CN114517198B - 一种半滑舌鳎miRNA及其在调控tgfb2基因表达中的应用 - Google Patents

一种半滑舌鳎miRNA及其在调控tgfb2基因表达中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种半滑舌鳎miRNA及其在调控tgfb2基因表达中的应用，属于分子生物学和基因工程技术领域，所述miRNA的名称为novel‑m0083‑3p，其序列如SEQ ID NO.1，其对应靶基因为半滑舌鳎tgfb2。本发明还提供所述半滑舌鳎miRNA在调控半滑舌鳎tgfb2基因表达的中的应用。本发明发现了调控半滑舌鳎tgfb2基因的miRNA，利用所述的miRNA能够调控tgfb2基因在半滑舌鳎体内的表达，从而调节半滑舌鳎的生长。

Description

一种半滑舌鳎miRNA及其在调控tgfb2基因表达中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学和基因工程技术领域，具体而言，涉及一种半滑舌鳎miRNA及其在调控tgfb2基因表达中的应用。
背景技术
半滑舌鳎tgfb2基因编码转化生长因子(Transforming growth factor-β-2,TGFB2)，TGFB2隶属于转化生长因子家族(Transforming growth factor-βfamily,TGFB)，是细胞外基质中生理和病理胶原合成和沉积的重要调节因子。TGFB由大量结构相关的胞外多肽生长因子组成，可调节多种生物过程。在肿瘤转移的初始阶段，上皮来源的癌细胞通过上皮间质转化获得间充质表型，形成转移集落，而TGFB家族被认为在上皮间质转化过程中起到重要作用，因此在临床医学尤其是肿瘤医学中，对TGFB的研究颇为重要。TGFB2与多种祖细胞类型的侵袭性和合成肌成纤维细胞的分化以及纤维化固有的转录程序的启动和维持有关，在哺乳动物、两栖动物，以及鱼类的细胞生长发育、软组织修复、骨重塑、炎症等生物学过程中，TGFB2均被报道在其中有显著性作用。因此在发育生物学领域，TGFB2及其家族有着重要的研究意义。
微小核糖核酸(Micro RNA,miRNA)是一类内源性的单链非编码RNA(Non-codingRNA,ncRNA)，一般由20-24个核苷酸组成，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过内切酶剪切加工后生成，在细胞内具有多种重要的调节作用。不同于双链的小干扰核糖核酸(Small interfering RNA,siRNA)，miRNA也参与调控基因表达，但区别于siRNA介导的mRNA降解机制，miRNA通过抑制mRNA的3’UTR参与细胞发育、转录、翻译、疾病发生等生物学过程来调控基因的转录。据报道，每个miRNA可以抑制多达数百个基因，而多个miRNA也可以调节同一个基因。据推测，在人和哺乳动物中，有三分之一的基因都受到miRNA的调控，且百分之七十的miRNA位于内含子区，在不同的物种中具有高度保守性，miRNA这种高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。综上所述，对miRNA及其靶基因以及其调控机制进行研究，对于进一步了解生物内源性调控代谢机制有着重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供一种半滑舌鳎miRNA及其在调控tgfb2基因表达中的应用。
本发明是通过如下技术方案来实现的：
一种半滑舌鳎miRNA，所述miRNA的名称为novel-m0083-3p，其序列如SEQ IDNO.1，其对应靶基因为半滑舌鳎tgfb2。
本发明还提供所述半滑舌鳎miRNA在调控半滑舌鳎tgfb2基因表达的中的应用。
本发明与现有技术相比的有益效果：
本发明发现了调控tgfb2基因的miRNA，利用所述的miRNA能够调控tgfb2基因在半滑舌鳎体内的表达，从而调节半滑舌鳎的生长。
附图说明
图1为pMir-Glo载体的结构示意图。
图2为半滑舌鳎tgfb2基因双荧光素酶报告基因载体测序图。
图3为突变型半滑舌鳎tgfb2基因双荧光素酶报告基因载体测序图。
图4为重组载体转染48h后双荧光素酶实验结果图。
具体实施方案
下面将结合具体操作方法对本发明的实施方案进行详细描述，下列实施方案仅适用于本发明。实施方案中未注明的具体实验条件，按照常规条件或制造商说明书中建议的条件进行。
实施例1
miRNA的发现过程：选取半滑舌鳎1.5龄雌鱼、雄鱼及伪雄鱼的脑、肝脏、性腺和肌肉组织，利用trizol提取总RNA后，根据miRNAcDNA合成试剂盒说明书构建cDNA文库，高通量测序后利用mirdeep2和miREvo软件预测新miRNA。其中novel-m0083-3p是其中新发现的miRNA之一。序列如SEQ ID NO.1。具体为：uuuucugacuauaaacugacc。
