JP5952423B2 - 新規オリゴヌクレオチド接合体およびその用途 - Google Patents

Description

本発明は、ガンおよび感染性疾病などの治療に有効に使用されることができ、二本鎖または一本鎖オリゴヌクレオチドの伝達を向上させる親水性および疎水性物質が結合している、新たな構造のオリゴヌクレオチド構造体およびその用途に関する。

本発明による第１形態は、前記構造体の親水性物質に標的特異的リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体、前記のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子、前記構造体を含む薬剤学的組成物、前記構造体からなるナノ粒子を含む薬剤学的組成物、前記構造体を製造する方法、前記構造体からなるナノ粒子を製造する方法、及び前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の伝達技術に関する。

また、本発明による第２形態は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（antisense oligonucleotide、以下、「ＡＳＯ」とする）の細胞内の伝達効率を向上させるために単純共有結合またはリンカー媒介（linker-mediated）共有結合によりＡＳＯの両末端に親水性物質および疎水性物質が接合したＡＳＯ接合体、前記接合体の製造方法、および前記ＡＳＯ接合体からなるナノ粒子用の伝達技術に関する。

ＲＮＡ干渉（RNA interference、以下、「ＲＮＡｉ」とする）は、その機能が発見されてから各種の哺乳動物細胞において配列特異的にｍＲＮＡに作用するという事実が明らかになった（Silence of the transcripts; RNA interference in medicine. J. Mol. Med., 2005, 83; 764-773）。長鎖のＲＮＡ二本鎖が細胞に伝達されると、伝達されたＲＮＡ二本鎖は、Ｄｉｃｅｒというエンドヌクレアーゼによって２１〜２３塩基対（base pair、ｂｐ）からなる低分子干渉ＲＮＡ（small interfering RNA、以下、「ｓｉＲＮＡ」とする）に変換される。ｓｉＲＮＡは、ＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）に結合してアンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡを認識して分解する過程により、標的遺伝子の発現を配列特異的に阻害する（NUCLEIC-ACID THERAPEUTICS; BASIC PRINCIPLES AND RECENT APPLICATIONS. Nature Reviews Drug Discovery. 2002. 1, 503-514）。

バートランド（Bertrand）研究チームの研究によると、同じ標的遺伝子に対して、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に比べてｓｉＲＮＡの方が、生体内／外におけるｍＲＮＡ発現の阻害効果に優れ、当該効果を長く保つ効果を奏することが明らかになった（Comparison of antisense oligonucleotides and siRNAs in cell culture and in vivo. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. 296; 1000-1004）。また、ｓｉＲＮＡの作用メカニズムは、標的ｍＲＮＡと相補的に結合して配列特異的に標的遺伝子の発現を調節するため、既存の抗体をベースとする医薬品や化学物質に比べて適用可能な対象が著しく拡大されることができるという利点を有する（Progress Towards in vivo Use of siRNAs. Molecular Therapy. 2006 13(4); 664-670）。

上述の優れた効果および様々な使用範囲を有するｓｉＲＮＡが治療剤として開発されるためには、ｓｉＲＮＡの安定性および細胞伝達効率を改善して、ｓｉＲＮＡが標的細胞に効果的に伝達されるようにする必要がある（Harnessing in vivo siRNA delivery for drug discovery and therapeutic development. Drug Discov Today. 2006 Jan; 11(1-2); 67-73）。

核酸分解酵素抵抗性類似体、又はウイルスベクター、リポソームまたはナノ粒子などの担体を利用することにより前記の問題点を解消しようとする試みが行われている。

アデノウイルスやレトロウイルスなどのウイルス性伝達システムは、トランスフェクション効率（transfection efficacy）が高いが、免疫原性（immunogenicity）および発ガン性（oncogenicity）が高い。これに対し、ナノ粒子を含む非ウイルス性伝達システムは、ウイルス性伝達システムに比べて、細胞伝達効率は低く評価されるが、生体内（in vivo）における高い安定性、標的特異的伝達、内包しているＲＮＡｉオリゴヌクレオチドの細胞または組織への吸収（uptake）および内在化（internalization）などの改善した伝達効果、並びに低い細胞毒性および免疫刺激（immune stimulation）などの利点を有することで、効果的な標的遺伝子の発現阻害をもたらし、最も有効な伝達方法として評価されている（Nonviral delivery of synthetic siRNAs in vivo. J. Clin Invest. 2007 December 3; 117(12); 3623-3632）。

様々なナノ粒子を用いた伝達システムがガン特異的伝達のために開発されているが、かかるナノ粒子システムは、血液内で長期間循環するために表面が親水性物質でコーティングされており、エンドサイトーシスを高めるために正電荷を帯びるように設計されることが一般的である（Active targeting schemes for nanoparticle systems in cancer therapeutics. Advanced Drug Delivery Reviews 60 (2008) 1615-1626）。一方、腫瘍の組織は、非常に堅固で正常組織と比較して拡散制限（diffusion-limitation）を有するが、かかる拡散制限は、腫瘍の成長に必要な栄養分、酸素および二酸化炭素などの老廃物の移動に悪い影響を及ぼすため、血管新生（angiogenesis）により周辺に血管を形成することで拡散制限を乗り越える。血管新生により形成された腫瘍組織内の血管は、腫瘍の種類に応じて、約１００ｎｍ〜２μｍの隙間が存在する緩い血管構造（leaky and defective blood vessel）を有する。

これにより、ナノ粒子は、正常組織の組織化した毛細血管より緩い血管構造を有するガン組織の毛細血管内皮（capillary endothelium）をスムーズに通過して、血液内循環過程中に腫瘍間隙（tumor interstitium）への接近が容易となり、また、腫瘍組織内にリンパ管（lymphatic drainage）が存在せず、薬物が蓄積される結果を示すが、これをＥＰＲ（enhanced permeation and retention）効果という。がかる効果によりナノ粒子が腫瘍組織特異的にスムーズに伝達されることを受動的標的（passive targeting）という（Nanoparticles for drug delivery in cancer treatment. Urol Oncol. 2008 Jan-Feb; 26(1); 57-64）。

抗ガン剤を含む治療薬物の非特異的生体内分布と標的、難溶性（lack of water solubility）などを解消するために、治療薬物が積載（loading）されたナノ粒子の大きさを最適化するか表面を修飾して血液内における循環時間を増進させる研究が行われている。特に、高分子接合体（polymer-drug conjugates）を含む高分子ナノ粒子（polymeric nanoparticle）に関して、アルブミン（albumin）、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（poly-L-glutamate、ＰＧＡ）やＮ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミドコポリマー（N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide copolymer）のような水溶性（water-soluble）、生物分解性（biodegradable）の特性を有する物質と抗ガン剤を連結させて抗ガン剤の腫瘍特異的伝達を改善する研究が行われている（Therapeutic Nanoparticles for Drug Delivery in Cancer. Clin Cancer Res 2008; 14; 1310-1316）。また、抗ガン剤に両親媒性（amphiphilic）の物質を結合して、抗ガン剤の疎水性コア（core）と親水性シェル（shell）からなる高分子ミセル（polymeric micelle）を形成する研究も行われている（Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. J Control Release 2001; 74; 295-302）。

したがって、抗ガン剤などの治療薬物に、疎水性物質をさらに結合してコアの凝集力を増進させる場合、低い濃度でもミセルを形成でき、シェルに存在する親水性物質により、より安定した形態の高分子ミセルを形成することができる。生分解性結合によって両末端に疎水性および親水性物質が付与された治療薬物は、標的臓器であるガン組織に治療薬物を安定的に伝達することができる、改善した形態の高分子ミセルを形成することができる。

近年、二本鎖オリゴＲＮＡを伝達する技術として、核酸の末端に結合した物質の特性により形成された自己組織化ナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡを形成する技術が開発された（韓国公開特許第２００９−００４２２９７号公報）。ＳＡＭｉＲＮＡは、二本鎖オリゴＲＮＡの伝達を向上させる親水性および疎水性高分子が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなる自己組織化ナノ粒子であり、ＳＡＭｉＲＮＡ形成技術は、二本鎖オリゴＲＮＡの細胞内への伝達を改善した技術と言える

ＳＡＭｉＲＮＡに蛍光標識を付着させた腫瘍が移植されているマウスモデル（tumor xenograft mouse model）の尾静脈に投与した場合、上述した受動的標的によって腫瘍特異的にナノ粒子が伝達されることが確認された（図２参照）。

一方、能動的標的（active targeting）は、標的化部分（targeting moiety）がナノ粒子に結合したものであって、ナノ粒子の標的組織での蓄積を増進させるか、または標的細胞内にナノ粒子が伝達される内在化（internalization）を改善すると報告されている（Does a targeting ligand influence nanoparticle tumor localization or uptake Trends Biotechnol. 2008 Oct; 26(10); 552-8. Epub 2008 Aug 21）。

能動的標的は、ナノ粒子に抗体やリガンドのような標的化部分（targeting moiety）を結合して改善した標的細胞への伝達を誘発するものである。近年、ｓｉＲＮＡに様々な標的化部分を結合して所望の組織に伝達する研究が行われている。

その例として、α−トコフェロールが結合したｓｉＲＮＡが効果的且つ安定的に生体内に伝達されて、ＲＮＡ干渉現象によって標的遺伝子の発現を阻害することを見出し（Kazutaka Nishina et al., The American Society of Gene therapy, 2008, 16(4); 734-740）、また、コレステロールが結合したｓｉＲＮＡが、ｓｉＲＮＡの伝達に主に使用される細胞浸入（penetration）を促進するペプチドであるＣＰＰ（cell penetratingpeptide）より優れた肝臓組織への伝達効果を奏することを見出した（US-20060014289; Moschos S.A. et al., Bioconjug. Chem. 18; 1450-1459）。当該伝達効果は、腫瘍組織の特異性だけでなく、結合した標的化部分による標的細胞の特異性によってその効果が現れるという結果が報告されている。

能動的標的は、標的細胞表面特異的または過剰発現している糖鎖、受容体、抗原と結合できる能力を有する物質を用いる（Nanotechnology in cancer therapeutics;bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006; 5(8); 1909-1917）。したがって、能動的標的化部分が結合したナノ粒子は、受動的標的によって血液内で循環する間に腫瘍組織に蓄積され、標的化部分によってナノ粒子の標的細胞内伝達が増加し、細胞に伝達された薬物の治療効果が向上する。この際、標的化部分としては、主に、リガンドや抗体が用いられるが、これは、細胞表面の受容体と高い親和性と特異性（avidity and specificity）を有して結合し、受容体を介したエンドサイトーシス（receptor-mediated endocytosis、ＲＭＥ）によりナノ粒子の内在化（internalization）を促進する（Kinetic analysis of receptor-mediated endocytosis (RME) of proteins and peptides; use of RME as a drug delivery system. J Control Release 1996; 39; 191-200）。

かかるリガンドまたは抗体の標的となる細胞表面の受容体や抗原は、標的細胞において特異的または過剰発現されて標的リガンドの接近を容易にする必要があり、これによってエンドサイトーシス効率（rate of endocytosis）が高い特徴を有し、また、当該受容体や抗原は、リガンドが結合したナノ粒子を細胞内に伝達した後、細胞表面にまた表出（recycle back）される特性を有する（Receptor-mediated endocytosis; An overview of a dynamic process. J. Biosci., Oct. 1984, 6(4), pp. 535-542.）。腫瘍標的化部分は、上皮成長因子（epidermal growth factor）や低密度リポタンパク質受容体（low-density lipoprotein receptor）などの標的細胞株において特異的に発現する受容体や、様々なガンの細胞表面において過剰発現するとして知られた葉酸受容体などの腫瘍特異的な受容体に、特異的に結合する物質を用いる（Nanotechnology in cancer therapeutics; bioconjugated nanoparticles for drug delivery. Mol Cancer Ther 2006, 5(8); 1909-1917）。

ＳＡＭｉＲＮＡに、標的化部分、特に、受容体を介したエンドサイトーシスの特性を有する受容体に特異的なリガンドが結合すると、標的細胞、特に、ガン細胞の内部への伝達を効率よく促進するようになり、比較的低い濃度の投与量でも標的細胞に伝達されて、二本鎖オリゴＲＮＡの活性が高くなることができ、他の臓器および細胞への非特異的な二本鎖オリゴＲＮＡの伝達を阻害することができる。

また、前記ＳＡＭｉＲＮＡ形成技術は、二本鎖オリゴＲＮＡだけでなく、一本鎖オリゴヌクレオチド、特に、治療を目的とする一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）にも適用されることができる。

ＡＳＯ技術は、一本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡ鎖を介してｍＲＮＡの代謝（metabolism）を変更することで、遺伝子からタンパク質への情報伝達を調節する技術である。すなわち、十分に相補的、特異的に混成化する塩基配列を選択して、標的タンパク質の好ましい発現抑制が行われるようにするものである。ＡＳＯの結合は、標的遺伝子に配列特異的に結合するため、標的遺伝子以外の他の遺伝子発現には影響を与えない。したがって、ＡＳＯ技術は、特定のタンパク質の生体内における機能を分析するために有効なツールであるだけでなく、特定の疾病に対する遺伝子治療法としての活用可能性も有する（FASEBJ. 9, 1288-1296, 1995）。

また、近年、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの新たな種類の一つであるアンタゴｍｉｒ（antagomir）が開発されて、細胞由来のｍｉＲＮＡ（microRNA）の機能を阻害するために使用されている。化学的に合成した短いＲＮＡであるアンタゴｍｉｒあるいはｍｉｃｒｏＲＮＡ阻害剤（miRNA inhibitor）は、標的となるｍｉｃｒｏＲＮＡに相補的に結合してその機能を阻害すると知られている。通常、アンタゴｍｉｒは、分解されることを防止するために、２'メトキシやホスホチオエートなどの修飾された化学構造を有することが好ましく、現在、ガン、心臓および肺線維症をはじめ様々な疾病に係るｍｉＲＮＡの機能を阻害するアンタゴｍｉｒが報告されている（Silencing of microRNAs in vivo with ‘antagomirs',Nature, Dec. 2005, 438(7068); 685-689; MicroRNAs as Therapeutic Targets, New England J. Medicine, 2006, 354(11); 1194-1195; Meister G. et al., Sequence-specific inhibition of microRNA-and siRNA-induced RNA silencing, RNA, Mar. 2004, 10(3); 544-550）。

