CN114875028B - 一种与母猪总产仔数性状关联的突变位点及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪miR‑23a基因核心启动子序列，一个与母猪总产仔数性状显著关联的突变位点，该位点位于猪miR‑23a基因核心启动子261碱基处(即2号染色体参考基因组65307715位核苷酸处)，该位点为C>T单碱基突变，TT型经产母猪总产仔数高于CC型和CT型母猪。总产仔数性状是一个低遗传力的繁殖性状，采用常规育种技术遗传进展较慢，由于本发明所述突变位点与总产仔数性状显著关联，采用简便的基因分型技术检测该位点，便可选留高产母猪，这对加快高产母本新品系培育、早日完成大白猪的本土化选育目标和提高我国生猪种业核心竞争力等具有重要价值。

Description

一种与母猪总产仔数性状关联的突变位点及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及猪miR-23a基因核心启动子序列、与经产母猪总产仔数性状显著关联的突变位点及其应用。

背景技术

产仔数性状是一个低遗传力的繁殖性状和重要的经济性状，产仔数的多少是影响生猪养殖经济效益的关键因素之一。众所周知，对于低遗传力性状来说，采用常规育种技术进行选育，遗传进展较为缓慢，而基于遗传标记的分子育种技术(如标记辅助选择育种、基因组选择育种和基因编辑育种)是解决这一难题的可行方法。但实施分子育种的前提条件是拥有大量的可靠的遗传标记，因此产仔数性状遗传标记的鉴定是采用分子育种技术加快母猪产仔数性状选育遗传进展的必要条件。目前，采用各种方法(候选基因法、全基因组关联分析和基因组重测序)在猪基因组中发现了大量的、母猪产仔数性状的潜在候选基因，经大群验证的候选基因也有几十个之多，如ESR1、FSHβ、BMPR1B、SMARCA2和AHR等。但这些基因主要为蛋白编码基因，而占基因组序列98％以上的非编码区往往被忽视了。微小RNAs(miRNAs)是一类前体序列为70nt、成熟序列长度仅为22nt左右的非编码RNAs，但其5’调控区序列长度与蛋白编码基因相似，且在基因组中分布广泛、在组织中表达丰富。研究发现miRNAs广泛参与猪重要经济性状形成相关的细胞功能的调控，如繁殖性状相关的卵巢颗粒细胞凋亡、肉质性状相关的脂肪细胞增殖和分化和生长性状相关的肌细胞分化等，但目前鉴定的与猪重要经济性状显著关联的突变位点较少，特别是产仔数性状相关的突变位点还未见报道。本验室前期发现miR-23a在猪卵巢颗粒细胞凋亡中发挥重要作用，说明其与卵泡闭锁(母猪繁殖力限制因素)有关。但目前还未在miR-23a基因上发现与母猪繁殖性状关联的突变位点。

发明内容

本发明的目的在于提供一种猪miR-23a基因核心启动子序列。

本发明的另一目的在于提供一个与母猪总产仔数性状显著关联的突变位点，以及该突变位点检测技术和选育高产母本的方法。

本发明的又一目的在于提供上述突变位点在选留高产母猪、辅助选育高产母本群体中的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

猪miR-23a基因核心启动子序列，由370个核苷酸组成，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。

一个与母猪总产仔数性状显著关联的突变位点，该突变位点位于如SEQ ID NO.1所示的猪miR-23a基因核心启动子的第261位碱基处，即2号染色体参考基因组的65307715核苷酸处，该位点为C>T单碱基突变，故命名为rs65307715；该位点在母猪群体中存在3种基因型(CC、CT和TT)，TT型经产母猪总产仔数比CC型和CT型母猪高，其中TT型经产母猪总产仔数比CC型母猪高0.55头/胎(差异显著)，比CT型母猪高0.23头/胎。

用于检测上述突变位点的特异性引物对，该特异性引物对的正反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。

一种检测猪基因组中上述突变位点的方法，利用设计的特异性引物对SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3对猪基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行直接测序，鉴定不同基因型。

