50µl的Opti-ME I培养基中稀释，室温孵育5分钟；
（2.2.3）将前两步所稀释的阳性克隆重组子和lip2000轻轻混匀，室温放置20分钟，获得转染液；
（2.3）在步骤（2.1）所述24孔细胞培养板的每孔细胞中加入100µl步骤（2.2）制备的转染液，轻轻摇匀，进行细胞转染；
（2.4）孵箱中37°C下培养18-48小时后检测基因表达，获得转染后细胞系；
（2.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子进行步骤（2.2）-步骤（2.4）操作，获得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子转染的转染后细胞系；
（3）双荧光素酶检测
（3.1）试剂准备
按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒E1910说明书配制PLB细胞裂解液、LAR II检测液、Stop&Glo检测液；
（3.2）样品准备
按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒E1910说明书使用PLB细胞裂解液裂解步骤（2）获得的转染后细胞系，取20µl裂解后的细胞系裂解液；
（3.3）检测过程
（3.3.1）取20µl步骤（3.2）获得的裂解后的细胞系裂解液置于1.5ml离心管中，然后加入100µl的LARII检测液，混合后放入Biotek Synergy2酶标仪检测第一次发光值；
（3.3.2）再加入Stop&Glo检测液，终止第一次发光，同时开始第二次发光，混合后放入Biotek Synergy2酶标仪检测第二次发光值；
（3.4）数据分析
以萤火虫荧光素酶基因Luc作为内参基因，将24孔细胞培养板的各孔Rluc的荧光值与Luc的荧光值进行比较，得到Rluc/Luc比值；
以双荧光素酶报告基因检测载体质粒为阴性对照，将实验组的Rluc/Luc值与阴性组的Rluc/Luc值进行统计分析，分析实验组的变化，若实验组Rluc/Luc值显著高于阴性组Rluc/ Luc值，则说明该启动子具有启动活性。
为了获得更好的技术效果，步骤（1.1）中，将所述截短的片段用EcoRI、NotI进行酶切，使得截短的片段两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
酶切体系（40µl）如下：
DNA：2µl；
EcoRI：1µl；
NotI：1µl；
10×buffer：4µl；
H2O：32µl；
在37℃酶切2小时，酶切完成后用胶回收试剂盒进行回收；
步骤（1.2）的酶切方法和酶切体系同上。
为了获得更好的技术效果，步骤（1.2）中，所述双荧光素酶报告基因检测载体质粒的增殖方法，其步骤包括，
将保存于-80℃的双荧光素酶报告基因检测载体质粒转化到100µl的JM109感受态细胞中；
将100µl转化后的JM109感受态细胞接种在含有Amp的固体培养基平板上，37℃培养过夜；
挑选单菌落于3m1的LB培养基中，振荡培养过夜；
用碱裂解法制备双荧光素酶报告基因检测载体质粒。
为了获得更好的技术效果，步骤（1.3）中，连接反应体系（20µl）如下：
酶切后启动子片段：2µl；
酶切后双荧光素酶报告基因检测载体质粒：100-200ng；
ligase buffer：2µl；
T4 ligase：1µl；
H2O：10-13µl
以上连接液在16°C过夜连接。
为了获得更好的技术效果，步骤（2）所述用于转染的细胞系为HEK293细胞。
为了获得更好的技术效果，步骤（2）所述用于转染的细胞系的密度为60%-70%时进行转染，可获得高转染效率、高表达水平和低细胞毒性。
为了获得更好的技术效果，步骤（3.4）所述双荧光素酶报告基因检测载体质粒为pmirGLO载体质粒。
为了获得更好的技术效果，步骤（3.4）中，每个转染后细胞系做至少3个生物学重复，计算出每个生物学重复的Rluc/Luc比值，再将Rluc/Luc比值代入步骤（3.4）中进行数据分析。
有益效果：本发明将蜜蜂Dnmt3基因启动子区截短成6个不同长度的DNA片段，将各个片段克隆到pmirGLO载体质粒构建成双荧光素酶报告基因检测载体质粒，随后进行细胞转染及启动子活性检测。便于对蜜蜂Dnmt3基因启动子的转录调控方式及调控元件进行研究。本发明使用的pmirGLO载体质粒，因同时携带萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase，Luc）和海肾荧光素酶（RenillaLuciferase，Rluc）报告基因，在做细胞转染时只需要转入该质粒载体即可，不需要另外转入内参质粒，可以减小实验误差。本发明操作简单易行，具有较高的可重复性和准确度，不需使用放射性同位素等优点，为研究西方蜜蜂Dnmt3通路及其它基因的转录调控提供了有效的检测工具。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。
图1为本发明实施例pmirGLO载体质粒的结构示意图；
图2为本发明实施例西方蜜蜂Dnmt3在HEK293细胞中的启动子活性分析；
