CN115094058A - 一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用 - Google Patents

一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN115094058A
CN115094058A CN202210655002.9A CN202210655002A CN115094058A CN 115094058 A CN115094058 A CN 115094058A CN 202210655002 A CN202210655002 A CN 202210655002A CN 115094058 A CN115094058 A CN 115094058A
Authority
CN
China
Prior art keywords
norfa
lncrna
seq
gene
apoptosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210655002.9A
Other languages
English (en)
Inventor
杜星
李齐发
李琦琦
潘增祥
杨柳
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Agricultural University
Original Assignee
Nanjing Agricultural University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Agricultural University filed Critical Nanjing Agricultural University
Priority to CN202210655002.9A priority Critical patent/CN115094058A/zh
Publication of CN115094058A publication Critical patent/CN115094058A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1138—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against receptors or cell surface proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用，属于lncRNA的功能探究技术研发领域，公开了所述lncRNA NORFA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；所述lncRNA NORFA在猪健康卵泡中的表达水平显著高于闭锁卵泡；在体外培养的猪卵巢颗粒细胞中过表达lncRNA NORFA可显著抑制细胞凋亡水平，而敲减内源性lncRNA NORFA则出现相反结果；所述lncRNA NORFA的靶基因为TGFBR2基因，两者均具有抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的能力，本发明提供的lncRNA NORFA为抑制卵泡闭锁、提高母猪繁殖力提供技术支持，同时对养猪业的实际生产具有重要经济价值。

Description

一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学中lncRNA功能探究技术研发领域，涉及一种抑制猪卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用。
背景技术
众所周知，卵泡的正常发育和排卵对于维持雌性哺乳动物繁殖过程至关重要，而卵泡闭锁作为雌性哺乳动物卵巢组织中一种普遍的生理现象，不仅降低了原始卵泡库的利用率，造成生物资源的浪费，同时严重制约了雌性哺乳动物繁殖力的发挥。因此，探究卵泡闭锁的分子机制对于减少卵泡闭锁、提高排卵率以及维持雌性动物正常的繁殖过程具有重大意义。目前，研究发现颗粒细胞凋亡或程序性死亡是雌性哺乳动物卵泡闭锁的主要诱因，而前者主要受到一个由体内、外多因素组成的复杂网络调控。近期，相关研究表明长链非编码RNAs(Long non-coding RNAs,lncRNAs)作为一类重要的表观遗传因子在上述过程中发挥重要作用。
LncRNAs是一类长度大于200nt、缺乏开放阅读框或编码蛋白能力的内源性RNA分子。特征分析发现lncRNAs的表达丰度较低、进化保守性与稳定性较差、且具有严格的组织表达模式，上述特点也成为了lncRNAs研究过程中的难点。根据目前已发表的高通量测序研究表明lncRNAs在卵巢组织中广泛表达，然而仅有极少数的lncRNAs经过系统的研究并具有完备的功能注释。近年来，相关研究鉴定了若干与雌性哺乳动物繁殖过程相关的lncRNAs，例如lncRNA Neat1和lncRNA H19与雌性小鼠黄体形成息息相关，敲除上述两个lncRNAs均可导致黄体缺失、孕酮合成异常、卵巢缺陷，最终导致雌性小鼠不孕不育；另外，linc-01572:28与lncRNA MALAT1被证实可分别通过KIP1与ERK/MAPK轴调控人和小鼠卵巢颗粒细胞增殖水平。上述研究表明lncRNAs在雌性卵巢组织中发挥重要作用，但目前lncRNAs对雌性哺乳动物卵巢功能和繁殖过程的影响程度尚不清楚，尤其是对猪等大型家畜卵泡发育、卵巢颗粒细胞状态与功能的调控及机制有待进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抑制猪卵泡闭锁与卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用；本发明提供的lncRNA NORFA的表达水平在猪卵泡闭锁过程中显著下调，lncRNANORFA具有抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡，促进卵母细胞体外培养成熟的功能。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
