CN115282283A - 一种小分子药物-寡核苷酸偶联物及其应用 - Google Patents

一种小分子药物-寡核苷酸偶联物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种小分子药物‑寡核苷酸偶联物及其应用，属于生物医药技术领域。本发明针对现有小分子免疫调节药物水溶性差、药物递送困难的问题，采用与寡核苷酸药物进行偶联的方法，一方面寡核苷酸优异的亲水性可改善小分子药物的溶解性质，改善其体内组织分布，促进递送和吸收。同时，疏水性小分子药物反过来也可促进寡核苷酸的入胞，从而提升其对靶标基因的调控能力。其次，本发明通过将小分子药物和功能寡核苷酸分子的共递送实现针对炎症反应不同靶点的协同调控，从而达到更好的疾病治疗效果，实现安全、高效用药。

Description

一种小分子药物-寡核苷酸偶联物及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种小分子药物-寡核苷酸偶联物及其应用。
背景技术
近年来，关于炎症反应机理的探讨以及炎症与疾病关系的研究呈现爆炸式增长。通过大量的研究，人们对炎症反应机制以及炎症如何影响众多疾病的发生发展也有了更深入的了解。基于所获得的研究结果，目前认为炎症可能是银屑病、干燥综合症、干眼症、葡萄膜炎、角膜炎、结膜炎、特应性皮炎、类风湿性关节炎、炎症性肠炎、克罗恩病、心脏病、糖尿病、癌症、哮喘、炎症性肠病、阿尔茨海默病等多种疾病的主要驱动因素。在常见的炎症反应过程中，在破裂或活化的肥大细胞、循环嗜碱性粒细胞以及血小板释放的组胺分子，血液循环中的血管细胞黏附因子1(VCAM-1)，内皮细胞粘附分子-1(E-selectin)以及细胞间粘附分子-1(ICAM-1)共同作用下会使血管发生舒张，从而导致血管通透性极大地增加(Cardiovasc Hematol Disord Drug Targets2008,8,252-260)。而血管通透性的增加会导致局部水肿，使得吞噬细胞、补体系统的蛋白质、花生酸、激肽、细胞因子、血小板活化因子等物质进入到血管中(JAllergy Clin Immunol 2010,125,S3-S23)，促进炎症发生发展。其中，细胞因子如肿瘤坏死因子、白细胞介素、淋巴因子、单核因子、干扰素、集落刺激因子以及由单核细胞、T细胞、血小板和内皮细胞产生的转化生长因子均参与炎症相关反应。此外，先天免疫系统的组成部分、单核细胞(包括巨噬细胞和树突状细胞)以及中性粒细胞被激活时炎症反应也会被增强。
先天免疫系统通过跨膜Toll样受体(Toll Like Receptor,TLR)与特定配体的识别，实现对细菌和其他损伤的识别。例如，采用脂多糖(LPS)刺激巨噬细胞上的TLR4会触发炎症因子如TNF-α和IL-1β的合成，并刺激获得性免疫反应所必需的免疫调节细胞因子IL-12的产生。一旦巨噬细胞被炎症因子激活，其寿命将增长并产生大量促炎性细胞因子，包括TNF-a、IL-1、IL-6、IL-12/IL-23、IL-18和高迁移率族蛋白1(HMGB1)。这些细胞因子将进一步放大炎症反应并触发获得性免疫反应。循环细胞因子与不同种类细胞上的特定受体相互作用并激活Janus激酶/信号转导和转录蛋白(JAK-STAT)、核因子kappa B(NF-κB)以及转化生长因子β(TGF-β)信号通路，从而导致细胞粘附、通透性增加、细胞凋亡等炎症反应，以及活性氧的增加。
炎症相关疾病的共同特点是表现为免疫平衡破坏后相关信号通路的激活以及多种炎症细胞因子过量表达，进而激发持续的炎症反应并对机体产生破坏作用。基于对诱发疾病炎症反应机制以及免疫激活过程的了解，研究人员致力于开发不同种类的药物实现炎症调控从而达到最终治愈疾病的目的。现有的炎症调控药物主要包括具有免疫调节功能的小分子药物、靶向参与炎症反应细胞因子和受体的抗体类药物、以及调控炎症信号通路相关基因表达的基因药物。常用具有免疫调节功能的小分子药物如钙调磷酸酶抑制剂、mTOR抑制剂、糖皮质激素、维生素D类似物等，上述小分子药物能够大规模生产，成本较低，一些小分子药物还可以制成口服制剂。但是小分子药物普遍面临水溶性差，生物利用度较低，通常存在较强的副作用，不宜长期使用。抗体类药物通常针对性强，见效快，免疫调控效果优异，但这类药物一般需要注射给药，而且生产和治疗成本高。此外，长期系统给药容易导致耐药性及其他的不良反应，具有较强的毒副作用，如免疫力降低，容易发生感染和癌症。
靶向炎症反应相关基因进而实现免疫调控的功能寡核苷酸分子(siRNA，反义寡核苷酸)作为一类新型药物则具有免疫原性低，作用靶点广泛，既可以靶向胞内靶点也可靶向胞外靶点，不易产生耐药，可调控更上游的信号通路等优点，为免疫调控和疾病治疗提供更多可能。但由于核酸药物分子量大、本身带负电使得单独的核酸药物难以跨越细胞膜屏障，因而面临递送的难题。为了实现核酸药物的有效递送并发挥基因调控功能，往往需要引入特定载体来帮助功能核酸递送至目标组织和细胞。其中病毒载体虽然转染效率高，但在实际应用过程当中还面临免疫原性、插入突变、制备复杂等一系列问题，阻碍其临床转化。除了病毒载体，非病毒载体如阳离子脂质体、阳离子聚合物等也常用于核酸药物的负载递送，但阳离子递送载体普遍面临着细胞毒性较大、质控困难等问题。虽然每种药物都有其优点，但由于炎症反应的复杂性，采用单一策略调控某一靶点或阻断某种细胞因子可能会导致其他促炎细胞因子的代偿式增加，难以取得令人满意的疗效。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种小分子药物-寡核苷酸偶联物及其应用，本发明的小分子药物-寡核苷酸偶联物同时包含调节免疫反应的小分子药物和功能寡核苷酸分子，两者联合使用能够同时作用于不同的炎症相关信号通路，产生协同效应，从而达到更好的治疗效果。
本发明提供了一种小分子药物-寡核苷酸偶联物，由具有免疫调节功能的小分子药物和能够调控炎症相关基因表达的功能寡核苷酸分子共价偶联得到。
优选的，所述小分子药物和功能寡核苷酸分子之间通过化学连接子共价偶联。
优选的，所选小分子药物为作用于免疫相关信号通路并能够调控免疫反应的小分子药物；优选的，所述小分子药物包括钙调磷酸酶抑制剂、糖皮质激素、mTOR抑制剂和维生素D类似物中的一种或几种。
优选的，所述炎症相关基因包括肿瘤坏死因子-a基因、白介素1b基因、白介素17基因、白介素23基因、NFKBIZ基因、炎性小体NLRP3基因、JAK基因和PDE4基因中的一种或几种。
优选的，所述功能寡核苷酸分子包括双链小干扰核酸、微小核酸和单链反义寡核苷酸中的一种。
优选的，当所述功能寡核苷酸分子为双链小干扰核酸或微小核酸时，所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的正义链的3’端；当所述功能寡核苷酸分子为单链反义寡核苷酸时，所述小分子药物共价偶联于单链反义寡核苷酸的3’端或5’端。
优选的，每个功能寡核苷酸分子上共价偶联的小分子药物的数量为1～40个。
优选的，所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的末端或者所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的3’端或5’端延伸序列的侧链碱基或者磷酸骨架上；
优选的，当所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的末端时，所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物的化学结构式如式1～式14所示：
Figure BDA0003704601890000031
Figure BDA0003704601890000041
在所述式1～式14中，L、T各自独立地为不存在、-(CH2)h-或-(CH2)h-中的任意一个或多个亚烷基被A基团所取代后的基团；所述h为0～15；所述A基团包括：-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-CH(RC)-、-C(R’)(R”)-、-NH-、-N(RN)-、-S-S-、-C(R’)＝C(R”)-、-C≡C-、
Figure BDA0003704601890000051
中的一种或几种；所述A基团中的RC、RN、R’、R”表示指定原子上的任何一个或多个氢原子被B基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物，所述指定原子包括碳原子或氮原子；所述B基团包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素；所述卤素包括F、C1、Br或I；所述A基团中(O)代表羰基氧原子；
在所述式1～式14中，Q、Y、Z各自独立地为不存在、-O-、-S-、-C(O)-、-NH-、-CH2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-和
Figure BDA0003704601890000052
中的一种或几种；所述Q、Y、Z基团中(O)代表羰基氧原子；所述
Figure BDA0003704601890000053
为连接位点；
在所述式1～式14中，G表示小分子免疫调节药物；m、n、k独立地为1～15；
X表示O或S；
优选的，当所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的3’端或5’端延伸序列的侧链碱基或者磷酸骨架上时，所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物的化学结构式如式15～式20所示：
Figure BDA0003704601890000054
Figure BDA0003704601890000061
在所述式15～式20中，T各自独立地为不存在、-(CH2)h-或-(CH2)h-中的任意一个或多个亚烷基被A基团所取代后的基团；所述h为0～15；所述A基团包括：-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-CH(RC)-、-C(R’)(R”)-、-NH-、-N(RN)-、-S-S-、-C(R’)＝C(R”)-、-C≡C-、
Figure BDA0003704601890000062
中的一种或几种；所述A基团中的RC、RN、R’、R”表示指定原子上的任何一个或多个氢原子被B基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物，所述指定原子包括碳原子或氮原子；所述B基团包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素；所述卤素包括F、C1、Br或I；所述A基团中(O)代表羰基氧原子；
