CN104388427A - miRNA-200b在制备β-catenin抑制剂的新用途 - Google Patents
miRNA-200b在制备β-catenin抑制剂的新用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种调节基因表达的非编码核酸，更具体的涉及miRNA-200b在制备β-catenin抑制剂的新用途。发明分别在缺氧缺血性脑损伤组织中过表达和低表达miR-200b，检测期间β-catenin蛋白表达情况，结果显示过表达miR-200b后，β-catenin蛋白表达降低，与此同时低表达miR-200b后，β-catenin蛋白表达升高，说明miR-200b通过调控β-catenin蛋白表达参与缺氧缺血性脑损伤的修复过程。本发明提供了miR-200b的新应用，其在缺氧缺血性脑损伤组织中可以有效的调节β-catenin蛋白表达，对缺氧缺血性脑损伤的修复具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种调节基因表达的非编码核酸，更具体的涉及miR-200b的新用途。
背景技术
microRNAs(miRNAs)是近年来研究发现的一类长度约22-24个核苷酸的非编码小分子RNA，是非编码小RNA(non-coding small RNA)家族中迄今研究最多的成员。目前认为miRNA主要通过以下两方面的机制介导转录后基因调节：mRNA的降解和翻译抑制。具体哪种作用方式取决于miRNA和靶mRNA互补配对的程度。miRNA能调控多种生物学过程，包括细胞周期、凋亡、分化发育和新陈代谢等，它在疾病发病和进展中所显现的治疗潜力已引起人们极大的兴趣。越来越多的证据表明，以miRNA为基础的基因治疗，不管是增强或抑制miRNA的表达和活性，都有很大的应用前景。尽管miRNA的生物合成和具体机制还有许多有待我们去探索，但已有足够的证据表明miRNAs在不同组织和疾病的表达存在差异。通过研究人类疾病中一些miRNA的异常表达，比如癌症，中枢神经系统疾病，感染性疾病，心血管疾病，代谢性疾病，和自身免疫性疾病，可以帮助我们开发新的基因治疗途径。
miR-200家族是由两个簇的五个成员：miRs-200b/c/429和miRs-200a/141组成的。在人类miR-200家族定位在l号和12号染色体上，在小鼠类定位在4号和6号染色体上。miR-200家族中的五个成员拥有高度相似的种子序列，miRs-200b/c/429的种子序列为AAUCU，miRs-200a/141的种子序列为AACACU。目前对miR-200家族的研究主要集中在miR-200家族在上皮间质转化转化和恶性肿瘤转移中的作用。
本发明旨在研究miR-200b在缺氧缺血性脑损伤的组织中与β-catenin的关系。发明首先建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，进行相应组的miRNA激动剂或 拮抗剂转染，分别过表达和低表达miR-200b，于不同时间点取大鼠脑组织检测β-catenin蛋白的变化趋势，从而了解miR-200b对β-catenin的作用。结果显示转染miR-200b后，β-catenin蛋白表达降低，拮抗miR-200b后，β-catenin蛋白表达进一步升高，说明miR-200b可能通过介导β-catenin参与缺氧缺血性脑损伤的修复作用。本发明提供了miR-200b的新应用，即miR-200b在缺氧缺血性脑损伤组织中可以有效的调节β-catenin蛋白的表达，这对缺氧缺血性脑损伤组织修复具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供miRNA-200b在制备β-catenin蛋白表达抑制剂中的应用。
所述miRNA-200b成熟序列为mmu-mir-200b-3p(miRBase登录号为MIMAT0000233)。
术语―miRNA‖(微小RNA)是指任何类型的干扰RNA，包括但不限于，内源微小RNA和人工微小RNA。内源miRNA是在基因组中天然存在的小RNAs，其能够调节mRNA的生产利用。术语―人工的‖或―合成的‖miRNA包括除内源miRNA之外的任何类型的RNA序列，其能够调节mRNA的生产利用。
本发明中miRNA-200b、miR-200b、microRNA-200b属于同一物质的不同表达形式，所代表的意思相同。
进一步，所述的miRNA可以经化学修饰的合成RNA。所述的化学修饰包括糖基修饰、磷酸链修饰、碱基修饰、突出和末端修饰、双螺旋结构修饰等。
核糖上的修饰最为广泛，因为2’-OH不是活性siRNA所必需的。RNA的2’-O甲基化可以提高结合亲和力和抗核酸酶的稳定性，并且在双螺旋中有很好的相容性，这些优点使其成为应用最为广泛的修饰之一。2’-O-甲氧乙基修饰已经用于一个siRNA的3’端突出和正义链上，但不适用于反义链。2’-O-烯丙基修饰除了可以应用在3’端突出外，其他大部分位点修饰都会引起活性降低。siRNA双链上70％的2’-OH被随机替换为2，4-二硝基苯基醚可以改善其诸多性质，如高亲和性、抗核酸酶稳定性和效价。
2’-F-RNA在正义链和反义链上的部分取代都是可以耐受的，有些全取代的siRNA同样具有活性。此外，2’-F-RNA修饰还大大提高siRNA的血浆稳定性， 改善双螺旋的结合亲和性。改变2’-F-RNA的氟原子的立体化学得到2’-F-ANA，它在siRNA双螺旋中也有很好的耐受性，包括对正义链的全修饰和反义链的部分修饰，它的引入也带来高亲和性和抗核酸酶稳定性。
