CN106350519A - 一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA及其应用 - Google Patents

一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA及其应用 Download PDF

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Abstract

一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA及其应用，它涉及一种小RNA(microRNA)，本发明提供了东北马鹿(Cervus elaphus)鹿茸软骨这种快速增长细胞起抑制作用的因子，其命名为：PC‑5p‑1090，其序列为CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU，具有高效下调SOX9蛋白的作用，可抑制细胞增殖。

Description

一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA及其应用
技术领域
本发明涉及一种小RNA(microRNA)，负调控鹿茸的癌样生长。
背景技术
在哺乳动物中，只有鹿茸角是目前所知唯一具有表形态再生能力的器官，即在失去后还能完全再生出来(如图1，2)。在再生周期里，鹿茸从顶部生长点平均每天延伸1-2cm。所以有人称鹿茸的生长是“癌样”(cancer-like)生长。随着近年来大量促癌因子，如TNFα、KGF等的发现，这种认为鹿茸癌样生长的观点已经得到分子水平证据的支持。可值得注意的是肿瘤和癌症组织很少自愈，而鹿茸会在近百天的的癌样生长后最终自动停止，茸性皮肤会慢慢死亡脱落。这种鹿茸软骨癌样生长后停止的过程中一定存在负调控因子起作用。
MicroRNA(miRNA)是一类内生的、重要基因表达的负调控因子，通过调节目标mRNA稳定性或翻译效率来表现其功能。这些小RNA长度为20-24个核苷酸、来源于长的具有发卡样二级结构的转录子，并被两种核酸内切酶Drosha和Dicer剪切。具体过程：miRNA首先由细胞核内的核糖核酸酶Drosha产生，此酶将在基因中编码的初级miRNA(primary miRNA，pri-miRNA)的茎环结构加工成前体miRNA(precursor miRNA，pre-miRNA)，60-70核苷酸长。然后通过输出蛋白5(esportin-5)将pre-miRNA转位输出到细胞质，并在另一种RNAIII，Dicer的作用形成双链的miRNA。
RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)包含AGO(argonaut)蛋白，组成miRNA双链。其中一条链形成成熟的miRNA而另一条链降解。成熟miRNA蛋白复合体通过与mRNA的3’UTR区目标位点结合，而进行转录抑制或者降解mRNA决定于成熟miRNA和目标mRNA互补程度。
一个miR的选择性活性依赖于与这个同源mRNA互补的miR的种子序列(seedregion)。因为microRNA种子内的不完美碱基配对代表这个核心5-7核苷酸序列可以潜在识别结合很多的mRNA序列，种子序列通常在基因组中重复并且同时调控几百个目标mRNA。然而，miRNA影响单个蛋白水平相对温和，尽管如此，在一个通路中通过一个miRNA同时调节几个基因的状况对于源于这个通路的生物学过程是有一个积累效应的。
越来越多的证据表明microRNA在许多细胞增殖、分化、形态发生和肿瘤发生等生物学过程中起非常关键的调节作用。众所周知，microRNA参与调节肿瘤起始和进展，并通过抑制目标基因起到癌基因或肿瘤抑制的功能。到目前，越来越多的miRNA被证明在癌症发生过程中起非常重要的作用，这说明miRNA可以作为治疗癌症的潜在新靶标。
SOX9(transcription factor sex-determining regionY(SRY)-box 9protein)属于SOX家族，是包括雄性决定、软骨形成、神经形成和神经嵴发育等发育进程中的一个关键性因子。而作为软骨主要调节转录因子的SOX9是小鼠软骨发育的必要因子，人类SOX基因杂合子突变会导致非常严重的骨骼畸形综合征——躯干发育异常(campomelicdysplasia)。在体外，下调SOX9的表达会导致人类关节软骨细胞分化的表型缺失，这也揭示了当前基于细胞基础上软骨修复治疗的主要问题。SOX9在细胞增殖过程尤为重要，小鼠中细胞SOX9缺失的睾丸、脊髓和胰腺不能正常发育。
发明内容
本发明确定了东北马鹿(Cervus elaphus)鹿茸软骨这种快速增长细胞起抑制作用的因子，并确定这种负调控因子的名称、序列。本发明从马路鹿茸软骨组织的microRNA数据库中筛选得到的microRNA，PC-5p-1090(以下简称PC-1090)，为24nt，序列如SEQ ID NO：1所示(CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU)。
本发明经过Hela、U2OS、293T等细胞的细胞增殖检测和Western Blotting等实验证明PC-1090下调细胞增殖关键转录因子SOX9的表达(图4、5所示)，可抑制细胞增殖(图6所示)。