在所述式15～式20中，Y、Z各自独立地为不存在、O、S、C(O)、NH、CH2、C(O)NH、NHC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)NH、NHC(O)O和
Figure BDA0003704601890000071
中的一种或几种；所述Y、Z基团中(O)代表羰基氧原子；所述
Figure BDA0003704601890000072
为连接位点；
在所述式15～式20中，G表式免疫调节抑制剂；n独立地为1～15；m、i独立地为0～5，k、j独立地为1～20；R表示H；B表示核酸碱基。
本发明还提供了上述方案所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物在制备治疗炎症相关疾病的药物中的应用。
优选的，所述炎症相关疾病包括干眼症、银屑病、干燥综合症、葡萄膜炎、角膜炎、结膜炎、特应性皮炎、类风湿性关节炎、炎症性肠炎、和克罗恩病中的一种或几种。
本发明提供了一种小分子药物-寡核苷酸偶联物，由具有免疫调节功能的小分子药物和能够调控炎症相关基因表达的功能寡核苷酸分子共价偶联得到。本发明针对现有小分子免疫调节药物水溶性差、药物递送困难的问题，采用与寡核苷酸药物进行偶联的方法，一方面寡核苷酸优异的亲水性可改善小分子药物的溶解性质，改善其体内组织分布，促进递送和吸收。同时，疏水性小分子药物反过来也可促进寡核苷酸的入胞，从而提升其对靶标基因的调控能力。其次，本发明通过将小分子药物和功能寡核苷酸分子的共递送实现针对炎症反应不同靶点的协同调控，从而达到更好的疾病治疗效果，实现安全、高效用药。此外，两种药物分子相互协助，可实现无需额外载体的新型药递送系统的制备，同时高效递送功能寡核苷酸分子和小分子免疫调节药物，达到协同调控炎症反应的目的，从而为多种炎症相关疾病的治疗提供更好的解决办法。
附图说明
图1为叠氮修饰环孢素A(CsA-N3)以及单环孢素A-NFKBIZ反义寡核苷酸共价偶联物(CsA-ASONFKBIZ)制备路线示意图；
图2为氯甲基碳酸酯环孢素A(CsA-Cl)的1HNMR谱图；
图3为氯甲基碳酸酯环孢素A(CsA-Cl)的13C NMR谱图；
图4氯甲基碳酸酯环孢素A(CsA-Cl)的MALDI-TOF质谱图；
图5为叠氮己酸碳酸酯修饰的环孢素A(CsA-N3)的1HNMR谱图；
图6为叠氮己酸碳酸酯修饰的环孢素A(CsA-N3)的MALDI-TOF质谱图；
图7为CsA-N3与DBCO修饰ASO偶联产物凝胶电泳图，10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测证实CsA-ASONFKBIZ偶联物高效合成；
图8为CsA-ASONFKBIZ-h偶联物的细胞摄取情况；
图9为实时荧光定量PCR检测CsA-ASONFKBIZ-h以及对照样品处理细胞后靶标基因NFKBIZ mRNA表达水平；
图10为CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)小鼠眼部在治疗第0、7、14d的荧光素钠染色图；(B)在治疗第0、7、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(C)在治疗第0、7、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图11为2CsA-ASONFKBIZ纳米胶束的10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳图与1％琼脂糖凝胶电泳图；
图12为实时荧光定量PCR检测2CsA-ASONFKBIZ-h以及对照样品处理细胞后靶标基因NFKBIZ mRNA表达水平；
图13为2CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)小鼠眼部在治疗第0、7、14d的荧光素钠染色图；(B)在治疗第0、7、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(C)在治疗第0、7、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图14为3CsA-ASONFKBIZ偶联物及其自组装纳米胶束的表征，左图为10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果，右图为0.5％琼脂糖凝胶电泳结果；
图15为实时荧光定量PCR检测3CsA-ASONFKBIZ-h以及对照样品处理细胞后靶标基因NFKBIZ mRNA表达水平；
图16为3CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)小鼠眼部在治疗第0、7、14d的荧光素钠染色图；(B)在治疗第0、7、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(C)在治疗第0、7、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图17为氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷的合成示意图；
图18为Boc-氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷的核磁共振氢谱；
图19为CsA3-ASONFKBIZ偶联物的合成示意图；
图20为20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征三炔基修饰ASONFKBIZ偶联物；
图21为0.5％琼脂糖凝胶电泳表征CsA3-ASONFKBIZ纳米胶束；
图22为CsA3-ASONFKBIZ纳米胶束的水合粒径(A)和形貌(B)；
图23为实时荧光定量PCR检测CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束以及对照样品处理细胞后靶标基因NFKBIZ mRNA表达水平；
图24为CsA3-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)小鼠眼部在治疗第0、14d的荧光素钠染色图；(B)在治疗第0、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(C)在治疗第0、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图25为CsA-siRNANFKBIZ、2CsA-siRNANFKBIZ与3CsA-siRNANFKBIZ偶联分子的15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳结果以及2CsA-siRNANFKBIZ与3CsA-siRNANFKBIZ纳米胶束的0.5％琼脂糖凝胶电泳结果；
图26为人眼角膜上皮细胞经CsA-siRNANFKBIZ-h偶联物、2CsA-siRNANFKBIZ-h纳米胶束与3CsA-siRNANFKBIZ-h纳米胶束以及对照样品处理后细胞中IκB-ζ蛋白表达水平；
图27为实时荧光定量PCR检测CsA-siRNANFKBIZ-h偶联物、2CsA-siRNANFKBIZ-h纳米胶束与3CsA-siRNANFKBIZ-h纳米胶束以及对照样品处理人眼上皮细胞后NFKBIZ mRNA表达量；
图28为CsA-siRNANFKBIZ-m偶联物、2CsA-siRNANFKBIZ-m纳米胶束以及3CsA-siRNANFKBIZ-m纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)小鼠眼部在治疗第0、7、14d的荧光素钠染色图；(B)在治疗第0、7、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(C)在治疗第0、7、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图29为羰乙基溴代环孢素A的合成步骤；图30为羰乙基溴代环孢素A的LC-MS谱图；
图31为20CsA-ASONFKBIZ纳米胶束的10％变性聚丙烯酰胺凝胶图与1％琼脂糖凝胶图；
图32为实时荧光定量PCR检测20CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束以及对照样品处理后细胞中NFKBIZ mRNA的表达量；
图33为20CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)在治疗第0、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(B)在治疗第0、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图34为实时荧光定量PCR检测经过不同靶点3CsA-siRNA纳米胶束与对照样品处理后的人眼角膜上皮细胞中各炎症mRNA的表达量；
图35为ELISA检测经过不同靶点3CsA-siRNA纳米胶束与对照样品处理后的人眼角膜上皮细胞中各炎症因子表达量；
图36为针对不同靶点3CsA-siRNA纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)在治疗第0、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(B)在治疗第0、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图37为实时荧光定量PCR检测经过不同靶点3CsA-siRNA纳米胶束与对照样品处理后的人眼角膜上皮细胞内各炎症靶点mRNA的表达量；
图38为针对不同靶点3CsA-siRNA纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)在治疗第0、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(B)在治疗第0、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图39为实时荧光定量PCR检测经过不同靶点的3CsA-ASO纳米胶束以及对照样品处理后人眼角膜上皮细胞中不同炎症mRNA的表达情况；
图40为ELISA检测经过不同靶点的3CsA-ASO纳米胶束以及对照样品处理后人眼角膜上皮细胞中不同炎症因子的表达情况；