DNA本身也是一种修饰，在它的2’-位没有电负性取代基，这种修饰同样可以被siRNA双螺旋所接受，在3’-突出端，或者碱基配对区域。全部用DNA嘌呤和2’-F-RNA嘧啶修饰的反义链有沉默活性。对反义链5’端的8个碱基区域用dsDNA进行替换有沉默活性，并可降低脱靶效应。
糖环氧也可修饰，4’S-RNA具有高亲和性，而且对核酸酶的稳定性大大提高。它在siRNA双螺旋末端有很好的耐受性。在2条链末端用4’S-RNA和2’-O-甲基、2’-O-甲氧乙基组合修饰显示出很好的效果和血浆稳定性。对2’-和4’-位进行修饰的4’S-FANA插入到2条链的各个位置也显示出siRNA活性。但它的较低亲和性只允许少量插入双螺旋。
LNA修饰同样也应用于siRNA修饰，其构象的刚性特点显著增强了其亲和性。在siRNA上小心引入此种修饰可得到多种类型的功能双螺旋。最常用于修饰的位点是正义链的末端和反义链的3’-突出端。
磷酸链的几种变化也可被RNAi机制接受。硫代磷酸酯键(PS)修饰后与未修饰的siRNA相比，效价相当或有所降低。是否可以全部进行PS修饰依赖于链的结构。已经观察到大量PS修饰后的细胞毒性。但PS修饰对siRNA的生物分布似乎没有明显影响。
硼烷磷酸酯键修饰的siRNA有基因沉默活性，与PS修饰和未修饰的siRNA相比可提高沉默效能。但为了达到最大效能，反义链中心区不宜修饰。这种修饰能显著提高siRNA的抗核酸酶稳定性。
核苷酸的2’，5’连接方式(2’，5’-DNA，或2’，5’-RNA)可以替换3’，5’连接方式，但只适用于正义链，并且会导致部分活性丧失。非离子性的酰胺键已经应用在siRNA的3’-突出端。
碱基修饰。siRNA的碱基修饰更受限制，能稳定A-U碱基配对(5-Br-尿嘧啶和5-I-尿嘧啶代替尿嘧啶，二氨基嘌呤代替腺嘌呤)的修饰可被siRNA接受，但是这种改造会导致活性有所降低。4-硫脲嘧啶修饰已有应用。2-硫脲嘧啶和C-连接的伪尿嘧啶可以提高亲和性，并且可以提高效价和特异性，前提是在双螺旋的合适位置引入。嘧啶的5-甲基化(使用T和5-Me-C代替U和C)常常和糖环的 修饰如DNA，2’-F-ANA和LNA修饰联用。
一些非标准的碱基结构也用于siRNA中。例如二氟代苯基，它与胸腺嘧啶形状相同但不能形成氢键，可以在整个siRNA双螺旋结构中代替某个位置的尿嘧啶碱基，而不会大幅度降低效价或者改变裂解机制。非芳香性的二氢尿嘧啶也可使用，但是由于其对碱基堆积作用没有贡献，所以会降低双螺旋的亲和力，最好插入双螺旋的5’端。
突出和末端修饰。早期研究表明，理想的siRNA由2条21个碱基的链组成，包括2个碱基的3’-突出。这些突出可以用各种方式进行修饰：最初常常使用脱氧残基修饰，既可以降低成本，还可能提高其抗3’-外切核酸酶能力。前述的多数修饰在突出上都可行，还可使用平末端siRNA。平末端siRNA更能抗3’-核酸外切酶。
链末端同样可以进行改造。反义链5’端的化学磷酸化可以确保高效价。此外，在siRNA双螺旋的末端可以连接各种各样的基团，尤其是正义链的末端。这些基团包括翻转的非碱基封端，它有助于增强抗外切核酸酶稳定性。一般认为反义链的5’端对修饰最敏感。
双螺旋结构修饰。双螺旋结构本身可以通过化学合成进行修饰。虽然多数siRNA双螺旋由2条链组成，但已经证明由3条链组成的(1条完整的反义链和2条9-13个碱基的正义链)siRNA可以减少脱靶效应并增加活性；它被称为小中心片段化干扰RNA(small internally segmented interfering RNA，sisiRNA)。siRNA也可由一条链以多种方式形成，如发卡型双螺旋和哑铃型RNA或纳米环结构，它不但保持了RNAi活性，同时还完全避免了核酸外切酶对其的降解。已有研究表明单链反义RNA(没有折叠成双螺旋)可以进入RNAi通路，在一定情况下，其效价接近双螺旋siRNA。
siRNA双螺旋的长度是可以改变的。增加siRNA双螺旋长度作为Dicer的底物，可以提高其效价。重要的是保持长度在30个碱基以下，以避免触发干扰素反应。
进一步，所述miRNA选自pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA及其片段或变体中的一种或几种。
―miRNA侧翼序列‖是指包括miRNA加工元件的核苷酸序列。miRNA加工元件是促成从前体miRNA产生成熟miRNA的最小限度核酸序列。称为 pri-miRNAs的前体miRNA在细胞核中被加工成大约15-70个核苷酸的pre-miRNAs，其折叠成不完全的茎-环结构。
在前体miRNA分子内的miRNA侧翼序列可以处于包含微小RNA序列的茎-环结构的一侧或两侧的侧翼。优选的结构在茎-环结构的两个末端处具有侧翼序列。侧翼序列可以与茎-环结构的一个或两个末端直接相邻，或者可以通过接头、额外的核苷酸或其他分子与茎-环结构相连接。
如本文中所使用的，―茎-环结构‖是指具有二级结构的核酸，所述二级结构包括已知或预知形成双链的核苷酸的区域(茎部分)，所述双链在一侧通过主要地单链的核苷酸的区域(环部分)相连接。术语―发夹‖和―折回‖结构在本文中也用于指茎-环结构。此类结构和术语是本领域众所周知的。在茎-环结构内的核苷酸的实际一级序列不是关键的，只要存在二级结构。如本领域中已知的，二级结构不需要精确的碱基配对。因此，茎可以包含一个或多个碱基错配。备选地，碱基配对可以不包括任何错配。