图3为本发明实施例西方蜜蜂Dnmt3基因667bp启动子区结构。
具体实施方式
根据以下实施例对本发明做进一步解释说明，以便更好地理解本发明。下述实施例中所用到的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径购买到。
一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，包括以下步骤：
（1）载体构建
（1.1）从NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载预测的西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1和西方蜜蜂基因组序列，利用Bioedit软件从西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1中找出西方蜜蜂Dnmt3基因编码区序列；
将西方蜜蜂Dnmt3基因编码区序列与西方蜜蜂基因组序列进行比对，确定西方蜜蜂Dnmt3基因翻译起始密码子“ATG”在西方蜜蜂基因组序列上的具体位置；
再在西方蜜蜂基因组序列上选取西方蜜蜂Dnmt3基因翻译起始密码子“ATG”之前2256bp的片段作为启动子区域片段，并进一步将启动子区域片段依次截短成950bp、667bp、453bp、246bp、143bp的启动子片段；
本实施例中，将2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp、143bp的启动子片段委托广州迎新生物科技有限公司进行DNA合成；
合成的DNA片段用EcoRI、NotI进行酶切，酶切后的合成的DNA片段两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
酶切体系（40µl）如下：
DNA：2µl；
EcoRI：1µl；
NotI：1µl；
10×buffer：4µl；
H2O：32µl；
在37℃酶切2小时，酶切完成后用胶回收试剂盒进行回收；
（1.2）本实施例中，双荧光素酶报告基因检测载体质粒为pmirGLO载体质粒；
制备酶切后的pmirGLO载体质粒，
将pmirGLO载体质粒用EcoRI、NotI进行双酶切，酶切后pmirGLO载体质粒的两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
酶切体系（40µl）如下：
DNA：2µl；
EcoRI：1µl；
NotI：1µl；
10×buffer：4µl；
H2O：32µl；
在37℃酶切2小时，酶切完后用胶回收试剂盒进行回收；
所述pmirGLO载体质粒的增殖方法，其步骤包括，
将保存于-80℃的pmirGLO载体质粒转化到100µl的JM109感受态细胞中；
将100µl转化后的JM109感受态细胞接种在含有Amp的固体培养基平板上，37℃培养过夜；
挑选单菌落于3m1的LB培养基中，振荡培养过夜；
用碱裂解法制备pmirGLO载体质粒；
（1.3）将步骤（1.1）获得的酶切后启动子片段与步骤（1.2）获得的酶切后pmirGLO载体质粒进行连接，连接反应体系（20µl）如下：
酶切后启动子片段：2µl；
酶切后pmirGLO载体质粒：100-200ng；
ligase buffer：2µl；
T4 ligase：1µl；
H2O：10-13µl；
以上连接液在16°C过夜连接；
（1.4）筛选重组子，其步骤包括，
（1.4.1）取连接产物直接转化JM109感受态细胞，向转化后的JM109感受态细胞中加入1ml的LB培养基，随后置于恒温摇床中于37°C下200转/分钟摇菌1小时；
然后取200µl转化后的JM109感受态细胞涂在含有氨苄青霉素的培养平板上，将平板置于恒温培养箱中于37°C过夜培养；
（1.4.2）从培养平板上随机挑取菌落于5ml的LB培养基中，37°C下250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，取阳性克隆菌液送到广州华大生物科技有限公司测序；
（1.4.3）经过测序验证后，使用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆重组子，以备转染；
（1.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段进行步骤（1.3）-步骤（1.4）操作，获得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子；
（2）细胞转染
本实施例中，用于转染的细胞系为HEK293细胞，HEK293细胞所使用DNA与lip2000的比值为1µg：2～3µl，当细胞的密度为60%-70%时进行转染，可获得高转染效率、高表达水平和低细胞毒性；
（2.1）转染前24小时，将HEK293细胞接种至每孔含有500µl不含抗生素的培养基的24孔细胞培养板中，在转染时HEK293细胞可长至90-95%融合；
（2.2）转染液制备，每孔细胞用量如下：
（2.2.1）用50µl的Opti-ME I低血清培养基稀释所述步骤（1.5）获得的阳性克隆重组子，轻轻混匀；