图41为不同靶点3CsA-ASO纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)在治疗第0、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(B)在治疗第0、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图42为实时荧光定量PCR检测经过不同靶点20CsA-ASO纳米胶束与对照样品处理后人眼角膜上皮细胞各炎症mRNA表达量；
图43为不同靶点20CsA-ASO纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)在治疗第0、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(B)在治疗第0、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图44为RAP-Bz-Br的合成示意图；
图45为TK-Bz-Br的核磁共振氢谱(A)和碳谱(B)；
图46为RAP-31-O-TMS-42-Bz-Br的核磁共振氢谱(A)和碳谱(B)；
图47为15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳；(A)和1％琼脂糖凝胶电泳(B)表征10RAP-ASO偶联物、10RAP-纳米胶束的成功制备；
图48为10RAP-ASONFKBIZ纳米胶束的水合粒径(左图)和透射电镜形貌(右图)；
图49为实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测NFKBIZ mRNA表达水平；
图50为不同靶点10RAP-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗干眼的效果评价；(A)在治疗第0、7、14d小鼠眼部荧光素钠评分数据分析；(B)在治疗第0、7、14d小鼠酚红棉线泪液测试结果；
图51为RT-PCR检测CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束以及对照样品与HaCaT细胞共孵育后细胞NFKBIZ mRNA的表达量；
图52为ELISA检测经过CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束以及对照样品处理后HaCaT细胞不同炎症因子分泌情况；
图53为小鼠背部在建模第7d的模型表型图；
图54为银屑病样模型小鼠背部经涂抹给药治疗后第0和7d的皮损照片；
图55为银屑病样模型小鼠经涂抹给药治疗后耳部和背部皮肤厚度变化；
图56为银屑病样模型小鼠经涂抹给药治疗后背部皮损处红斑、鳞屑、皮肤增厚的评分及银屑病皮损面积严重程度指数评分；
图57为羰乙基溴代曲安奈德(TA-Br)的合成示意图；
图58为TA-Br的核磁共振氢谱；
图59为TA-Br的核磁共振碳谱；
图60为TA-Br的LC-MS谱图；
图61为15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征10TA-ASONFKBIZ偶联物的成功制备；
图62为1％琼脂糖凝胶电泳表征10TA-ASONFKBIZ纳米胶束的成功制备；
图63为RT-PCR检测10TA-ASONFKBIZ-h纳米胶束以及对照样品与HaCaT细胞共孵育后细胞NFKBIZ mRNA的表达量；
图64为银屑病样模型小鼠经涂抹给药治疗后耳部和背部皮肤厚度变化；
图65为治疗前后小鼠背部皮损处红斑、鳞屑、皮肤增厚的评分及银屑病皮损面积严重程度指数评分；
图66为银屑病样模型小鼠背部在治疗第0和7d的皮损照片；
图67为Cal-Bz-Br的合成示意图；
图68为DTPA-Bz-Br的核磁共振氢谱；
图69为Cal-Bz-Br的核磁共振氢谱；
图70为Cal-Bz-Br的LC-MS谱图；
图71为15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳表征10Cal-ASONFKBIZ偶联物的成功制备；
图72为1％琼脂糖凝胶电泳表征10Cal-ASONFKBIZ纳米胶束的成功制备；
图73为10Cal-ASONFKBIZ纳米胶束的水合粒径(左图)和透射电镜形貌(右图)；
图74为10Cal-ASONFKBIZ纳米胶束的临界胶束浓度图；
图75为RT-PCR检测10Cal-ASONFKBIZ-h纳米胶束以及对照样品与HaCaT细胞共孵育后细胞NFKBIZ mRNA的表达量；
图76为银屑病样模型小鼠治疗过程皮肤厚度变化；
图77为治疗前后小鼠背部皮损处红斑、鳞屑、皮肤增厚的评分及银屑病皮损面积严重程度指数评分；
图78为银屑病样模型小鼠背部在治疗第0和7d的皮损照片。
具体实施方式
本发明提供了一种小分子药物-寡核苷酸偶联物，由具有免疫调节功能的小分子药物和能够调控炎症相关基因表达的功能寡核苷酸分子共价偶联得到。
在本发明中，所述小分子药物和功能寡核苷酸分子之间优选的通过化学连接子共价偶联。
在本发明中，所选小分子药物优选为作用于免疫相关信号通路并能够调控免疫反应的小分子药物；在本发明中，所述小分子药物包括钙调磷酸酶抑制剂、糖皮质激素、mTOR抑制剂和维生素D类似物中的一种或几种。在本发明中，所述钙调磷酸酶抑制剂优选的包括环孢菌素A、他克莫司、西罗莫司、吡美莫司或者环孢菌素A、他克莫司、西罗莫司或吡美莫司的类似物；所述mTOR抑制剂优选的包括雷帕霉素或雷帕霉素的衍生物；所述雷帕霉素的衍生物优选的包括Temsirolimus(CCI-779)或Everolimus(RAD001)；所述糖皮质激素优选的包括曲安奈德、地塞米松、倍他米松、甲泼尼龙、可的松、氢化可的松、醋酸泼尼松、醋酸泼尼松龙、强的松或者曲安奈德、地塞米松、倍他米松、甲泼尼龙、可的松、氢化可的松、醋酸泼尼松、醋酸泼尼松龙、强的松的类似物；所述维生素D类似物优选的包括卡泊三醇、骨化三醇、骨化二醇、阿法骨化醇或帕立骨化醇。
在本发明中，所述炎症相关基因包括肿瘤坏死因子-a(TNF-a)基因、白介素1b(IL-1b)基因、白介素17(IL-17)基因、白介素23(IL-23)基因、NFKBIZ基因、炎性小体NLRP3基因、JAK基因和PDE4基因中的一种或几种。针对上述炎症反应关键基因设计对应调控其表达的功能寡核苷酸分子，每个基因有其对应的功能寡核苷酸分子调控基因对应mRNA表达。
在本发明中，所述功能寡核苷酸分子包括双链小干扰核酸(siRNA)、微小核酸(miRNA)和单链反义寡核苷酸(ASO)中的一种。在本发明中，所用功能寡核苷酸分子可以是未做修饰的功能寡核苷酸分子，也可以稳定性增强修饰的功能寡核苷酸分子；所述稳定性增强修饰优选的包括PS、2位OMe、MOE和F代修饰中的一种或几种。
在本发明中，所述小分子药物和功能寡核苷酸分子之间的组合多种多样，互不限制，一种小分子药物可与多种功能寡核苷酸分子进行偶联，而一种功能寡核苷酸分子也可与多种小分子药物进行偶联，以实现不同应用目的。
在本发明中，当所述功能寡核苷酸分子为双链小干扰核酸或微小核酸时，所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的正义链的3’端；当所述功能寡核苷酸分子为单链反义寡核苷酸时，所述小分子药物共价偶联于单链反义寡核苷酸的3’端或5’端。
在本发明中，所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的末端或者所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的3’端或5’端延伸序列的侧链碱基或者磷酸骨架上。在本发明中，每个功能寡核苷酸分子上共价偶联的小分子药物的数量优选为1～40中取任意整数值。当所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的末端时，每个功能寡核苷酸分子上共价偶联的小分子药物的数量优选为1～6中取任意整数值；当所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的3’端或5’端延伸序列的侧链碱基或者磷酸骨架上时，每个功能寡核苷酸分子上共价偶联的小分子药物的数量优选为1～20中取任意整数值。
在本发明中，当所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的末端时，所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物的化学结构式如式1～式14所示：
Figure BDA0003704601890000111
Figure BDA0003704601890000121
Figure BDA0003704601890000131
在所述式1～式14中，L、T各自独立地为不存在、-(CH2)h-或-(CH2)h-中的任意一个或多个亚烷基被A基团所取代后的基团；所述h为0～15；所述A基团包括：-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-CH(RC)-、-C(R’)(R”)-、-NH-、-N(RN)-、-S-S-、-C(R’)＝C(R”)-、-C≡C-、
Figure BDA0003704601890000132
中的一种或几种；所述A基团中的RC、RN、R’、R”表示指定原子上的任何一个或多个氢原子被B基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物，所述指定原子包括碳原子或氮原子；所述B基团包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素；所述卤素包括F、C1、Br或I；所述A基团中的(O)代表羰基氧原子；
在所述式1～式14中，Q、Y、Z各自独立地为不存在、-O-、-S-、-C(O)-、-NH-、-CH2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-和
Figure BDA0003704601890000141
中的一种或几种；所述Q、Y、Z基团中(O)代表羰基氧原子；所述
Figure BDA0003704601890000142
为连接位点；
在所述式1～式14中，G表示小分子免疫调节药物；m、n、k独立地为1～15；
X表示O或S；
优选的，当所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的3’端或5’端延伸序列的侧链碱基或者磷酸骨架上时，所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物的化学结构式如式15～式20所示：
Figure BDA0003704601890000143
Figure BDA0003704601890000151