实施例2
本实施例提供了一种半滑舌鳎tgfb2基因双荧光素酶报告基因载体，包含双荧光素酶报告基因载体和tgfb2基因的3’UTR区核苷酸序列片段。
在本实施例中，pMir-Glo载体被用于双荧光素酶报告基因载体的构建。
在本实施例中，tgfb2基因的3’UTR区被成功克隆，并通过双酶切后连接的方式插入到双荧光素酶报告基因载体中。
在本实施例中，利用PCR扩增得到所述tgfb2基因的3’UTR区(序列：acaggtgaacttaacagccgttgtcgcagatctctgtgctcaatattgacttgataaaagacatgggagaccctgtcctaccgcatgctattgatggaaaaagacaaagaggtattaaaaggtgtcagaaaaaaagatccatgtttactgactgacaattcattttagttaagttgacatcaagagtctcaactgtgtaggatgaaataacatgttagtggtgattatgttctgttcgga)(加粗部分为novel-m0083-3p的靶向区域)，长度240bp，带有XhoI和SalI两种限制性内切酶酶切位点的PCR扩增正反引物如下：
tgfb2-3’UTR-F:5’-ACGCTCGAGACAGGTGAACTTAACAGCCG-3’；
tgfb2-3’UTR-R:5’-ACGGTCGACTCCGAACAGAACATAATCACC-3’；
上述引物由北京睿博兴科生物技术有限公司合成。
PCR扩增反应体系如下：
Figure BDA0003538244070000041
反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s，共40个循环；后72℃延伸7min；最后4℃保存。
PCR反应完吸取7μl PCR产物进行1％琼脂糖电泳分析，成功PCR扩增得到带有XhoI和SalI限制性内切酶酶切位点的半滑舌鳎tgfb2基因的3’UTR区片段。
之后，对验证正确的PCR产物进行纯化后回收，用两种内切酶对上述PCR产物以及pMir-Glo载体进行双酶切，酶切反应体系如下：
Figure BDA0003538244070000042
反应程序：37℃双酶切3h，后加入6μL 10×的loading dye使得酶切反应停止，随后利用液体回收试剂盒进行纯化回收。
将双酶切之后的pMir-Glo载体和目标片段DNA进行连接反应，总体系为10μl，反应体系如下：DNA目的片段50ng；载体50ng，10×DNAligaseBuffer1μl；无菌无酶水补足10μl；
反应程序：室温下(25℃)连接15min。
连接反应结束后转入感受态细胞，37℃恒温摇床中150转摇1h后涂板进行阳性单克隆挑选，后进行菌液PCR验证，然后将阳性单克隆进行测序验证，结果如图2所示，结果表明成功构建tgfb2-WT重组载体。
在本实验方案中，同样利用PCR扩增针对novel-m0083-3p突变体DNA片段，突变引物序列如下：
tgfb2-0083-MU-F:5’-AAGAGGTATTAAAAGGTTGACACCCAAAAGATCCATGTTTACT-3’；
tgfb2-0083-MU-F:5’-AGTAAACATGGATCTTTTGGGTGTCAACCTTTTAATACCTCTT-3’；
本实施例使用天根的Fast Site-Directed Mutagenesis Kit快速定点突变试剂盒(目录号：KM101)设计上述突变引物，并进行针对miRNA novel-m0083-3p的突变载体构建。按照上述tgfb2-WT重组载体的构建方法，成功构建了突变型重组载体tgfb2-0083-MU，并用于后续miRNA:novel-m0083-3p的检测，具体测序结果如图3所示。
进行细胞转染
本实施例转染的细胞为HEK 293T细胞，按照细胞培养的常规条件，37℃恒温，5％的CO2浓度，在24孔板中培养24h后开始进行转染。
本方案共设置4个转染组：①共转染tgfb2-WT重组载体和miRNA novel-m0083-3p；②共转染tgfb2-WT重组载体和NC(阴性对照)；③共转染突变型重组载体tgfb2-0083-MU和miRNA novel-m0083-3p；④共转染突变型重组载体tgfb2-0083-MU和NC(阴性对照)。
DMEM培养基添加10％FBS用以配置293T细胞培养液。分别将①②③④通过碧云天公司Lipo 8000TM转染试剂在24孔板中以500ng质粒+2μl miRNA(20μM)/孔转染到HEK 293T细胞中，其中Lipo 8000TM转染试剂每孔1μl，用细胞培养液补充到每孔25μl，每个转染组设置3-4个平行重复。在转染后培养6小时后更换为新鲜的细胞培养液，48小时后，进行荧光素酶活性测定与生物统计学分析。
进行荧光素酶活性测定与生物统计学分析