（2.2.2）轻轻摇匀lip2000，之后分别取3µl的lip2000在50µl的Opti-ME I培养基中稀释，室温孵育5分钟；
（2.2.3）将前两步所稀释的阳性克隆重组子和lip2000轻轻混匀，室温放置20分钟，获得转染液；
（2.3）在步骤（2.1）所述24孔细胞培养板的每孔细胞中加入100µl步骤（2.2）制备的转染液，轻轻摇匀，进行细胞转染；
（2.4）孵箱中37°C下培养18-48小时后检测基因表达，获得转染后HEK293细胞；
（2.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子进行步骤（2.2）-步骤（2.4）操作，获得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子转染的转染后HEK293细胞；
（3）双荧光素酶检测
（3.1）试剂准备
按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒E1910（购于Promega公司）说明书配制PLB细胞裂解液、LAR II检测液、Stop&Glo检测液；
（3.2）样品准备
按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒E1910（购于Promega公司）说明书使用PLB细胞裂解液裂解步骤（2）获得的转染后HEK293细胞，取20µl裂解后的HEK293细胞裂解液；
（3.3）检测过程
（3.3.1）取20µl步骤（3.2）获得的裂解后的HEK293细胞裂解液置于1.5ml离心管中，然后加入100µl的LARII检测液，混合后放入Biotek Synergy2酶标仪（美国Biotek公司）检测第一次发光值；
（3.3.2）再加入Stop&Glo检测液，终止第一次发光，同时开始第二次发光，混合后放入Biotek Synergy2酶标仪检测第二次发光值；
（3.4）数据分析
以萤火虫荧光素酶基因Luc作为内参基因，将24孔细胞培养板的各孔Rluc的荧光值与Luc的荧光值进行比较，得到Rluc/Luc比值；
每个转染后HEK293细胞做3个生物学重复，计算出每个生物学重复的Rluc/Luc比值，再将Rluc/Luc比值代入步骤（3.4）中进行数据分析，分析实验做与对照组是否有显著差异，若实验组Rluc/Luc值显著高于阴性组Rluc/Luc值，则说明该启动子具有启动活性；
以pmirGLO载体质粒为阴性对照，将实验组的3个Rluc/Luc值与阴性组的3个Rluc/Luc值进行统计分析，分析实验组的变化，若实验组Rluc/Luc值显著高于阴性组Rluc/Luc值，则说明该启动子具有启动活性。
结果如图2所示，其中667bp、453bp的启动子片段在HEK293细胞中具有很高的转录活性，因此判定启动子的核心区在-667～-453bp。
实验结果表明当启动子截短为667bp时转录活性升高，推测在-2256bp～-667bp之间可能存在一些转录抑制因子，抑制了其转录活性。
对上述鉴定出的667bp启动子序列在“gene-regulation”网站（http://gene-regulation.com/pub/programs.html）进行转录因子结合位点分析，发现该序列上有多个SP1/SP3结合位点，如图3所示。推测哺乳动物转录因子SP1、SP3在西方蜜蜂中的同源体可能结合到蜜蜂Dnmt3基因启动子区调控其转录。
SEQUENCE LISTING
<110> 江西农业大学
<120> 一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法
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<211> 2256
<212> DNA
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<400> 1
gtgagcgaaa cggaaagaga aagacagaga gagagagaga gagagagaga gagcgttgga 60
aggaaaagac gatatcgcca tcgttgaagc tcacgcaaac acgttcctgg ccaagctcgc 120
acactgctgc tgcctgccag agactcccac cacgcgaact ttcggaaaaa tcaatagaat 180
acaagaaaag cccacgctgc gctaggcgag tgaaactctc tcgtccttct ttctcttctc 240
aaatttttcc ttccttctct cttctttcct tcctttctct ccttctattt gcgctccacc 300
acaaaacgca gtatatccta cgatcgagat aaaaaccatt ggaaaaaaaa aattggtagc 360
gaaggaagga aaagacgcgc gaactcgtgt gatcgaggca aaaatgatcg tggatcgagc 420