在所述式15～式20中，T各自独立地为不存在、-(CH2)h-或-(CH2)h-中的任意一个或多个亚烷基被A基团所取代后的基团；所述h为0～15；所述A基团中的(O)代表羰基氧原子；所述A基团包括：-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-CH(RC)-、-C(R’)(R”)-、-NH-、-N(RN)-、-S-S-、-C(R’)＝C(R”)-、-C≡C-、
Figure BDA0003704601890000152
中的一种或几种；所述A基团中的RC、RN、R’、R”表示指定原子上的任何一个或多个氢原子被B基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物，所述指定原子包括碳原子或氮原子；所述B基团包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素；所述卤素包括F、C1、Br或I；所述A基团中的(O)代表羰基氧原子；
在所述式15～式20中，Y、Z各自独立地为不存在、O、S、C(O)、NH、CH2、C(O)NH、NHC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)NH、NHC(O)O和
Figure BDA0003704601890000153
中的一种或几种；所述Y、Z基团中的(O)代表羰基氧原子；所述
Figure BDA0003704601890000154
为连接位点；
在所述式15～式20中，G表式免疫调节抑制剂；n独立地为1～15；m、i独立地为0～5，k、j独立地为1～20；R表示H；B表示核酸碱基。
本发明还提供了上述方案所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物的制备方法，包括以下步骤：
将具有免疫调节功能的小分子药物和能够调控炎症相关基因表达的功能寡核苷酸分子共价偶联，得到小分子药物-寡核苷酸偶联物。本发明对所述小分子药物和功能寡核苷酸分子共价偶联的具体方法没有特殊限制，采用本领域的常规偶联方法即可。
在本发明中，所述共价偶联涉及的反应类型优选的包括酯化、酰胺化、点击化学反应、亲电取代、和亲核取代或狄尔斯阿德耳反应中的一种或几种。
本发明还提供了上述方案所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物在制备治疗炎症相关疾病的药物中的应用。
在本发明中，所述炎症相关疾病包括银屑病、干眼症、干燥综合症、葡萄膜炎、角膜炎、结膜炎、特应性皮炎、类风湿性关节炎、炎症性肠炎、和克罗恩病中的一种或几种。
本发明利用功能寡核苷酸分子亲水的特性促进具有免疫调节功能的疏水性的小分子药物在水溶液中的溶解，使其无需使用其他助溶剂即可很好地分散在缓冲溶液中并被细胞高效摄取。溶解性的增加可减小给药时的使用浓度，降低药物分子的毒副作用。同时疏水性的小分子药物的修饰也使得功能寡核苷酸分子具备一定的疏水性质，在疏水药物较多时，小分子药物-寡核苷酸偶联物还能进一步组装成胶束，进而促进细胞对小分子药物-寡核苷酸偶联物的摄取，克服核酸药物入胞困难的问题。本发明的小分子药物-寡核苷酸偶联物同时包含调节免疫反应的小分子药物和功能寡核苷酸分子，两者联合使用能够同时作用于不同的炎症相关信号通路，产生协同效应，解决单独使用小分子免疫调节药物或寡核苷酸药物疗效不佳的问题，从而达到更好的治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了由单个环孢素A(CyclosporineA，CsA)分子与靶向核因子κB抑制因子ζ(NFKBIZ)基因的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ)共价偶联形成的CsA-NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物(CsA-ASONFKBIZ)。在本发明中，所述CsA-NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物能够用于制备治疗干眼症的药物。本发明通过构建CsA-ASONFKBIZ共价偶联物可实现小分子免疫调节药物与核酸药物协同治疗干眼症。CsA作为一种常用的免疫抑制剂，能够通过抑制钙调磷酸酶活性来抑制促炎细胞因子的生成与释放，在临床上已被用于干眼症的症状与体征。而靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ)则能够有效敲低角膜上皮细胞内NFKBIZ基因的表达，进一步降低细胞炎症水平，调控免疫平衡。CsA-ASONFKBIZ共价偶联物中小分子药物和核酸药物作用于炎症信号通路不同靶点能够实现干眼症协同治疗，达到更佳的治疗效果。本发明利用核酸分子亲水性强的特点偶联后赋予小分子药物CsA良好的水溶性，可使其在没有其他助剂帮助的情况下能够高效地被细胞摄取，更快地发挥药效，降低治疗时给药浓度，从而减小药物可能的毒副作用。同时所制备的CsA-ASONFKBIZ共价偶联物由于疏水性CsA的存在能够增强其与细胞的相互作用，相比于未修饰反义寡核苷酸，CsA-ASONFKBIZ偶联物能够更好地被细胞内吞，从而更好地发挥基因调控作用。最终通过CsA与反义寡核苷酸双重炎症调控作用，达到良好的干眼症治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了由两个CsA分子与NFKBIZ反义寡核苷酸(ASONFKBIZ)共价偶联形成的小分子药物-反义寡核苷酸偶联物(2CsA-ASONFKBIZ)，并利用其双亲性通过自组装形成纳米胶束组装结构用CsA和NFKBIZ反义寡核苷酸的共递送；所述2CsA-ASONFKBIZ能够用于制备治疗干眼症的药物。本发明采用小分子药物CsA与反义寡核苷酸药物协同治疗干眼病，同时作用于炎症信号通路不同靶点协同降低细胞炎症水平；其次，本案名利用核酸亲水的特点赋予免疫调节小分子药物更好的水溶性，同时利用CsA疏水性增强偶联产物与细胞相互作用，提高药物递送效率；再者，相比单个CsA分子与靶向NFKBIZ基因的ASO偶联制备的CsA-ASONFKBIZ共价偶联物可以单分子形式溶解于水溶液中，两个CsA小分子偶联后形成的2CsA-ASONFKBIZ共价偶联物由于其疏水性CsA数量增加使其表现出双亲性，在溶液中能够组装成为纳米胶束结构，此纳米胶束中心为疏水的CsA分子，外壳为水溶性的反义寡核苷酸分子。组装的纳米胶束无需任何转染试剂即可高效地转染细胞，实现CsA和反义寡核苷酸的高效共递送，进而达到良好的干眼协同治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了由三个环孢素A分子修饰靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸从而制备了三环孢素A-NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物(3CsA-ASONFKBIZ)，并利用其双亲性通过自组装形成3CsA-ASONFKBIZ纳米胶束组装结构用于CsA和靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸的共递送，进而用于干眼症的协同治疗。本发明采用小分子药物与核酸药物同时作用于炎症信号通路的不同靶点协同降低细胞炎症水平；利用核酸亲水的特点赋予免疫调节小分子药物更好的水溶性，同时利用CsA疏水性增强偶联产物与细胞的相互作用，提高药物的利用效率；相比于单个或两个CsA分子与靶向NFKBIZ基因的ASO偶联物，3个CsA小分子偶联后的药物-核酸偶联物3CsA-ASONFKBIZ，其与核酸偶联后所表现的双亲性更强，在溶液中更易组装为纳米胶束，从而使得3CsA-ASONFKBIZ纳米胶束更易与细胞相互作用，从而达到更好的干眼协同治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了环孢素A三聚体分子与靶向NFKBIZ的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ)共价偶联形成的环孢素A-反义寡核苷酸偶联物(CsA3-ASONFKBIZ)，并探索由其自组装形成的球形纳米胶束用于干眼症的协同治疗。本发明通过点击化学反应在ASO末端接枝三个环孢素A，其纯化及制备方法简单可控。利用三个环孢素A分子较强的疏水性使得偶联物具有较强的两亲性，所制备偶联产物在水溶液中可自组装形成稳定的纳米胶束结构，其临界胶束浓度低，球形核酸胶束纳米结构能够高效地被细胞摄取，实现CsA和ASO的同时共递送；环孢素A作为一种免疫调节剂与抗炎药，能抑制促炎症细胞因子的生成与释放，并提高抗炎细胞因子的释放水平，临床上可有效地改善由长期炎症所致的干眼症状与体征；同时ASO可以敲低炎症相关基因NFKBIZ蛋白的表达，进一步抑制干眼症的炎症反应。通过协同调控作用抑制炎症反应，调控免疫平衡，实现更好的干眼症治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了单个、两个、以及三个环孢素A分别与靶向NFKBIZ基因的小干扰RNA(siRNANFKBIZ)共价偶联形成药物-核酸偶联物，利用所制备偶联物或其组装纳米结构进一步实现了干眼症的协同治疗。本发明采用小分子药物与核酸药物协同治疗干眼病，CsA是一种免疫调节剂与抗炎药，能抑制促炎症细胞因子的生成与释放水平，临床上可有效地改善由长期炎症所致的干眼症状与体征；同时NFKBIZ siRNA可以敲低角膜上皮细胞内NFKBIZ的表达，进一步降低细胞炎症水平；利用siRNA亲水的特点赋予CsA药物更好的水溶性，减小系统性应用时的使用浓度，从而减小毒副作用，与此同时疏水性的免疫调节小分子药物CsA使得二者的偶联物更易与细胞相互作用，改善RNA药物入胞难的问题，进而达到更好的干眼病治疗效果。本实施例意在扩展在干眼治疗方面的药物-核酸偶联物类别。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了由多个环孢素A分子通过硫代磷酸酯接枝修饰靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ)构建药物-反义寡核苷酸偶联物，并利用其双亲性自组装形成纳米胶束，用于干眼症的协同治疗。该结构不仅可以实现环孢素A与ASONFKBIZ协同治疗干眼病，同时可以增强环孢素A的水溶性与核酸药物的稳定性，孵育药物-核酸偶联物更好的与细胞相互作用的能力。