本发明提供了一种抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA NORFA核苷酸全序列，序列长度为739nt，如SEQ ID No.1所示。
本发明提供了扩增所述抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA NORFA的引物对，包括核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的反向引物。
本发明提供了所述的lncRNA NORFA在抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡中的应用，通过在猪卵巢颗粒细胞中敲入或过表达所述lncRNA NORFA，提高抗卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的能力。
本发明提供了所述lncRNA NORFA的靶基因在抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡中的应用，通过在猪卵巢颗粒细胞中敲入或过表达所述lncRNA NORFA的靶基因，提高抗卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的能力。
所述的靶基因为TGFBR2基因，该TGFBR2基因的序列号为ENSSSCG00025024102。
扩增所述TGFBR2基因的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的反向引物。
本发明提供了所述的lncRNA NORFA在促进体外培养猪卵母细胞成熟能力中的应用，过表达所述的lncRNA NORFA能够提高猪卵丘-卵母细胞复合体在体外培养过程中卵母细胞的成熟率。
本发明提供了所述lncRNA NORFA的靶基因在促进体外培养猪卵母细胞成熟能力中的应用，过表达所述lncRNA NORFA的靶基因能够提高猪卵丘-卵母细胞复合体在体外培养过程中卵母细胞的成熟率。
优选的，所述应用通过提高猪卵巢颗粒细胞中所述TGFBR2基因的表达水平实现。
本发明的有益效果：
本发明提供了一种能够抑制猪卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用；本发明提供的lncRNA NORFA的表达水平在猪卵泡闭锁过程中显著下调，lncRNA NORFA及其靶基因TGFBR2具有抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡，促进卵母细胞体外培养成熟能力的功能，为促进卵泡发育和提高母猪繁殖力提供技术支持。
附图说明
图1为利用RACE技术扩增获取猪lncRNA NORFA末端序列；
其中，A为猪lncRNA NORFA 5’末端扩增产物电泳鉴定结果；B为猪lncRNA NORFA3’末端扩增产物电泳鉴定结果。
图2为lncRNA NORFA在母猪健康与闭锁卵泡中的表达水平比较。
图3为lncRNA NORFA和靶基因在猪卵泡中表达水平的相关性。
图4为lncRNA NORFA对猪卵巢颗粒细胞中靶基因表达水平的影响；
其中，A为过表达lncRNA NORFA对靶基因TGFBR2表达水平的影响；B为敲低内源性lncRNA NORFA对靶基因TGFBR2表达水平的影响。
图5为过表达lncRNA NORFA对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响；
其中，A为过表达lncRNA NORFA对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响；B为敲低内源性lncRNA NORFA对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响。
图6为lncRNA NORFA靶基因TGFBR2对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响；
其中，A为过表达靶基因TGFBR2对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响；B为敲低内源性靶基因TGFBR2对猪卵巢颗粒细胞凋亡水平的影响。
图7为过表达lncRNA NORFA后猪体外培养卵母细胞的成熟率。
图8为过表达靶基因TGFBR2后猪体外培养卵母细胞的成熟率。
图9为干扰靶基因TGFBR2对lncRNA NORFA抗颗粒细胞凋亡和促卵母细胞成熟功能的影响；
其中，A为敲低靶基因TGFBR2对lncRNA NORFA抗颗粒细胞凋亡能力的影响；B为敲低靶基因TGFBR2对lncRNA NORFA促卵母细胞体外成熟能力的影响。
具体实施方式
本发明提供了一种抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA，同时提供所述lncRNA及其靶基因TGFBR2在抗卵巢颗粒细胞凋亡、促体外培养卵母细胞成熟以及提高母猪繁殖力等能力中的应用。在本发明中，所述应用优选的通过促进猪卵巢颗粒细胞中所述TGFBR2基因的表达水平实现。
下面结合实例，进一步对本发明进行详细说明。
实施例1
1、实验材料
在江苏省某保种场核心群中随机选取100头健康大白母猪(180日龄，110kg体重)用于采集新鲜卵巢，分离卵泡用于提取卵泡总RNA，同时用于猪健康卵巢颗粒细胞的分离与体外培养试验。