miRNA优选地与合适的药物载体组合地用于治疗用途。此类组合物包含有效量的化合物以及药学上可接受的载体或赋形剂。制备制剂以适宜于施用方式。药学上可接受的载体部分地由待施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法来决定。因此，存在有广泛多样的包含核酸的药物组合物的合适制剂。
在本发明中所提的反义阻断是抑制microRNA功能最常应用的手段。Krutzfeldt等发现一类新的可以特异且有效地抑制microRNA表达的化学修饰的寡核苷酸，称为antagomirs。antagomirs是胆固醇共轭单链RNA分子(21-23nt)，与成熟的靶microRNA互补。
本发明的目的在于提供一种抑制β-catenin蛋白表达的方法，包括：
1)制备miRNA-200b模拟物；
2)将上步制备的miRNA施用到表达Rac-1蛋白的细胞或组织中。
miRNA模拟物(miRNA mimics)已经成为研究基因调控的工具之一。miRNA mimics是一种RNA分子，可以通过载体导入细胞内，上调miRNA在细胞内或者活体内miRNA浓度，从而调控基因表达。开发的miRNA mimics有两种，一种是前体分子60碱基以上的前体；一种是双链的成熟体分子。这两种分子都已经证实，能够很好的上调miRNA在细胞内的丰度。
进一步，所述miRNA选自pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA 及其片段或变体。
miRNA可以合成获得，例如通过经由技术人员已知的任何合成方法来化学合成核酸。然后，所合成的miRNA可以通过本领域已知的任何方法进行纯化。用于化学合成核酸的方法包括但不限于，体外化学合成，其使用磷酸三酯、磷酸酯或亚磷酰胺化学和固相技术，或者经由脱氧核苷氢膦酸酯中间体。
进一步，所述的miRNA为经化学修饰的合成RNA。所述的化学修饰包括糖基修饰、磷酸链修饰、碱基修饰、突出和末端修饰、双螺旋结构修饰等。
进一步，miRNA-200b通过核酸递送系统递送到细胞或组织中。
所述核酸递送系统包含所希望的核酸，例如但不限于，以作为―裸露‖核酸的―裸露‖形式，或者配制在适合于递送的媒介物中，例如在具有阳离子分子或脂质体形成性脂质的复合物中，或者作为载体的组分，或者作为药物组合物的组分。可以将核酸递送系统直接地(例如通过使其与细胞相接触)或间接地(例如通过任何生物学过程的作用)提供给细胞。例如但不限于，可以通过下列方式将核酸递送系统提供给细胞：胞吞作用，受体靶向，与天然或合成细胞膜片段相偶联，物理手段例如电穿孔，使核酸递送系统与聚合物载体例如控释薄膜或纳米颗粒或微颗粒相组合，使用载体，将核酸递送系统注射到围绕细胞的组织或流体中，核酸递送系统简单扩散穿过细胞膜，或者通过任何主动或被动转运机制而穿过细胞膜。另外，可以通过使用诸如病毒载体的与抗体相关的靶向和由抗体介导的固定化的技术来将核酸递送系统提供给细胞。
进一步，将所述miRNA整合到载体中。
所述载体进一步包含一种或多种体内表达控制元件。其中所述一种或多种体内表达控制元件选自启动子、增强子、RNA剪接位点及其组合。
载体包括但不限于质粒、粘粒、噬菌粒、病毒、源自病毒或细菌来源的其他媒介物，其已经通过插入或掺入用于产生微小RNA的核酸序列和可以附着至这些核酸序列的游离核酸片段而进行了操作。病毒和逆转录病毒载体是优选的载体类型，并且包括但不限于来自下列病毒的核酸序列：逆转录病毒，例如：莫洛尼鼠白血病病毒；鼠干细胞病毒，哈维(Harvey)鼠肉瘤病毒；鼠乳腺肿瘤病毒；劳斯肉瘤病毒；腺病毒；腺伴随病毒；SV40-型病毒；多瘤病毒；EB病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒例如任何逆转录病毒。本领域技术人员可以容易地采用本领域已知的其他载体。
载体优选质粒、粘粒、噬菌粒、病毒和人工染色体中的一种或几种。
所述miRNA可以作为裸露的RNA即在盐水进行施用，或者将siRNA包裹在转运载体上。直接施用包括以静脉内、皮下、肌内、经鼻、腹膜内、经阴道、经肛门、经口、眼内或鞘内方式将所述miRNA直接施用至患病组织。载体方面在siRNA给药方面显示出良好有壳聚糖、树状聚酰胺-胺、聚乙烯亚胺、树状聚赖氨酸、聚乳酸聚乙醇酸共聚物、atelocollagen、环糊精以及基于脂质体或囊泡的siRNA转运系统和包裹siRNA的双分子脂膜等。
脂质体是体外转染时最常用的转染试剂之一，然而，因其毒性、非特异性摄取和免疫反应，使得其很难实现体内安全和高效的转染。多数非特异反应及毒性均源于其微粒表面的正电荷，而这些正电荷正是与核酸结合所必需的。目前市售的几种以脂质体为基础的靶向miRNA的体外转染试剂均应用了这种原理。研究者们开发了聚阳离子脂质体-透明质酸(LPH)的纳米颗粒作为miRNA的运输系统。这种输送系统的优点在于转染siRNA和/或miRNA可以同时抑制几个不同的致癌途径。
聚乙烯亚胺(Polyethyleni—mine，PEI)：聚乙烯是用于基因转染研究最多的聚合物之一。在生理环境下，PEI由于胺基质子化带正电荷，从而可以与核酸聚合。在细胞表面，PEI与核酸形成的带正电荷的阳离子聚合物与细胞表面的带负电荷的多糖聚合，通过内吞作用进入细胞。该多聚物在体内通过所谓的质子海绵效应解聚，PEI大量捕获质子，水进入细胞，导致内皮肿胀，最终释放多聚物到细胞质中。使用PEI作为转染试剂，已经成功将DNA和siRNA转染到在体动物模型中各个组织器官。除了传统的转染方法，以PEI为基础的基因传输系统经进一步修饰还可透过血脑屏障(blood–brain barrier，BBB)。从狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)提取短肽，连接PEI组成的PEI-RVG，能够结合神经细胞表面烟碱乙酰胆碱特异性受体。RVG通过二硫键(RVG-SSPEI)与PEI连接，转染miR-124a，促进神经发生。为克服PEI载体因体积太大无法穿过血脑屏障，可用甘露醇通透血脑屏障。