与此同时，在本实施例中，20个环孢素A分子接枝的ASONFKBIZ结构，其组装为纳米胶束的CMC值更小，所携带的治疗性小分子药物量更多，可以达到更好的治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了三个CsA分子分别与靶向IL-17的siRNAIL-17、靶向IL-1β的siRNAIL-1β、靶向IL-23的siRNAIL-23、以及靶向TNF-α的siRNATNF-α共价偶联修饰制备的小分子药物-核酸偶联物及其自组装纳米胶束用于干眼症的协同治疗。本实施例制备了不同炎症因子靶点的三环孢素A与小干扰RNA药物-核酸偶联物纳米胶束用于协同治疗干眼病。本实施例选择的基因靶点为细胞分泌于胞外的不同炎症因子，进一步验证该结构在治疗干眼疾病中的多靶点可行性。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了三个CsA分子分别与靶向NLRP3的siRNANLRP3、靶向JAK1的siRNAJAK1、以及靶向PDE4的siRNAPDE4共价偶联修饰制备的小分子药物-核酸偶联物及其自组装纳米胶束用于干眼症的协同治疗。本实施例制备了靶向细胞内炎症相关关键基因的siRNA与环孢素A分子的偶联物，利用其双亲性组装形成纳米胶束用于干眼症的协同治疗。本实施例选择细胞内不同炎症基因靶点，进一步验证该结构在治疗干眼疾病中的多靶点可行性。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了3CsA与ASOIL-17、3CsA与ASOIL-1β、3CsA与ASOIL-23以及3CsA与ASOTNF-α共递送药物核酸偶联物自组装纳米胶束用于干眼病的协同治疗。本实施例制备了不同炎症因子靶点的三环孢素A与反义寡核苷酸药物-核酸偶联物纳米胶束用于协同治疗干眼病。本实施例选择的基因靶点为细胞分泌于胞外的不同炎症因子，进一步验证该结构在治疗干眼疾病中的多靶点可行性。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了20CsA与ASONLRP3、20CsA与ASOJAK1和20CsA与ASOPDE4共递送药物核酸偶联物纳米胶束，用于干眼病的协同治疗。本实施例采用20PS修饰的ASO，与多个环孢素A小分子接枝，增大了载药量的同时可减小治疗剂量，提高了治疗安全性；与此同时，本实施例选取干眼疾病中的多个胞内炎症治疗靶点，进一步炎症药物-核酸偶联物治疗干眼病的多靶点可行性。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了由10个雷帕霉素(Rapamycin,RAP)修饰靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸得到的小分子药物-反义寡核苷酸偶联物(10RAP-ASONFKBIZ)及其自组装形成的纳米胶束用于干眼症的协同治疗。本发明通过在ASO序列一端的核酸骨架上接枝多个雷帕霉素分子所构建的雷帕霉素-反义寡核苷酸偶联物具有较高载药量。利用雷帕霉素分子的疏水性和核酸分子的亲水性赋予雷帕霉素-反义寡核苷酸偶联物双亲性特征，其在水溶液中可自组装即可形成纳米胶束结构。该纳米胶束结构无需其他载体材料即能够被细胞有效摄取，从而实现雷帕霉素和反义寡核苷酸的高效共递送；雷帕霉素-反义寡核苷酸偶联物可通过调控不同炎症相关信号通路实现干眼症的联合治疗。其中雷帕霉素作为雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂可有效抑制mTOR信号转导通路实现炎症抑制作用，同时靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸可以有效敲低NFKBIZ基因表达，进一步抑制干眼症相关的炎症反应。通过两者协同作用联合抑制炎症反应，从而实现了良好的干眼治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了由环孢素A三聚体(CsA3)与靶向NFKBIZ的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ)共价偶联形成的小分子药物-反义寡核苷酸偶联物及其自组装形成的球形纳米胶束用于银屑病的协同治疗。本发明通过点击化学反应在ASO末端接枝三个环孢素A，其纯化及制备方法简单可控。利用三个环孢素A分子较强的疏水性使得偶联物具有较强的两亲性，无需载体即可在水溶液中自组装形成稳定的纳米胶束结构，所制备的球形胶束核酸纳米结构能够高效地被细胞摄取，实现CsA和ASO的同时共递送；环孢素A作为一种免疫调节剂与抗炎药，能抑制促炎症细胞因子的生成与释放，并上升抗炎症细胞因子的释放水平；同时ASO可以敲低炎症相关基因NFKBIZ蛋白的表达，进一步抑制银屑病的炎症反应。通过协同调控作用抑制炎症反应，调控免疫平衡，实现更好的银屑病治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了由10个曲安奈德分子修饰靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASO)的小分子药物-反义寡核苷酸偶联物及其组装形成的纳米胶束纳米结构用于银屑病的协同治疗。本发明通过在ASO序列末端接枝多个曲安奈德分子构建的曲安奈德-反义寡核苷酸偶联物具有较高载药量。利用曲安奈德的疏水性和核酸分子的亲水性赋予曲安奈德-反义寡核苷酸偶联物两亲性，在水溶液中通过自组装即可形成纳米胶束结构。该纳米胶束结构无需其他载体材料即可实现曲安奈德和反义寡核苷酸的高效共递送，能够有效地被细胞摄取；通过调控不同炎症相关信号通路实现银屑病的联合治疗，其中曲安奈德作为一种糖皮质激素，具有抗炎、抗瘙痒和收缩血管等作用，其在皮肤疾病治疗中的抗炎和抗过敏作用较强且持久。同时靶向NFKBIZ基因的ASO可以有效敲低NFKBIZ蛋白表达，进一步抑制银屑病相关的炎症反应。通过两者协同作用联合抑制炎症反应，从而达到良好的银屑病治疗效果。
在本发明的一个实施例中，本发明构建了由10个卡泊三醇分子与靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASO)共价偶联制备的小分子药物-反义寡核苷酸偶联物(10Cal-ASONFKBIZ)及其组装形成的纳米胶束用于银屑病的协同治疗。本发明通过在ASO序列末端接枝多个卡泊三醇分子构建的卡泊三醇-反义寡核苷酸偶联物具有较高载药量。利用卡泊三醇的疏水性和核酸分子的亲水性赋予卡泊三醇-反义寡核苷酸偶联物双亲性，在水溶液中通过自组装即可形成纳米胶束结构。该纳米胶束结构无需其他载体材料即可实现卡泊三醇和反义寡核苷酸的高效共递送，能够有效地被细胞摄取；通过调控不同炎症相关信号通路实现银屑病的联合治疗，其中卡泊三醇是一种维生素D3的类似物，能够抑制皮肤细胞(角朊细胞)增殖和诱导其分化，从而纠正银屑病皮损的增生和分化异常。同时靶向NFKBIZ基因的ASO可以有效敲低NFKBIZ蛋白表达，进一步抑制银屑病相关的炎症反应。通过两者协同作用联合抑制炎症反应，从而达到良好的银屑病治疗效果。
如无特殊说明，本发明对所用原料的来源没有特殊要求，采用本领域技术人员所熟知的市售商品即可。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应该理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中本领域技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1单环孢素A(CyclosporineA,CsA)与靶向核因子κB抑制因子ζ(NFKBIZ)反义寡核苷酸偶联物用于干眼症的协同治疗
1.1叠氮己酸碳酸酯修饰环孢素A(CsA-N3)的合成
本实施例中叠氮己酸碳酸酯修饰环孢素A(CsA-N3)以及CsA-ASONFKBIZ共价偶联物的制备路线如图1所示。
1.1.1氯甲基碳酸酯环孢素A(CsA-Cl)合成
在氮气保护下，取环孢素A(1000mg)置于干燥的50mL圆底烧瓶中，加入10mL无水二氯甲烷搅拌至溶解，将反应瓶至于冰浴中，然后逐滴加入592μL氯甲酸氯甲酯，再逐滴加入336μL无水吡啶，自然恢复至室温，搅拌反应24h。反应完毕后，加入40mL无水二氯甲烷稀释反应液，依次用50mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，50mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，收集有机相后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩有机相后再经硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，最后得到白色固体550mg，即制得氯甲基碳酸酯环孢素A，产率：～60％。
氯甲基碳酸酯环孢素A的1HNMR谱图如图2所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，各质子峰的归属如下：δ(ppm):8.46(1H,d),7.91(1H,d),7.46(1H,d),7.37(1H,d),5.72(1H,d),5.62(1H,dd),5.47(1H,d),5.31(2H,m),5.21(2H,m),5.06(2H,m),5.00(1H,q),4.88(1H,t),4.77(1H,t),4.70(1H,t),4.60(1H,d),4.33(1H,t),4.05(1H,q),3.39(3H,s),3.25(3H,s),3.16(3H,s),3.13(1H,s),3.01(3H,d),2.60(3H,d),2.34(1H,m),2.06(4H,m),2.00(4H,m),1.92(2H,m),1.81(3H,m),1.66(6H,m),1.53(4H,d),1.42(2H,m),1.34(1H,m),1.26(3H,d),1.20(3H,d),1.14(1H,dq),1.05(3H,d),1.04(1H,d),0.98(3H,t),0.94(3H,d),0.91(3H,d),0.89(3H,d),0.88(3H,d),0.86(3H,d),0.82(9H,m),0.81(3H,d),0.76(3H,d).氯甲基碳酸酯环孢素A的13C NMR谱图如图3所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，产物所含特征碳的归属如下：173.7,173.4,173.1,172.8,171.6,171.2,170.9,170.8,170.0,169.9,167.6,153.5。氯甲基碳酸酯环孢素A的理论分子量为1293.80，基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)实际测得的分子量为1294.80，归属于氯甲基碳酸酯环孢素A的分子离子峰[M+1]+，如图4所示。