2、猪卵泡总RNA提取与反转录
根据卵泡外观(颜色和血管分布)、游离颗粒细胞数量以及卵泡液中E2/P4(雌二醇/孕酮)指数分离健康和闭锁卵泡，随后采用Trizol试剂(Invitrogen公司)提取并纯化猪卵泡总RNA，采用反转录试剂盒(Vazyme公司)以上述卵泡总RNA为模版合成双链cDNA，置于-20℃保存。
3、猪lncRNA NORFA核苷酸序列鉴定
采用快速扩增cDNA末端(RACE)技术鉴定猪lncRNA NORFA的核苷酸全序列，具体操作步骤按照
Figure BDA0003689069150000041
5’/3’试剂盒(TaKaRa公司)提供的说明书进行。简要过程如下：①以上述猪卵泡总RNA为模版制备RACE-first-Ready cDNA，根据猪lncRNA NORFA的部分序列特征设计基因特异性扩增引物(5’-GSP和3’-GSP)进行PCR扩增。引物序列分别为，5’-GSP：5’-GCT TCA CCT GCA GCA CTG CAC CC-3’,3’-GSP：5’-TCT GTG GGC GCC TGC ATC AG-3’。PCR反应程序为：95℃30sec，72℃3min(5循环)；95℃30sec，70℃30sec，72℃3min(5循环)；95℃30sec，68℃30sec，72℃3min(30循环)。PCR产物在2.0％的琼脂糖凝胶中以120V电压下电泳20min(附图1)，确定目标片段后进行DNA回收纯化(TingKe公司)，将其连接在pMD-19T载体(TingKe公司)上，随后经过转化、涂板、挑取单克隆送上海生工公司测序。测序结果使用DNAStar软件进行序列比对和分析。
4、引物设计与载体构建
根据RACE获得的猪lncRNA NORFA核苷酸全序列(如SEQ ID No.1所示)，利用Primer5.0软件设计1对正反向引物扩增所述基因的全序列，正向引物序列为5’-CAT CAGCCT CCC TGC CTC-3’(SEQ ID No.2)，反向引物序列为5’-ACA CAA GCT CCA TGA ACT TGGA-3’(SEQ ID No.3)；另外，根据靶基因TGFBR2基因组序列(GenBank ID:XM_021071493.1)，利用Primer5.0软件设计1对正反向引物扩增猪TGFBR2基因的全序列，正向引物序列为5’-ACA TCT GGC CGC ACC GCT-3’(SEQ ID No.4)，反向引物序列为5’-GTG CTA ACA CAG CTTATC CTA TG-3’(SEQ ID No.5)。引物有上海生工生物科技有限公司合成。
以猪卵巢组织cDNA为模版，利用上述引物进行PCR扩增，PCR扩增程序为98℃3min，98℃30sec，60℃30sec，72℃1min(33循环)；72℃5min。PCR产物在2.0％的琼脂糖凝胶中以120V电压下电泳20min，确定目标片段后进行DNA回收纯化，将其连接在真核生物表达载体pcDNA3.1-Basic(TingKe公司)上，随后经过转化、涂板、挑取单克隆送上海生工公司测序。测序结果使用DNAStar软件进行序列比对和分析，阳性重组质粒分别命名为pcDNA3.1-NORFA和pcDNA3.1-TGFBR2。
5、卵巢颗粒细胞与卵丘-卵母细胞复合体体外培养与处理
猪卵巢颗粒细胞与卵丘-卵母细胞复合体的体外培养方法参考文献(①Du X.,LiuL.,Li Q.Q.,Zhang L.F.,Pan Z.X.,Li Q.F.,NORFA,long intergenic noncoding RNA,maintains sow fertility by inhibiting granulosa cell death.Commun Biol 2020,3(1):131.②Pan B.,Li J.L.,MicroRNA-21up-regulates metalloprotease by down-regulating TIMP3 during cumulus cell-oocyte complex in vitro maturation.MolCell Endocrinol2018,477:29-38.)进行。采用lipofectamine3000转染试剂(Invitrogen)对重组质粒和靶向lncRNA NORFA与其基因TGFBR2的siRNA对(吉玛公司)进行瞬时转染，具体过程按照说明书进行。
6、荧光定量PCR与Pearson相关性分析
转染48h后收集卵巢颗粒细胞，提取细胞总RNA并制备cDNA，方法同上“猪卵泡总RNA提取与反转录”部分一致，采用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒(Vazyme公司)进行lncRNA NORFA和靶基因的荧光定量PCR检测，具体方法按照提供的说明书进行。以GAPDH为内参基因，采用2-□□Ct法计算目的基因的相对表达水平。根据基因序列设计3对的定量引物。LncRNA NORFA正向定量引物为5’-AGG AAC CTG CGT GGG AAT C-3’(SEQ IDNo.6)，反向定量引物为5’-CCG ATC TCC CAG CAT GAA A-3’(SEQ ID No.7)；TGFBR2基因正向定量引物为5’-GTG CCC AAG CAG GTC ATT CA-3’(SEQ ID No.8)，反向定量引物为5’-CTC CTC AGG GCT TCG GTC A-3’(SEQ ID No.9)；GAPDH基因正向定量引物为5’-GAT GGTGAA GGT CGG AGT G-3’(SEQ ID No.10)，反向定量引物为5’-CGA AGT TGT CAT GGA TGACC-3’(SEQ ID No.11)。采用荧光定量PCR方法检测lncRNA NORFA在健康和闭锁卵泡中的表达水平进行检测，结果发现LncRNA NORFA在健康卵泡中的表达水平显著高于闭锁卵泡(P<0.01)(附图2)。利用Pearson相关性分析鉴定lncRNA NORFA与其靶基因TGFBR2在卵泡中表达水平的相关性，结果发现两者呈显著正相关(P<0.01，R＝0.85)(附图3)。进一步通过荧光定量PCR分析发现过表达lncRNA NORFA可显著促进靶基因TGFBR2 mRNA水平(P<0.01)，而敲低lncRNA NORFA则出现相反的结果(P<0.01)(附图4)。