本发明包含以下有益效果：
作为基因表达的负调控因子，microRNA在细胞生长、器官发育、个体生长及各种疾病的进程中都起到非常重要的作用。因此，从快速生长的鹿茸顶端分生组织中分离出来的microRNA序列对鹿茸的癌样生长及自动终止会起非常重要的调控作用。
为此，本发明从快速生长期的新生马路鹿茸顶端软骨组织microRNA测序结果中得到一个miR，PC-1090，其转录前体长约120nt，可形成发卡结构，成熟miR全长24nt(GenBank登陆号:KJ179845)，在miRBase数据库(Release 21)中无同源序列。BLAST结果显示，无论是成熟miR全长还是其seed序列，在人、小鼠、大鼠、狗、鸡、猪等模式物种基因组中均无同源序列。仅在牛(Bos taurus)第11号染色体上有成熟miR的同源序列，相似性100％。
通过TargetScan预测软骨发育的关键性因子SOX9是PC-1090的靶基因之一，通过PC-1090mimics实验验证了PC-1090对SOX9具有靶向作用，在U2OS、293T等细胞中证明了PC-1090具有高效下调SOX9蛋白的作用(实验结果如图4、5所示)，并抑制细胞增殖(实验结果如图6所示)。
本发明筛选的基因序列如下：
名称：PC-5p-1090
序列：CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU。
附图说明
图1为马鹿鹿茸表形态再生周期图。其中，箭头所指为鹿茸顶端增生区；
图2为鹿茸快速生长期顶端增生区轴向纵切图和茸皮组织结构图；其中，左侧为轴向纵切图，右侧为茸皮组织结构图，E为上皮，D为真皮层，RM为间充质层，CA为未矿化软骨区，H为毛囊，S为皮脂腺；图中箭头所指处可见软骨中红色血管；
图3为多种模式生物SOX9mRNA 3’UTR区具有潜在的PC-1090的seed序列(小写加下划线序列)互补结合保守位点(框内序列)；
图4为PC-1090mimics下调U2OS细胞内源SOX9蛋白水平图；内参为GAPDH；
图5为PC-1090mimics可下调293T细胞pMIR-SOX9-3UTR-Luc载体表达荧光素酶；内参为GAPDH，实验设pMIR-Luc空白质粒(ev)对照；
图6为CCK-8法检测转染PC-1090mimics后以24小时为间隔的Hela细胞增殖活性图；其中，A为miR-NC阴性对照活性曲线；B为PC-1090mimic活性曲线。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式的一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA，它命名为：PC-5p-1090，其序列为CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU(如Seq ID No：1所示)。
具体实施方式二：本实施方式的一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA的应用，抑制促进细胞增殖的转录因子SOX9表达。
具体实施方式三：本实施方式的一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA的应用，它具有抑制细胞增殖功能。
本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。
通过以下实施例验证本发明的有益效果：
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂公司购买得到的。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例1、鹿茸软骨miR-1090的获取过程
1)材料获取：实验所用材料为处于快速增长期约70天的东北马鹿鹿茸顶端分生组织软骨层组织(图2所示)中靠近间充质部分。锯茸后立即用消毒的剪刀将鹿茸顶端骨组织切成厚度小于0.5cm的片状，立即放入装有防止RNA降解的保护液(RNA later)中，置于低温保存箱中并带回实验室保存。
2)mRNA的提取：将实验室保存鹿茸软骨称取30mg，在超净工作台中快速切碎置于无菌1.5mL试管中，利用QIAGEN公司(德国)试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit(Cat.No.69504)提取鹿茸软骨中的总RNA，并将提取的总RNA最终溶解于RNAse-free的水中，提取的总RNA经过分光光度检测均具有较高的质量(OD260nm/OD280nm：1.75-1.86)。
3)鹿茸软骨small RNA高通量测序：将提取的总RNA递交到美国联川公司(杭州)通过Illumina miRNA Solexa测序平台进行鹿茸软骨组织small RNAs文库进行高通量测序后，用ACGT101-miR v4.2(LC Sciences)软件进行数据处理。
4)鹿茸软骨新miRNAmiR-1090的获取：对鹿茸软骨组织的small RNA文库分别进行Solexa深度测序后获得序列原始数据进行综合分析，得到一种新miRNA，PC-1090，其序列不能比对到miRBase牛的miRNAs前体(pre-miRNAs)，但是测得序列(已知的成熟体)可以比对到基因组上，而且延伸的基因组序列可以形成合格的发夹结构。