树枝状聚合物(dendrimer)在基因传输中也引起了较大的关注，其独特的球形结构和较高的表面积与体积比，最大程度减小了细胞毒性，提高了转染效率。用聚酰胺-胺型树枝状高分子(PAMAM)转染miR-21和5-氟尿嘧啶(5-FU)后增加了细胞凋亡。与只用5-FU治疗相比，肿瘤细胞的迁移能力下降。与用紫杉 醇相比，用PAMAM转染抗miR-21后，增加了人脑胶质瘤细胞的化疗敏感性。虽然不是体内转染，这仍表明树枝状聚合物可以用于体内miRNA的转染。
聚乳酸聚乙醇酸共聚物(poly(D，L-lactide-co-glycolideacid)，PLGA)兼具结合miRNA的能力和非特异性进入细胞的能力。PLGAs聚合物易被制成微粒或纳米颗粒结合生物活性分子。用PLGA为材料制得的纳米粒可以起到保护药物、提高生物利用度的作用，达到较长时间的缓控释目的，在临床实验中表现了极大的潜力。在这种情况下，有必要将PLGA微粒聚乙二醇化，稳定空间结构，并且加强细胞渗透能力。
附图说明
图1转染Cy3标记的miR-200b antagomir和antagomir NC后检测结果(荧光显微镜)A：miR-200b antagomir；B：miR-200b antagomir NC；
图2不同时间点miR-200b表达量折线图
图3不同组别转棒时间变化
图4不同组别逃避潜伏期(EL)变化
图5不同组别β-catenin蛋白表达水平
图6不同组别β-catenin蛋白表达量折线图
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1缺氧缺血性脑损伤新生大鼠模型的建立及转染miR-200b对其远期神经学预后的影响
一、缺氧缺血性脑损伤新生大鼠模型的建立
1材料与方法
主要试剂与耗材：
microONTM miR-200b agomir、microONTM miR-200b agomir NC、Cy3标记microOFFTM miR-200b antagomir、Cy3标记microOFFTM miR-200b antagomir NC、Bulge-LoopTM miRNA qRT-PCR Primer、U6snRNA qRT-PCR Primer(上述试剂均来自广州瑞博生物科技有限公司)、EntransterTM-in vivo RNA转染试剂(北京英格恩生物科技有限公司)、miRNA提取试剂盒、miRNA cDNA第一链合成试剂盒、miRNA荧光定量PCR检测试剂盒(上述试剂均来自CWbio.Co.Ltd)
主要实验仪器与设备：
持针器、眼科解剖镊、眼科手术剪、手术台(美国Shor-line)、Ritter无影手术灯(美国MidMark)、微量注射器、分光光度计、带非吸收性外科缝线缝合针(台湾佳合医材股份有限公司)、凝胶成像系统(BIO-RAD)、荧光显微镜(Olympus)、电泳仪(北京六一仪器厂)、实时定量荧光PCR仪7500(美国ABI公司)、超净工作台(北京冠鹏净化设备有限公司)、电热恒温水浴箱(北京西城区医疗器械厂)、冰冻组织切片机(德国leica)
实验动物来源：
SPF级新生3日龄SD大鼠(雌雄不计，体重8-10g)由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[SCXK(京)2012-0001]。
实验方法：
(1)随机分组：
正常对照组(control)：新生3日龄SD大鼠，不予特殊处理。
缺氧缺血组(HI)：新生3日龄SD大鼠，永久结扎左侧颈总动脉，并缺氧2.5h，缺氧缺血12h后双侧侧脑室分别注射2ul的无菌PBS。
激动剂组(HI+agomir)：缺氧缺血(具体方法及实验控制因素同缺氧缺血组)12h后，双侧侧脑室分别注射2ul的miR-200b agomir和纳米转染复合物的混合物。
激动剂阴性对照组(HI+agomir NC)：缺氧缺血12h后，双侧侧脑室分别注射2ul的miR-200b agomir NC(Negative control)和纳米转染复合物的混合物。
拮抗剂组(HI+antagomir)：缺氧缺血12h后，双侧侧脑室分别注射2ul的miR-200b antagomir和纳米转染复合物的混合物。
拮抗剂阴性对照组(HI+antagomir NC)：缺氧缺血12h后，双侧侧脑室分别注射2ul的miR-200b antagomir NC和纳米转染复合物的混合物。
(2)建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型：
缺血：3日龄SD大鼠，4％的水合氯醛腹腔注射麻醉(40ul/只)。小鼠仰位固定于手术操作台上，无菌单固定，颈前部皮肤消毒后，剪开此处皮肤，作颈前正中切口，逐层分离暴露左侧颈总动脉，从分离好的左侧颈总动脉下方穿过2条手术线，分别结扎后从中间剪短。缝合切口。术后在37℃的水浴箱内休息30分钟保暖，完全苏醒后回母笼休息3小时。
缺氧：缺血处理3.5小时后置于密闭的塑料箱中，持续通以氮氧混合气(8％氧气+92％氮气)2.5小时，保持箱内温度37℃。缺氧完成后送回母笼。
(3)在体动物转染miRNA：
①核酸的稀释：将核酸用纯水稀释至2ug/ul，取10ul核酸，加入10％的葡萄糖溶液10ul，使葡萄糖终浓度为5％，终体积为20ul，充分混匀。