7、细胞凋亡与卵母细胞体外成熟率分析
将靶向lncRNA NORFA的1对siRNA(干扰组，干扰效率58％；正向序列为5’-AGG AACCTG CGT GGG AAT C-3’，SEQ ID No.12；反向序列为5’-CCG ATC TCC CAG CAT GAA A-3’，SEQ ID No.13)、靶向TGFBR2基因的1对siRNA(干扰组，干扰效率58％；正向序列为5’-GCCAAC AAC AUC AAC CAC ATT-3’，SEQ ID No.14；反向序列为5’-UGU GGU UGA UGU UGU UGGCTT-3’，SEQ ID No.15)和NC-siRNA(正向序列为5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’，SEQ ID No.16；反向序列为5’-ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT-3’，SEQ ID No.17)分别瞬时转染进入体外培养的卵巢颗粒细胞，继续培养48h后收集颗粒细胞并采用Annexin V-FITC/PI试剂盒(Vazyme公司)对体外培养的猪卵巢颗粒细胞凋亡水平进行检测，结果发现过表达lncRNA NORFA可显著降低体外培养的猪卵巢颗粒细胞凋亡率(P<0.01)，而敲低lncRNA NORFA则出现相反的结果(P<0.01)(附图5)；过表达TGFBR2可显著降低体外培养的猪卵巢颗粒细胞凋亡率(P<0.05)，而敲低TGFBR2则出现相反的结果(P<0.01)(附图6)。
以第一极体排出率为标准检测lncRNA NORFA及其靶基因对体外培养卵丘-卵母细胞复合体中卵母细胞成熟率的影响，结果发现过表达lncRNA NORFA可显著提高猪卵母细胞体外成熟率，而敲低lncRNA NORFA则出现相反的结果(P<0.01)(附图7)；过表达TGFBR2可显著提高猪卵母细胞体外成熟率，而敲低TGFBR2则出现相反的结果(P<0.01)(附图8)。另外，结果还发现敲低TGFBR2可显著抑制lncRNA NORFA的抗卵巢颗粒细胞凋亡和促卵母细胞体外培养成熟率的功效(P<0.01)(附图9)。
卵巢颗粒细胞凋亡介导的卵泡闭锁是母猪繁殖力的主要抑制因素之一。本发明所述lncRNA NORFA及其靶基因TGFBR2具有抑制猪卵泡闭锁、卵巢颗粒细胞凋亡和促进体外培养卵母细胞成熟的能力，对促进猪卵泡发育、提高母猪群体的繁殖力具有重要的经济价值，对相关技术和产品的研发提供了一定的理论依据。以上所述仅是本发明的优选实施方案，应当指出在不脱离本发明原理的前提下，本领域技术人员可适当做出改进和调整，但相关调整应视为本发明的保护范围。
序列表
SEQ ID No.1
Figure BDA0003689069150000071
SEQ ID No.2
catcagcctc cctgcctc
SEQ ID No.3
acacaagctc catgaacttg ga
SEQ ID No.4
acatctggcc gcaccgct
SEQ ID No.5
gtgctaacac agcttatcct atg
SEQ ID No.6
aggaacctgcgtgggaatc
SEQ ID No.7
ccgatctccc agcatgaaa
SEQ ID No.8
gtgcccaagc aggtcattca
SEQ ID No.9
ctcctcaggg cttcggtca
SEQ ID No.10
gatggtgaag gtcggagtg
SEQ ID No.11
cgaagttgtc atggatgacc
SEQ ID No.12
cagacagaug uggaugaaut t
SEQ ID No.13
auucauccac aucugucugt t
SEQ ID No.14
gccaacaaca ucaaccacat t
SEQ ID No.15
ugugguugau guuguuggct t
SEQ ID No.16
uucuccgaac gugucacgut t
SEQ ID No.17
acgugacacg uucggagaat t
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 739
<212> DNA
<213> 大白猪(Large White Pig)
<400> 1
catcagcctc cctgcctcct ggcccgtgtg ctggtctccc aaaggcctga ggaaggaacc 60
tgcgtgggaa tcccctgagt tgccctgcaa ccagtgagtc atccttttcc agcccgccag 120
gacggaggtg tcaccctgct gagctggcgg ccgggtggcc actcttcagt cagcagccct 180
tccttgccaa gctccctgtc cccagcgctc cgcccccaaa atgtgtgcat gacaatcctc 240
tgaaagcggc agtccctaac gcgagagcgt tttcatgctg ggagatcggc aggtacttcc 300
aggctggatc agccccagca gtgccaaggg ctgtaggcag ccgccttcct gggaagcaag 360