aacctgtccg tcagtctgca ccggctacta tccctttgaa atctcttttc ctccccaccg 480
ctcctttccc gatcccgcat tttctcgctt tcaaaaatgg aaacgaagga ctttttcaga 540
tttccgatac tcgaatacga agggaaggat aataacgtaa ttgcaatatc gcgcgaatag 600
aatagaaagg gctgaaaaag aaggtagata aactctgaaa aagcgtgtga aaaaaaaacg 660
tgttatatat tggtcgagag agcgtgggat catcatagag agtggaaatt ggtccgatga 720
aagatcgcgc gttccgtgca catttctccg atccaaacgg aatcgtagcc tatctcgtac 780
taaacggaac tgacccagct tcgtggcttt gtacccttcg ctcatccgtc tctctctctc 840
tctctctcac tctccgtctc cctgtctctc tgtcagtcgg tcgctctctc ccctctatct 900
cgctgcttct ttccatcttt gtccggtatt cctgttactt cgagtatcgc gctctgtatc 960
catcttcctc gcgcgtacgc gctctctctt tctctgtcct tcgccccttg acattctccc 1020
actggctgcg acggtggcgg cgacggcggc ggcgagacac cctcgagaag tttcaattta 1080
taccgaaagt cgtcatgacc gaatccacaa atacgttcac tcgctcgcgc tcctagtcca 1140
ttcatatcag ctgagtacgc gtaaacattg ctgtatcgtt ccttgttccg tcatctcggt 1200
acgagcggtg cttttttctt tctttctcac gattccaaat cgcaacgaat tcttcctctc 1260
gtctgcaagt gcgaaaattt agtggagcga gaaggaaaaa aaaaaagcta tcgttgtcga 1320
gatggtatcg taacggcaag tcggtcacgc gacgcgatac actctcgcgt gtacgagtat 1380
ctctttggaa aacggaaaat tttccacgag tttcgtttcc cgaaaaaaag aacgttctcg 1440
aaaaattcaa cgattcggtc ggtacgatcg catcctccca cctcgatcga tccccgtatc 1500
gatcgattcg cggaaagaag gcgagagaaa taggcgaagg agagatggaa gaaggcgagc 1560
aagcacgcgg tgcgatggac gaggagccga ccgcgagtgg acacgatccg gaggggggag 1620
ggcagaggga caataaaata agcgaatcag caggtcgttg tcgtaattct ggctacgtca 1680
ctggtactac ccctctacac tcgacggcgg agggtcgtgt accctcgcgt agaggggtat 1740
aacggcggct ggggagtgga ggggtgagag gcgcaacggg gctagctagg gaggagggac 1800
agagcgcggt ggtgagagga acgcgcggaa cgctttatga atgaatgttt ccacgccaag 1860
tgtggcgaga gagcgagaga ggcccccgtg tgtcccgcgt gtaaacacaa taataccgac 1920
gtttccattc atcaggtcga ccccggcaaa gcacgccgcg acctcgagaa atgcctttcg 1980
aggcgccacg tggatcgcat acccctccct aactctctct ctctctccct ccctctccct 2040
ttctctttct ctttttctct ctatcccttt cttttttctt ttcaaccctc ctccatcgcg 2100
gtggatttca aacgcgattt cgatcctgcc tccttctctt cgattcgccg cgcttccacc 2160
actttcttcc actttgcgca aacaacgagc gtatcgagtg tatgtgggtt ttaacgagca 2220
cgtttcaacg cgtgttgttg cagatcccag gaggaa 2256
<210> 2
<211> 950
<212> DNA
<213> 西方蜜蜂(Apismellifera)
<400> 2