②转染试剂的稀释：取5ul的转染试剂EntransterTM-in vivo RNA，用10ul的10％葡萄糖溶液稀释，并用纯水5ul补足，得到葡萄糖终浓度为5％，终体积为20ul的液体，充分混匀。
③转染复合物形成：将稀释后的转染试剂加入到稀释后的核酸溶液中，立即充分混匀。
④室温静置15分钟。
⑤动物注射：大鼠双侧侧脑室注射，每侧2ul(留针30秒，保证液体全部渗入脑组织)。
⑥转染后1d，在转染核酸的各组中随机选取3只大鼠，断头取脑，放入4％多聚甲醛溶液，4度冰箱内固定8小时，20％、30％蔗糖溶液梯度脱水各8小时，行冰冻切片(切片厚度约15μm)后于荧光显微镜下观察转染情况。
⑦分别在注射完成后0h、12h、1d、3d、5d、7d后断头处死，剥离脑组织(去除嗅球和小脑)，存于液氮中，待提取RNA。
(4)实时定量荧光PCR
液氮中取出留取的各时间点的脑组织，行实时定量荧光PCR检测miRNA的变化。具体方法如下：
提取样本总miRNA：
用miRNA提取试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW0627)提取组织样本中总RNA。
①将组织在液氮中磨碎，20mg组织加入1ml的Buffer RLM，震荡混匀。室 温放置5分钟，使核酸复合物完全分离。
②以每1ml Buffer RLM加入200ul氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15s，室温放置5min。
③4度12，000rpm离心15分钟，样品分为三层：红色有机相，中间层和无色水相，将上层水相移到一个新离心管中，进行下一步操作。
④加入1.25倍体积的无水乙醇，混匀。
⑤将上步得到的溶液和沉淀一起转入已装入收集管的吸附柱RM中，(可以分多次转入)。12000rpm离心30s，弃收集管废液，将吸附柱重新重新放回收集管内。
⑥向吸附柱RM中加入700μl Buffer RWT((检查是否加入无水乙醇)，RT，12000rpm离心30S，弃废液。将吸附柱重新重新放回收集管内。
⑦向吸附柱RM中加入500μl Buffer RW2((检查是否加入无水乙醇)RT，12000rpm离心30S，弃废液。将吸附柱重新重新放回收集管内。
⑧重复步骤7。
⑨12000rpm离心1min，弃收集管废液。将吸附柱RS置于室温数分钟，晾干。
⑩将吸附柱RM转入新的1.5ml RNase-free Collection Tube中，加30μlRNase-free Water，室温放置1分钟，12，000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，得到的RNA溶液保存在-70度，防止降解。
电泳：
取5ulRNA用1％琼脂糖凝胶进行电泳。
加尾，反转录：
用miRNA cDNA第一链合成试剂盒(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW2141)进行反转录。
A.miRNA加Poly(A)尾：
①首先根据所用RNA的量，按如下公式，用1mM Tris(PH8.0)来稀释10mM ATP。
②向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入以下试剂至总体积25ul。
③轻轻混匀上述反应液，短暂离心将液体收集于管底。37℃，孵育15分钟，于-20℃。
B.修饰后的miRNA cDNA第一链合成的过程：
①向冰浴中预冷的无RNase反应管中加入下表中试剂，至终体积20ul：
| 试剂 | 体积 |
| 上述Poly(A)反应液 | 4ul |
| 超纯dNTPs(10Mm each) | 1ul |
| 25Um RT primer | 3ul |
| 5XRT Buffer | 4ul |
| SuperRT Reverse Tanscriptase | 0.5ul |
| RNase-Free Water | 7.5ul |
②轻轻混匀上述反应液，短暂离心后将液体收集于管底。42℃，孵育50分钟。
③85℃，孵育5分钟，终止反应。合成的cDNA反应液于-20℃保存备用。
④miRNA Real-time PCR
使用miRNA Real-time PCR Assay Kit(CWbio.Co.Ltd，Cat#CW2142)
1)、室温融化2×miRNA qPCR premix和Reverse primer(10uM)。
2)、使用时请将2×miRNA qPCR premix上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡，并经短暂离心后使用。
3)、将试剂置于冰上，并按以下配制反应体系：
4)、反应程序设置如下：
2统计学分析
所有数据采用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，各组数据以均数表示，多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)：首先进行方差齐性检验，若各组间反应变量为方差齐性，则组间比较采用LSD法；方差不齐采用Duoett’s法，P<0.05为差异有统计学意义。
3实验结果
图像采集：
结果如图1所示，转染后24h，随机选取各组脑组织行冰冻切片，可见带有Cy3荧光标记的miRNA在脑组织内聚集。
qRT-PCR结果：