アンチセンスＤＮＡは、標的ｍＲＮＡと結合してＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖を形成し、このＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖構造は、生体内に存在するＲＮａｓｅ Ｈ（ＲＮａｓｅ Ｈ；リボ核酸分解酵素の一種としてＲＮＡ／ＤＮＡ混成二本鎖が形成されているｍＲＮＡを特異的に分解する酵素）の攻撃を受けて分解が誘発される。アンチセンスＲＮＡは、ＲＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を形成し、ＲＮａｓｅ Ｌの攻撃を受けて標的ｍＲＮＡの分解が誘発される。ＲＮａｓｅ Ｌは、二本鎖ＲＮＡ周辺の一本鎖ＲＮＡを優先して分解するリボ核酸分解酵素である（Pharmacol. Toxicol. 32, 329-376, 1992）。

しかし、ｍｉＲＮＡ阻害剤であるアンタゴｍｉｒを含むＡＳＯが標的細胞に効果的に伝達された場合に所望の効果を奏することができ、血液内に存在する核酸分解酵素によってＡＳＯが分解される可能性があるため、ＡＳＯを治療のために用いるためには、ＡＳＯ接合体が細胞膜を効率よく透過して伝達される必要があり、体内におけるＡＳＯ安定性が確保されなければならない。（Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22(3); 142-151, 2007）。

したがって、ほとんどのＡＳＯは、生体内安定性を向上させるために、核酸分解酵素抵抗性を有する様々な修飾（modification）が行われたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）の形態を有するが、前記修飾は、一つ以上のヌクレオチド内の糖構造の２’炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）、−ＯＣＨ_３、−ＮＨ_２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル、−Ｏ−プロピル、−Ｏ−２−メチルチオエチル、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾；ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄で置換された修飾；ヌクレオチド間の結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホネート結合への修飾などのいずれか一つ以上が組み合わされて使用されてもよく、ＰＮＡ（ペプチド核酸）またはＬＮＡ（ロックト核酸（locked nucleic acid））形態への修飾が使用されてもよい（Ｃｒｏｏｋｅなど、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．５５；ｐｐ６１−６５ ２００４、米国特許第５，６６０，９８５号、米国特許第５，９５８，６９１号、米国特許第６，５３１，５８４号、米国特許第５，８０８，０２３号、米国特許第６，３２６，３５８号、米国特許第６，１７５，００１号、Ｂｒａａｓｃｈ Ｄ．Ａ．など、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１４；１１３９−１１４３，２００３；Ｃｈｉｕ Ｙ．Ｌ．など、ＲＮＡ，９；１０３４−１０４８，２００３；Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ Ｍ．など、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．３１；５８９−５９５，２００３参照）。

ＡＳＯを標的細胞内に伝達するために、アデノウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルスを用いた遺伝子伝達技術と、リポソーム、カチオン性脂質またはカチオン性高分子を用いた非ウイルス性担体（non-viral carrier）を用いた遺伝子伝達技術が開発されてきた。しかし、ウイルス性担体は、宿主の染色体に導入されて宿主遺伝子の正常機能の異常を誘発したり、発ガン遺伝子を活性化させないと確信できず、安定性における問題点があり、ウイルス遺伝子が少量でも発現し続けて自己免疫疾患を誘発したり、ウイルス担体から修飾した形態のウイルス性感染が誘発される場合にＡＳＯを効率よく伝達できないこともある。

したがって、かかる問題点を改善するために、非ウイルス性担体であるリポソームに遺伝子を融合させる方法やカチオン性脂質や高分子を用いた方法などにおいて、それらが有する欠点を改善する方向に研究が行われている。これらの非ウイルス性担体は、ウイルス性担体に比べて効率性に劣るが、生体内安定性と経済性に鑑みて、副作用が少なく、生産コストが下がるという利点がある（Lehrman S. Nature. 401(6753); 517-518, 1999）。

非ウイルス性担体を用いたＡＳＯを含むＯＤＮ分子の安定的伝達を効果的に行うために、酵素または非酵素的な分解を防止する効果的方法が求められるが、ＡＳＯを化学的に修飾する方法により核酸分解酵素に対する不安定性および細胞内への低い吸収率を改善する方法が提案されている（Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3); 142-151, 2007）。

一方、ＰＥＧ（polyethylene glycol）を接合した高分子は、互いの相互作用によって自発的に形成されたミセル構造を有する複合体を形成するが、これを高分子複合体ミセルという（Kataoka K. et al. Macromolecules, 29; 8556-8557, 1996）。これらの高分子複合体ミセルは、薬物伝達の担体として使用される他のシステム、すなわち、微小球体、ナノ粒子などに比べて、その大きさが極めて小さいながらも極めて一定に分布され、自発的に形成される構造を有することで、製剤の品質管理および再現性確保が容易であるという利点がある。

近年、ＡＳＯの細胞内伝達効率を向上させるために、ＡＳＯに生体適合性高分子であるＰＥＧなどの親水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介共有結合で接合した接合体により、ＡＳＯの安定性確保および効率的な細胞膜透過性のための技術が開発された（韓国登録特許第０４６６２５４号公報）。しかし、化学的修飾およびＰＥＧ（polyethylene glycol）の接合（PEGylation）だけでは、ＡＳＯの生体内安定性の改善および標的組織への伝達が十分に行われないという欠点が依然として存在する。

上述したように、ｓｉＲＮＡの伝達のためにｓｉＲＮＡに疎水性および親水性物質を付与して細胞伝達を改善したナノ粒子に係る技術であるＳＡＭｉＲＮＡ技術が開発されたが、前記技術がＡＳＯの伝達に適用された例は報告されていない。したがって、ＡＳＯに様々な化学的修飾の導入および高分子物質の接合によってこれらを分解酵素から保護して安定性を向上させようとする試みにより、ＡＳＯの安定性を確保し、効率的な細胞膜透過性の向上を保証できるＡＳＯの担体およびその製造技術の開発が必然的に求められる。

本発明による第１形態において、本発明の目的は、治療用薬物の細胞内伝達効率性を向上させるために、治療用薬物の両末端に生体適合性高分子化合物である親水性および疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介共有結合で結合した治療用薬物の親水性物質にリガンドが結合した治療用薬物構造体、および前記構造体からなるナノ粒子およびその製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、治療用薬物、特に、二本鎖オリゴＲＮＡの細胞内伝達効率性を向上させるために、二本鎖オリゴＲＮＡの末端に生体適合性高分子化合物である親水性および疎水性物質を単純共有結合またはリンカー媒介共有結合で結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の親水性物質に標的細胞、特に、ガン細胞特異的に細胞内在化（internalization）を増進させる受容体を介したエンドサイトーシス特性を有する受容体に特異的なリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体、前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子および前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体または前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を含む薬剤学的組成物を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体およびこれを含むナノ粒子の製造方法、および前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を用いた二本鎖オリゴＲＮＡの伝達技術を提供することにある。

二本鎖オリゴＲＮＡ構造体に標的特異的リガンドが結合する場合、当該リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子は、標的細胞に効率よく伝達されることができ、これにより、比較的低い濃度のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を投与しても、標的細胞において二本鎖オリゴＲＮＡの活性を示すことができる。また、リガンドの結合は、他の臓器および細胞への非特異的な二本鎖オリゴＲＮＡの伝達を阻害することができ、これにより、様々な疾病に対する二本鎖オリゴＲＮＡ治療用ツールだけでなく、新たな形態の二本鎖オリゴＲＮＡ伝達システムとして有効に使用されることができ、特に、ガンおよび感染性疾病などの治療に有効に使用されることができる。

本発明の第２形態において、本発明の目的は、前記のような従来技術における問題点を解決するために開発されたものであって、ＡＳＯの細胞内伝達効率を向上させるために、ＡＳＯの両末端に、生体適合性高分子である親水性物質および疎水性物質を、単純共有結合またはリンカー媒介（linker-mediated）共有結合により接合したＡＳＯ−高分子接合体、およびその製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、前記ＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子を用いたＡＳＯ伝達技術、および前記ＡＳＯ−高分子接合体またはＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子のいずれかを含む薬学的組成物を提供することにある。

本発明において提供されるＡＳＯ−高分子接合体およびＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子は、ＡＳＯの生体内安定性を向上させることで、細胞内に治療用ＡＳＯを効率よく伝達することができ、トランスフェクション物質がなくても末端が修飾されないＡＳＯに対し、比較的低い濃度の投与量でＡＳＯの活性を示すことができ、これにより、ガンおよび感染性疾病などの様々な疾病のためのＡＳＯ治療用ツールだけではなく、新たな形態のＡＳＯ伝達システムとして、バイオテクノロジーのための基礎研究と医薬産業において非常に有効に使用されることができる。

リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が形成するナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ）の模式図である。 ＳＡＭｉＲＮＡの腫瘍特異的伝達を示す図であり、（Ａ）は、腫瘍移植されたマウスにＣｙ５．５が標識されたＳＡＭｉＲＮＡを５ｍｇ／ｋｇ体重の量で尾静脈に一回投与した後、時間の経過に対するＳＡＭｉＲＮＡの生体内分布を確認する写真（赤い点線で標識された部分が腫瘍移植部位）であり、（Ｂ）は、ＳＡＭｉＲＮＡの投与後、４８時間が経過した時点で各組織を採取して測定したＳＡＭｉＲＮＡの体外の写真である。 １，３，４，６−テトラアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン（1,3,4,6-Tetraacetyl-NAG）（化合物Ａ）のＮＭＲ分析結果を示す図である。（^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ_６）；δ７．８９ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），５．６４ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），５．２７ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．３Ｈｚ），５．０７ｐｐｍ（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．７，３．６Ｈｚ），４．２２ｐｐｍ（１Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．３Ｈｚ），４．１４−３．９６ｐｐｍ（２Ｈ，ｍ），２．１２ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），２．０４ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），１．９９ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），１．９１（３Ｈ，ｓ），１．７８ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ）） ３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン（3,4,6-Triacetyl-1-Hexa(Ethylene Glycol)-NAG）（化合物Ｂ）のＮＭＲ分析結果を示す図である。^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ_６）；δ７．７１ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），５．２１ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），４．９７ｐｐｍ（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．１，３．０Ｈｚ），４．５６ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），３．８８ｐｐｍ（１Ｈ，ｑ，Ｊ＝８．７Ｈｚ），３．８３−３．７４ｐｐｍ（１Ｈ，ｍ），３．６２−３．３９ｐｐｍ（２５Ｈ，ｍ），２．１０ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），２．０１ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），１．８９ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），１．７７ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ） １−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ホスホラミダイト（1-Hexa(Ethylene Glycol)-NAG-Phosphoramidite）（化合物Ｃ）のＮＭＲ分析結果を示す図である。（Ａ）：^１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ_６）；δ７．７８ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．３Ｈｚ），５．２１ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝３．０Ｈｚ），４．９７ｐｐｍ（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝１１．１，３．６Ｈｚ），４．５６ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝８．１Ｈｚ），３．８８ｐｐｍ（１Ｈ，ｄ，Ｊ＝９．０Ｈｚ），３．８１−３．４１ｐｐｍ（３０Ｈ，ｍ），２．８９ｐｐｍ（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．７Ｈｚ），２．１１ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），２．００ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），１．８９ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），１．７７ｐｐｍ（３Ｈ，ｓ），１．２０−１．１２ｐｐｍ（１２Ｈ，ｍ），（Ｂ）：^３１Ｐ ＮＭＲ ｄａｔａ（１２１ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−Ｄ_６）；δ１４７．３２ｐｐｍ ＲＮＡ一本鎖の製造過程を示す図である。 二本鎖オリゴＲＮＡの５’末端にＰＥＧが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造反応式および製造結果であり、（Ａ）は、ＰＥＧ−ホスホラミダイトを用いて二本鎖オリゴＲＮＡにＰＥＧを結合する過程であり、（Ｂ）は、５’末端修飾が行われていない一本鎖ＲＮＡ（２１ｍｅｒ）の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）結果を示す結果図（配列番号１、ＭＷ６６６２．１）であり、（Ｃ）は、５’末端にＰＥＧが結合した一本鎖ＲＮＡ（２１ｍｅｒ）の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）結果を示す図（配列番号１、ＭＷ８６６２．１）である。 モノ−ＮＡＧ−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造反応式および製造結果であり、（Ａ）は、Ｎ−アセチルガラクトサミン−ホスホラミダイトを用いてＰＥＧ−ＲＮＡにＮ−アセチルガラクトサミン（ＮＡＧ）を結合する過程であり、（Ｂ）は、ＰＥＧ−ＲＮＡ（緑、ＭＷ８６２４．１）にＮ−アセチルガラクトサミンが結合したＮＡＧ−ＰＥＧ−ＲＮＡ（青、ＭＷ９１７１．２）構造体の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）結果を示す図であって、Ｎ−アセチルガラクトサミンの分子量（ＭＷ５４７）だけ中心ピークが移動したことを確認した結果を示している。 トリ−ＮＡＧ−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造反応式および製造結果であり、（Ａ）は、デンドリマホスホラミダイト（dendrimer phosphoramidite）およびＮ−アセチルガラクトサミン−ホスホラミダイト（NAG-Phosphoramidite）を用いてＰＥＧ−ＲＮＡにＮ−アセチルガラクトサミンを結合する過程であり、（Ｂ）は、ＰＥＧ−ＲＮＡ（緑、Ｍ．Ｗ．８６２４．１）とＮ−アセチルガラクトサミンが結合したモノ−ＮＡＧ−ＰＥＧ構造体（青、ＭＷ９１７１．２）およびトリ−ＮＡＧ−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体（赤、ＭＷ１０６３０）の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）結果を比較する図である。 ５’葉酸−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造反応式および製造結果であり、（Ａ）は、ＮＨＳ−葉酸によりＰＥＧ−ＲＮＡに葉酸を結合する過程であり、（Ｂ）は、ＰＥＧ−ＲＮＡ（緑、ＭＷ８６２４．１）と葉酸が結合した葉酸−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体（青、ＭＷ９２７７．８）の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）結果を比較する図であり、葉酸の分子量（ＭＷ６１５）だけ中心ピークが移動したことを確認した結果図である。 ５’Ｃ_２４−ＲＮＡ構造体の製造結果であり、（Ａ）は、配列番号１と相補的な配列の一本鎖ＲＮＡの質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）結果図（ＭＷ７３４９．５）であり、（Ｂ）は、配列番号１と相補的な配列の一本鎖５’Ｃ_２４−ＲＮＡ構造体の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）結果図である（ＭＷ７８３０．２）。 アミン−ＣＰＧによる３’ＣＰＧ−アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造過程を示す図である。 アミン−ＣＰＧによる３’ＣＰＧ−アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体の製造過程を示す図である。 ３’葉酸−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造反応式および製造結果であり、（Ａ）は、ＮＨＳ−葉酸により３’アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体に葉酸を結合する過程であり、（Ｂ）は、３’葉酸−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）結果を示す図である（配列番号１、ＭＷ９２７７．７）。 ５’葉酸−ＲＮＡ−高分子構造体からなるナノ粒子（葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ）の物性分析結果を示す図であり、（Ａ）は、葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡの大きさおよび多分散指数（polydisperse index、ＰＤＩ）グラフであり、（Ｂ）は、葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡの臨界ミセル濃度グラフである。 葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡの葉酸受容体過剰発現細胞株における標的遺伝子発現阻害向上効果を示す図であり、葉酸受容体が過剰発現する細胞株であるＫＢ腫瘍細胞に葉酸が存在するか否かによる葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡおよびＳＡＭｉＲＮＡを葉酸を含まない条件および葉酸を過量含む条件下で処理して、４８時間が経過した時点で腫瘍細胞株内の標的遺伝子のｍＲＮＡ量をｑＰＣＲで測定した（Without Folate in culture medium：葉酸を含まない条件、With Folate in culture medium：過量（１ｍＭ）の葉酸を含む条件、Ｃｏｎ：対照群配列である配列番号２の二本鎖オリゴＲＮＡ−高分子構造体からなるナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡ−Ｃｏｎを処理した実験群、ＳＡＭ：サバイビン配列である配列番号１の二本鎖オリゴＲＮＡ−高分子構造体からなるナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒを処理した実験群、葉酸−ＳＡＭ：サバイビン配列である配列番号１の葉酸リガンドが結合した形態の葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子である葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒを処理した実験群）。 葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡの腫瘍組織内の標的遺伝子発現阻害効果を示す図であり、葉酸受容体が過剰発現する細胞株であるＫＢ腫瘍細胞からなる腫瘍を有するマウスの尾静脈にＳＡＭｉＲＮＡおよび葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡを５ｍｇ／ｋｇ体重の量で１回投与した後、４８時間または７２時間が経過した時点で、腫瘍組織内の標的遺伝子（サバイビン）のｍＲＮＡ量をｑＰＣＲで測定した（ＰＢＳ：陰性対照群、ＳＡＭｉＲＮＡ：リガンドが結合していないサバイビン配列である配列番号１の二本鎖オリゴＲＮＡ−高分子構造体からなるナノ粒子であるＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒ投与群、葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ：葉酸リガンドが結合したサバイビン配列である配列番号１のナノ粒子である葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒ投与群）。 ＡＳＯ−高分子接合体を含むナノ粒子の模式図である。 本発明によるＡＳＯおよびＡＳＯ−高分子接合体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳを用いた質量分析結果のスペクトルであり、５と３の両末端に４個のヌクレオチドが２−ＯＣＨ_３（メトキシ）で修飾されたヌクレオチド配列であり、「ｍ」は、ＯＣＨ_３（メトキシ）基を意味する。（Ａ）は、ＡＳＯのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ データ（Ｍ．Ｗ．５９６７．９Ｄａ）であり、（Ｂ）は、ＡＳＯ−高分子接合体のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦデータ（Ｍ．Ｗ．８４４８Ｄａ）である。 ＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子の物性分析結果であり、（Ａ）は、ＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子の大きさおよび多分散指数（Polydispersity index、ＰＤＩ）値のグラフであり、（Ｂ）は、ＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子の臨界ミセル濃度グラフである。 本発明によるＡＳＯおよびＡＳＯ−高分子接合体の腫瘍細胞内の標的遺伝子発現阻害効果を確認するための各処理濃度（１０、５０、１００ｎＭ）によるｍＲＮＡ発現量の分析結果を示す図である（ｓｃｒａｍｂｌｅ：対照群配列である配列番号４のＡＳＯ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ：サバイビン配列である配列番号３のＡＳＯ、ＡＳＯ：何も接合していないＡＳＯ、ＡＳＯ−高分子接合体：３’ＰＥＧ−ＡＳＯ−５’脂質形態のＡＳＯ高分子接合体）。