一种选留高繁殖力母猪的方法，采用设计的特异性引物对SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3对猪基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物测序分型，选留TT基因型高产母猪。

上述的与经产母猪总产仔数性状显著关联的突变位点在选留高产母猪或辅助选育猪高产母本群体中的应用，或者在制备选留高产母猪或辅助选育猪高产母本群体试剂盒中的应用。

用于检测上述突变位点的特异性引物对在选留高产母猪或辅助选育猪高产母本群体中的应用，或者在制备选留高产母猪或辅助选育猪高产母本群体试剂盒中的应用。

母猪总产仔数性状是一个低遗传力的繁殖性状，采用常规育种技术遗传进展较慢，由于本发明所述突变位点与母猪总产仔数性状显著关联，采用简便的基因分型技术检测该位点，便可选留高产母猪，对快速选育高产母本群体、提供更多的商品仔猪具有重要的经济价值。

本发明的有益效果：

本发明提供了猪miR-23a基因核心启动子全序列、一个与母猪总产仔数性状显著关联的突变位点及其检测技术，可用于高产母猪选留和高产母本群体的辅助选择。这对加快高产母本新品系培育、早日完成猪的本土化选育目标和提高我国生猪种业核心竞争力等具有重要价值。

附图说明

图1猪miR-23a基因核心启动子突变位点测序分型峰图。

图2猪miR-23a基因核心启动子突变位点与经产母猪总产仔数性状的关联分析。

图3 rs65307715突变对猪卵巢颗粒细胞中miR-23a基因核心启动子活性的影响。

图4 rs65307715突变对猪卵巢颗粒细胞中miR-23a基因转录的影响。

具体实施方式

结合实例，进一步说明本发明。

实施例一

1、实验材料

用耳号钳在某种猪场随机采集经产大白母猪(n＝346)耳样，并收集总产仔数记录，共1076条。

2、基因组DNA提取

采用酚/氯仿抽提法提取DNA，稀释成50ng/μL作为PCR扩增模板。

3、引物设计

根据获得的猪miR-23a基因核心启动子(SEQ ID NO.1)，利用Primer Primer5.0软件设计1对引物，正向引物序列为：5'-CTG CCC TTC AGG CTT CTA GG-3'(SEQ ID NO.2)，反向引物序列为：5'-TCC CTT CCC CAC CAC CAC T-3'(SEQ ID NO.3)。引物由南京擎科生物科技有限公司合成。

4、PCR扩增

PCR扩增体系为10μL，主要包括：0.5μL DNA模板，0.5μM正向游引物，0.5μM反向引物，5μL 2×Premix rTaq DNA聚合酶(TaKaRa公司)，用双蒸水定容至10μL。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，32个循环，最后72℃延伸5min。本发明采用的PCR仪为TaKaRa梯度PCR仪。

5、测序分型

PCR扩增产物采用纯化试剂盒(北京天根公司)纯化后，直接送上海生工公司进行测序。测序峰图用Chromas v2.3软件进行分析，判别基因型，rs65307715位点为C单峰的判为CC基因型，为T单峰的判为TT基因型，双峰则判为CT基因型(附图1)。结果发现CC基因型母猪143头，CT基因型母猪161头，TT基因型母猪42头。