结果如图2所示，正常对照组和激动剂组miR-200b的表达呈现先升高后降低的趋势，而缺氧缺血组、拮抗剂组、激动剂和拮抗剂的阴性对照组均呈现先降低后升高的趋势。
空白对照组miR-200b的表达量随培养时间增加而逐渐增加，并在转染3d时达到高峰，后缓慢下降；与正常对照组相比，缺氧缺血组miR-200b的表达量在转染0h时升高(P<0.05)，随即呈下降趋势，在转染12h后低于正常对照组，在转染1d、3d、5d时差异均有统计学意义(P<0.05)，在转染5d时表达量逐渐上升恢复至正常水平(P>0.05)。与缺氧缺血组相比，激动剂组在转染0h时miR-200b的表达量较缺氧缺血组无差异(P>0.05)，但在转染12h后miR-200b的表达量明显升高，在转染1d、3d、5d差异均有统计学意义(P<0.05)，在转染5d时趋于正常水平。拮抗剂组在转染0h时miR-200b的表达量较缺氧缺血组也无差异(P>0.05)，其在转染后的各个时间点均与缺氧缺血组差异不大(P>0.05)。激动剂阴性对照组、拮抗剂阴性对照组在各时间点miR-200b的表达量较缺氧缺血组均无明显差异(P>0.05)。
二、转染miR-200b对缺氧缺血性脑损伤新生大鼠远期神经学预后的影响
1材料与方法
主要仪器：
(1)主要实验仪器与设备：
1、水迷宫(安徽正华生物仪器设备有限公司)
2、转棒式疲劳仪(安徽正华生物仪器设备有限公司)
(2)实验动物：同第一部分
实验方法：
(1)建立模型及分组：
随机分为4组，正常对照组(control)，缺氧缺血组(HI)，激动剂组(HI+agomir)，拮抗剂组(HI+antagomir)，各组模型建立方法及实验控制因素同第一部分。
(2)运动协调功能评价：
转棒实验：各组大鼠于生后21天起进行转棒实验测试，连测4天。在正式测试前实验动物被放上转棒仪上适应60s(5rpm)，然后以40rpm恒速测试动物在转棒仪上停留的时间(最长计时5min，超过5min的以5min计算)，每只动物测量1次后休息1h再进行重复测量，取3次测量的平均值为其最终成绩。
(3)认知功能评价：
Morris水迷宫：共测试5天，前4天进行定位航行实验，第5天进行空间探索实验。前4天的定位航行实验中，各组大鼠每天接受3次训练，记录大鼠分别从3个象限(不包括平台所在象限的其他3个象限)不同入水点找到平台所需的时间，即逃避到平台上的潜伏期(escape latency，EL)。3次潜伏期成绩的平均值作为当天最终成绩进行统计。若大鼠在120s内找到平台，则在平台上保持30s；如果在120s内未找到平台，则引导其游向平台并在平台上停留30s，成绩按120s计算。训练从大鼠生后28天开始，每天8:00AM-1:00PM进行。第5天进行空间探索实验时撤去平台，从任意入水点将大鼠放入水中，记录120s大鼠游泳轨迹和跨越平台次数。
2统计方法：
实验数据以均数±标准差表示，数据各组间的显著性检验均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，继以LSD法两两比较。两组间的比较采用独立样本T检验。以P<0.05为差异有显著性意义，在SPSS 13.0统计软件上完成。
3实验结果
(1)转棒实验：
表1 各组大鼠转棒时间
注：同一时间不同分组间差异采用多因素方差分析，a：与对照组相比，P<0.05；b：与缺氧缺血组相比，P<0.05；同组不同时间采用单因素方差分析，有统计学差异后的post-hoc采用SNK两两比较，c为与前一天比较有显著性差异，p<0.05。
实验表明，各组大鼠均随着训练天数增加，转棒时间逐渐延长，各组在第3天转棒时间均较前一天明显延长(P<0.05)。每个检测点，与正常对照组相比，缺氧缺血组、激动剂组、拮抗剂组的转棒时间均明显缩短(P<0.05)。各时间点激动剂组的转棒时间较缺氧缺血组稍有缩短，但差异不显著(P>0.05)，各时间点拮抗剂组的转棒时间与缺氧缺血组相比有所延长，但差异也无统计学意义(P>0.05)(见表1，图3)。
(2)水迷宫实验：
表2 各组大鼠Mirris水迷宫实验结果(±s)
注：同一时间不同分组间差异采用多因素方差分析，a：与对照组相比，P<0.05；b：与缺氧缺血组相比，P<0.05；同组不同时间采用单因素方差分析，有统计学差异后的post-hoc采用SNK两两比较，c为与前一天比较有显著性差异，p<0.05。
在定位航行试验寻找站台中，各组实验动物在训练第3天、第4天的表现均与前一天有显著提高(P<0.05)。训练第1天，四个实验组间平均逃避潜伏期(EL)无显著差异(P>0.05)。从训练第2天开始，缺氧缺血组、激动剂组较正常对照组EL明显延长(P<0.05)，拮抗剂组较正常对照组差异不显著(P>0.05)。各时间点激动剂组较缺氧缺血组EL在训练第4天显著延长(P<0.05)，余时间点差异均无统计学意义(P>0.05)，拮抗剂组的EL较缺氧缺血组无显著差异(P>0.05)(见表2，图4)。
空间探索试验中，与正常对照组相比，缺氧缺血组和激动剂组跨越平台次数降低，差异有统计学意义(P<0.05)。与缺氧缺血组相比，激动剂组跨越平台次数有所减少，但差异不显著(P>0.05)；拮抗剂组较缺氧缺血组跨越平台次数有所增加，差异有统计学意义(P<0.05)(见表2)。
实施例2miR-200b对β-Catenin蛋白表达的调控
一、材料与方法
主要仪器与试剂：