gctatcgttg tcgagatggt atcgtaacgg caagtcggtc acgcgacgcg atacactctc 60
gcgtgtacga gtatctcttt ggaaaacgga aaattttcca cgagtttcgt ttcccgaaaa 120
aaagaacgtt ctcgaaaaat tcaacgattc ggtcggtacg atcgcatcct cccacctcga 180
tcgatccccg tatcgatcga ttcgcggaaa gaaggcgaga gaaataggcg aaggagagat 240
ggaagaaggc gagcaagcac gcggtgcgat ggacgaggag ccgaccgcga gtggacacga 300
tccggagggg ggagggcaga gggacaataa aataagcgaa tcagcaggtc gttgtcgtaa 360
ttctggctac gtcactggta ctacccctct acactcgacg gcggagggtc gtgtaccctc 420
gcgtagaggg gtataacggc ggctggggag tggaggggtg agaggcgcaa cggggctagc 480
tagggaggag ggacagagcg cggtggtgag aggaacgcgc ggaacgcttt atgaatgaat 540
gtttccacgc caagtgtggc gagagagcga gagaggcccc cgtgtgtccc gcgtgtaaac 600
acaataatac cgacgtttcc attcatcagg tcgaccccgg caaagcacgc cgcgacctcg 660
agaaatgcct ttcgaggcgc cacgtggatc gcatacccct ccctaactct ctctctctct 720
ccctccctct ccctttctct ttctcttttt ctctctatcc ctttcttttt tcttttcaac 780
cctcctccat cgcggtggat ttcaaacgcg atttcgatcc tgcctccttc tcttcgattc 840
gccgcgcttc caccactttc ttccactttg cgcaaacaac gagcgtatcg agtgtatgtg 900
ggttttaacg agcacgtttc aacgcgtgtt gttgcagatc ccaggaggaa 950
<210> 3
<211> 667
<212> DNA
<213> 西方蜜蜂(Apismellifera)
<400> 3
accgcgagtg gacacgatcc ggagggggga gggcagaggg acaataaaat aagcgaatca 60
gcaggtcgtt gtcgtaattc tggctacgtc actggtacta cccctctaca ctcgacggcg 120
gagggtcgtg taccctcgcg tagaggggta taacggcggc tggggagtgg aggggtgaga 180
ggcgcaacgg ggctagctag ggaggaggga cagagcgcgg tggtgagagg aacgcgcgga 240
acgctttatg aatgaatgtt tccacgccaa gtgtggcgag agagcgagag aggcccccgt 300
gtgtcccgcg tgtaaacaca ataataccga cgtttccatt catcaggtcg accccggcaa 360
agcacgccgc gacctcgaga aatgcctttc gaggcgccac gtggatcgca tacccctccc 420
taactctctc tctctctccc tccctctccc tttctctttc tctttttctc tctatccctt 480
tcttttttct tttcaaccct cctccatcgc ggtggatttc aaacgcgatt tcgatcctgc 540
ctccttctct tcgattcgcc gcgcttccac cactttcttc cactttgcgc aaacaacgag 600
cgtatcgagt gtatgtgggt tttaacgagc acgtttcaac gcgtgttgtt gcagatccca 660
ggaggaa 667
<210> 4
<211> 453
<212> DNA
<213> 西方蜜蜂(Apismellifera)
<400> 4
gcgcggtggt gagaggaacg cgcggaacgc tttatgaatg aatgtttcca cgccaagtgt 60
ggcgagagag cgagagaggc ccccgtgtgt cccgcgtgta aacacaataa taccgacgtt 120
tccattcatc aggtcgaccc cggcaaagca cgccgcgacc tcgagaaatg cctttcgagg 180