6、关联分析

采用SAS9.2软件中的一般线性模型对rs65307715突变位点多态性与总产仔数性状进行关联分析。一般线型模型为：

y＝μ+x₁+x₂+x₃+x₄+e

其中：y为繁殖形状观察值，μ为群体平均数，x₁为季节效应，x₂为胎次效应，x₃为日龄效应，x₄为基因型效应，e为随机误差。

结果发现，母猪群体中存在3种基因型(CC、CT和TT)，其中TT型经产母猪总产仔数比CC型母猪高0.55头/胎(差异显著)，比CT型母猪高0.23头/胎。

7、突变位点的功能验证

合成了含有rs65307715突变位点的猪miR-23a基因核心启动子区的荧光素酶报告载体pGL3-C和pGL3-T(擎科生物公司，提供序列生物公司直接合成)，转染到猪卵巢颗粒细胞中，利用荧光素酶报告基因试剂盒(诺维赞公司)分析发现pGL3-C载体的荧光素酶活性极显著高于pGL3-T载体(附图3)，说明rs65307715突变导致miR-23a基因转录活性降低。分离了rs65307715突变位点2种纯合基因型(CC和TT)猪卵巢颗粒细胞，采用TRIzol试剂(诺维赞公司)提取总RNA，用HiScriptⅡQ Select RT SuperMix(诺维赞公司)反转录成cDNA，并用荧光定量PCR技术检测颗粒细胞中miR-23a基因表达水平，结果发现CC基因型颗粒细胞中miR-23a基因表达水平显著低于TT基因型(附图4)，说明rs65307715突变可引起猪卵巢颗粒细胞中miR-23a基因转录抑制。结合关联分析结果，说明rs65307715突变位点是影响母猪繁殖性状的因果突变位点。

母猪总产仔数性状是一个低遗传力的繁殖性状，遗传力仅为0.16左右。采用常规育种技术遗传进展较慢，如丹麦用了长达50年的时间才将母猪总产仔数提高1.0头。本发明所述突变位点的基因型与母猪总产仔数性状显著关联，采用简便的基因分型技术检测这个突变位点，便可选留高产基因型(TT基因型)母猪，这对快速选育高产母本群体、提供更多的商品仔猪具有重要的经济价值。

猪miR-23a基因核心启动子序列

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序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种与母猪总产仔数性状关联的突变位点及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 370

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggcttaaagg gcatttggga agctgccaag ctgggatctg caccttgagt ctgggtctgg 60

ggctcggggg gcgtgcgtgc ctgggattgc tcgctgccgg catccgctct ggtgggtgag 120

gcgcgtgctg aggcctggcc tccgaggaga cggggccacg gggggcgggg aggggggagg 180

ccctggtggt ttcctcctgc ccttcaggct tctaggaagt ggcgccagct ggggtgagat 240

cacttcctca cccgcctgcc cgccaccccc tcagcttcct ctccccatgg ccccatttag 300

cctgcccagg gctcagtggt ggtggggaag ggaggtgaaa agagggaggg gggggggtcc 360

ctggctttgg 370

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ctgcccttca ggcttctagg 20

<210> 3

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcccttcccc accaccact 19

Claims (5)

1.用于检测与母猪总产仔数性状显著关联的突变位点的特异性引物对，其特征在于,该特异性引物对的正反向引物如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；

所述的突变位点位于如SEQ ID NO.1所示的猪miR-23a基因核心启动子的第261位碱基上，该位点为C>T单碱基突变，该位点在母猪群体中存在CC、CT和TT 3种基因型，TT型经产母猪总产仔数比CC型和CT型母猪高。

2.一种检测猪基因组中与母猪总产仔数性状显著关联的突变位点的方法，其特征在于，利用设计的特异性引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3对猪基因组DNA进行PCR扩增，对扩增产物进行直接测序，鉴定不同基因型；

所述的突变位点位于如SEQ ID NO.1所示的猪miR-23a基因核心启动子的第261位碱基上，该位点为C>T单碱基突变，该位点在母猪群体中存在CC、CT和TT 3种基因型，TT型经产母猪总产仔数比CC型和CT型母猪高。

3.一种选留高繁殖力母猪的方法，其特征在于，采用设计的特异性引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3对猪基因组DNA进行PCR扩增，对PCR扩增产物测序分型，选留TT基因型高产母猪。

4.用于检测与母猪总产仔数性状显著关联的突变位点的特异性引物对在选留高产母猪或辅助选育猪高产母本群体中的应用，或者在制备选留高产母猪或辅助选育猪高产母本群体试剂盒中的应用；

所述的突变位点位于如SEQ ID NO.1所示的猪miR-23a基因核心启动子的第261位碱基上，该位点为C>T单碱基突变，该位点在母猪群体中存在CC、CT和TT 3种基因型，TT型经产母猪总产仔数比CC型和CT型母猪高。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异性引物对的核苷酸序列如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示。

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