actttgtccg ggaaacctcc tctggacgca gggtggggcc ccgagcccag ggcttctgcg 420
ttgtccccaa tgcgggaagg gggagtgggc tctgaccctc ccgggggagt caccgcagaa 480
ggcgacttcc tcattttacc ctgaagaaag aggggtgcag tgctgcaggt gaagctcccc 540
tcggcagcag gaaccctgcg gaggcgtcac aggacggccc cggcctccca gcgccgggag 600
gagatccgtt taggtccgtt agagctggct tagctgtggg gttagagaga aaccccatgg 660
aacttgcggg gggaggactg ggagacgttt ccgcagctgc ttgtggcaaa ctcagcctcc 720
aagttcatgg agcttgtgt 739
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
catcagcctc cctgcctc 18
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acacaagctc catgaacttg ga 22
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acatctggcc gcaccgct 18
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtgctaacac agcttatcct atg 23
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggaacctgc gtgggaatc 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgatctccc agcatgaaa 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgcccaagc aggtcattca 20
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctcctcaggg cttcggtca 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gatggtgaag gtcggagtg 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgaagttgtc atggatgacc 20
<210> 12
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cagacagaug uggaugaaut t 21
<210> 13
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
auucauccac aucugucugt t 21
<210> 14
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gccaacaaca ucaaccacat t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ugugguugau guuguuggct t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgugacacg uucggagaat t 21

Claims (8)

1.一种抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA NORFA，该lncRNA NORFA的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.扩增权利要求1所述抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡的lncRNA NORFA的引物对，其特征在于，该引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的反向引物。
3.权利要求1所述的lncRNA NORFA在抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞凋亡中的应用，其特征在于，通过在卵巢颗粒细胞中敲入或过表达所述的lncRNA NORFA，提高抗卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的能力。
4.权利要求1所述lncRNA NORFA的靶基因在抑制猪卵泡闭锁和卵巢颗粒细胞中的应用，其特征在于，通过在卵巢颗粒细胞中敲入或过表达所述lncRNA NORFA的靶基因，提高抗卵泡闭锁与颗粒细胞凋亡的能力；
所述的靶基因为TGFBR2基因，该TGFBR2基因的序列号为ENSSSCG00025024102。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，扩增所述TGFBR2基因的引物对包括核苷酸序列如SEQ ID No.4所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID No.5所示的反向引物。
6.权利要求1所述的lncRNA NORFA在促进体外培养猪卵母细胞成熟能力中的应用，其特征在于，过表达所述lncRNA NORFA能够提高猪卵丘-卵母细胞复合体在体外培养过程中卵母细胞的成熟率。