cgccacgtgg atcgcatacc cctccctaac tctctctctc tctccctccc tctccctttc 240
tctttctctt tttctctcta tccctttctt ttttcttttc aaccctcctc catcgcggtg 300
gatttcaaac gcgatttcga tcctgcctcc ttctcttcga ttcgccgcgc ttccaccact 360
ttcttccact ttgcgcaaac aacgagcgta tcgagtgtat gtgggtttta acgagcacgt 420
ttcaacgcgt gttgttgcag atcccaggag gaa 453
<210> 5
<211> 246
<212> DNA
<213> 西方蜜蜂(Apismellifera)
<400> 5
aactctctct ctctctccct ccctctccct ttctctttct ctttttctct ctatcccttt 60
cttttttctt ttcaaccctc ctccatcgcg gtggatttca aacgcgattt cgatcctgcc 120
tccttctctt cgattcgccg cgcttccacc actttcttcc actttgcgca aacaacgagc 180
gtatcgagtg tatgtgggtt ttaacgagca cgtttcaacg cgtgttgttg cagatcccag 240
gaggaa 246
<210> 6
<211> 143
<212> DNA
<213> 西方蜜蜂(Apismellifera)
<400> 6
gcgatttcga tcctgcctcc ttctcttcga ttcgccgcgc ttccaccact ttcttccact 60
ttgcgcaaac aacgagcgta tcgagtgtat gtgggtttta acgagcacgt ttcaacgcgt 120
gttgttgcag atcccaggag gaa 143

Claims (8)

1.一种利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，包括以下步骤：
（1）载体构建
（1.1）从NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载预测的西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1和西方蜜蜂基因组序列，利用Bioedit软件从西方蜜蜂Dnmt3基因mRNA序列NM_001190421.1中找出西方蜜蜂Dnmt3基因编码区序列；
将西方蜜蜂Dnmt3基因编码区序列与西方蜜蜂基因组序列进行比对，确定西方蜜蜂Dnmt3基因翻译起始密码子“ATG”在西方蜜蜂基因组序列上的具体位置；
再在西方蜜蜂基因组序列上选取西方蜜蜂Dnmt3基因翻译起始密码子“ATG”之前2256bp的片段作为启动子区域片段，并进一步将启动子区域片段依次截短成950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段；
将上述启动子片段用EcoRI、NotI进行双酶切，酶切后启动子片段的两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
（1.2）制备酶切后的双荧光素酶报告基因检测载体质粒，
将双荧光素酶报告基因检测载体质粒用EcoRI、NotI进行双酶切，酶切后双荧光素酶报告基因检测载体质粒的两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
（1.3）将步骤（1.1）获得的酶切后启动子片段与步骤（1.2）获得的酶切后双荧光素酶报告基因检测载体质粒进行连接；
（1.4）筛选重组子，其步骤包括，
（1.4.1）取连接产物直接转化JM109感受态细胞，向转化后的JM109感受态细胞中加入1ml的LB培养基，随后置于恒温摇床中于37°C下200转/分钟摇菌1小时；
然后取200µl转化后的JM109感受态细胞涂在含有氨苄青霉素的培养平板上，将平板置于恒温培养箱中于37°C过夜培养；
（1.4.2）从培养平板上随机挑取菌落于5ml的LB培养基中，37°C下250转/分钟摇菌14小时，用菌液进行PCR鉴定，取阳性克隆菌液测序；
（1.4.3）经过测序验证后，使用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆重组子，以备转染；
（1.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段进行步骤（1.3）-步骤（1.4）操作，获得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子；
（2）细胞转染
用于转染的细胞系所使用DNA与lip2000的比值为1µg：2～3µl；
（2.1）转染前24小时，将用于转染的细胞系接种至每孔含有500µl不含抗生素的培养基的24孔细胞培养板中，在转染时用于转染的细胞系可长至90-95%融合；