１．本発明の第１形態
本発明の第１形態において、アンチセンス鎖は、ＲＩＳＣ（RNA-induced silencing complex）で標的ｍＲＮＡと相補的に結合して標的ｍＲＮＡを分解するＲＮＡｉ活性を示す鎖であり、センス鎖は、アンチセンス鎖と相補的な配列を有する鎖を意味する。

本発明において、相補的または相補的結合とは、二つの配列が互いに結合して二本鎖構造をなすことを意味し、必ずしも完全な相補的（perfect match）結合である必要はなく、一部の配列が相違する場合（mismatch）であってもよい。

本発明は、下記式（１）の構造を有するリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体を提供する：
（式（１）中、Ａは、親水性物質であり、Ｂは、疎水性物質であり、ＸとＹは、互いに独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｒは、治療用薬物であり、Ｌは、受容体を介したエンドサイトーシスにより標的細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有するリガンドである。）

この際、治療用薬物は、抗ガン剤、二本鎖オリゴＲＮＡ、抗ウイルス剤、ステロイド系消炎剤（ＳＡＩＤ）、非ステロイド系消炎剤（ＮＳＡＩＤ）、抗生剤、抗真菌剤、ビタミン、ホルモン、レチノイン酸、プロスタグランジン、プロスタサイクリン、抗代謝剤、縮瞳剤（micotics）、コリン作動薬物、アドレナリン拮抗剤、抗痙攣剤、抗不安剤、静穏剤、抗うつ剤、麻酔剤、鎮痛剤、同化性ステロイド剤、エストロゲン、プロゲステロン、グリコサミノグリカン、ポリヌクレオチド、免疫抑制剤、免疫促進剤から選択されてもよい。

本発明における治療用薬物は、二本鎖オリゴＲＮＡまたは抗ガン剤であることが好ましい。この際、治療用薬物が二本鎖オリゴＲＮＡの場合、前記親水性物質は、二本鎖オリゴＲＮＡの３’または５’末端のいずれかの位置に結合していてもよい。

本発明のリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体において、二本鎖オリゴＲＮＡまたは抗ガン剤に結合した親水性物質の特定の位置、特に、末端にリガンドをさらに備えていてもよい。前記リガンドは、標的細胞特異的に細胞内在化を増進させるＲＭＥ特性を有する標的受容体特異的抗体やアプタマー｛aptamer、標的分子に高い親和性と特異性で結合する特徴を有する一本鎖核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは修飾核酸）｝、ペプチドまたは葉酸（通常、Ｆｏｌａｔｅ（葉酸）とｆｏｌｉｃ ａｃｉｄ（葉酸）は、互いに互換的に使用されており、本発明における葉酸は、自然状態または人体で活性化形態のＦｏｌａｔｅ（葉酸）を意味する）、Ｎ−アセチルガラクトサミン（N-Acetylgalactosamine、ＮＡＧ）、マンノースを含む化学物質などから選択されてもよい。この際、リガンドは、標的受容体特異的に伝達を行うようにする物質であって、前記抗体、アプタマー、ペプチドおよび化学物質に限定されるものではない。

前記二本鎖オリゴＲＮＡは、１９〜３１個のヌクレオチドからなることが好ましい。本発明において使用可能な二本鎖オリゴＲＮＡとしては、遺伝子治療用または研究用に使用されるか使用可能性のあるいかなる遺伝子に対する二本鎖オリゴＲＮＡが採択されてもよい。

前記疎水性物質は、疎水性相互作用を起こし、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を形成させる機能を果たす。前記疎水性物質の中でも特に炭素鎖やコレステロールは、二本鎖オリゴＲＮＡの合成段階において容易に接合可能な利点を有しており、本発明の構造体の製造において非常に好適である。

前記疎水性物質は、分子量２５０〜１，０００であることが好ましいが、特に、疎水性物質としては、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ_１２〜Ｃ_５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、リポポリアミンなどが使用されてもよく、これに制限されず、本発明の目的に適合するものであれば、いかなる疎水性物質を使用してもよい点は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとっては自明なことである。

特に、前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメートおよびコレスタニルアミンからなる群から選択されてもよく、前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどから選択されてもよく、この際、グリセリドの脂肪酸は、Ｃ_１２〜Ｃ_５０の不飽和または飽和脂肪酸であることを特徴とする。

また、前記親水性物質は、分子量が２００〜１０，０００のカチオン性または非イオン性高分子物質であることが好ましく、より好ましくは１，０００〜２，０００の非イオン性高分子物質である。例えば、親水性高分子化合物としては、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリオキサゾリンなどの非イオン性親水性高分子化合物を使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではない。

前記親水性物質は、必要に応じて、リガンドとの結合のために必要な官能基を有するように変更されてもよい。前記親水性物質の中でも特にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、様々な分子量と官能基を導入することができ、生体内親和性が良好で、免疫反応を誘導しないなど、生体適合性に優れており、二本鎖オリゴＲＮＡの生体内での安定性を増加させ、伝達効率を増加させる点から、本発明のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造において非常に好適である。

前記共有結合を媒介するリンカーは、親水性物質（または疎水性物質）と二本鎖オリゴＲＮＡの残基の末端で共有結合し、必要に応じて、所定の環境で分解可能な結合を提供する限り特に限定されるものではない。したがって、前記リンカーは、構造体の製造過程中に二本鎖オリゴＲＮＡおよび／または親水性物質（または疎水性物質）を活性化するために結合するいかなる化合物を含んでもよい。

また、前記共有結合は、非分解性結合または分解性結合のいずれであってもよい。この際、非分解性結合としては、アミド結合またはリン酸結合が挙げられ、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合などが挙げられ、必ずしもこれに限定されるものではない。

下記式（２）のように二本鎖オリゴＲＮＡセンス鎖の３’末端に親水性物質が結合し、親水性物質にリガンドが結合し、５’末端に疎水性物質が結合した形態のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を提供し、これを製造する方法は、（１）官能基−親水性物質が結合した固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、（２）前記官能基−親水性物質が結合したＲＮＡ一本鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合する段階と、（４）前記官能基−ＲＮＡ−高分子構造体および別に合成した相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を固形支持体から分離する段階と、（５）前記官能基によりリガンドを親水性物質の末端に結合する段階と、（６）前記リガンドが結合したＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖を形成する段階と、を含むリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造方法である：
（式（２）中、Ａは、親水性物質であり、Ｂは、疎水性物質であり、ＸとＹは、互いに独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖であり、Ｌは、受容体を介したエンドサイトーシスにより標的細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有するリガンドである。）

より好ましい具体例は、（１）官能基が結合している固形支持体（ＣＰＧ）に親水性物質を結合する段階と、（２）官能基−親水性物質が結合している固形支持体（ＣＰＧ）にＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、（３）前記ＲＮＡ一本鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合する過程で合成する段階と、（４）合成が完了すると、固形支持体（ＣＰＧ）から官能基−ＲＮＡ−高分子構造体および別に合成した相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離する段階と、（５）前記官能基を用いて親水性物質の末端にリガンドが結合したＲＮＡ−高分子構造体を製造する段階と、（６）製造されたリガンドが結合したＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングしてリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する段階と、を含むことができる。前記（６）段階の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物とＲＮＡ−高分子構造体および相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を分離して精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望のＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡが製造されているか否かを確認することができる。前記製造方法において、（３）段階で合成したＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階は、（１）段階の前または（１）〜（６）段階のいずれか一つの過程中に行われてもよい。

他の様態において、下記式（３）のように、二本鎖オリゴＲＮＡセンス鎖の５’末端に親水性物質が結合し、親水性物質にリガンドが結合し、３’末端に疎水性物質が結合した形態のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を提供し、これを製造する方法は、（１）官能基が結合している固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、（２）段階（１）で得られた物質に親水性物質を共有結合する段階と、（３）段階（２）で得られた物質にリガンドを共有結合する段階と、（４）段階（３）で得られた物質を固形支持体から分離する段階と、（５）段階（４）で得られた物質に、３’末端に結合した官能基により疎水性物質を共有結合する段階と、（６）段階（５）で得られた物質と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖を形成する段階と、を含むリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造方法である：

より好ましい具体例は、（１）官能基が結合している固形支持体（ＣＰＧ）をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、（２）前記ＲＮＡ一本鎖の５’末端に親水性物質を共有結合する過程で合成する段階と、（３）前記ＲＮＡ一本鎖の親水性物質にリガンドが結合した官能基−ＲＮＡ−親水性高分子構造体を合成する段階と、（４）合成が完了すると、固形支持体（ＣＰＧ）からリガンドが結合した官能基−ＲＮＡ−親水性高分子構造体を分離する段階と、（５）官能基により疎水性物質を結合して、リガンドが結合したＲＮＡ−高分子構造体を合成する段階と、（６）製造されたＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖オリゴＲＮＡ−高分子構造体を製造する段階と、を含むことができる。

前記段階（５）の後、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物を精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定し、所望のＲＮＡ−高分子構造体およびＲＮＡが製造されているか否かを確認することができる。前記製造方法において、（１）段階で合成されたＲＮＡ一本鎖の配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を合成する段階は、（１）段階の前または（１）〜（６）段階のいずれか一つの過程中に行われてもよい。

さらに他の様態において、下記式（４）のように、二本鎖ＲＮＡセンス鎖およびアンチセンス鎖の５’末端に親水性物質または疎水性物質が結合した形態のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造する過程は、（１）固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、（２）前記ＲＮＡ一本鎖の５’末端に親水性物質を共有結合する段階と、（３）前記ＲＮＡ一本鎖の親水性物質にリガンドを結合する段階と、（４）固形支持体からリガンドが結合したＲＮＡ−親水性高分子構造体および別に合成した相補的な配列のＲＮＡ−疎水性高分子構造体の一本鎖を固形支持体から分離する段階と、（５）前記リガンドが結合したＲＮＡ−親水性高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ疎水性高分子構造体をアニーリングして二本鎖を形成する段階と、を含むリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造方法において、（１）〜（４）段階の間に、（１）段階のＲＮＡ一本鎖と相補的な配列からなるＲＮＡ一本鎖を合成した後、疎水性物質を共有結合して、疎水性物質が結合した形態のＲＮＡ−疎水性高分子構造体一本鎖を合成する段階をさらに含むことを特徴とする製造方法である：
（前記式（４）中、Ａは、親水性物質であり、Ｂは、疎水性物質であり、ＸとＹは、互いに独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｓは、二本鎖オリゴＲＮＡのセンス鎖であり、ＡＳは、二本鎖オリゴＲＮＡのアンチセンス鎖であり、Ｌは、受容体を介したエンドサイトーシスにより標的細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有するリガンドである。）