电泳仪(北京六一仪器厂)、转移电泳槽(上海天能科技有限公司)、凝胶成像系统(Bio-Rad)、高速低温离心机(美国BECIIAN，AvantiJ-30I)丙烯酰胺、亚甲叉双丙烯酰胺、SDS、Tris-base、甘氨酸、DTT、AP、Tween-20、TEMED(以上试剂均购自上海康成公司)；甲醇(北京化工厂)；高效RIPA组织/细胞裂解液(Solarbio)；Protease inhibitor cocktail(Amresco)；抗体稀释保护液(北京普利来有限公司)；BCA蛋白浓度测定试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；Western特异发光检测试剂盒(北京英格恩生物科技有限公司)；预染蛋白mrker(Biomed)；PVDF膜(Millipore)；脱脂奶粉(Amresco)。
抗体：β-Catenin抗体、HRP-linked抗体、Anti-mouse IgG，HRP-linked抗体(抗体均购自美国Cell signaling Technology)。
实验动物：同实施例1
常用液体配制备：
1、1.0mol/L Tris·HCl
Tris(MW121.14) 30.29g
蒸馏水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至6.8，最后用蒸馏水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
2、1.5mol/L Tris·HCl(pH8.8)
Tris(MW121.14) 45.43g
超纯水 200ml
溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用超纯水定容至250ml，高温灭菌后室温下保存。
3、10％SDS
SDS 10g
蒸馏水至 100ml
50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。
4、10％过硫酸胺(AP)
过硫酸胺 0.1g
超纯水 1.0ml
溶解后，4℃保存，保存时间为1周。
5、30％Acr/Bic(37.5：1)
丙稀酰胺(Acr) 29g
甲叉双丙稀酰胺(Bic 1g
超纯水至 100ml
37℃下溶解后，4℃保存。使用时恢复至室温且无沉淀。
6、电泳液缓冲液(25mmol/L Tris，0.25mol/L甘氨酸，0.1％SDS)
溶解后室温保存，溶液可重复使用3～5次。
7、转移缓冲液(48mmol/L Tris，39mmol/L甘氨酸，0.037％SDS，20％甲醇)
溶解后室温保存，次溶液可重复使用3-5次。
8、TBS缓冲液(100mmol/L Tris·HCl pH7.5，150mmol/L NaCl)
1mol/LTris·HCl(pH7.5) 10ml
NaCl 8.8g
蒸馏水至 1000ml
9、TBST缓冲液(含0.05％Tween20的TBS缓冲液)
20％Tween20 1.65ml
TBS 700ml
混匀后即可使用，最好现用现配。
10、封闭液(含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液)
脱脂奶粉 5g
TBST 100ml
溶解后4℃保存。使用时，恢复室温，用量以盖过膜面即可。
11、5×SDS上样缓冲液
混匀后，分装于1.5ml离心管中，4℃保存。
12、8％分离胶，10％分离胶，12％分离胶，5％积层胶
5％积层胶(两块胶，4ml)12％分离胶(两块胶，10ml)
10％分离胶(两块胶，10ml)8％浓缩胶(两块胶，10ml)
加TEMED后，立即混匀即可灌胶。
实验方法：
(1)建立模型及分组：
同实施例2。
(2)Western blot实验步骤：
1.提取蛋白：
1.1、在冰上预冷玻璃匀浆器。
1.2、预冷RIPA组织蛋白裂解液，加入蛋白酶抑制剂Protease inhibitor cocktail(1ml：10ul)。
1.3、取适量脑组织置于玻璃匀浆器，将加入蛋白酶抑制剂的组织裂解液按照100mg：1ml的比例加入到各样本脑组织中，进行匀浆。冰上孵育20min后，14000rpm(4度)离心20min，取上清，分装-80度保存，待测。
2.BCA法蛋白定量：
2.1、配制工作液，25ml A液+0.5ml B液(试剂A：B＝50:1)，充分混匀。
2.2、稀释蛋白标准品，取15ul稀释至150ul，使终浓度为0.5mg/ml。
2.3、将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20ul加至96孔板的标准品孔中，并用PBS稀释液补足20ul。
2.4、将1ul待测样品滴加至样品孔中，用标准品稀释液补足至20ul(即稀释20倍)。
2.5、各孔加入200ul BCA工作液，37℃放置30min。
2.6、冷却至室温，用酶标仪测定A562nm，绘制标准曲线图并计算蛋白浓度。
3.蛋白电泳：
3.1正确安装电泳装置。
3.2配制分离胶。(分离胶的浓度根据目的蛋白分子量的不同有所区别，选用10％的浓度)
3.3将分离胶混匀，灌注于垂直平板电泳仪两层玻璃板之间，留出灌注积层胶所需空间(梳子的齿长再加1cm)，在胶上轻轻覆盖一层蒸馏水，以防止氧气扩散进入凝胶抑制聚合反应，室温垂直放置30min。
3.4待分离胶聚合完全后，倒出顶层蒸馏水，用洁净的滤纸吸尽残留液体。制备5％的积层胶，在已聚合的分离胶上直接灌注积层胶，并立即插入梳子，动作轻柔，避免形成气泡，将凝胶垂直置于室温30min。
3.5待积层胶聚合完全后，小心拔出梳子。把凝胶移入电泳槽中。
3.6把已制备好的蛋白样品(β-catenin上样量40ug，β-actin作为内参对照，与相应的目的蛋白加样量保持一致)，置于等体积的2×SDS上样缓冲液中，在沸水浴中加热10min，使蛋白变性。