（2.2）转染液制备，每孔细胞用量如下：
（2.2.1）用50µl的Opti-ME I低血清培养基稀释所述步骤（1.5）获得的阳性克隆重组子，轻轻混匀；
（2.2.2）轻轻摇匀lip2000，之后分别取3µl的lip2000在50µl的Opti-ME I培养基中稀释，室温孵育5分钟；
（2.2.3）将前两步所稀释的阳性克隆重组子和lip2000轻轻混匀，室温放置20分钟，获得转染液；
（2.3）在步骤（2.1）所述24孔细胞培养板的每孔细胞中加入100µl步骤（2.2）制备的转染液，轻轻摇匀，进行细胞转染；
（2.4）孵箱中37°C下培养18-48小时后检测基因表达，获得转染后细胞系；
（2.5）依次取2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子进行步骤（2.2）-步骤（2.4）操作，获得2256bp、950bp、667bp、453bp、246bp和143bp的启动子片段的阳性克隆重组子转染的转染后细胞系；
（3）双荧光素酶检测
（3.1）试剂准备
按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒E1910说明书配制PLB细胞裂解液、LAR II检测液、Stop&Glo检测液；
（3.2）样品准备
按照双荧光素酶报告基因检测试剂盒E1910说明书使用PLB细胞裂解液裂解步骤（2）获得的转染后细胞系，取20µl裂解后的细胞系裂解液；
（3.3）检测过程
（3.3.1）取20µl步骤（3.2）获得的裂解后的细胞系裂解液置于1.5ml离心管中，然后加入100µl的LARII检测液，混合后放入Biotek Synergy2酶标仪检测第一次发光值；
（3.3.2）再加入Stop&Glo检测液，终止第一次发光，同时开始第二次发光，混合后放入Biotek Synergy2酶标仪检测第二次发光值；
（3.4）数据分析
以萤火虫荧光素酶基因Luc作为内参基因，将24孔细胞培养板的各孔Rluc的荧光值与Luc的荧光值进行比较，得到Rluc/Luc比值；
以双荧光素酶报告基因检测载体质粒为阴性对照，将实验组的Rluc/Luc值与阴性组的Rluc/Luc值进行统计分析，分析实验组的变化，若实验组Rluc/Luc值显著高于阴性组Rluc/ Luc值，则说明该启动子具有启动活性。
2.如权利要求1所述利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，其特征在于，步骤（1.1）中，将所述截短的片段用EcoRI、NotI进行酶切，使得截短的片段两端带有EcoRI和NotI酶切位点；
酶切体系（40µl）如下：
DNA：2μ1；
EcoRI：1μ1；
NotI：1μ1；
10×buffer：4μ1；
H2O：32μ1；
在37℃酶切2小时，酶切完成后用胶回收试剂盒进行回收；
步骤（1.2）的酶切方法和酶切体系同上。
3.如权利要求1所述利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，其特征在于，步骤（1.2）中，所述双荧光素酶报告基因检测载体质粒的增殖方法，其步骤包括，
将保存于-80℃的双荧光素酶报告基因检测载体质粒转化到100μ1的JM109感受态细胞中；
将100μ1转化后的JM109感受态细胞接种在含有Amp的固体培养基平板上，37℃培养过夜；
挑选单菌落于3m1的LB培养基中，振荡培养过夜；
用碱裂解法制备双荧光素酶报告基因检测载体质粒。
4.如权利要求1所述利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，其特征在于，步骤（1.3）中，连接反应体系（20µl）如下：
酶切后启动子片段：2µl；
酶切后双荧光素酶报告基因检测载体质粒：100-200ng；
ligase buffer：2µl；
T4 ligase：1µl；
H2O：10-13µl
以上连接液在16°C过夜连接。
5.如权利要求1所述利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，其特征在于，步骤（2）所述用于转染的细胞系为HEK293细胞。
6.如权利要求1所述利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，其特征在于，步骤（2）所述用于转染的细胞系的密度为60%-70%时进行转染。
7.如权利要求1所述利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，其特征在于，步骤（3.4）所述双荧光素酶报告基因检测载体质粒为pmirGLO载体质粒。
8.如权利要求1所述利用双荧光素酶报告基因检测西方蜜蜂Dnmt3基因启动子活性的方法，其特征在于，步骤（3.4）中，每个转染后细胞系做至少3个生物学重复，计算出每个生物学重复的Rluc/Luc比值，再将Rluc/Luc比值代入步骤（3.4）中进行数据分析。
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