CN112251516B - 利用猪7号染色体检测猪达标体重日龄的方法及其试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种利用猪7号染色体检测猪达标体重日龄的方法及其试剂盒，本发明利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，检测猪7号染色体(v11.1)41672433位脱氧核糖核苷酸是G还是A，然后确定待测猪的基因型是GG还是AA，GG基因型的猪的达100kg体重日龄要大于AA基因型的猪的达100kg体重日龄。本发明提供的方法，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选优良种猪时间长的问题，降低育种花费，有效降低或提高实际生产中的猪的背膘性状育种进展。本发明的检测方法操作简单、费用不高、准确度高，并可实现自动化的直接检测。本发明将在猪的育种工作中发挥巨大作用。

Description

利用猪7号染色体检测猪达标体重日龄的方法及其试剂盒

技术领域

本发明涉及一种利用猪7号染色体检测猪达标体重日龄的方法及其试剂盒，属于生物检测领域。

背景技术

猪的达100kg体重日龄直接与猪场的经济效益相关，达100kg体重日龄减少一天，可使养猪成本降低5元左右，因此其在育种上的价值很高，一直是猪育种目标的重要组成部分。但是，达100kg体重日龄的测定时段为猪只体重在85-110kg范围，传统方法只能在猪长成之后才能测定。对其成年后测定一方面会加大育种成本，另一方面会拉长世代间隔，减缓遗传进展速度，对其进行早期选择优势明显。分子生物技术、芯片技术、测序技术的飞速发展为猪达100kg体重日龄等数量性状开展育种更早、更准确、进展更快速的分子育种提供了研究基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用猪7号染色体检测猪达标体重日龄的方法及其试剂盒，以对待选猪进行早期筛选，提高育种效率。

本发明采用了如下技术方案：

一种利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，其特征在于，检测猪7号染色体(v11.1)41672433位脱氧核糖核苷酸是G还是A，然后确定待测猪的基因型是GG还是AA，GG基因型的猪的达100kg体重日龄要大于AA基因型的猪的达100kg体重日龄。

进一步，本发明的利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，还具有这样的特征：确定待测猪7号染色体(v11.1)自5′末端第41672433位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法为测序分析。

进一步，本发明的利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，还具有这样的特征：测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序的步骤；所述PCR扩增所用的引物对满足如下条件：以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物中含有猪7号染色体41672433位的脱氧核糖核苷酸。

进一步，本发明的利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，还具有这样的特征：所述PCR扩增所用的引物对为序列1：TTGTTGTCGCACATCACCTTC，和序列2：GCCATACGGAGTAATCCTGAATG组成的引物对。

进一步，本发明的利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，还具有这样的特征：PCR扩增体系为：基因组DNA 200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs 10mM，上、下游引物各50ng，TaqDNA聚合酶0.75U，Mg²⁺2.5mmol/L，用ddH₂O补充反应体系至50μl，

PCR反应条件为：95℃变性5min；然后95℃变性20s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min，

PCR产物经琼脂糖凝胶检测后于-20℃保存，以2头被测猪的基因组DNA为模板进行扩增的产物分别命名为产物1、产物2。

本发明还提供一种辅助检测猪达100kg体重日龄的试剂盒，其特征在于，包括：

序列1：TTGTTGTCGCACATCACCTTC，

和序列2：GCCATACGGAGTAATCCTGAATG组成的引物对。

本发明还提供序列1：TTGTTGTCGCACATCACCTTC，和序列2：GCCATACGGAGTAATCCTGAATG组成的引物对在制备检测猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的试剂中的应用。

本发明还提供序列1：TTGTTGTCGCACATCACCTTC，和序列2：GCCATACGGAGTAATCCTGAATG组成的引物对在制备检测猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的试剂盒中的应用。