5)靶基因预测：通过TargetScan预测miR-1090的靶基因之一为软骨发育的关键转录因子SOX9。
实施例2、PC-1090在细胞水平上能够下调促细胞增殖关键性因子SOX9表达
1)PC-1090合成：将PC-1090序列递交到上海吉玛公司合成mimics和相应的NegativeControl(NC)。
2)构建SOX9-3’UTR-pMIR-REPORT载体：序列比对分析得知多种模式生物Sox9mRNA3’UTR区具有潜在的PC-1090seed序列(小写加下划线序列)互补结合保守位点(框内序列)(图3所示)。因此，本实施例根据小鼠SOX9的3’UTR区克隆了339bp的片段插入到pMIR-REPORT(Applied Biosystems公司，美国)载体中，其中插入片段包含PC-1090种子序列的互补序列，插入片段(如Seq ID No：2所示)如下：
caatgttttcagccatagacctttgggtctgcctggactgtatgtggatgtgtgcgtgtgttgtgacacgggacaacacatgcctctgcaagtgtgtgtgccgtggatagccccttggctgctctcctgcagagagacatcggacagaccttaattcttactcactgctgtggctggagagtataaggaatgctttttctttttttctttctttctttcttttttttttttaagacagcagtctttttttttaatttaaaaaaaaaaagatatattaacagttttagaagtcagtagaataaaaccttaaagcgttcttataatatggcatctttcgcg。
pMIR-REPORT载体是ABI公司(美国)设计的将一个miRNA的靶序列插入到多克隆位点中，pMIR-REPORT的荧光素酶蛋白Luciferase报告载体可以用来定性和定量衡量miRNA的功能。当PC-1090mimics和SOX9-3’UTR-pMIR-REPORT载体共转染细胞时，如果Luciferase蛋白表达下调，说明PC-1090对SOX9表达有下调作用。
3)细胞培养：293T细胞和U2OS细胞均购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，培养基：293T细胞培养基为DMEM(Gibco，美国)，U2OS细胞培养基为McCoy's 5A(Modified)Medium(Gibco，美国)，均添加10％的胎牛血(Gibco，美国)和100U/mL的双抗(Invetrogen公司，美国)。置于37℃，5％二氧化碳条件下培养。
4)转染与Western检测：细胞以8×105个/孔种于6孔培养板上，培养36小时，细胞汇合度达到70％-80％，以Lipofectmin3000(Invetrogen公司，美国)为介导，将合成的PC-1090的mimics和SOX9-3’UTR-pMIR-REPORT载体对U2OS细胞、293T细胞进行转染，转染的重组质粒量为2ug/孔。40～48小时后收细胞，对蛋白进行变性处理后，利用4％-12％的PAGE预制胶(Invitrogen公司，美国)电泳。转硝酸纤维膜后，用5％脱脂奶粉的TBST混合液封闭2小时，然后硝酸纤维膜分别在SOX9一抗(Santa CruzBiotechnology公司，美国)(图4)或Luciferase一抗(Santa Cruz Biotechnology公司，美国)(图5)中孵育2小时以上，荧光标记的二抗(Licor Bioscience，美国)中孵育1小时，以GAPDH(Santa Cruz Biotechnology公司，美国)为内参，Odyssey红外激光成像系统扫膜。检测结果表明miR-1090有效下调SOX9的表达(图4、5所示)。
实施例3、PC-1090在细胞水平上具有抑制细胞增殖功能
1)细胞培养与转染：Hela细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库，培养基为DMEM(Gibco，美国)，培养方法同实施例2中3)。细胞转染同实施例2中的4)。
2)细胞活性检测：利用CCK-8(上海碧云天)试剂盒检测PC-1090mimic/NC转染Hela细胞后的增殖情况，每隔24小时对转染后的细胞进行计数统计。检测结果表明相比对照组(NC)，PC-1090mimics的Hela细胞增殖受到抑制(图6所示)。

Claims (3)

1.一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA，其特征在于它命名为：PC-5p-1090，其序列为CACUGACUGGCUCAGCGUGUGCCU。
2.一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA的应用，其特征在于它抑制细胞增殖。
3.根据权利要求1所述的一种调节鹿茸软骨快速生长的microRNA的应用，其特征在于抑制细胞增殖是通过抑制促进细胞增殖的转录因子SOX9表达完成。
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