双荧光素酶检测使用碧云天(Beyotime)双荧光素酶报告基因检测试剂盒(RG027)。将报告基因细胞裂解液充分混匀后，吸出原有培养液，按照每孔200μl加入报告基因细胞裂解液，充分裂解后，12000g离心5分钟，取上清用于测定。按照每个样品需100μl的量，取适量海肾萤光素酶检测缓冲液，按照1:100加入海肾萤光素酶检测底物(100×)配制成海肾萤光素酶检测工作液。使用Thermo公司的Varioskan Flash全波长多功能酶标仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。加入100μl萤火虫萤光素酶检测试剂，混合均匀后测定荧光值；在完成上述测定萤火虫萤光素酶步骤后，加入100μl海肾萤光素酶检测工作液，混合均匀后测定荧光值后计算二者的比值(Firefly/Renilla)。
所有数据以平均值±标准差表示，统计分析采用SPSS17.0软件。结果如图4显示，共转染tgfb2-WT重组载体和novel-m0083-3p的第一组相较于第二组miRNA negativecontrol(NC)，荧光素酶活性降低81％左右(P<0.001)，在统计学上具有显著差异(***表示)；而共转染突变型重组载体tgfb2-0083-MU和novel-m0083-3p的第三组，以及共转染突变型重组载体tgfb2-0083-MU和miRNA NC的第四组，与第二组相比，荧光素酶活性均无显著差异(P>0.05)。
上述结果表明，novel-m0083-3p可以抑制tgfb2-WT荧光素酶报告载体的活性，而当tgfb2-WT中3’UTR中的结合位点突变为tgfb2-0083-MU之后，novel-m0083-3p对tgfb2-0083-MU荧光素酶报告载体活性的抑制作用便消失，说明这一抑制作用主要是因为novel-m0083-3p与tgfb2-3’UTR的靶向结合而产生；进一步验证了tgfb2是novel-m0083-3p的靶基因。
在本专利中已采用具体实验方案说明和描述了发明内容，考虑到实验中具有特殊情况，因此在不违背本发明的原始目的和适用范围的情况下可以允许有其它的修订和更改。这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有修订。
序列表
<110> 中国水产科学研究院黄海水产研究所
<120> 一种半滑舌鳎miRNA及其在调控tgfb2基因表达中的应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)
<400> 2
uuuucugacu auaaacugac c 21
<210> 2
<211> 240
<212> DNA
<213> 半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)
<400> 2
acaggtgaac ttaacagccg ttgtcgcaga tctctgtgct caatattgac ttgataaaag 60
acatgggaga ccctgtccta ccgcatgcta ttgatggaaa aagacaaaga ggtattaaaa 120
ggtgtcagaa aaaaagatcc atgtttactg actgacaatt cattttagtt aagttgacat 180
caagagtctc aactgtgtag gatgaaataa catgttagtg gtgattatgt tctgttcgga 240
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgctcgaga caggtgaact taacagccg 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acggtcgact ccgaacagaa cataatcacc 30
<210> 5
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
aagaggtatt aaaaggttga cacccaaaag atccatgttt act 43
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
agtaaacatg gatcttttgg gtgtcaacct tttaatacct ctt 43

Claims (2)

1.一种半滑舌鳎miRNA，其特征在于所述miRNA的名称为novel-m0083-3p，其序列如SEQID NO.1所示，其对应靶基因为半滑舌鳎tgfb2。
2.权利要求1所述半滑舌鳎miRNA在调控半滑舌鳎tgfb2基因表达的中的应用。
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