上述的试剂盒，还具有这样的特征：检测的猪为大白猪。

上述述的应用，还具有这样的特征：所检测的猪为大白猪。

本发明述的试剂盒在猪的育种中的应用。

发明的有益效果：本发明的猪7号染色体(v11.1)自5′末端第41672433位脱氧核糖核苷酸存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(G/A)，该单核苷酸多态被命名为g.41672433G>A。本发明经过研究发现AA纯合基因型群体比GG纯合基因型群体达100kg体重日龄少约7.62天，可以利用该位点作为猪达100kg体重日龄性状分子育种标记。

本发明使用基因测序方法检测g.41672433G>A，只需进行PCR反应，测序即可判别个体的基因型，基因型判型非常准确，检测费用不高，具有很高的育种实践应用价值。用本发明的方法对猪和性状进行选择，可使猪平均达100kg体重日龄变少约7.62天，从而在更短的时间内获得生产性能更高的猪。

应用本发明提供的方法对猪进行育种，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选优良种猪时间长的问题，降低育种花费，有效降低或提高实际生产中的猪的背膘性状育种进展。本发明的检测方法操作简单、费用不高、准确度高，并可实现自动化的直接检测。本发明将在猪的育种工作中发挥巨大作用。

附图说明

图1是序列M1和序列M2的测序结果图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，以下的实施例用于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为分子生物学领域的常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为通过商品化途径购买得到。以下实施例中的引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。

大白猪：该猪来自上海新农科技股份有限公司猪场。

实施例一、育种方法的建立

一、猪7号染色体(v11.1)g.41672433G>A多态性位点的确定

1、PCR扩增

根据猪7号染色体(v11.1)g.41672433G>A上下游序列信息,设计一对引物如下：

U(上游引物)：5’-TTGTTGTCGCACATCACCTTC-3’(见序列表的序列1)；

D(下游引物)：5’-GCCATACGGAGTAATCCTGAATG-3’(见序列表的序列2)。

选择大白猪两头为实验材料。以大白猪的基因组DNA为模板，使用引物U和D进行PCR扩增。

扩增体系为：基因组DNA200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs10mM，上、下游引物各50ng，TaqDNA聚合酶0.75U，Mg²⁺2.5mmol/L，用ddH₂O补充反应体系至50μl。

PCR反应条件为：95℃变性5min；然后95℃变性20s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

PCR产物经琼脂糖凝胶检测后于-20℃保存。以2头大白猪的基因组DNA为模板进行扩增的产物分别命名为产物1、产物2。

2、克隆测序及序列分析

分别将2种PCR产物进行核苷酸序列测定(英潍捷基(上海)贸易有限公司)。如图1所示，测序结果表明：产物1为序列M1，产物2为序列M2；序列M1和序列M2的长度均为160bp，只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异(G/A)，此脱氧核糖核苷酸为猪7号染色体(v11.1)自5′末端第41672433位脱氧核糖核苷酸，将该单核苷酸多态命名为g.41672433G>A。序列M1的核苷酸序列见序列表的序列3，序列M2的核苷酸序列见序列表的序列4。

将猪7号染色体(v11.1)自5′末端第41672433位脱氧核糖核苷酸为A的纯合体基因型命名为AA，猪7号染色体(v11.1)自5′末端第41672433位脱氧核糖核苷酸为G的纯合体基因型为GG，它们的杂合体基因型为GA。

二、猪7号染色体(v11.1)g.41672433G>A多态位点与猪达100kg体重日龄的相关性分析

为确定g.41672433G>A多态位点与猪达100kg体重日龄性状是否相关，以2520头大白猪为实验材料，进行如下试验：提取基因组进行测序分析，方法同步骤一；同时测定并记录达100kg体重日龄性状，对g.41672433G>A位点与性状以最小二乘法开展关联分析。所用模型如下：

Y＝S+P+G+e

其中Y为性状测定值，S为性别效应，P为品系效应，G为基因型效应，e为残差效应。

结果见表1。

表1：猪7号染色体(v11.1)突变位点g.41672433G>A基因型与达100kg体重日龄相关性状的关联

注：同列上标不同字母表示差异显著(P<0.05)