また、本発明は、前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を含むナノ粒子、および前記リガンドが結合した治療薬物−高分子構造体を含むナノ粒子を提供する。

本発明のリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体間の相互作用によりナノ粒子が形成される。詳細には、ナノ粒子の構造について記述すると、ナノ粒子の中心に疎水性物質が位置し、二本鎖オリゴＲＮＡは外部の親水性物質によって保護され、リガンドがナノ粒子の表面に位置する形態のナノ粒子を形成する（図１参照）。前記のナノ粒子は、リガンドによる二本鎖オリゴＲＮＡの細胞内伝達により改善した細胞伝達効率を有し、これを疾病の治療のために応用することができる。より具体的な構造体の合成と構造体からなるナノ粒子の特徴、細胞伝達効率および効果については、後述する実施例においてより詳細に説明する。

また、本発明は、前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体またはリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体からなるナノ粒子を用いた遺伝子治療方法を提供する。

具体的に、前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を準備する段階と、前記ナノ粒子を動物の体内に導入する段階と、を含む治療方法を提供する。

また、本発明は、前記リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子の薬剤学的有効量を含む薬剤学的組成物を提供する。

本発明の組成物は、投与のために、前記の有効成分以外に薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んでなることができる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能である必要があり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のいずれか一つ以上の成分を混合して使用してもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化することができる。特に、凍結乾燥化（lyophilized）した形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥化の剤形を製造するために、本発明が属する技術分野において通常知られている方法が使用されてもよく、凍結乾燥化のための安定化剤が追加されてもよい。

さらに、当分野の適正な方法またはレミントン薬学科学（Remington’s pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA）に開示されている方法を用いて、各疾病または成分に応じて好ましく製剤化することができる。

本発明の薬剤学的組成物は、通常、患者の症状と疾病の深刻度に応じて本技術分野における通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態に製剤化することができ、単位投与量または多回投与量容器、例えば、シールしたアンプルおよびビンなどで提供されることができる。

本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与が可能である。本発明による薬剤学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではなく、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、硬皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。

かかる臨床投与のために、本発明の薬剤学的組成物は、公知の技術を用いて好適な剤形に製剤化することができる。本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度などに応じてその範囲が様々であり、本技術分野における通常の専門家が容易に決定することができる。

２．本発明の第２形態
本発明による第２形態の課題を果たすための本発明は下記構造のＡＳＯ−高分子接合体を提供する：
（前記式（５）中、ＡとＢのいずれか一つは、親水性物質であり、他の一つは、疎水性物質であり、ＸとＹは、互いに独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｒは、ＡＳＯである。）

本発明におけるＡＳＯは、ｍＲＮＡの発現を抑制するために用いられる通常のアンチセンスオリゴヌクレオチドだけでなく、ｍｉＲＮＡ（microRNA）の機能を阻害するアンタゴｍｉｒも含む意味で使用される。

前記式（５）中、親水性物質は、標的特異的なリガンドが付着した形態を有することができる。前記標的特異的リガンドは、標的特異的に細胞内在化を増進させるＲＭＥ特性を有する標的特異的抗体やアプタマー、受容体特異的リガンドなどから選択されるペプチド；または葉酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン（N-acetylgalactosamine、ＮＡＧ）、マンノースを含む化学物質などから選択されてもよい。この際、標的化部分は、標的特異的に伝達を行うようにする物質であって、前記抗体、アプタマー、ペプチドおよび化学物質に限定されるものではない。

本発明の接合体において、前記ＡＳＯは、１０〜５０個のオリゴヌクレオチドを含むことが好ましく、より好ましくは、１３〜２５個のオリゴヌクレオチドを含む。

また、生体内安定性を向上させるために核酸分解酵素抵抗性を有する様々な修飾が行われたオリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ；oligodeoxynucleotide）形態を含む。前記修飾は、一つ以上のヌクレオチド内の糖構造の２炭素位置で−ＯＨ基が−ＣＨ_３（メチル）、−ＯＣＨ_３、−ＮＨ_２、−Ｆ（フッ素）、−Ｏ−２−メトキシエチル、−Ｏ−プロピル、−Ｏ−２−メチルチオエチル、−Ｏ−３−アミノプロピル、−Ｏ−３−ジメチルアミノプロピル、−Ｏ−Ｎ−メチルアセトアミドまたは−Ｏ−ジメチルアミドオキシエチルへの置換による修飾；ヌクレオチド内の糖構造内の酸素が硫黄で置換された修飾；ヌクレオチド間の結合のホスホロチオエートまたはボラノリン酸、メチルホスホネート結合への修飾；などのいずれか一つ以上が組み合わされて使用されてもよく、ＰＮＡ（peptide nucleic acid）またはＬＮＡ（locked nucleic acid）形態への修飾が使用されてもよい。

本発明において使用可能なＡＳＯは、治療用または研究用に使用されているものに特に限定されず、遺伝子治療用または研究用に使用されているか使用可能性のあるいかなる遺伝子に対するＡＳＯが採択されてもよい。

また、本発明におけるＡＳＯは、所望のｍＲＮＡと完全に相補的結合の関係にあるものだけでなく、一部の配列で相補的結合をなさなくても所望のｍＲＮＡと結合して、そのようなｍＲＮＡの翻訳を阻害できる不完全な相補的結合の関係にあるものを使用してもよいことは、通常の技術者にとっては自明なことである。

前記親水性物質としては、分子量２００〜１０，０００の親水性物質が好ましく、分子量が１，０００〜２，０００の高分子化合物より好ましい。また、前記親水性物質は、カチオン性または非イオン性高分子化合物であることが好ましい。

例えば、親水性高分子化合物は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、およびポリオキサゾリンなどの非イオン性の親水性高分子化合物を使用することが好ましいが、必ずしもこれに限定されるものではない。

前記親水性物質は、必要に応じて、他の物質の接合のために必要な官能基を有するように変更されてもよい。前記親水性物質の中でも、特に、ＰＥＧは、様々な分子量と官能基を導入することができ、生体内親和性が良好で、免疫反応を誘導しないなど、生体適合性に優れており、生体内でＡＳＯの安定性を増加させ、伝達効率を増加させることで、本発明の接合体を製造するために非常に好適である。

また、前記疎水性物質は、分子量２５０〜１，０００の疎水性物質であることが好ましいが、その中でも好ましい疎水性物質としては、ステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ_１２〜Ｃ_５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、リポポリアミンなどが使用されてもよく、これに制限されず、本発明の目的に適合するものであれば、いかなる疎水性物質を使用してもよい点は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者にとっては自明なことである。

特に、前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメートおよびコレスタニルアミンからなる群から選択されてもよく、前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドなどから選択されてもよく、この際、グリセリドの脂肪酸は、Ｃ_１２〜Ｃ_５０の不飽和または飽和脂肪酸であることを特徴とする。

前記疎水性物質は、疎水性相互作用を起こし、ナノ粒子を形成させる機能を果たす。前記疎水性物質の中でも、特に、炭素鎖やコレステロールは、ＡＳＯの製造段階において容易に接合可能な利点を有しており、本発明の接合体の製造において非常に好適である。

また、前記式（１）中、ＸまたはＹと表される共有結合は、非分解性結合または分解性結合のいずれであってもよい。この際、非分解性結合としては、アミド結合またはリン酸結合が挙げられ、分解性結合としては、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合または酵素分解性結合などが挙げられ、必ずしもこれに限定されるものではない。

ＡＳＯ−高分子接合体は、親水性物質がＡＳＯの５’末端または３’末端に結合することができ、その反対の末端に疎水性物質が結合する形態を有する。

ＡＳＯの３末端に親水性物質が結合した形態のＡＳＯ−高分子接合体を製造する方法は、（ａ）固形支持体に親水性物質を共有結合する段階と、（ｂ）前記親水性物質を含む固形支持体をベースとし、ＡＳＯを合成する段階と、（ｃ）前記固形支持体上のＡＳＯの５’末端に疎水性物質を共有結合する段階と、（ｄ）前記親水性物質と疎水性物質が結合したＡＳＯ−高分子接合体を固形支持体から分離および精製する段階と、を含むことを特徴とする。

より好ましい具体例は、３’末端部位に親水性物質が結合した固形支持体（solid support；固形支持体は、Controlled Pore Glass（ＣＰＧ）を使用）をベースとし、合成する段階と、親水性物質が共有結合した固形支持体（ＣＰＧ）をベースとし、遮断除去（deblocking）、結合（coupling）、キャッピング（capping）および酸化（oxidation）の過程によりＡＳＯを合成する段階と、前記ＡＳＯの５’末端に疎水性物質を共有結合する過程で合成する段階と、により所望のＡＳＯ−高分子接合体を製造する方法が挙げられ、ＡＳＯ−高分子接合体の製造が完了すると、６０℃の恒温槽で２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア処理を施して、固形支持体（ＣＰＧ）からＡＳＯ−高分子接合体を分離し、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物とＡＳＯ−高分子接合体を分離、精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望のＡＳＯ−高分子接合体が製造されているか否かを確認することができる。

さらに他の様態において、ＡＳＯの５’末端に親水性物質が結合した形態のＡＳＯ−高分子接合体を製造する方法は、（ａ）官能基が付着している固形支持体をベースとし、ＡＳＯを合成する段階と、（ｂ）前記ＡＳＯ５’末端に親水性物質を共有結合する段階と、（ｃ）前記親水性物質が結合したＡＳＯ接合体を固形支持体から分離する段階と、（ｄ）前記固形支持体から分離したＡＳＯ３’末端に疎水性物質を共有結合する段階と、を含むことを特徴とする。

より好ましい具体例は、官能基が付着しているＣＰＧをベースとし、ＡＳＯを合成する段階と、前記ＡＳＯの５’末端に親水性物質を共有結合する過程で合成する段階と、合成が完了すると、６０℃の恒温槽で２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア処理を施して、固形支持体（ＣＰＧ）から官能基が付着したＡＳＯ−親水性高分子接合体を分離する段階と、前記官能基により疎水性物質を付着して、両末端に親水性高分子および疎水性物質が付着したＡＳＯ−高分子接合体を合成する段階と、を含んでなり、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物とＡＳＯ−高分子接合体を分離して精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望のＡＳＯ−高分子接合体が製造されているか否かを確認することができる。

一方、本発明のＡＳＯ−高分子接合体は、リガンドがさらに結合した形態を有することができるが、この際、リガンドは、親水性物質に結合している形態を有する。

親水性物質にリガンドが結合する形態は、リガンドに付着した官能基に応じて決定されるが、例えば、ホスホラミダイトの形態に製造されたリガンド−ホスホラミダイトは、ＡＳＯの合成過程と同じ方法で親水性物質に結合することができ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide、ＮＨＳ）−リガンド形態のリガンドは、親水性物質にＮ−ヒドロキシスクシンイミド（N-Hydroxysuccinimide（ＮＨＳ））エステル結合で結合することができる。

ＡＳＯの３’末端に親水性物質が付着した形態のＡＳＯ−高分子接合体にリガンドが付着した形態のリガンド結合ＡＳＯ−高分子接合体を製造する方法は、（ａ）官能基が付着している固形支持体に親水性物質を結合する段階と、（ｂ）前記官能基−親水性物質が結合している固形支持体にＡＳＯを合成する段階と、（ｃ）前記ＡＳＯ５’末端に疎水性物質を共有結合する段階と、（ｄ）前記親水性物質と疎水性物質が結合したＡＳＯ−高分子接合体を固形支持体から分離する段階と、（ｅ）前記固形支持体から分離したＡＳＯ−高分子接合体の親水性物質の末端にリガンドを結合する段階と、を含むことを特徴とする。

より好ましい具体例は、官能基が付着している固形支持体（ＣＰＧ）に親水性物質を結合する段階と、官能基−親水性物質が結合している固形支持体（ＣＰＧ）にＡＳＯを合成する段階と、前記ＡＳＯの末端基に疎水性物質を共有結合する過程で合成する段階と、合成が完了すると、固形支持体（ＣＰＧ）から官能基−ＡＳＯ−高分子接合体を分離する段階と、前記官能基によりリガンドを親水性高分子の末端に付着して、リガンド結合ＡＳＯ−高分子複合体を製造する段階と、を含んでなり、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物とＡＳＯ−高分子接合体を分離して精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望のリガンド結合ＡＳＯ−高分子接合体が製造されているか否かを確認することができる。

さらに他の様態において、ＡＳＯの５’末端に親水性物質が付着した形態のＡＳＯ−高分子接合体にリガンドが付着した形態のリガンド結合ＡＳＯ−接合体を製造する方法は、（ａ）官能基が付着している固形支持体をベースとし、ＡＳＯを合成する段階と、（ｂ）前記ＡＳＯの末端に親水性物質を共有結合する段階と、（ｃ）前記親水性物質が結合したＡＳＯ接合体にリガンドを共有結合する段階と、（ｄ）前記官能基が付着したＡＳＯ−親水性高分子−リガンド接合体を固形支持体から分離する段階と、（ｅ）前記固形支持体から分離したＡＳＯの３’末端に疎水性物質を共有結合する段階と、を含むことを特徴とする。

より好ましい具体例は、官能基が付着している固形支持体（ＣＰＧ）をベースとし、ＡＳＯを合成する段階と、前記ＡＳＯの末端基に親水性物質を共有結合する過程で合成する段階と、前記ＡＳＯ−親水性物質にリガンドを共有結合する過程で合成する段階と、合成が完了すると、固形支持体（ＣＰＧ）から官能基が付着したＡＳＯ−親水性高分子−リガンド接合体を分離する段階と、前記官能基により疎水性物質を付着して親水性高分子の反対側の末端に疎水性物質が付着したリガンド結合ＡＳＯ−高分子接合体を合成する段階と、を含んでなり、製造が完了すると、高速液体クロマトグラフィーにより前記反応物とＡＳＯ−高分子接合体を分離して精製した後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置で分子量を測定して、所望のリガンド結合ＡＳＯ−高分子接合体が製造されているか否かを確認することができる。

前記のように、本発明において合成されたＡＳＯ−高分子接合体は、疎水性物質および親水性物質の両方を含んでいる両親媒性であり、親水性物質は、体内に存在する水分子と水素結合などの相互作用により親和力を有することで外側に向かうようになり、疎水性物質は、それらの疎水性相互作用により内側に向かうようになり、熱力学的に安定したナノ粒子を形成する。すなわち、ナノ粒子の中心に疎水性物質が位置し、ＡＳＯの外側に親水性物質が位置してＡＳＯを保護する形態のナノ粒子を形成する（図１８参照）。このように形成されたナノ粒子は、ＡＳＯの細胞内伝達能を向上させ、これを疾病の治療のために応用することができる。より具体的な接合体の製造と接合体からなるナノ粒子の特徴、細胞伝達効率および効果については、後述する実施例においてより詳細に説明する。

また、本発明は、前記ＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子を準備する段階と、前記ナノ粒子により生体外でＡＳＯを伝達する段階と、を含む遺伝子治療方法を提供する。前記遺伝子治療方法は、生体外に適用することに限定されるものではない。

また、本発明は、前記ＡＳＯ−高分子接合体またはＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子の有効量を含む薬剤学的組成物を提供する。

本発明の組成物は、投与のために、前記の有効成分以外に薬剤学的に許容可能な担体を１種以上含んでなることができる。薬剤学的に許容可能な担体は、本発明の有効成分と両立可能である必要があり、食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝食塩水、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノールおよびこれらの成分のいずれか一つ以上の成分を混合して使用してもよく、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤など、他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤をさらに添加して、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形に製剤化することができる。特に、凍結乾燥化（lyophilized）した形態の剤形に製剤化して提供することが好ましい。凍結乾燥化の剤形を製造するために、本発明が属する技術分野において通常知られている方法が使用されてもよく、凍結乾燥化のための安定化剤が追加されてもよい。

さらに、本発明が属する技術分野において通常使用される適正な方法またはレミントン薬学科学（Remington’s pharmaceutical Science, Mack Publishing company, Easton PA）に開示されている方法を用いて、各疾病または成分に応じて好ましく製剤化することができる。

本発明の薬剤学的組成物は、通常の患者の症状と疾病の深刻度に応じて本技術分野における通常の専門家が決定することができる。また、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、注射剤、軟膏剤、シロップ剤などの様々な形態に製剤化することができ、単位投与量または多回投与量容器、例えば、シールしたアンプルおよびビンなどで提供されることができる。

本発明の薬剤学的組成物は、経口または非経口投与が可能である。本発明による薬剤学的組成物の投与経路は、これらに限定されるものではなく、例えば、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、硬皮、皮下、腹腔内、腸管、舌下または局所投与が可能である。かかる臨床投与のために、本発明の薬剤学的組成物は、公知の技術を用いて好適な剤形に製剤化することができる。

本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、方法、排泄率および疾病の重症度などに応じてその範囲が様々であり、本技術分野における通常の専門家が容易に決定することができる。

以下、実施例を参照して本発明についてより詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されないということは、当該技術分野における通常の知識を有する者にとって自明なことである。

≪実施例１：結合可能なリガンド物質の製造≫
リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造するために、二本鎖オリゴＲＮＡ構造体に結合可能なリガンド物質を製造した。

実施例１−１：１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ホスホラミダイト（1-Hexa(Ethylene Glycol)-N-AcetylGalactosamine-Phosphoramidite）試薬（化合物Ａ、Ｂ、Ｃ）の製造
Ｎ−アセチルガラクトサミン（N-Acetyl Galactosamine、ＮＡＧ）を二本鎖オリゴＲＮＡ構造体に結合するために、下記反応式Ｉに示すように、１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ホスホラミダイト（1-Hexa(Ethylene Glycol)-NAG-Phosphoramidite）を製造した。

実施例１−１−１：１，３，４，６−テトラアセチル−ＮＡＧ（1,3,4,6-Tetraacetyl-NAG）（化合物Ａ）の製造
出発物質の塩酸ガラクトサミン（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（２ｇ、９．２７ｍｍｏｌ）、アセトニトリル（Acetonitrile、ＳＡＭＣＨＵＮ社製、韓国）（３１ｍＬ）、トリエチルアミン（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（１５．４２ｍＬ、１１１．２４ｍｍｏｌ）を混合して１時間還流する。徐々に常温に冷却し、冷却水を用いて０℃に冷却した後、無水酢酸（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（８．７６ｍＬ、９２．７０ｍｍｏｌ）を１０分間滴加した。滴加が完了した後、冷却水を除去し、常温で２４時間攪拌した。反応が完了すると、重炭酸ナトリウム（ＳＡＭＣＨＵＮ社製、韓国）水溶液にｐＨが中性になるまで徐々に投入した。ｐＨが中性になってから常温で２時間攪拌して生成された固体を濾過し、濾過物をエチルアセテート（ＳＡＭＣＨＵＮ社製、韓国）（１００ｍＬ×２）、蒸留水（１００ｍＬ×２）、エチルアセテート（１００ｍＬ×１）の順に洗浄した。固体を真空乾燥して、１，３，４，６−テトラアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン（１．８２ｇ、５２．３％）を得た（図３参照）。

実施例１−１−２：３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン（3,4,6-Triacetyl-1-Hexa(Ethylene Glycol)-NAG）（化合物Ｂ）の製造
前記実施例１−１−１で得られた１，３，４，６−テトラアセチル−Ｎ−アセチルガラクトサミン（１．８１ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）、塩化鉄（III）（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（１．０２ｇ、６．２７ｍｍｏｌ）、メチレンクロライド（ＳＡＭＣＨＵＮ社製、韓国）（４８ｍＬ）を混合して常温で攪拌した。１０分間攪拌した後、ヘキサ（エチレングリコール）（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（１．５８ｍＬ、４．８２ｍｍｏｌ）を投入して２時間還流した。反応が完了すると、セライト（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）を使用して濾過し、濾過物をメチレンクロライド（５０ｍＬ×２）で洗浄した。濾液を減圧濃縮し、エチルアセテート（１００ｍＬ）と蒸留水（１００ｍＬ）を投入して水層を抽出した。取得した水層をメチレンクロライド（１００ｍＬ×３）で抽出して有機層を集めて無水硫酸マグネシウム（ＳＡＭＣＨＵＮ社製、韓国）で乾燥して濾過した。濾液を減圧濃縮し、真空乾燥して、３，４，６−トリアセチル−１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン（２．２４ｇ、７４．９％）を得た（図４参照）。

実施例１−１−３：１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ホスホラミダイト（1-Hexa(Ethylene Glycol)-NAG-Phosphoramidite）（化合物Ｃ）の製造
前記実施例１−１−２で得られた（２．２２ｇ、３．７１ｍｍｏｌ）、メチレンクロライド（３７ｍＬ）、トリエチルアミン（０．９４ｍＬ、６．７５ｍｍｏｌ）を混合して常温で攪拌した。１０分間攪拌した後、２−シアノエチルＮ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト（2-Cyanoethyl N,N-diisopropylchlorophosphoramidite、ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（０．７５ｍＬ、３．３８ｍｍｏｌ）を投入して４５分間攪拌した。反応が完了すると、減圧濃縮し、エチルアセテート（１００ｍＬ）と蒸留水（１００ｍＬ）を投入して有機層を抽出した。取得した有機層を無数硫酸マグネシウムで乾燥し、濾過した。濾液を減圧濃縮し、カラムで分離して、１−ヘキサ（エチレングリコール）−Ｎ−アセチルガラクトサミン−ホスホラミダイト（１．１４ｇ、４２．２％）を得た（図５参照）。

実施例１−２：ＮＨＳ−葉酸の製造
葉酸を二本鎖オリゴＲＮＡ構造体に結合するために、下記反応式ＩＩに示すように、ＮＨＳ−葉酸を製造した。

出発物質の葉酸（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（３ｇ、６．８ｍｍｏｌ）、ジメチルスルホキシド（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（６０ｍＬ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（０．８６ｇ、７．５ｍｍｏｌ）、１，３−ジクロロヘキシルカルボジイミド（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）（１．５４ｇ、７．５ｍｍｏｌ）を混合して常温で１８時間攪拌した。反応が完了すると、反応混合物をエチルアセテート：Ｎ−ヘキサン（ＳＡＭＣＨＵＮ社製、韓国）の割合が３：５である溶液（９５０ｍＬ）に１０分間滴加して生成された固体ＮＨＳ−葉酸（３．７９ｇ）を濾過して得た（Robert J. Lee and Philip S. Low (1994) J. Biological Chemistry. 269; 3198-3204）。

実施例１−３：ペプチドの製造
ペプチド化合物がα−アミノ酸を含んでいるため、これと同様な構造を有しているペプチド誘導体とＰＥＧに存在するアミン官能基との結合反応を行った。この結合反応の前提條件としてＰＥＧとペプチド誘導体に存在するアミン官能基は、ペプチドに存在するカルボン酸との結合反応の際に交互競争反応を行うため、ペプチド化合物に存在するアミン官能基を保護基で置換する先行過程が必要であった。ペプチド化合物に存在するアミン基は、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（9-fluorenylmethyloxycarbonyl；Ｆｍｏｃ）またはｔ−ブチルオキシカルボニル（tert-Butyloxycarbonyl；ｔ−ＢＯＣ）の保護基で置換されてペプチドのカルボン酸との反応性を除去してＰＥＧに結合可能な形態のペプチド化合物を製造した。

≪実施例２：５’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造≫
前記実施例１で製造された結合可能なリガンド物質は、実施例１−１のＮＡＧホスホラミダイトのようにホスホラミダイト形態に構成されて、通常の化学的オリゴ合成過程（遮断除去（deblocking）、結合（coupling）、キャッピング（capping）および酸化（oxidation）からなる過程）によりＰＥＧ末端に結合するか、実施例１−２のＮＨＳ−葉酸のようにＮＨＳ−リガンド形態に構成されて、ＰＥＧにアミン基を結合した後、アミンＰＥＧとエステル反応により5’末端にリガンドが結合したＰＥＧ−ＲＮＡの形態に結合することができる。合成された５’末端にリガンドが結合したＰＥＧ−ＲＮＡ構造体は、相補的な配列の疎水性残基が結合した形態である５’Ｃ_２４−ＲＮＡ構造体とアニーリングして、５’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を合成した。

実施例２−１：二本鎖オリゴＲＮＡの製造
以下、実施例では、サバイビンを抑制するためにサバイビン二本鎖オリゴＲＮＡを使用した。サバイビンは、今までテストされたほとんどの新生腫瘍や形質転換された細胞株において共通して発現するタンパク質であって、抗ガン治療において重要な標的になると予測されている（Survivin; a new target for anti-cancer therapy. Cancer Treat Rev. 2009 Nov; 35(7); 553-62）。本発明のサバイビン二本鎖オリゴＲＮＡは、配列番号１と記載されるセンス鎖とこれに相補的な配列であるアンチセンス鎖からなっており、対照群として使用される二本鎖オリゴＲＮＡは、配列番号２と記載されるセンス鎖とこれに相補的な配列であるアンチセンス鎖からなっている。本実施例に使用される二本鎖オリゴＲＮＡは、下記の塩基配列からなっている。
（配列番号１）５’−ＡＡＧ ＧＡＧ ＡＵＣ ＡＡＣ ＡＵＵ ＵＵＣ Ａ−３’
（配列番号２）５’−ＣＵＵ ＡＣＧ ＣＵＧ ＡＧＵ ＡＣＵ ＵＣＧ Ａ−３’

二本鎖オリゴＲＮＡは、β−シアノエチルホスホラミダイトを用いてＲＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法を用いて、前記ＲＮＡ一本鎖の合成を行った（Polymer support oligonucleotide synthesis XVIII: use of beta-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of deoxynucleosides for the synthesis of DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product. Nucleic Acids Res. 1984 Jun 11; 12(11); 4539-57）。

合成過程は、ヌクレオシドが結合した固形支持体（ＣＰＧ）上から始まり、遮断除去（deblocking）、結合（coupling）、キャッピング（capping）および酸化（oxidation）からなるサイクルを繰り返すことで、所望の配列のＲＮＡを得る。当該一連のＲＮＡ一本鎖の合成過程は、ＲＮＡ合成機（３８４Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＢＩＯＮＥＥＲ社製、韓国）を使用して行った（図６参照）。

実施例２−２：５’ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造
実施例２−１で合成されたＲＮＡにＰＥＧホスホラミダイト試薬を処理して、通常のＲＮＡ合成過程により５’ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体を製造した（図７参照）。

実施例２−３：５’末端にリガンドが結合したＰＥＧ−ＲＮＡの合成
実施例２−３−１：Ｎ−アセチルガラクトサミンホスホラミダイトを用いたＮＡＧ−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造
実施例２−２で合成された５’ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体に実施例１−１で合成されたＮ−アセチルガラクトサミンホスホラミダイト試薬を用いて、通常のＲＮＡ合成過程により、Ｎ−アセチルガラクトサミンをＰＥＧ−ＲＮＡ構造体にホスホジエステル結合した。Ｎ−アセチルガラクトサミンリガンドは、デンドリマリンカー（dendrimer linker）を活用して、ＰＥＧに単分子あるいはそれ以上の分子のＮ−アセチルガラクトサミンを結合することができる。

実施例２−３−１−１：モノＮＡＧ−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造
実施例２−２で合成されたＰＥＧ−ＲＮＡ構造体に、実施例１−１で合成されたＮ−アセチルガラクトサミンホスホラミダイト試薬を用いて、通常のＲＮＡ合成過程により、Ｎ−アセチルガラクトサミンをＰＥＧ−ＲＮＡ構造体にホスホジエステル結合して、５’モノ−ＮＡＧ−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体を合成した（図８参照）。

実施例２−３−１−２：トリ−ＮＡＧ−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造
実施例２−２で合成されたＰＥＧ−ＲＮＡ構造体に、デンドリマホスホラミダイト（Dendrimer Phosphoramdite）（Ｔｒｅｂｌｅｒ Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｔｅ、Ｇｌｅｎ ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、米国）試薬で合成した後、実施例１−１で合成されたＮＡＧホスホラミダイト試薬を用いて、通常のＲＮＡ合成過程により、３個のＮＡＧをＰＥＧ−ＲＮＡ構造体にホスホジエステル結合で５’トリ−ＮＡＧ−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体を合成した（図９参照）。

実施例２−３−２：葉酸−ポリエチレングリコール−ＲＮＡ構造体の製造
実施例２−２で合成されたＰＥＧ−ＲＮＡ構造体に、アミンホスホラミダイト試薬を用いて、通常のＲＮＡ合成過程により、アミン基をＰＥＧ−ＲＮＡ構造体にホスホジエステル結合でアミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体を合成した。合成されたアミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体に、実施例１−２で合成されたＮＨＳ−葉酸をエステル反応により５’葉酸−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体を合成した（図１０参照）。

実施例２−３−３：アミン修飾およびペプチド化合物によるペプチド−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造
実施例１−３で製造された保護されたペプチド化合物と実施例２−３−２のアミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体のＰＥＧのアミン基とペプチドのカルボキシル基の結合反応は、ＢＯＰ（Benzotriazole-1-yl-oxy-tris-(dimethylamino)-phosphonium hexafluorophosphate、ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）とＨＯＢＴ(1-Hydroxybenzotriazole、ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）の条件下で行われた。前記結合反応が行われた後、保護基を除去するために、ピペリジン（ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）処理を施して、５’ペプチド−ＰＥＧ−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造した。

実施例２−４：５’Ｃ _２４ −ＲＮＡ構造体の製造
実施例２−３の５’リガンドが結合したＰＥＧ−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体配列と相補的な配列のＲＮＡ構造体は、実施例２−１のＲＮＡ合成方法により合成した後、ジスルフィド結合が含まれている炭素数２４個のテトラドコサン試薬を用いて、通常のＲＮＡ合成過程により、Ｃ_２４をＲＮＡ構造体にホスホジエステル結合で結合して、５’Ｃ_２４−ＲＮＡ構造体を合成した（図１１参照）。

実施例２−５：回収反応およびアニーリング
実施例２−１，２−２，２−３および２−４で合成されたＲＮＡ一本鎖は、６０℃の恒温槽で２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア処理を施して合成されたＲＮＡおよびＲＮＡ構造体をＣＰＧから分離した後、脱保護反応により保護残基を除去した。保護残基が除去された５’末端にリガンドが結合したＰＥＧ−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体および５’Ｃ_２４−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン、トリエチルアミンおよびトリエチルアミントリヒドロフルオリド（triethylamine trihydrofluoride）を１０：３：４の体積割合で処理して、２’ＴＢＤＭＳ（tert-butyldimethylsilyl）を除去した。

前記反応物を高速液体クロマトグラフィーによりＲＮＡを分離して精製し、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）で分子量を測定し、所望の塩基配列および二本鎖オリゴＲＮＡ構造体と対応するか否かを確認した。

次に、それぞれのリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造するために、リガンドが結合したＰＥＧ−ＲＮＡセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを同量混合して、１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭの酢酸マグネシウム、ｐＨ７．０〜７．５）に投入し、９０℃の恒温槽で３分間反応させた後、また３７℃で反応させて、所望のそれぞれの二本鎖５’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造した。製造された５’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動によりアニーリングを確認した。

≪実施例３：３’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造≫
アミン−ＣＰＧにＰＥＧホスホラミダイト試薬を用いて３’アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡの形態に合成した後、実施例１−２のＮＨＳ−葉酸のようにＮＨＳ−リガンド形態からなる結合可能なリガンド物質とエステル反応により３’末端にリガンドが結合したＰＥＧ−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を合成することができる。合成された３’末端にリガンドが結合したＰＥＧ−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、疎水性物質であるＣ_２４が結合して３’末端にリガンドが結合したＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４を形成するようになり、これは、相補的な配列のＲＮＡとアニーリングされて３’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体に合成される。

実施例３−１：３’アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造
アミン−ＣＰＧにポリエチレングリコールホスホラミダイト試薬を用いて、通常のＲＮＡ合成過程により、３’ＣＰＧ−アミン−ＰＥＧに合成された。３’ＣＰＧ−アミン−ＰＥＧは、実施例２−１のＲＮＡ合成過程により、所望の配列のＲＮＡを有する３’ＣＰＧ−アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体に合成された（図１２参照）。

実施例３−２：３’アミン−ＰＥＧ ＲＮＡ−Ｃ _２４ 構造体の製造
実施例３−１で合成された３’ＣＰＧ−アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体は、ジスルフィド結合が含まれている炭素数２４個のテトラドコサン試薬を用いて、通常のＲＮＡ合成過程により、Ｃ_２４をＲＮＡにホスホジエステル結合して構造体を合成した（図１３参照）。

実施例３−３：３’末端にリガンドが結合したＰＥＧ ＲＮＡ−Ｃ _２４ 構造体の製造
実施例３−２で合成された３’アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体は、６０℃の恒温槽で２８％のアンモニア処理を施して合成された３’アミン−ＰＥＧ−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体および３’アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体をＣＰＧから分離した後、脱保護反応により保護残基を除去した。保護残基が除去された３’アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体は、７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン、トリエチルアミンおよびトリエチルアミントリヒドロフルオリドを１０：３：４の体積割合で処理して、２’ＴＢＤＭＳ（tert-butyldimethylsilyl）を除去した。分離した３’アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体は、ＮＨＳ−リガンド形態からなる結合可能なリガンド物質とエステル反応により、３’末端にリガンドが結合したＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体に合成された。

実施例３−３−１：３’葉酸−ＰＥＧ−ＲＮＡ構造体の製造
実施例３−２で合成された３’アミン−ＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体は、実施例１−２で合成されたＮＨＳ−葉酸とエステル反応により、３’葉酸−ＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体を合成した（図１４参照）。

実施例３−４：相補的な配列のＲＮＡ構造体の製造
実施例３−３の３’末端にリガンドが結合したＰＥＧ−ＲＮＡ−Ｃ_２４配列と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖は、実施例２−１のＲＮＡ合成方法で合成した。合成されたＲＮＡ一本鎖は、６０℃の恒温槽で２８％のアンモニア処理を施して合成されたＲＮＡをＣＰＧから分離した後、脱保護反応により保護残基を除去した。保護残基の除去されたＲＮＡは、７０℃のオーブンでＮ−メチルピロリドン、トリエチルアミンおよびトリエチルアミントリヒドロフルオリドを１０：３：４の体積割合で処理して、２’ＴＢＤＭＳを除去した。

実施例３−５：アニーリング
前記反応物を高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−２０Ａ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）によりＲＮＡおよび３’リガンドが結合したＰＥＧ ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体を分離して精製し、これをＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析装置（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）で分子量を測定して、合成しようとする塩基配列および３’末端にリガンドが結合したＰＥＧ ＲＮＡ−Ｃ_２４構造体と対応するかを確認した。

次に、それぞれのリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造するためにリガンドが結合したＰＥＧ−ＲＮＡセンスＲＮＡとアンチセンスＲＮＡを同量混合して１Ｘアニーリングバッファー（３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ酢酸カリウム、２ｍＭ酢酸マグネシウム、ｐＨ７．０〜７．５）に投入し、９０℃の恒温槽で３分間反応させた後、また３７℃で反応させて、所望のそれぞれの二本鎖３’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を製造した。製造された３’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、電気泳動によりアニーリングを確認した。

≪実施例４：リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体のナノ粒子の形成≫
実施例２および３で合成された５’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体および３’末端にリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体は、二本鎖オリゴＲＮＡの末端に結合した疎水性物質間の疎水性相互作用によりリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子、すなわちミセルを形成する（図１参照）。実施例２で合成された５’葉酸−リガンド−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子の大きさおよび臨界ミセル濃度、透過型電子顕微鏡（Transmission Electron Microscope、ＴＥＭ）分析によりナノ粒子の形成を確認した。

実施例４−１：５’葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の粒径測定
ゼータ電位測定装置により前記ナノ粒子の大きさを測定した。具体的に、前記５’葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を１．５ｍＬのＤＰＢＳ（Dulbecco’s Phosphate buffered saline）に５０μｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）でナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）した。均質化したナノ粒子は、ゼータ電位測定装置（Ｎａｎｏ−ＺＳ、ＭＡＬＶＥＲＮ社製、英国）で大きさを測定したが、物質に対する屈折率は１．４５９、吸収率は０．００１とし、溶媒であるＰＢＳの温度２５℃およびそれによる粘度は１．０２００および屈折率は１．３３５の値を入力して測定した。１回の測定は、大きさを２０回繰り返して測定することで行われ、これを３回繰り返した。

葉酸が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ）の場合、約１００〜２００ｎｍの大きさを有することが確認された。多分散指数（polydisperse index、ＰＤＩ）は、低いほど当該粒子が均一に分布していることを判断できる数値であって、葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡのＰＤＩ値は０．４未満に測定され、比較的均一な大きさのナノ粒子を形成することが分かった。前記構造体からなるナノ粒子の大きさは、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれるために好適な大きさであることを確認した（Nanotoxicology; nanoparticles reconstruct lipids. Nat Nanotechnol. 2009 Feb; 4(2); 84-5）（図１５の（Ａ）参照）。

実施例４−２：二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の臨界ミセル濃度測定
単分子に親油基と親水基がともに存在している両親媒性物質は、界面活性剤になることができるが、界面活性剤は、水溶液に溶解されると、疎水性物質は水との接触を避けるために中央に集まり、親水性物質は外側に向かってミセルを形成する。この際、最初にミセルを形成する濃度を臨界ミセル濃度と言う。蛍光染料を用いてＣＭＣを測定する方法は、ミセルが形成される前／後に蛍光染料の蛍光値グラフ曲線の傾斜が急激に変化する特性に基づくものである。

葉酸が結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ）の臨界ミセル濃度を測定するために、蛍光染料である０．０４ｍＭのＤＰＨ（1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene、ＳＩＧＭＡ Ａｌｄｒｉｃｈ社製、米国）を準備する。実施例２で合成された５’葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体１ｎｍｏｌｅ／μＬを０．０９７７μｇ／ｍＬで最高５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳで段階別に希釈し、計１８０μＬの５’葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体試料を準備する。準備した試料に０．０４ｍＭのＤＰＨと対照群として使用されるＤＰＨの溶媒であるメタノールをそれぞれ２０μＬずつ添加して均一に撹拌した後、実施例４−１と同じ方法で超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）によりナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）した。均質化した試料は、光を遮断した常温条件下で約２４時間反応させた後、蛍光値（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ；３５５ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ；４２８ｎｍ、ｔｏｐ ｒｅａｄ）を測定した。測定された蛍光値は、相対的な蛍光値を確認するものであるため、同じ濃度で相対的な蛍光値（［ＤＰＨが含まれた試料の蛍光値］−［メタノールのみが含まれた試料の蛍光値］）を求めて（Ｙ軸）処理した５’葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の濃度のｌｏｇ値（Ｘ軸）に対するグラフで示した（図１５の（Ｂ）参照）。

各濃度別に測定された蛍光値は、低濃度区間から高濃度区間に移動するにつれて急激に増加するが、このように急激に増加する点の濃度がＣＭＣ濃度になる。したがって、蛍光量が増加しない低濃度区間と蛍光量が増加した高濃度区間をいくつかの点に区分して傾向線を作成し、二つの傾向線が交差する交差点のＸ値がＣＭＣ濃度となる（図１５の（Ｂ））。測定された葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体のＣＭＣが１．３３μｇ／ｍＬと非常に低く形成されることが観察され、これにより、葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡが非常に低い濃度でもミセルを容易に形成することができることを確認した。

実施例４−３：二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の透過型電子顕微鏡の観察
葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子が形成された形態を確認するために、透過型電子顕微鏡により観察した。

具体的に、葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体をＤＰＢＳに最終１００ｎｇ／ｍＬの濃度で溶かした後、超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）でナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）した。葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子は、電子密度が高い物質であって、陰性染色により観察した。透過型電子顕微鏡により観察されたナノ粒子は、実施例４−１で測定されたナノ粒子の大きさと類似した程度にナノ粒子がよく形成されていることが確認された。

≪実施例５：リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の生体外伝達≫
実施例２で合成された５’葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ）の生体外条件下での改善した二本鎖オリゴＲＮＡの効能を確認するために、葉酸受容体が過剰発現する細胞株であるＫＢ細胞株を葉酸が存在する条件であるか否かに応じて、トランスフェクション物質が存在しない状態で処理して結合したリガンドによる改善したＳＡＭｉＲＮＡの伝達効率および標的遺伝子の発現阻害効果を確認した。

実施例５−１：腫瘍細胞株の培養
米国合衆国培養細胞系統保存機関（American type Culture Collection、ＡＴＣＣ）から手に入れたヒト口腔上皮ガン細胞（ＫＢ）株は、葉酸を含まないＲＰＭＩ−１６４０培養培地（Ｇｉｂｃｏ、米国）に、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加して、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件下で培養した。

実施例５−２：葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡによる腫瘍細胞株の形質転換
前記実施例５−１で培養された腫瘍細胞株（１．３×１０^５／ウェル）を前記実施例の５−１条件下で６−ウェルプレートで葉酸を含まないＲＰＭＩ−１６４０培養培地で１８時間培養してから培地を除去した後、各ウェル当たり同量のＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）培地を分注した。

標的遺伝子であるサバイビンの発現を阻害する二本鎖オリゴＲＮＡ配列である配列番号１を含む二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒ）、対照群配列の配列番号２を含む二本鎖オリゴＲＮＡ−高分子構造体からなるナノ粒子（ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｃｏｎ）、および配列番号１を含む葉酸リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒ）は、実施例４−１と同じ方法である５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳに添加し、高周波音による分解により各構造体からなるナノ粒子を均等化して製造した。

Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地に葉酸が過量存在する条件を形成するために、葉酸をさらに投入して、最終１ｍＭの葉酸を含む条件、および葉酸をさらに投入していない条件を形成した後、２００ｎＭの濃度で試料を処理し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２の条件下で計４８時間培養した。

実施例５−３：サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対定量分析
前記実施例５−２でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、リアルタイムＰＣＲによりサバイビンのｍＲＮＡ発現量を韓国公開特許第２００９−００４２２９７号公報の方法にしたがって相対定量した。

ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｃｏｎは、対照群配列である配列番号２の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を処理した実験群であり、ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒは、サバイビン配列である配列番号１の二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を処理した実験群である。葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒは、サバイビン配列である配列番号１の葉酸リガンドが結合した形態の葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を処理した実験群である。

標的ｍＲＮＡ発現阻害程度は、ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｃｏｎを処理した試料の標的遺伝子発現量に対するＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒおよび葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒを処理した試料の標的遺伝子発現量として相対定量法により計算された（図１６参照）。