1.1.2碘甲基碳酸酯环孢素A(CsA-I)的合成
在氮气保护下，取氯甲基碳酸酯环孢素A(500mg)放置于干燥的25mL圆底烧瓶中，加入1mL无水二氯甲烷搅拌溶解，氮气流下减压蒸馏除去二氯甲烷，加5mL无水乙腈溶解，将碘化钠(500mL)加入反应溶液中，在40℃条件下反应24h，反应完毕后，减压蒸馏除去乙腈，然后加入50mL无水二氯甲烷，用50mL饱和氯化钠溶液洗涤2次，收集有机相，然后用无水硫酸钠干燥，减压蒸馏除去溶剂后置真空干燥箱内(40℃)真空干燥即制得碘甲基碳酸酯环孢素A，所得产物直接用于下一步反应。
1.1.3叠氮己酸碳酸酯键连接的环孢素A(CsA-N3)的合成
在氮气保护下，取上述所制备碘甲基碳酸酯环孢素A(200mg)，放置于10mL圆底烧瓶中，加入1mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)搅拌溶解，取40mg 6-叠氮基己酸溶解在1mL无水DMF中，滴加至碘甲基碳酸酯环孢素A中，加入60μL无水N,N-二异丙基乙胺，在室温条件下反应24h。反应完毕后，减压蒸馏除去DMF，加50mL乙酸乙酯溶解，加入50mL 10％焦亚硫酸钠溶液(w/v)洗涤2次，饱和氯化钠溶液洗涤1次，然后收集有机相，加入无水硫酸钠进行干燥，过滤后将有机相减压蒸馏浓缩，然后利用硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯(～1:2)混合溶液，最后收集得到白色固体产物约120mg(Rf:～0.2)，即制得叠氮己酸碳酸酯修饰的环孢素A。
叠氮己酸碳酸酯键修饰的环孢素A(CsA-N3)的1HNMR谱图如图5所示，核磁波谱测试使用溶剂为CDCl3，各质子峰的归属如下：δ(ppm):8.54(1H,d),7.98(1H,d),7.52(1H,d),7.46(1H,d),5.82(1H,d),5.70(1H,dd),5.68(1H,d),5.54(1H,d),5.37(2H,m),5.25(2H,m),5.11(2H,m),5.06(1H,d),4.97(1H,t),4.85(1H,t),4.77(1H,t),4.66(1H,d),4.40(1H,t),3.46(3H,s),3.31(3H,s),3.28(2H,d),3.23(3H,s),3.20(3H,s),3.09(1H,s),2.67(3H,d),2.41(1H,t),2.12(4H,m),2.06(4H,m),1.99(2H,m),1.87(3H,m),1.66(6H,m),1.60(4H,d),1.42(2H,m),1.33(3H,d),1.26(3H,d),1.20(3H,d),1.14(1H,dq),1.05(7H,d),1.00(3H,d),0.96(3H,t),0.94(12H,m),0.91(3H,d),0.89(3H,d),0.88(3H,d),0.86(3H,d),0.82(9H,m),0.81(3H,d),0.76(3H,d)。叠氮己酸碳酸酯修饰的环孢素A的理论分子量为1415.89，实际测得的分子量为1416.90，归属为叠氮己酸碳酸酯修饰的环孢素A的分子离子峰[M+1]+，如图6所示。
1.2单环孢素A与NFKBIZ反义寡核苷酸共价偶联物(CsA-ASONFKBIZ)的合成
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因反义寡核苷酸均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，在反义寡核苷酸3’端我们引入了二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne,DBCO)修饰，使其能够与修饰在CsA-N3上的叠氮基团通过点击反应高效偶联，3’端DBCO基团修饰在以下所有实施例中均以-DBCO-3’表示，其修饰结构如下所示：
Figure BDA0003704601890000211
本实施例中使用的核酸序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(DBCO-ASONFKBIZ-h)序列为
Human:5’-ATCAGACAACGAATCGGGC-DBCO-3’(SEQ ID NO.1)；
其中靶向小鼠NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(DBCO-ASONFKBIZ-m)序列为
Mouse:5’-AATACTGGTACATTGACGCC-DBCO-3’(SEQ ID NO.2)。
单个环孢素A分子共价修饰NFKBIZ反义寡核苷酸制备共价偶联物(CsA-ASONFKBIZ)的合成方法为：将0.2mg CsA-N3(130nmol)溶于0.13mLDMSO中，加入5OD DBCO-ASONFKBIZ(26nmol)后，放置于50℃下震荡反应24h。加入5mL水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的CsA-N3，然后将水溶液浓缩蒸干后，即得到CsA-ASONFKBIZ偶联物分子。通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶图验证CsA与ASO成功偶联，结果如图7所示。从图中可以看出单个CsA与DBCO-ASONFKBIZ的偶联效率较高，约为95％。
1.3CsA-ASONFKBIZ-h偶联物的细胞摄取情况
将人角膜上皮细胞(Human corneal epithelial cells,HCEC)按照5×104细胞/孔的密度接种于置于12孔板中培养过夜，去除培养基后分别加入含有10μM或100μM带有FITC荧光的CsA-ASONFKBIZ-h偶联物的新鲜培养基0.5mL继续与HCEC细胞进行共孵育6h，不加偶联物的孔板作为空白对照(Mock组)。孵育完成后弃掉上清培养基，然后用胰酶消化细胞后用磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH＝7.2)洗涤2～3次，收集细胞后使用流式细胞仪进行流式细胞分析，实验结果如图8所示。结果表明，CsA-ASONFKBIZ-h偶联物能够有效地被细胞摄取，孵育后细胞呈现明显的荧光增强信号。同时100μM CsA-ASONFKBIZ-h偶联物孵育后细胞平均荧光强度约为10μM共同孵育后荧光强度的10倍，证明CsA-ASONFKBIZ-h偶联物具有良好的入胞效果。
1.4CsA-ASONFKBIZ-h偶联物对靶标基因NFKBIZ的调控作用
将HCEC细胞按照1×105细胞/孔的密度接种于6孔板培养至贴壁，然后采用100ng/mL脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激过夜，去掉上清液后，分别加入含ASONFKBIZ-h、ASONFKBIZ-h+Lipofectamine2000(Lipo2000)，以及CsA-ASONFKBIZ-h的Opti-MEM培养基1mL(均含10μMASO)，同时以不做任何处理的细胞作为空白参考(Mock),37℃共孵育转染6h后，更换DMEM培养基继续孵育48h。然后收集细胞并提取RNA进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测，以分析HCEC细胞中靶标基因NFKBIZ mRNA表达水平，实验结果如图9所示。从图中可以看出，LPS刺激过后的HCEC细胞中NFKBIZ mRNA表达水平约为正常细胞的1.3倍，无转染试剂下ASONFKBIZ-h对LPS刺激后人眼上皮细胞中NFKBIZ mRNA的表达有一定的抑制作用，但仍为正常细胞的1.25倍左右；使用Lipo2000转染ASONFKBIZ-h后其表达水平降低至正常细胞的表达水平，加入CsA-ASONFKBIZ-h共孵育后NFKBIZ mRNA表达量降至正常细胞的0.8倍左右。由此结果可以看出，CsA-ASONFKBIZ-h偶联物对NFKBIZ mRNA的敲低能力优于无修饰的ASONFKBIZ-h。
1.5CsA-ASONFKBIZ-m偶联物对干眼症的治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周。建模成功后分别使用院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，简称院配CsA滴眼液或CsA滴眼液，由上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)与CsA-ASONFKBIZ-m(400μM CsA)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每次滴5μL，每日早晚各滴一次。同时在治疗的第0，7，14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线泪液分泌量测试，以评估治疗效果，实验结果如图10所示。
荧光素钠染色结果显示，院配CsA滴眼液治疗组小鼠眼部评分在第7d有所下降，14d治疗结束后评分由略高于6分降至5分左右，酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增至3mm左右；CsA-ASONFKBIZ-m治疗组的小鼠眼部荧光素钠评分14d后由最初的5.5分降至3分左右，酚红棉线浸润长度由1.8mm增至3.2mm左右。相比于病理组与单纯的院配CsA滴眼液组，CsA-ASONFKBIZ-m由于能够更好地实现小分子药物以及核酸药物的递送，两者能够协同抑制干眼小鼠眼表炎症，显示了对小鼠干眼更好的治疗效果。
实施例2.双环孢素A修饰NFKBIZ反义寡核苷酸的共价偶联物(2CsA-ASONFKBIZ)及其组装结构用于干眼症的协同治疗
2.12CsA-ASONFKBIZ偶联物及其自组装纳米胶束的制备与表征
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，在反义寡核苷酸3’端我们引入了2个二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne,DBCO)修饰，使其能够与修饰在CsA-N3上的叠氮基团通过点击反应高效偶联，其中一个DBCO修饰与实施例1中相同，位于核酸序列3’端；第二个DBCO修饰靠近3’端，为核酸序列中间T碱基修饰，在以下所有实施例中含中间修饰DBCO的T碱基均以/iDBCOdT/符号表示，其结构如下所示：
Figure BDA0003704601890000231
本实施例中使用的核酸序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(2DBCO-ASONFKBIZ-h)序列为：