7.权利要求1所述lncRNA NORFA的靶基因在促进体外培养猪卵母细胞成熟能力中的应用，其特征在于，过表达所述lncRNA NORFA的靶基因能够提高猪卵丘-卵母细胞复合体在体外培养过程中卵母细胞的成熟率。
8.根据权利要求3或权利要求6所述的应用，其特征在于，该应用通过提高猪卵巢颗粒细胞中所述TGRBR2基因的表达水平实现。
CN202210655002.9A 2022-06-10 2022-06-10 一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用 Pending CN115094058A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210655002.9A CN115094058A (zh) 2022-06-10 2022-06-10 一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210655002.9A CN115094058A (zh) 2022-06-10 2022-06-10 一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115094058A true CN115094058A (zh) 2022-09-23

Family

ID=83290983

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210655002.9A Pending CN115094058A (zh) 2022-06-10 2022-06-10 一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN115094058A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117165696A (zh) * 2023-11-03 2023-12-05 四川省畜牧科学研究院 lncRNA相关试剂在调控鸡卵泡发育中的应用

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117165696A (zh) * 2023-11-03 2023-12-05 四川省畜牧科学研究院 lncRNA相关试剂在调控鸡卵泡发育中的应用
CN117165696B (zh) * 2023-11-03 2024-02-06 四川省畜牧科学研究院 lncRNA相关试剂在调控鸡卵泡发育中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110628766B (zh) 与羊骨骼肌发育相关的lncRNA编码基因及其应用
CN107267627B (zh) 与猪生产性状相关的Six1基因分子标记的制备与应用
CN108610427B (zh) 飞蝗滞育激素基因及其在调控昆虫滞育中的应用
CN110205284B (zh) L-脯氨酸在提高卵母细胞早期胚胎发育及抗氧化能力中的应用
CN115094058A (zh) 一种抑制猪卵泡闭锁和颗粒细胞凋亡的lncRNA及其应用
CN113678789A (zh) Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法
CN101148668A (zh) 猪产肉性状相关基因btg1的克隆及其在猪分子标记辅助选择中的应用
CN112941198B (zh) 一种检测猪眼肌面积的snp标记及其应用
CN116218846B (zh) 一种调控猪Ptrf基因表达的增强子序列的鉴定及其应用
CN114517198B (zh) 一种半滑舌鳎miRNA及其在调控tgfb2基因表达中的应用
CN106350519A (zh) 一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA及其应用
CN116103342A (zh) 基于CRISPR-Cas9系统和PB转座子系统的羊早期胚胎发育的谱系示踪方法
CN111893119B (zh) 利用CRISPR/Cas9系统与显微注射获得SCD1基因编辑山羊胚胎的方法
CN111676273B (zh) 一种检测牛成肌细胞hmga2基因增强子的方法
CN109576276B (zh) 猪肉质性状相关基因Prox1的分子克隆及应用
CN110923229B (zh) 一种在黄颡鱼中双gRNA位点敲除dmrt1基因的CRISPR/Cas9系统及应用
CN110511933B (zh) 一种大鼠长链非编码lncRNA-lncMSTRG10078及其抵抗细胞损伤的应用
CN110241135B (zh) 促进基因编辑的化合物筛选和鉴定及其应用
CN108085324B (zh) 绵羊b4galnt2基因全长序列的扩增及其表达量的检测
CN109652421B (zh) 靶向编辑羊繁殖负调控基因NPFFR1的sgRNA及其编码DNA和应用
CN114875028B (zh) 一种与母猪总产仔数性状关联的突变位点及其应用
CN111235153A (zh) 靶向敲除人MC1R基因的sgRNA及其构建的细胞株
Hui-Liang et al. Effects of the MyoG gene on the partial growth traits in pigs
Wang et al. Single nucleotide polymorphism analysis on chicken extracelluar fatty acid binding protein gene and its associations with fattiness trait
CN109438565B (zh) 飞蝗叉头转录因子LmFoxO及其编码基因与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination