miR-574-5p的用途
技术领域
本发明涉及一种生物医学材料小分子RNA,尤其是涉及一种小分子RNA——miR-574-5p在制备结直肠癌的治疗药物和诊断试剂中的用途。
背景技术
1)结直肠癌
结直肠癌是发生于消化道的常见恶性肿瘤。它是人类高发恶性肿瘤之一,其发病率一直呈上升趋势。在全球恶性肿瘤中,结直肠癌的发病率居第三位,死亡率居第二位。据统计,全球每年新增约100万结直肠癌患者。同时,全球每年约有50万人死于结直肠癌。随着我国的经济发展和人民生活水平的不断提高,生活方式及膳食结构的改变,结直肠癌已呈逐年上升的趋势。有增无减的发病率,居高不下的死亡率已经使结直肠癌的发病机制研究与预防医治成为亟待解决的重大课题。
根据Hendon等的研究,早期结直肠癌(Dukes A和B)术后5年生存率约为80%,而进展期结直肠癌(Dukes C和D)术后5年生存率仅为50%左右([1]Hendon SE,DiPalma JA.U.S.practices for colon cancer screening[J].Keio J Med.2005,54(4):179-183)。因此,早期发现,早期诊断以及早期治疗是改善结直肠癌预后的关键。但是,早期结直肠癌病灶局限于结肠粘膜及粘膜下层,患者往往无临床症状,不会主动就诊,因此目前早期结直肠癌检出率还不高。
结直肠癌的发展需经历不典型增生、重度不典型增生、腺瘤、原位癌、进展期癌等阶段。在各个阶段,基因呈顺序突变,并不断积累,每一个时期均有特异性的分子事件发生([2]Iaitskii NA,Dubina MV.Vasil′ev SV et al.The scientific and clinical value of molecular geneticchanges in the intercellular gap junctions observed in colon cancer[J].Vestn Ross Akad Med Nauk.2003,(10):24-29)。Baldus等报道,在66%~79%的结直肠癌组织中,β-catenin的表达异常增高,且从腺瘤到腺癌的过程中β-catenin的表达呈逐渐上升的趋势([3]Baldus SE,Monig SP,Huxel S et al.MUC1 and nuclear beta-catenin are coexpressed at the invasion front of colorectalcarcinomas and are both correlated with tumor prognosis[J].Clin Cancer Res.2004,10(8):2790-2796)。p27Kip1蛋白是一种周期素依赖激酶抑制剂,与肠上皮细胞分化及凋亡的启动有关,其表达下降是结直肠癌的一个特征。对这些分子事件的了解将为结直肠癌的预防和治疗提供理论依据。
2)miR-574-5p
MicroRNA(miRNA)是一类内源性非编码小分子RNA,长约为22个核苷酸。它通过完全/不完全与靶mRNA 3’UTR互补结合抑制靶mRNA的翻译或直接介导靶mRNA的降解,进而调控包括细胞增殖、分化和凋亡等一系列生理进程,影响生物体的生长发育,并与多种人类疾病的发生密切相关([4]Valencia-Sanchez MA,Liu J,Hannon GJ et al.Control of translationand mRNA degradation by miRNAs and siRNAs[J].Genes Dev.2006,20(5):515-524.)。miRNA在多种肿瘤组织中异常表达。它们通过调节癌基因或抑癌基因的表达,参与细胞中重要的信号途径,间接起着“癌基因”或“抑癌基因”的功能。因此,对miRNA的研究有助于促进人们对癌症发生发展机制的了解。
miR-574-5p最早是由HUGO基因命名委员会(HGNC,http://www.genenames.org/)所报道一类miRNA。它的成熟序列为“UGAGUGUGUGUGUGUGAGUGUGU”。最近的几个研究显示,miR-574-5p在肺癌病人的血液中有显著的升高,可能可以作为非小细胞肺癌诊断的生物标记([5]Foss KM,Sima C,Ugolini D et al.miR-1254 and miR-574-5p:serum-basedmicroRNA biomarkers for early-stage non-small cell lung cancer[J].J Thorac Oncol.2011,6(3):482-488;[6]Keller A,Leidinger P,Borries A et al.miRNAs in lung cancer-studying complexfingerprints in patient′s blood cells by microarray experiments[J].BMC Cancer.2009,9:353;[7]Ranade AR,Cherba D,Sridhar S et al.MicroRNA 92a-2*:a biomarker predictive forchemoresistance and prognostic for survival in patients with small cell lung cancer[J].J ThoracOncol.2010,5(8):1273-1278)。此外,在食管鳞癌组织([8]尤振兵;刘;刘;苏;杨;浦;尹;王;潘;郭.淮安食管鳞癌与癌旁组织中差异表达microRNAs的初步分析[J].癌变.畸变.突变.2010,22:418-422)和恶性胰腺癌病人的血液([9]Ali S,Almhanna K,Chen W et al.Differentiallyexpressed miRNAs in the plasma may provide a molecular signature for aggressive pancreaticcancer[J].Am J Transl Res.2010,3(1):28-47)中,miR-574-5p也是表达异常升高幅度最大的miRNAs之一。这些研究都表明miR-574-5p在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。
3)QKI
QKI(quaking)蛋白是STAR蛋白家族的成员,是一类集信号转导特性与RNA激活功能于一身的蛋白质,在胚胎发生、组织器官的发育以及蛋白质合成的调节方面都发挥着重要作用([10]Chenard CA,Richard S.New implications for the QUAKING RNA binding protein inhuman disease[J].J Neurosci Res.2008,86(2):233-242.)。人Qki基因位于6号染色体而小鼠基因则位于17号染色体。人Qki基因含有8个外显子,长度约为16kb([11]Klempan TA,ErnstC,Deleva V et al.Characterization of QKI gene expression,genetics,and epigenetics in suicidevictims with major depressive disorder[J].Biol Psychiatry.2009,66(9):824-831)。人Qki通过选择性剪接可以产生多个剪接体,主要有Qki5、Qki6、Qki7和Qki7b,分别编码蛋白QKI5、QKI6、QKI7和QKI7b。QKI5的C端具有核定位信号,因此主要定位于细胞核和细胞质中,而QKI6、QKI7和QKI7b则主要存在于细胞质中([10]Chenard CA,Richard S.New implicationsfor the QUAKING RNA binding protein in human disease[J].J Neurosci Res.2008,86(2):233-242)。
QKI蛋白可以通过KH结构域与靶mRNA的3’UTR上的QKI应答元件(QRE)结合,参与mRNA的稳定性、RNA转运和核定位以及RNA翻译的调控。QKI应答元件通常典型序列为NACUAAY-N1-20-UAAY([12]Galarneau A,Richard S.Target RNA motif and target mRNAsof the Quaking STAR protein[J].Nat Struct Mol Biol.2005,12(8):691-698)。生物信息学分析显示,QKI通过与QRE结合,控制至少1430种mRNAs,其中包括p27Kip1和β-catenin。通过对已知或预测的QKI靶基因的分析显示,QKI蛋白在细胞生长、迁移、通信、分化和发育中具重要作用。
许多有关QKI的功能研究集中在神经系统,特别是与髓鞘发育相关的分子机理方面。研究已表明,QKI在神经髓鞘的形成、胚胎的发生、组织器官的发育以及调节蛋白质的合成和表达等方面发挥着重要作用([13]Hardy RJ.QKI expression is regulated during neuron-glial cellfate decisions[J].J Neurosci Res.1998,54(1):46-57;[14]Larocque D,Pilotte J,Chen T et al.Nuclear retention of MBP mRNAs in the quaking viable mice[J].Neuron.2002,36(5):815-829;[15]Sidman RL,Dickie MM,Appel SH.Mutant Mice(Quaking and Jimpy)with DeficientMyelination in the Central Nervous System[J].Science.1964,144:309-311;[16]Wu HY,DawsonMR,Reynolds R et al.Expression of QKI proteins and MAP1B identifies actively myelinatingoligodendrocytes in adult rat brain[J].Mol Cell Neurosci.2001,17(2):292-302)。2010年,卢兹凡等人发现,在人结直肠癌组织中,QKI表达的下调可以通过影响p27Kip1及β-catenin等蛋白促进结直肠癌细胞的增殖与分化异常,从而参与到结直肠癌的发生发展过程中([17]Yang G,FuH,Zhang J et al.RNA-binding protein quaking,a critical regulator of colon epithelialdifferentiation and a suppressor of colon cancer[J].Gastroenterology.2011,138(1):231-240e231-235)。QKI因而是结肠上皮细胞分化的调控蛋白,同时也是结直肠癌细胞中一个重要的抑癌基因。
发明内容
本发明的目的在于提供miR-574-5p在制备结直肠癌治疗药物和诊断试剂中的应用。
通过生物信息学分析表明,Qki6/7/7b是miR-574-5p的潜在靶基因。以正常C57BL/6小鼠的结肠组织为对照,先天性Apc基因缺失的结直肠癌小鼠模型C57BL/6-Apcmin/+小鼠的结直肠癌组织样品中miR-574-5p表达异常上升,而QKI表达异常下降。在小鼠结直肠癌细胞CT26和人结直肠癌细胞HCT116、SW480和SW620等细胞中,过量表达miR-574可以抑制QKI表达,而抑制miR-574-5p可以促进QKI表达。
在以上工作基础上,通过分析miR-574-5p调控Qki6/7/7b表达的分子机理,及其对结直肠癌发生发展的影响表明,miR-574-5p可以转录后抑制Qki6/7/7b的表达,而QKI可以促进p27Kip1的表达并抑制β-catenin的表达。实验证明,miR-574-5p可以通过下调Qki6/7/7b的表达,进而影响p27Kip1和β-catenin的表达,抑制结直肠癌细胞的分化并促进结直肠癌细胞的增殖与侵袭。
通过检测30例结直肠癌病人的结直肠癌组织样品和12例结直肠癌病人的血液样品。与癌旁组织样品相比,绝大部分结直肠癌组织样品的QKI表达水平显著降低而miR-574-5p的表达水平显著升高。通过对血液样品的分析表明,正常人的血液样品中miR-574-5p的表达水平普遍较低,而至少41%的结直肠癌病人的血液样品中miR-574-5p的表达量显著升高。
基于以上结果,提出miR-574-5p在制备治疗结直肠癌的药物和诊断试剂中的应用。通过抑制miR-574-5p的表达,从而抑制结直肠癌细胞的增殖与侵袭,促进结直肠癌细胞的分化。通过检测miR-574-5p在癌组织及血液中的表达水平,并结合QKI、p27Kip1和β-catenin的表达水平分析,对结直肠癌进行诊断和治疗。
miR-574-5p在制备结直肠癌治疗药物中的应用。
所述结直肠癌的治疗药物,由有效量的miR-574-5p反义核苷酸和药学上可接受的载体或辅料组成,包括利用合成的miR-574-5p反义核苷酸直接给药,通过导入DNA或RNA序列在细胞内产生miR-574-5p反义核苷酸或其它利用miR-574-5p反义核苷酸治疗结直肠癌的药物。
miR-574-5p在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。
所述结直肠癌的诊断试剂,包括利用miR-574-5p的cDNA和互补RNA为探针进行杂交检测miR-574-5p表达,以Real-time PCR和其它PCR方法检测miR-574-5p表达,以miRNA芯片方法检测miR-574-5p表达或以其它检测miR-574-5p表达水平的方法进行结直肠癌诊断。
附图说明
以下附图是对本发明的进一步详细阐明,所述是对本发明的解释而不是限定。数值表示为mean±SEM。NS,无显著差别;*,p<0.05;**,p<0.01;***,p<0.001。C57BL/6-Apcmin/+小鼠和C57BL/6小鼠为16周龄雄鼠,实验裸鼠为5周龄雄鼠。Normal:正常人结直肠上皮组织样本;Tumor:结直肠癌病人肿瘤样本。
图1为C57BL/6-Apcmin/+小鼠结直肠癌组织中,总QKI和QKI5/6/7蛋白表达显著下调。图1b是western分析结果,图1a是其定量分析。
图2为C57BL/6-Apcmin/+小鼠结直肠癌组织中,总Qki和Qki5/6/7信使RNA(mRNA)表达显著下调。
图3为C57BL/6-Apcmin/+小鼠结直肠癌组织中,miR-574-5p、miR-717和miR-20a表达水平显著上调,而miR-200b,miR-466g和miR-17表达水平没有显著变化。
图4为过量表达miR-574-5p,总Qki和Qki5/6/7mRNA表达水平显著下调;抑制miR-574-5p,总Qki和Qki5/6/7mRNA表达水平显著上调。
图5为抑制miR-574-5p,总QKI和QKI5/6/7蛋白表达水平显著上调。
图6为抑制miR-574-5p后,总Qki在HCT116、SW480和SW620中显著上调;Qki5/6/7/7bmRNA在SW480和SW620细胞表达水平显著上升;而在HCT116细胞中只有Qki6/7 mRNA表达水平显著上升,Qki5在HCT116细胞表达水平没显著上升。
图7为抑制miR-574-5p,SW480细胞总QKI和QKI5/6/7蛋白表达水平显著上升。图7b是western分析结果,图7a是其定量分析。
图8为miR-574-5p通过结合于Qki6/7/7b mRNA的3’UTR调控Qki6/7/7b的荧光素酶报告基因分析。
图9为QKI5/6/7抑制β-catenin mRNA的表达。图9a为QKI5抑制β-catenin mRNA的表达;图9b为QKI6抑制β-catenin mRNA的表达;图9c为QKI7抑制β-catenin mRNA的表达
图10为QKI5/6/7抑制β-catenin蛋白的表达。图10a为QKI5抑制β-catenin蛋白的表达;图10b为QKI6抑制β-catenin蛋白的表达;图10c为QKI7抑制β-catenin蛋白的表达
图11为QKI5/6/7通过结合于β-catenin mRNA的3’UTR抑制β-catenin的表达。图11a为QKI5通过结合于β-catenin mRNA的3’UTR抑制β-catenin的表达;图11b为QKI6通过结合于β-catenin mRNA的3’UTR抑制β-catenin的表达;图11c为QKI7通过结合于β-cateninmRNA的3’UTR抑制β-catenin的表达。
图12为QKI5/6/7抑制β-catenin/Wnt信号活性。图12a为QKI5抑制β-catenin/Wnt信号活性;图12b为QKI6抑制β-catenin/Wnt信号活性;图12c为QKI7抑制β-catenin/Wnt信号活性。
图13为过量表达miR-574-5p,SW480和CT26细胞中β-catenin mRNA表达水平显著升高;抑制miR-574-5p,SW480和CT26细胞中β-catenin mRNA表达水平显著降低。
图14为过量表达miR-574-5p,SW480和CT26细胞中β-catenin蛋白表达水平显著升高;抑制miR-574-5p,SW480和CT26细胞中β-catenin蛋白表达水平显著降低。图14b是western实验结果,图14a是其定量分析。
图15为过量表达miR-574-5p,SW480和CT26细胞中p27Kip1mRNA表达水平显著降低;抑制miR-574-5p,SW480和CT26细胞中p27Kip1mRNA表达水平显著升高。
图16为过量表达miR-574-5p,SW480和CT26细胞中p27Kip1蛋白表达水平显著降低;抑制miR-574-5p,SW480和CT26细胞中p27Kip1蛋白表达水平显著升高。图16b是western实验结果,图16a是其定量分析。
图17为抑制miR-574-5p,CT26和SW480细胞的增值能力显著降低。
图18为抑制miR-574-5p导致SW480细胞在G1/S期停滞。
图19为在CT26细胞中,过量表达miR-574-5p显著下调Lactase mRNA表达水平,而抑制miR-574-5p显著上调Lactase mRNA表达水平。
图20为在CT26细胞中,过量表达miR-574-5p显著下调IAP活性,而抑制miR-574-5p显著上调IAP活性。
图21为在CT26细胞中,过量表达miR-574-5p显著增强细胞侵袭能力,而抑制miR-574-5p显著抑制细胞侵袭能力。
图22为在SW480细胞中,过量表达miR-574-5p显著增强细胞迁移能力,而抑制miR-574-5p显著抑制细胞迁移能力。
图23为表达miR-574-5p shRNA的慢病毒处理SW480细胞96小时后,miR-574-5p表达水平显著下调,总Qki mRNA表达水平显著上调。
图24为注射SW480细胞后,裸鼠体内异体移植肿瘤的生长曲线。
图25为注射SW480细胞到裸鼠体内28天后,肿瘤形成大小的比较。
图26为裸鼠异体移植肿瘤组织中,总QKI和PCNA的蛋白表达水平。图26b是western实验结果,图26a是其定量分析。
图27为人结直肠癌组织中,miR-574-5p表达水平显著升高。
图28为人结直肠癌组织中,总Qki mRNA表达水平显著下降。
图29为人结直肠癌组织中,总QKI蛋白表达水平显著下降。
图30为结直肠癌病人样本中,miR-574-5p的表达与总Qki mRNA表达的相关性分析。
图31为结直肠癌病人样本中,miR-574-5p的表达与总QKI蛋白表达的相关性分析。
图32为人结直肠癌组织样品#11-20对中,Qki5 mRNA的表达水平。
图33为人结直肠癌组织样品#11-20对中,Qki6 mRNA的表达水平。
图34为人结直肠癌组织样品#11-20对中,Qki7 mRNA的表达水平。
图35为人结直肠癌组织样品#11-20对中,Qki7b mRNA的表达水平。
图36为人结直肠癌组织样品#16-20对中,QKI5/6/7蛋白表达水平。图36b是western实验结果,图36a是其定量分析。
图37为结直肠癌组织中,QKI蛋白表达的免疫组化分析与miR-574-5p的原位杂交分析。
图38为正常人和结直肠癌病人血液中miR-574-5p的表达水平分析。
具体实施方式
1.在C57BL/6-Apcmin/+小鼠的结直肠癌组织样品中,miR-574-5p与Qki表达负相关
通过生物信息学分析表明,Qki mRNA的3’UTR上有很多miRNA的潜在结合位点,包括miR-574-5p、miR-717和miR-20a。因此,利用Real-time RT-PCR(qPCR)和western blots实验分析了C57BL/6-Apcmin/+小鼠结直肠癌组织样品与正常C57BL/6小鼠结直肠组织样品中Qki表达水平和一些miRNAs表达水平。与正常C57BL/6小鼠结直肠组织样品比较,C57BL/6-Apcmin/+小鼠结直肠癌组织样品中总Qki mRNA/蛋白(pan-Qki/pan-QKI)和Qki5/6/7mRNA/蛋白表达水平都显著降低(图1和图2),miR-574-5p、miR-717和miR-20a的表达水平显著升高,而miR-200b、miR-466g和miR-17没有显著变化(图3)。其中,miR-574-5p是变化最显著的miRNA,上升了约3.7倍。生物信息学分析发现,miR-574-5p在Qki6/7 mRNA的3’UTR上有潜在结合位点,而在Qki5上却没有,暗示miR-574-5p可能与小鼠结直肠癌组织中Qki6/7表达的下调相关。
2.miR-574-5p转录后调控Qki6/7/7b的表达
为了验证miR-574-5p对Qkis的调控作用,在结直肠癌细胞系中过量表达miR-574-5p或抑制miR-574-5p后,利用qPCR和western blots特异性检测Qki的表达水平。小鼠结直肠癌细胞CT26中,转染pmiR-574过量表达miR-574-5p后,总Qki mRNA/蛋白表达水平显著降低,同时Qki5/6/7mRNA/蛋白表达水平也都出现了显著降低;而抑制miR-574-5p的表达后,总Qki mRNA/蛋白表达水平显著升高,同时Qki5/6/7mRNA/蛋白表达水平也都出现了显著升高(图4和图5)。在人结直肠癌细胞HCT116、SW480和SW620中,过量表达miR-574-5p或抑制miR-574-5p后也得到相似的结果(图6和图7)。
为了进一步验证miR-574-5p是否通过结合于Qki mRNA的3’UTR上来调控QKI的表达,分别构建了小鼠Qki5 mRNA的3’UTR荧光素酶报告基因质粒(pmQki5-3’UTR-luc)和Qki7mRNA的3’UTR荧光素酶报告基因质粒(pmQki7-3’UTR-luc)。其中,Qki5 mRNA的3’UTR没有miR-574-5p的潜在结合位点,而Qki7 mRNA的3’UTR含有miR-574-5p的潜在结合位点并且该位点与Qki6/7b的一致。在CT26细胞中,过量表达miR-574-5p可以下调pmQki7-3’UTR-luc的荧光素酶活性,而对pmQki5-3’UTR-luc的荧光素酶活性没有显著影响;抑制miR-574-5p可以上调pmQki7-3’UTR-luc的荧光素酶活性,而对pmQki5-3’UTR-luc的荧光素酶的表达没有显著影响(图8)。这些实验结果表明,miR-574-5p可以通过结合于Qki6/7/7bmRNA的3’UTR调控Qki6/7/7b的表达。Qki7 mRNA的3’UTR上miR-574-5p位点的突变分析进一步证明了miR-574-5p与Qki6/7/7b mRNA的3’UTR的特异性结合(突变:pMT-miR-574-5p-MRE-luc与野生:pWT-miR-574-5p-MRE-luc,图8)。
3.在结直肠癌细胞中,QKI下调β-catenin的表达与活性
β-catenin是QKI蛋白的潜在靶标,在其mRNA的3’UTR上有两个QRE(QKI responseelement)位点。有研究表明,QKI5/6可以抑制β-catenin的表达。因此,希望进一步研究QKI5/6/7对β-catenin的表达和β-catenin/Wnt信号活性的调控机制。首先,在CT26细胞中转染pFlag-mQki5、pFlag-mQki6和pFlag-mQki7过量表达QKI5、QKI6和QKI7,用qPCR和westernblot检测β-catenin mRNA/蛋白的表达,发现β-catenin mRNA/蛋白的表达水平都出现了显著降低,且随着QKI表达量的逐渐增高,β-catenin的表达量也呈逐渐下降(图9和图10)。为了进一步验证QKIs是否是转录后抑制β-catenin的表达,构建了β-catenin mRNA的3’UTR荧光素酶报告基因质粒pmCtnnb1-3’UTR。在CT26细胞中,分别过量表达QKI5、QKI6和QKI7都能抑制β-catenin mRNA的3’UTR的荧光素酶活性,且随着QKI表达量的逐渐增高,荧光素酶活性也呈逐渐下降(图11)。这些实验证明QKI5/6/7都能通过结合于β-catenin mRNA的3’UTR来调控β-catenin的表达。同时,TOP/FOP-Flash实验也表明,QKI5/6/7可以抑制TOP-Flash报告基因的活性,而不影响FOP-Flash报告基因的活性,说明QKI5/6/7具有抑制β-catenin/Wnt信号活性的功能(图12)。
4.miR-574-5p正调控β-catenin,而负调控p27Kip1
为了进一步验证miR-574-5p是否影响β-catenin和p27Kip1的表达,在CT26和SW480细胞中分别过量表达miR-574-5p或抑制miR-574-5p的表达,用qPCR和western blot分析发现,过量表达miR-574-5p后β-catenin mRNA/蛋白表达水平显著升高,p27Kip1mRNA/蛋白表达水平显著降低;而抑制miR-574-5p的表达后,β-catenin mRNA/蛋白表达水平显著降低,p27Kip1mRNA/蛋白表达水平显著升高(图13~16)。这些实验结果表明,miR-574-5p对β-catenin和p27Kip1表达的影响很大程度上是通过下调QKI的表达引起的。
5.miR-574-5p在结直肠癌细胞的增殖、分化和侵袭中的作用
为了评价miR-574-5p调控QKI,进而影响β-catenin和p27Kip1表达的作用,在CT26和SW480细胞中过量表达miR-574-5p或抑制miR-574-5p的表达,观察细胞的各种生理变化。抑制miR-574-5p的表达后,通过MTT法检测发现CT26和SW480细胞的增殖能力显著下降(图17),通过流式细胞技术分析发现SW480的G1期细胞显著增多而S期细胞显著减少,表明细胞停滞于G1/S期(图18)。Lactase和IAP是结肠细胞分化的两个标志物。在CT26细胞中,过量表达miR-574-5p后Lactase mRNA的表达水平显著下降,同时IAP的酶活性也显著降低;抑制miR-574-5p后Lactase mRNA的表达水平显著上升,同时IAP的酶活性也显著上升(图19和图20)。在CT26和SW480细胞中,Transwell和划痕损伤修复的实验结果也表明过量表达miR-574-5p促进了细胞的迁移和侵袭能力,而抑制miR-574-5p则抑制了细胞的迁移和侵袭能力(图21和图22)。
6.抑制miR-574-5p可以抑制结直肠癌细胞在裸鼠中的异体移植
为了进一步研究miR-574-5p在肿瘤发生发展中的作用,验证了miR-574-5p的siRNA对裸鼠异体移植肿瘤生长的影响。与对照组相比,转染了表达miR-574-5p siRNA慢病毒的SW480细胞中,miR-574-5p的表达水平显著降低,总Qki mRNA的表达水平显著升高,且在裸鼠体内肿瘤生长能力显著降低(图23和图24)。在注射28天后,miR-574-5p抑制组的肿瘤大小只有对照组的39%左右,且肿瘤细胞中总QKI和PCNA蛋白表达水平也显著升高(图25和图26)。这些实验表明,在体内,miR-574-5p的siRNA可以通过上调QKI的表达来抑制结直肠癌细胞的肿瘤生长能力。
7.结直肠癌病人的结直肠癌组织中miR-574-5p表达显著升高而QKI表达显著降低
为了验证结直肠癌病人癌组织中miR-574-5p的表达水平与QKI的表达水平的关系,本项目申请的发明人用qPCR和western blot实验检测了30对临床样品。与癌旁组织相比,在大部分的癌组织中miR-574-5p的表达水平显著升高(图27),总Qki的mRNA和蛋白表达水平都显著降低(图28和图29)。个体相关性分析也表明,miR-574-5p的表达水平与总QKI的mRNA和蛋白的表达水平呈相反的趋势(图30和图31)。同时,与癌旁组织相比,Qki5/6/7/7b的mRNA和蛋白表达水平也都显著降低(图32~36)。此外,免疫组化和原位杂交实验也证明,在结直肠癌组织中miR-574-5p的表达水平显著升高,而QKI的表达水平显著降低(图37)。
8.结直肠癌病人的血液中miR-574-5p表达显著上升
为了验证结直肠癌病人血清中miR-574-5p的表达水平,本项目申请的发明人用qPCR法检测了7个正常人血清和12个结直肠癌病人血清样品。在正常人血清中,miR-574-5p的表达水平普遍较低;至少41%结直肠癌病人血清样品中,miR-574-5p的表达水平显著升高(图38)。这些实验表明,与其他检测方法结合,血清中miR-574-5p的表达水平可能可以作为结直肠癌检测的标准之一。