结果表明：在达100kg体重日龄性状中，GG基因型个体分别比AA基因型个体在达100kg体重日龄性状方面高约7.62天(P<0.05)。

所以，在实际的猪育种中，为获得更少达100kg体重日龄性状的猪，最好选择AA基因型的猪进行育种。

实施例三：

基于实施例一中的引物对：

序列1：TTGTTGTCGCACATCACCTTC，

和序列2：GCCATACGGAGTAATCCTGAATG组成的引物对。加入核酸试剂常用的稳定剂或其它试剂，制备检测猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的试剂。此试剂可单独作为商品。

实施例四：

基于实施例一中的引物对：

序列1：TTGTTGTCGCACATCACCTTC，

和序列2：GCCATACGGAGTAATCCTGAATG组成的引物对。可以将此引物对应用于检测试剂盒中，与PCR相关试剂一起，从而制成对检测猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的试剂盒。

序列表

<110> 上海新农科技股份有限公司

<120> 利用猪7号染色体检测猪达标体重日龄的方法及其试剂盒

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgttgtcgc acatcacctt c 21

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gccatacgga gtaatcctga atg 23

<210> 3

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgttgtcgc acatcacctt catgttttct tgtgccaaaa tccggatggg tgtaacgact 60

actttttttg tggaccaata tgcaaaaaca tctattgtca gtctgcagat atagtcacct 120

gcagggaata cacaaagcat tcaggattac tccgtatggc 160

<210> 4

<211> 160

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ttgttgtcgc acatcacctt catgttttct tgtgccaaaa tccggatggg tgtaacaact 60

actttttttg tggaccaata tgcaaaaaca tctattgtca gtctgcagat atagtcacct 120

gcagggaata cacaaagcat tcaggattac tccgtatggc 160

Claims (7)

1.一种利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，其特征在于，检测猪7号染色体v11.1第41672433位脱氧核糖核苷酸是G还是A，然后确定待测猪的基因型是GG还是AA，GG基因型的猪的达100kg体重日龄要大于AA基因型的猪的达100kg体重日龄；

其中，待测猪为大白猪。

2.如权利要求1所述的利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，其特征在于：

所述确定待测猪7号染色体v11.1自5′末端第41672433位脱氧核糖核苷酸是G还是A的方法为测序分析。

3.如权利要求2所述的利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，其特征在于：

所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序的步骤；所述PCR扩增所用的引物对满足如下条件：以猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物中含有猪7号染色体41672433位的脱氧核糖核苷酸。

4.如权利要求3所述的利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，其特征在于：

所述PCR扩增所用的引物对为序列1：TTGTTGTCGCACATCACCTTC，

和序列2：GCCATACGGAGTAATCCTGAATG组成的引物对。

5.如权利要求4所述的利用猪7号染色体辅助检测猪达100kg体重日龄的方法，其特征在于：

PCR扩增体系为：基因组DNA200ng，10×PCR扩增缓冲液5μL，dNTPs 10mM，上、下游引物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg²⁺2.5mmol/L，用ddH₂O补充反应体系至50μL，

PCR反应条件为：95℃变性5min；然后95℃变性20s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min，

PCR产物经琼脂糖凝胶检测后于-20℃保存，以2头被测猪的基因组DNA为模板进行扩增的产物分别命名为产物1、产物2。

6.序列1：TTGTTGTCGCACATCACCTTC和序列2：GCCATACGGAGTAATCCTGAATG组成的引物对在制备检测猪7号染色体v11.1第41672433位基因型以辅助检测大白猪达100kg体重日龄的试剂中的应用。

7.序列1：TTGTTGTCGCACATCACCTTC和序列2：GCCATACGGAGTAATCCTGAATG组成的引物对在制备检测猪7号染色体v11.1第41672433位基因型以辅助检测大白猪达100kg体重日龄的试剂盒中的应用。