Human:5’-ATCAGACAACGAATCGGGC/iDBCOdT/TT-DBCO-3’(SEQ ID NO.3)；
而靶向鼠源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(2DBCO-ASONFKBIZ-m)序列为：
Mouse:5’-AATACTGGTACATTGACGCC/iDBCOdT/TT-DBCO-3’(SEQ ID NO.4)。
2CsA-ASONFKBIZ偶联物的合成方法为：将0.4mg实施例1中制备的CsA-N3(260nmol)溶于0.13mL二甲亚砜(DMSO)中，加入5OD(Optical Density)量的2DBCO-ASONFKBIZ(26nmol)后，放置于50℃下震荡反应24h。加入5mL水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的CsA-N3，浓缩蒸干后，即得到2CsA-ASONFKBIZ偶联物分子，然后将其用50μL DMSO溶液重新溶解，然后滴入500μLPBS中进行自组装形成2CsA-ASONFKBIZ纳米胶束，然后在PBS溶液中透析除去DMSO得到最终的自组装核酸纳米胶束。通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳以及1％琼脂糖凝胶电泳验证CsA与反义寡核苷酸的成功接枝偶联以及纳米胶束的成功组装，见图11。从图中可以看出，CsA接枝2DBCO-ASONFKBIZ的效率较高，产率95％以上，同时组装后形成的2CsA-ASONFKBIZ纳米胶束尺寸较为均一，在1％琼脂糖凝胶电泳图中表现为单一条带。
2.22CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对靶标NFKBIZ基因的调控作用
将HCEC细胞按照1×105细胞/孔的密度接种于6孔板培养至贴壁，然后采用100ng/mL LPS刺激过夜，去掉上清液后，分别加入含ASONFKBIZ-h+Lipo2000复合物以及2CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束的Opti-MEM培养基1mL(均含10μMASO)，37℃共孵育转染6h后，更换DMEM培养基继续孵育48h。收集细胞并提取RNA进行RT-qPCR检测，以分析HCEC细胞中靶标基因NFKBIZ mRNA表达水平，实验结果如图12所示。
从图中可以看出，LPS刺激后的HCEC细胞，其NFKBIZ mRNA表达增至正常细胞的1.4倍左右，Lipo2000转染后的ASONFKBIZ-h可将其下调至正常细胞水平，2CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束共孵育处理后LPS刺激的HCEC细胞中NFKBIZ mRNA表达量下降至正常细胞的0.8倍左右。综上，相比于单一靶向NFKBIZ的ASO，2CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因的表达具有更强的敲低能力。
2.32CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束对干眼症的治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周。建模成功后分别使用的院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，由上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)与2CsA-ASONFKBIZ-m(400μM CsA)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每次滴5μL，每日早晚各滴一次。同时在治疗的第0，7，14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线泪液分泌量测试，以评估治疗效果，实验结果如图13所示。
荧光素钠染色结果显示，院配环孢素A滴眼液治疗后小鼠眼部评分6分降至4分左右，其对应酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增加至3mm左右。而2CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗后小鼠眼部荧光素钠染色评分由6分降至3.5分左右，酚红棉线浸润长度由1.5mm增至3.5mm左右。从动物实验结果中可以看出，相比于病例组和院配CsA滴眼液治疗组，2CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束对小鼠干眼的治疗效果更为明显，一是由于自组装形成的球形核酸纳米胶束具有更好的入胞能力，二是小分子药物与核酸药物能够实现协同治疗，从而更好地实现抑制小鼠眼部组织炎症，达到干眼治疗的目的。
实施例3.三环孢素A修饰NFKBIZ反义寡核苷酸共价偶联物(3CsA-ASONFKBIZ)及其组装结构用于干眼病的协同治疗
3.13CsA-ASONFKBIZ偶联物及其自组装纳米胶束的制备与表征
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，在反义寡核苷酸3’端我们引入了3个二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne,DBCO)修饰，使其能够与修饰在CsA-N3上的叠氮基团通过点击反应高效偶联，其中一个DBCO修饰位于核酸序列3’端；另外两个均为核酸序列中间T碱基DBCO修饰，靠近3’端，其序列如下：
靶向人源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(3DBCO-ASONFKBIZ-h)序列为：
Human:5’-ATCAGACAACGAATCGGGC/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3’(SEQ IDNO.5)；
靶向鼠源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(3DBCO-ASONFKBIZ-m)序列为：
Mouse:5’-AATACTGGTACATTGACGCC/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3’(SEQ IDNO.6)。
3CsA-ASONFKBIZ偶联物合成方法为：将0.6mg CsA-N3(390nmol)溶于0.13mLDMSO中，加入5OD DNA(26nmol)后，放置于50℃下震荡反应24h。加入5mL水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的CsA-N3，浓缩蒸干后，即得到3CsA-ASONFKBIZ偶联物分子，然后将其用50μLDMSO溶液重新溶解，所得溶液滴入500μL PBS中进行组装形成3CsA-ASONFKBIZ纳米胶束，然后在PBS溶液中透析除去DMSO得到最终的纳米胶束组装结构。通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳与1％琼脂糖凝胶电泳验证其成功接枝与组装，见图14。从图中可以看出，CsA接枝3DBCO-ASONFKBIZ的效率较高，同时组装后的尺寸较为均一。
3.2 3CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因调控作用
将HCEC细胞按照1×105细胞/孔的密度接种于6孔板中孵育至贴壁，用100ng/mLLPS刺激过夜，去掉上清液，分别加入含ASONFKBIZ-h+Lipo2000复合物以及3CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束的Opti-MEM培养基1mL(均含10μMASO)，37℃共孵育转染6h后，更换为DMEM培养基继续孵育48h，后收集细胞并提取RNA进行RT-qPCR测试，以评估HCEC细胞中NFKBIZ mRNA的表达，实验结果如图15所示。
从图中可以看出，LPS刺激后的HCEC细胞，其NFKBIZ mRNA表达增至正常细胞的1.4倍左右，Lipo2000转染后的ASONFKBIZ-h可将其下调至正常细胞水平，3CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因下调至正常细胞的0.75倍左右，因此相比于单一的ASO，3CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因的表达下调能力更佳。
3.3 3CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束对干眼症的治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周。建模成功后分别使用院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)与3CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束(133μMASO浓度，400μM CsA)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每次滴5μL，每日早晚各滴一次。同时在治疗的第0，7，14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线评估治疗效果，实验结果如图16所示。
荧光素钠染色结果显示，院配环孢素A滴眼液治疗后的小鼠眼部评分10分降至8分左右，酚红棉线泪液测试结果由1mm增至2.5mm左右；3CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗后的小鼠眼部荧光素钠评分由10分降至4分左右，酚红棉线浸润长度由1.3mm增至4mm左右。从动物实验结果中可以看出，相比于病例组与单纯的CsA滴眼液组，3个CsA与靶向NFKBIZ的ASO偶联后组装形成的纳米胶束对小鼠干眼的治疗效果更为明显。
实施例4环孢素A三聚体(CsA3)修饰NFKBIZ反义寡核苷酸共价偶联物(CsA3-ASONFKBIZ)及其纳米胶束组装结构用于干眼症治疗
4.1连接子氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷的合成，步骤见图17