培地に葉酸が過量存在する条件の場合、ＫＢ細胞株の葉酸受容体が過量の葉酸によって飽和されてＳＡＭｉＲＮＡに結合している葉酸リガンドによる細胞内在化促進が阻害される効果を奏し、これは、ＳＡＭｉＲＮＡの細胞伝達効率に影響を及ぼして、標的遺伝子のｍＲＮＡ発現阻害に決定的な役割をすると予想された。

ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒを処理した場合、葉酸の存在有無と標的遺伝子の発現阻害効率の差が大きくなかったが、葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ−Ｓｕｒを処理した場合、葉酸が存在しない条件下で葉酸が過量存在する場合に比べて約２倍改善した標的遺伝子発現阻害を確認することができた。すなわち、葉酸が過量存在する条件の場合、葉酸リガンド結合による標的遺伝子発現阻害効果の変化が観察されなかったが、葉酸が存在しない条件の場合、葉酸リガンド結合による標的遺伝子発現阻害効果の増進が確認された。

したがって、リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子の場合、当該リガンド受容体が過剰発現している細胞で改善した伝達効率および標的遺伝子発現阻害効能が増加することを確認することができた。

≪実施例６：リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の生体内伝達≫
実施例２で合成された５’葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子（葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ）の生体内条件下での二本鎖オリゴＲＮＡの効能を確認するために、葉酸受容体が過剰発現する細胞株であるＫＢ細胞株からなる腫瘍を有するマウスに投与し、伝達された葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡおよびＳＡＭｉＲＮＡの腫瘍組織内における標的遺伝子の発現阻害効果を確認した。

実施例６−１：ＫＢ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌの準備
実施例５−１で培養されたＫＢ細胞株を１×１０^６ずつ５週齢のヌードマウス（ＢＡＬＢ／Ｃ ｎｕ）の皮下組織に投与した。投与後、２日おきに腫瘍長軸および短縮の長さを測定して腫瘍の成長を観察し、投与後、２週経過した時点で、約１５０〜２００ｍｍ^３ほどに腫瘍が成長していることを確認した。

実施例６−２：リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体、およびリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の投与
実施例６−１で準備したＫＢ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌに実施例２で合成された配列番号１を含む５’葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体とリガンドが結合していない二本鎖オリゴＲＮＡ構造体を実施例４−１と同じ方法で超音波分散機により二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子を均質化した。均質化したナノ粒子は、５ｍｇ／ｋｇの体重の量で尾静脈投与によりＫＢ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌに１回投与し（ｎ＝４）、投与後、４８時間または７２時間が経過した時点で腫瘍組織を採取した。採取した腫瘍組織は、全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、リアルタイムＰＣＲによりサバイビンｍＲＮＡの発現量を韓国公開特許第２００９−００４２２９７号公報の方法にしたがって相対定量した（図１７参照）。

ＰＢＳは、陰性対照群であって、ナノ粒子が含まれていない溶媒のみを投与した実験群であり、ＳＡＭｉＲＮＡは、リガンドが結合していない二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子が投与された実験群であり、葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡは、葉酸リガンドが結合した５’葉酸−二本鎖オリゴＲＮＡ構造体からなるナノ粒子が投与された実験群である。

４８時間が経過した時点に比べて７２時間が経過した時点で、ＳＡＭｉＲＮＡによる標的遺伝子発現阻害効果が著しかったが、４８時間が経過した時点で標的遺伝子の発現阻害程度を比較すると、リガンドが結合した構造体（葉酸−ＳＡＭｉＲＮＡ）が投与された場合、１６０％の改善した効率を示し、７２時間が経過した時点でも１２０％改善した効率を示した。

したがって、葉酸リガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体が生体内で標的臓器である葉酸受容体が過剰発現する腫瘍組織に迅速に伝達されて、改善した二本鎖オリゴＲＮＡ効果を示し、当該効果は、時間が経過しても維持されることを確認することができた。

≪実施例７：ＡＳＯ−高分子接合体の製造≫
本発明の実施例では、サバイビン（Survivin）を抑制するためにサバイビン（Survivin）ＡＳＯを使用した（Biol. Proced. Online 2004; 6(1); 250-256）。サバイビンは、今までテストされたほとんどの新生腫瘍や形質転換された細胞株で共通して発現されるタンパク質であって、抗ガン治療において重要な標的になると予測されている（Abbrosini G. et al. Nat. Med. 3(8); 917-921, 1997）。

以下、実施例では使用されたＡＳＯは、配列番号３と記載されるサバイビン特異的な配列と配列番号４と記載される対照群配列からなっている。
（配列番号３）Ｓｕｒｖｉｖｉｎ ＡＳＯ（ＩＳＩＳ２３７２２）、５−ＴＧＴＧＣＴＡＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＴ−３
（配列番号４）ｓｃｒａｍｂｌｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌ（ＩＳＩＳ２８５９８）、５−ＴＡＡＧＣＴＧＴＴＣＴＡＴＧＴＧＴＴ−３

前記ＡＳＯ配列は、β−シアノエチルホスホラミダイトを用いてＤＮＡ骨格構造をなすホスホジエステル結合を連結する方法を使用して前記ＡＳＯを合成した（Shina et al. Nucleic Acids Research, 12; 4539-4557, 1984）。

ＡＳＯの合成過程は、ヌクレオシドが付着した固形支持体（ＣＰＧ）をベースとし、遮断除去（deblocking）、結合（coupling）、キャッピング（capping）および酸化（oxidation）からなるサイクルを繰り返すことで所望の配列のＤＮＡを得る。

具体的に、最初の段階である遮断除去（deblocking）は、ヌクレオチドが付着したＣＰＧに３％のトリクロロ酢酸（trichloroacteic acid、ＴＣＡ）を処理して、ＤＭＴ（4,4’-dimethoxytrityl）を除去する段階であり、第二の段階である結合（coupling）は、以前段階でＣＰＧに形成された５’−水酸基と所望の配列のヌクレオシドホスホラミダイトモノマーと結合反応によりヌクレオチド鎖が連結される段階であり、第三の段階であるキャッピング（capping）は、結合段階で反応しなかった５’−水酸基を遮断（blocking）して、次のサイクルで結合過程で所望しない塩基配列を有するヌクレオチド鎖を排除する段階であり、無水酢酸とＮ−メチルイミダゾールを処理して、アセチル化する段階であり、最後の段階である酸化（oxidation）は、結合段階で形成された５’−水酸基とホスホラミダイトとの結合が亜リン酸トリエステル結合をなすが、これをホスホジエステル結合に変換する段階であり、０．０２Ｍの酸化溶液（０．０２Ｍ−Ｉ２ ｉｎ ＴＨＦ／ピリジン／Ｈ_２Ｏ）を処理して、亜リン酸がリン酸に変更される段階である。当該一連のＡＳＯの合成過程は、ＤＮＡ合成機（３８４ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ、ＢＩＯＮＥＥＲ社製、韓国）を使用して行われた。

ＡＳＯ−高分子接合体（３’ＰＥＧ−ＡＳＯ−５’脂質）の合成過程は、３’末端部位に親水性物質ＰＥＧが付与された３’ＰＥＧ−ＣＰＧ支持体から遮断除去（deblocking）、結合（coupling）、キャッピング（capping）および酸化（oxidation）の過程によりＡＳＯを合成し、ジスルフィド結合が含まれている２４個の炭素数（Ｃ_２４）を有する疎水性物質であるテトラドコサンを５’末端に付与して、所望のＡＳＯ−高分子接合体を製造した（韓国公開特許第２００９−００４２２９７号公報参照）。

また、リガンドが付着したリガンド結合ＡＳＯ−高分子接合体（３’リガンド−ＰＥＧ−ＡＳＯ−５’脂質）を製造するために、アミン基のような官能基が付着しているＣＰＧから遮断除去（deblocking）、結合（coupling）、キャッピング（capping）および酸化（oxidation）の過程によりＰＥＧホスホラミダイト試薬を用いてＰＥＧを結合した後、遮断除去、結合、キャッピングおよび酸化の過程によりＡＳＯを合成し、ジスルフィド結合が含まれている２４個の炭素数（Ｃ_２４）を有する疎水性物質であるテトラドコサンを５’末端に付与して、所望のリガンドが付着可能なＡＳＯ−高分子接合体（３’−官能基−ＰＥＧ−ＡＳＯ−５’−脂質）を製造した。合成が完了すると、６０℃の恒温槽で２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア処理を施してリガンドが付着可能なＡＳＯ−高分子接合体をＣＰＧから分離した後、官能基によりリガンドを付着して、所望のリガンドが付着したＡＳＯ−高分子接合体（３’リガンド−ＰＥＧ−ＡＳＯ−５’脂質）を製造した。

一方、ＡＳＯ−高分子接合体（３’脂質−ＡＳＯ−５’ＰＥＧ）を合成するために、アミン基のような官能基が付与されたＣＰＧから遮断除去、結合、キャッピングおよび酸化の過程によりＡＳＯを合成し、ＰＥＧホスホラミダイトを用いて５’末端に付与して、所望の官能基−ＡＳＯ親水性高分子接合体を製造した。官能基−ＡＳＯ親水性高分子接合体の合成が完了すると、６０℃の恒温槽で２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア処理を施して官能基−ＡＳＯ親水性高分子接合体をＣＰＧから分離した後、官能基により疎水性物質を結合して、所望の親水性および疎水性物質が結合した形態のＡＳＯ−高分子接合体を製造した。次に、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−２０Ａ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）により前記反応物とＡＳＯ−高分子接合体を分離して精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）により前記のＡＳＯおよびＡＳＯ−高分子接合体の分子量を測定して、合成しようとする塩基配列と対応するかを確認した。

≪実施例８：ホスホチオエートで修飾されたＡＳＯ−高分子接合体の合成≫
本実施例で使用されたＡＳＯは、ＤＮＡ骨格構造をなしているリン酸基がホスホチオエート基で置換されているＳ−オリゴを用いてホスホチオエート結合方法で連結されたものである。

具体的には、まず、公知の方法である、遮断除去、結合、キャッピングおよび酸化からなる繰り返し過程によりＡＳＯを合成したが、Ｓ−オリゴを使用する場合、酸化過程で０．０２Ｍの酸化溶液の代りに０．１Ｍの硫化剤を処理した。当該ＡＳＯの合成過程により配列番号３および配列番号４の配列を有するホスホチオエートで修飾されたＡＳＯを合成した（Shina et al. Nucleic Acids Research, 12; 4539-4557, 1984）。残りの合成過程は、実施例７と類似した方法が使用された。

５’と３’両末端に４個のヌクレオシドが２−ＯＣＨ_３（メトキシ）で修飾されたＡＳＯを合成する場合、２’−ＯＣＨ_３−ＤＮＡ形態で修飾された部位のヌクレオシドは２’−ＯＣＨ_３−ＤＮＡ−シアノエチルホスホラミダイト［ｒＡ（Ｂｚ）、ｒＣ（Ａｃ）、ｒＧ（ｉｂｕ）、ｒＵ］を用いて合成して、骨格構造をホスホチオエートで置換する方式で製造した後、上述したように、Ｓ−オリゴを用いてホスホチオエート結合方法でＤＮＡ骨格構造を合成する方式により製造された。

ホスホチオエートで修飾されたＡＳＯ−高分子接合体の場合、３’末端部位にＰＥＧが付与された３’ＰＥＧ−ＣＰＧを支持体をベースとして知られた方法である、遮断除去、結合、キャッピングおよび酸化からなる繰り返し過程によりホスホチオエートで修飾されたＡＳＯ接合体を合成した後（韓国公開特許第２００９−００４２２９７号公報参照）、ジスルフィド結合が含まれている炭素数２４個の疎水性物質であるテトラドコサンを５’末端に付与することで、所望のホスホチオエートで修飾されたＡＳＯ−高分子接合体を製造した。

また、ホスホチオエートで修飾されたＡＳＯ−高分子接合体親水性物質の末端部位にリガンドを付与するために３’ＣＰＧにリガンドが結合されることができる官能基を付与した後、親水性物質を結合して前記反応を行ってリガンドが付与されることができるＡＳＯ−高分子接合体を製造した。

ＡＳＯ−高分子接合体の合成が完了すると、６０℃の恒温槽で２８％（ｖ／ｖ）のアンモニア処理を施してＡＳＯおよびＡＳＯ−高分子接合体をＣＰＧから分離した後、高速液体クロマトグラフィー（ＬＣ−２０Ａ Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）により前記反応物とＡＳＯ−高分子接合体を分離して精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（ＭＡＬＤＩ ＴＯＦ−ＭＳ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ社製、日本）により前記のＡＳＯおよびＡＳＯ−高分子接合体の分子量を測定して、合成しようとする塩基配列と対応するかを確認した（図１９参照）。

≪実施例９：ＡＳＯ−高分子接合体の生体内の同じ条件下での安定性評価≫
前記実施例７および実施例８で合成、分離したＡＳＯ−高分子接合体が結合していない最初の形態のＡＳＯに比べてＡＳＯの安定性が向上したか否かを確認した。高分子接合体が結合していないＡＳＯとＡＳＯ−高分子接合体を生体内条件をまねした形態である３０および５０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳが添加された培地でそれぞれ０、３、５、７および１０日間培養した後、最初のＡＳＯに比べて分解された程度を電気泳動法または重合酵素連鎖反応法（ＰＣＲ）により検証した。

結果、使用されたＦＢＳ濃度と関係なく、ＡＳＯ高分子接合体は、時間が経過するにつれてＰＥＧがＡＳＯから分離することと同様な様相を示しただけであって、ＡＳＯが安定性を示した一方、ＡＳＯの場合、３日後から安定性が減少した。

≪実施例１０：ＡＳＯ−高分子接合体のナノ粒子物性の分析≫
ＡＳＯ−高分子接合体は、ＡＳＯの末端に付与された疎水性物質間の疎水性相互作用によってＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子を形成する（図１８参照）。ゼータ電位測定装置によりＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子の臨界ミセル濃度および大きさを測定した。

実施例１０−１：ＡＳＯ−高分子接合体のナノ粒子の大きさ測定
実施例８で製造した配列番号３のＡＳＯ−高分子接合体のナノ粒子の大きさをゼータ電位測定装置で測定した。前記ＡＳＯ−高分子接合体５０μｇを１ｍＬのＤＰＢＳに溶かした後、超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）でナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）した。均質化したナノ粒子は、ゼータ電位測定装置（Ｎａｎｏ−ＺＳ、ＭＡＬＶＥＲＮ社製、英国）で大きさを測定したが、物質に対する屈折率は１．４５４、吸収率は０．００１とし、溶媒である水の温度２５℃およびそれによる粘度および屈折率を入力して測定した。１回の測定は、大きさを２０回繰り返して測定することで行われ、これを３回繰り返した。

ＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子の大きさは、１００〜２００ｎｍの大きさと、０．４未満の多分散指数（Polydispersity index、ＰＤＩ）値を観察することができた（図２０の（Ａ）参照）、多分散指数（Polydispersity index、ＰＤＩ）値は、低いほど当該粒子が均一に分布していることを判断できる数値であって、ＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子は、比較的均一な大きさのナノ粒子を形成し、これは、エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれるために十分な大きさである（Kenneth A. Dawson et al. nature nanotechnology 4; 84-85, 2009）。

実施例１０−２：ＡＳＯ−高分子接合体の臨界ミセル濃度の測定
単分子に疎水基と親水基がともに存在している両親媒性の物質は、界面活性剤となることができ、界面活性剤が水溶液に溶解されると、疎水基は、水との接触を避けるために中央に集まり、親水基は、外側に向かってミセルを形成する。この際、最初にミセルを形成する濃度を臨界ミセル濃度と言う。蛍光染料を用いてＣＭＣを測定する方法は、ミセルが形成される前／後に蛍光染料の蛍光値グラフ曲線の傾斜が急激に変化する特性に基づくものである。

ＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子の臨界ミセル濃度を測定するために、蛍光染料である０．０４ｍＭのＤＰＨ（1,6-Diphenyl-1,3,5-hexatriene、ＳＩＧＭＡ社製，米国）を準備する。配列番号３のＡＳＯ−高分子接合体１ｎｍｏｌｅ／μＬを０．０９７７μｇ／ｍＬで最高５０μｇ／ｍＬの濃度でＤＰＢＳで段階別に希釈し、計１８０μＬのＡＳＯ−高分子接合体試料を準備する。準備した試料に０．０４ｍＭのＤＰＨと対照群として使用されるＤＰＨの溶媒であるメタノールをそれぞれ２０μＬずつ加えて均一に撹拌した後、実施例１０−１と同じ方法で超音波分散機(Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）によりナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）した。均質化した試料は、光を遮断した常温条件下で約２４時間反応させた後、蛍光値（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ；３５５ｎｍ、ｅｍｉｓｓｉｏｎ；４２８ｎｍ、ｔｏｐ ｒｅａｄ）を測定した。測定された蛍光値は、相対的な蛍光値を確認するものであるため、同一濃度でＤＰＨが含まれた試料の蛍光値−メタノールのみが含まれた試料の蛍光値を求めて（Ｙ軸）処理したＡＳＯ−高分子接合体濃度のｌｏｇ値（Ｘ軸）に対するグラフで示した（図２０の（Ｂ）参照）。

各濃度別に測定された蛍光値は、低濃度区間から高濃度区間に移動するにつれて急激に増加するが、このように急激に増加する点の濃度がＣＭＣ濃度となる。したがって、蛍光量が増加しない低濃度区間と蛍光量が増加した高濃度区間をいくつかの点で区分して傾向線を作成し、二つの傾向線が交差する交差点のＸ値がＣＭＣ濃度となる。測定されたＡＳＯ−高分子接合体のＣＭＣは、１．５６μｇ／ｍＬと非常に低く形成されることが観察され、これにより、ＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子が非常に低い濃度でもミセルをよく形成することができることを確認した。

≪実施例１１：ＡＳＯ−高分子接合体とトランスフェクション物質を用いた腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制≫
実施例８で製造した何も接合されていないＡＳＯとＡＳＯ−高分子接合体を用いて腫瘍細胞株であるヒト大腸ガン細胞株（ＳＷ４８０）をトランスフェクションさせ、前記トランスフェクションされた腫瘍細胞株のサバイビンの発現パターンを分析した。

１１−１：腫瘍細胞株の培養
米国合衆国培養細胞系統保存機関（American type Culture Collection、ＡＴＣＣ）から手に入れたヒト大腸ガン細胞株（ＳＷ４８０）は、生長培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５培養培地、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ；米国）に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加して、３７℃、５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素（ＣＯ_２）の条件下で培養した。

実施例１１−２：ＡＳＯ−高分子接合体を用いた腫瘍細胞株のトランスフェクション
前記実施例８で製造した何も接合されていないＡＳＯとＡＳＯ−高分子接合体を用いて腫瘍細胞株であるヒト大腸ガン細胞株（ＳＷ４８０）をトランスフェクションさせ、前記トランスフェクションされた腫瘍細胞株のサバイビンの発現パターンを分析した。

前記実施例１１−１で培養された腫瘍細胞株を１つのウェル当たり１．３×１０^５を前記実施例の１１−１の条件下で６−ウェルプレートで１８時間生長培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５培養培地、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ；米国）で培養してから培地を除去した後、各ウェル当たり８００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｇｌｅ’ｓ Ｍｉｎｉｍｕｍ Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｅｄｉａ、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ；米国）培地を分注した。

一方、リポフェクタミン（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製；米国）２μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地１９８μＬを混合し、常温で５分間反応させた後、前記実施例７および実施例８で製造したそれぞれのＡＳＯ−高分子接合体（２５ｐｍｏｌｅ／μＬ）を最終１０、５０、１００ｎＭの濃度で処理した後、また、常温で２０分間反応させて、溶液を製造した。

次に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液をそれぞれ２００μＬずつ分注して６時間培養した後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を除去した。これに生長培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５培養培地、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ；米国）２．５ｍＬを分注した後、３７℃、５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素（ＣＯ_２）の条件下で２４時間培養した。

実施例１１−３：サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対定量分析
実施例１１−２でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、リアルタイムＰＣＲによりサバイビン遺伝子のｍＲＮＡ量を韓国公開特許第２００９−００４２２９７号公報の方法にしたがって相対定量した（図２１参照）。

何も接合されていないＡＳＯとＡＳＯ−高分子接合体の標的遺伝子発現阻害効果を分析するためにトランスフェクション物質とともに形質転換させた後、サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ発現程度を比較した結果、ＡＳＯ−高分子接合体は、接合体が存在しない何も接合されていないＡＳＯと類似した程度の発現阻害を示し、高分子が接合されている形態がＡＳＯのメカニズムを妨害しないと考えられる。

≪実施例１２：ＡＳＯ−高分子接合体のみを用いた腫瘍細胞株での標的遺伝子の発現抑制≫
実施例７および実施例８で製造したそれぞれのＡＳＯ−高分子接合体を用いて腫瘍細胞株であるヒト大腸ガン細胞株(ＳＷ４８０）をトランスフェクションさせ、前記トランスフェクションされた腫瘍細胞株のサバイビンの発現パターンを分析した。

実施例１２−１：腫瘍細胞株の培養
米国合衆国培養細胞系統保存機関（American type Culture Collection、ＡＴＣＣ）から手に入れたヒト大腸ガン細胞株（ＳＷ４８０）は、生長培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５培養培地、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ；米国）に１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清、ペニシリン１００ｕｎｉｔｓ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬを添加し、３７℃、５％（ｖ／ｖ）二酸化炭素（ＣＯ_２）の条件下で培養した。

実施例１２−２：ＡＳＯ−高分子接合体を用いた腫瘍細胞株の形質転換
実施例１２−１で培養された腫瘍細胞株の１つのウェル当たり１．３×１０^５を前記実施例５−１条件下で６−ウェルプレートで１８時間生長培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５培養培地、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ；米国）で培養してから培地を除去した後、各ウェル当たり８００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地を分注した。

Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地１００μＬと前記実施例１、２で製造したそれぞれのＡＳＯ−高分子接合体（１ｎｍｏｌｅ／μＬ）５、１０、１００μＬを添加し（５００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ処理）、実施例４−１と同じ方法で超音波分散機（Ｗｉｓｅｃｌｅａｎ、ＤＡＩＨＡＮ社製、韓国）によりナノ粒子の大きさを均質化（７００Ｗ；振幅２０％）してＡＳＯ−疎水性物質接合体からなるナノ粒子を均等化して溶液を製造した。

次に、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭが分注された腫瘍細胞株の各ウェルにトランスフェクション用溶液をそれぞれ１００μＬずつ分注して２４時間培養した後、２０％ＦＢＳが含まれた生長培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ Ｌ−１５培養培地、ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｏｒｇｅｎ；米国）１ｍＬを添加した。これを３７℃、５％（ｖ／ｖ）の二酸化炭素（ＣＯ_２）の条件下でさらに２４時間培養して、ＡＳＯ−高分子複合体処理後、計４８時間培養した。

実施例１２−３：サバイビン遺伝子のｍＲＮＡ相対定量分析
実施例１２−２でトランスフェクションされた細胞株から全体ＲＮＡを抽出してｃＤＮＡを合成した後、リアルタイムＰＣＲによりサバイビン遺伝子のｍＲＮＡ量を韓国公開特許第２００９−００４２２９７号公報の方法にしたがって相対定量した。

何も接合されていないＡＳＯとＡＳＯ−高分子接合体のトランスフェクション物質が存在しない条件下で細胞に伝達されてサバイビン遺伝子のｍＲＮＡ発現阻害程度を比較した結果、トランスフェクション物質が存在しない条件下でＡＳＯ−高分子接合体の場合、何も修飾していないＡＳＯに比べて相対的に低い濃度で標的遺伝子のｍＲＮＡ発現阻害を誘発することを確認することができた。

したがって、本発明で合成したＡＳＯ−高分子接合体またはＡＳＯ−高分子接合体からなるナノ粒子は、トランスフェクション物質が存在しない条件下でも細胞内に伝達されて、ＡＳＯの標的遺伝子の発現を阻害することを確認することができた。

本発明による新たな構造のオリゴヌクレオチド構造体およびこれを含む薬学的組成物は、ガンおよび感染性疾患の治療に非常に効率よく、且つ、有効に使用されることができる。

Claims (13)

1. 下記式（１）の構造を有するリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体：
   （式（１）中、Ａは、親水性物質であり、Ｂは、疎水性物質であり、ＸとＹは、互いに独立して、単純共有結合またはリンカー媒介の共有結合であり、Ｒは、二本鎖オリゴＲＮＡであり、Ｌは、受容体を介したエンドサイトーシスにより標的細胞内在化を増進させる受容体と特異的に結合する特性を有する、二本鎖オリゴＲＮＡであるＲの５’末端側に結合しそして葉酸、Ｎ−アセチルガラクトサミン及びマンノースから選択されるリガンドを意味する）。
2. 前記二本鎖オリゴＲＮＡは、１９〜３１個のヌクレオチドからなる請求項１に記載のリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体。
3. 前記疎水性物質の分子量は２５０〜１，０００であることを特徴とする請求項１に記載のリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体。
4. 前記疎水性物質はステロイド誘導体、グリセリド誘導体、グリセロールエーテル、ポリプロピレングリコール、Ｃ_１２〜Ｃ_５０の不飽和または飽和炭化水素、ジアシルホスファチジルコリン、脂肪酸、リン脂質、及びリポポリアミンからなる群より選択されることを特徴とし、そして、前記ステロイド誘導体は、コレステロール、コレスタノール、コール酸、コレステリルホルメート、コレスタニルホルメートおよびコレスタニルアミンからなる群から選択され、そして前記グリセリド誘導体は、モノ−、ジ−およびトリ−グリセリドから選択されることを特徴とする、請求項３に記載のリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体。
5. 前記親水性物質の分子量は２００〜１０，０００であることを特徴とする請求項１に記載のリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体。
6. 前記親水性物質はポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン及びポリオキサゾリンからなる群より選択されることを特徴とする請求項５に記載のリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体。
7. 前記共有結合は非分解性結合または分解性結合であることを特徴とし、そして前記非分解性結合は、アミド結合またはリン酸結合であり、そして前記分解性結合は、ジスルフィド結合、酸分解性結合、エステル結合、無水物結合、生分解性結合及び酵素分解性結合からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１に記載のリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体。
8. (１）官能基−親水性物質が結合した固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、
   （２）前記官能基−親水性物質が結合したＲＮＡ一本鎖の５’末端に疎水性物質を共有結合する段階と、
   （４）前記官能基−ＲＮＡ−高分子構造体および別に合成した相補的な配列のＲＮＡ一本鎖を固形支持体から分離する段階と、
   （５）前記官能基によりリガンドを親水性物質の末端に結合する段階と、
   （６）前記リガンドが結合したＲＮＡ−高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖を形成する段階と、を含むリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造方法。
9. （１）固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、
   （２）前記ＲＮＡ一本鎖の５’末端に親水性物質を共有結合する段階と、
   （３）前記ＲＮＡ一本鎖の親水性物質にリガンドを結合する段階と、
   （４）固形支持体からリガンドが結合したＲＮＡ−親水性高分子構造体および別に合成した相補的な配列のＲＮＡ−疎水性高分子構造体の一本鎖を分離する段階と、
   （５）前記リガンドが結合したＲＮＡ−親水性高分子構造体と相補的な配列のＲＮＡ疎水性高分子構造体をアニーリングして二本鎖を形成する段階と、
   を含むリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造方法において、
   （１）〜（４）段階の間に、（１）段階のＲＮＡ一本鎖と相補的な配列からなるＲＮＡ一本鎖を合成した後、疎水性物質を共有結合して、疎水性物質が結合した形態のＲＮＡ−疎水性高分子構造体一本鎖を合成する段階をさらに含むことを特徴とする製造方法。
10. （１）官能基が結合している固形支持体をベースとし、ＲＮＡ一本鎖を合成する段階と、
    （２）段階（１）で得られた物質に親水性物質を共有結合する段階と、
    （３）段階（２）で得られた物質にリガンドを共有結合する段階と、
    （４）段階（３）で得られた物質を固形支持体から分離する段階と、
    （５）段階（４）で得られた物質に、３’末端に結合した官能基により疎水性物質を共有結合する段階と、
    （６）段階（５）で得られた物質と相補的な配列のＲＮＡ一本鎖をアニーリングして二本鎖を形成する段階と、
    を含むリガンドが結合した二本鎖オリゴＲＮＡ構造体の製造方法。
11. 請求項１に記載のリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体を含むナノ粒子。
12. 請求項１に記載のリガンドが結合した治療薬物−高分子構造体を含む薬剤学的組成物。
13. 請求項１１に記載のナノ粒子を含む薬剤学的組成物。