3.7取上述处理好的样品依次加入加样孔内，另外留一孔加入预染蛋白marker，在不用加样的对照孔中加入等体积的1×SDS上样缓冲液保持左右平衡。
3.8将电泳装置与电源相连(正极接下槽)，凝胶上所加电压为80V，当染料前沿进入分离胶后，将电压提高到120V，继续电泳直至溴酚蓝到达分离胶底部(约2.5h)，关闭电源，将凝胶取出。
4.转膜：
4.1、剪2张洁净滤纸和一张PVDF膜，其大小与凝胶一致。
4.2、PVDF膜于甲醇中浸透3分钟，然后与滤纸一起浸入转膜液中备用。
4.3、转膜电泳仪的转膜夹子用转膜液涂湿后，将滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸由下而上依次叠放于夹板上，保证滤纸、凝胶和PVDF膜对齐，排出气泡。
4.4、盖上盖，连接电极，膜一侧接正极，凝胶一侧接负极，恒流300mA，转膜60分钟。
5.封闭：
转移结束后，取出PVDF膜做好标记，室温下放入封闭液中，在平缓摇动的摇床上温和振荡2h，以消除抗体的非特异性结合。
6.免疫反应：
6.1、一抗孵育：弃去封闭液，立即将PVDF膜放入塑料袋中，加入适量抗体稀释保护液和一抗(一抗用抗体稀释保护液稀释，β-catenin一抗稀释浓度为1:1000，内参β-actin稀释浓度为1:5000)，排出气泡，平放在平缓摇动的摇床上孵育30min后放入4度冰箱孵育过夜。
6.2、二抗孵育：弃去一抗，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10min。然后将PVDF膜放入塑料袋中，加入适量封闭液和辣根过氧化物酶标记的抗体(二抗)，于摇床上室温孵育2h。弃去二抗，用TBST缓冲液洗膜3次，每次10mm。
7.化学发光：取ECL试剂A液和B液各1ml在保鲜膜上混合，PVDF膜蛋白面朝下与此混合液充分接触1min，将PVDF膜移至干净保鲜膜上，去尽残液，包好，放入紫外凝胶成像仪中曝光。
8.Western Blot图像分析及处理：用1D-Gel图像分析软件对Western blot条带进行灰度分析，采用目的蛋白条带与内参β-actin条带灰度值的比值作为结果，以此表示目的蛋白的表达水平。
二、统计方法：
实验数据以均数±标准差表示，数据各组间的显著性检验均采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，继以LSD法两两比较。两组间的比较采用独立样本T检验。以P<0.05为差异有显著性意义，在SPSS 13.0统计软件上完成。
三、实验结果
结果如图5和6所示：实验证实，正常对照组β-catenin蛋白表达在较平稳的低水平状态。与正常对照组相比，缺氧缺血组β-catenin蛋白表达升高，除转染后12h、5d时间点外，其余各时间点差异显著(P<0.05)。与缺氧缺血组相比，激动剂组β-catenin蛋白表达在转染后2d、3d、4d、5d均明显下降(P<0.05)，拮抗剂组β-catenin蛋白表达在转染后12h、1d、2d明显升高(P<0.05)，余时间点差异不显著(P>0.05)。
Claims (11)
1.miRNA-200b在制备β-catenin蛋白表达抑制剂中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA为经化学修饰的RNA。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的化学修饰包括糖基修饰、磷酸链修饰、碱基修饰、突出和末端修饰、双螺旋结构修饰中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA选自pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA及其片段或变体中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述miRNA与药学上可接受的载体或赋形剂组合制备β-catenin蛋白表达抑制剂。
6.一种抑制β-catenin蛋白表达的方法，包括：
1)制备miRNA-200b模拟物；
2)将上步制备的miRNA施用到表达β-catenin蛋白的细胞或组织中。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述miRNA选自pri-miRNA、pre-miRNA、成熟miRNA、dsmiRNA及其片段或变体中的一种或几种。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，中将所述miRNA整合到载体中。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述载体包含一种或多种体内表达控制元件。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对所述的与miRNA为经化学修饰的合成RNA。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过脂质体、基于聚合物的纳米颗粒、胆固醇缀合物、环状葡聚糖复合物、聚乙烯亚胺聚合物或蛋白质复合物施用所述miRNA到表达β-catenin蛋白的细胞或组织中。
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