a)Boc-氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷的合成。将1.0g Boc-氨基三(羟甲基)甲烷(4.52mmol，1当量)溶于10mL无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。将混合液置于冰浴中搅拌，加入3.2g溴丙炔(27.12mmol，6当量)。然后在15min内分3个批次将1.5g氢氧化钾粉末(27.12mmol，6当量)加入混合液中，反应升温至35℃，在氮气保护氛围下继续反应24h。反应液中加入100mL乙酸乙酯后，用200mL去离子水分3次洗涤。萃取收集乙酸乙酯有机相，加入无水硫酸钠除水后旋蒸蒸干，产物通过硅胶柱层析进行纯化得到Boc-氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷。洗脱剂为正己烷/乙酸乙酯混合溶液。Boc-氨基三(炔丙基)甲烷产率为64％。产物核磁共振图谱及各峰归属见图18。
b)氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷的合成。将0.5g Boc-氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷溶于5mL无水二氯甲烷中。然后将混合液放置于冰水浴中并进行搅拌，缓慢滴加3mL三氟乙酸(TFA)至混合液中继续搅拌约2h。反应结束后，利用旋转蒸发仪将溶剂蒸干，然后加入15mL饱和碳酸氢钠溶液，同时加入50mL乙酸乙酯萃取3次，收集合并有机层后用15mL去离子水洗涤，然后再次收集有机相后加入无水硫酸钠除水并通过旋蒸蒸干溶剂，最后得到氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷，其产率为98％。
4.2环孢素A三聚体-ASO偶联物的合成(CsA3-ASO)，步骤见图19
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，在反义寡核苷酸3’端我们引入了N-羟基琥珀酰亚胺脂(N-Hydroxysuccinimide ester，NHS ester)功能基团，使其能够与氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷发生偶联反应得到3’端了三个炔基的反义寡核苷酸，进而与修饰在CsA-N3上的叠氮基团通过点击反应高效偶联，3’端NHS基团修饰在以下所有实施例中均以-NHS-3’表示，其修饰结构如下所示：
Figure BDA0003704601890000261
本实施例中使用的核酸序列如下：
靶向人源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(NHS-ASONFKBIZ-h)序列为：
Human:5’-ATCAGACAACGAATCGGGC-NHS-3’(SEQ ID NO.7)；
靶向鼠源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(NHS-ASONFKBIZ-m)序列为：
Mouse:5’-AATACTGGTACATTGACGCC-NHS-3’(SEQ ID NO.8)。
CsA3-ASO偶联物的合成方法为：
a)分别将1.20mg氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷(5.12μmol，50当量)溶于800μLDMSO中，20OD羟基琥珀酰亚胺修饰的反义寡核苷酸(NHS-ASO,102.40nmol，1当量)溶于200μL 1×PBS缓冲溶液中，按照DMSO与1×PBS缓冲溶液体积比4:1将两相充分混合后，在室温条件下搅拌过夜。加入去离子水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的氨基三[(2-丙炔基氧)甲基]甲烷，浓缩蒸干后，即得到三炔丙基修饰的ASO偶联物分子。在1×TBE缓冲溶液中，600V电压条件下运行2h，通过20％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证偶联物分子成功接枝，见图20。
b)分别将1.09mg叠氮己酸碳酸酯键连接的环孢素A(CsA-N3,0.77μmol，15当量)和0.56mg CuI·TBTA(0.77μmol，15当量)溶于475μLDMF中，10OD三炔丙基修饰ASO偶联物分子(51.20nmol，1当量)溶于25μL无菌水中，按照DMF与水体积比为95:5将两相充分混合后，反应在氮气保护条件下搅拌过夜。然后真空浓缩至微量体积，通过高效液相色谱(HPLC)纯化得到环孢素A三聚体-ASO偶联物(CsA3-ASONFKBIZ)。在1×TAE缓冲溶液中，80V电压条件下运行20min，通过0.5％琼脂糖凝胶电泳验证其成功接枝，见图21。
4.3CsA3-ASONFKBIZ纳米胶束的制备和表征
将CsA3-ASONFKBIZ偶联物(10ODASO)溶于100μLDMSO中，逐滴加入至300μL连续搅拌的1×PBS缓冲溶液中。随后将溶液放入透析袋中透析过夜除去DMSO。3000转离心5min后，即可得到CsA3-ASONFKBIZ胶束纳米粒子。通过DLS、TEM表征其直径和形貌，如图22所示。
4.4CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因的调控效果
将HCEC细胞按照1×105细胞/孔的密度接种于6孔板中孵育至贴壁，用100ng/mLLPS刺激过夜，分别加入含有ASONFKBIZ-h+Lipo2000复合物以及CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束的Opti-MEM培养基1mL(均含10μMASO)，在37℃共孵育转染6h后，更换DMEM培养基继续孵育48h。后收集细胞并提取RNA进行RT-qPCR检测，以评估HCEC细胞中NFKBIZ mRNA的表达量，实验结果如图23所示。
从图中可以看出，LPS刺激过后的HCEC细胞中NFKBIZ mRNA表达水平约为正常细胞的1.5倍，使用Lipo2000转染ASO后NFKBIZ mRNA的含量降低至正常细胞的表达水平，加入CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束后NFKBIZ mRNA表达量降至正常细胞的0.5倍左右。由此结果可以看出，CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ mRNA具有显著下调能力。
4.5CsA3-ASONFKBIZ-m纳米胶束对干眼症治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周。建模成功后分别使用院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，由上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)与CsA3-ASONFKBIZ-m纳米胶束(400μM CsA)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每次滴5μL，每日早晚各滴一次。同时在治疗的第0，14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线评估治疗效果，实验结果如图24所示。
荧光素钠染色结果显示，院配环孢素A滴眼液治疗后的小鼠眼部评分10分降至7.5分左右，酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增至2mm左右；CsA3-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗后的小鼠眼部荧光素钠评分由10分降至6分左右，酚红棉线浸润长度由1.5mm增至3.5mm左右。从动物实验结果中可以看出，相比于病例组与单纯的CsA滴眼液组，3个CsA与靶向NFKBIZ的ASO偶联后组装形成的纳米胶束对小鼠干眼的治疗效果更为明显。
实施例5.单个、两个、以及三个环孢素A分子与靶向NFKBIZ小干扰RNA偶联物(nCsA-siRNANFKBIZ，n＝1,2,或3)用于干眼病的协同治疗
5.1单个、两个以及三个环孢素A与siRNANFKBIZ偶联物(nCsA-siRNANFKBIZ，n＝1,2,或3)的制备与表征
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因的小干扰RNA均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，在小干扰RNA正义链(Sense链)3’端我们引入了n(n＝1,2,或3)个二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne,DBCO)修饰，使其能够与修饰在CsA-N3上的叠氮基团通过点击反应高效偶联。下面详细例举了本实施例中所选用的siRNA具体序列信息。
修饰1、2、3个DBCO并靶向人源NFKBIZ基因的siRNA序列如下：
DBCO-siRNANFKBIZ-h
Sense 5’-rGrCrCrCrGrArUrUrCrGrUrUrGrUrCrUrGrArUdTdT-DBCO-3’(SEQ IDNO.9)；
Antisense 5’-rArUrCrArGrArCrArArCrGrArArUrCrGrGrGrCdTdT-3’(SEQ IDNO.10)；
2DBCO-siRNANFKBIZ-h
Sense 5’-rGrCrCrCrGrArUrUrCrGrUrUrGrUrCrUrGrArUdTdT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’(SEQ ID NO.11)；
Antisense 5’-rArUrCrArGrArCrArArCrGrArArUrCrGrGrGrCdTdT-3’(SEQ IDNO.12)；
3DBCO-siRNANFKBIZ-h
Sense5’-rGrCrCrCrGrArUrUrCrGrUrUrGrUrCrUrGrArUdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3(SEQ ID NO.13)
Antisense 5’-rArUrCrArGrArCrArArCrGrArArUrCrGrGrGrCdTdT-3’(SEQ IDNO.14)。
修饰1、2、3个DBCO的鼠源NFKBIZ siRNA序列如下：
DBCO-siRNANFKBIZ-m
Sense 5’-rGrCrGrUrCrArArUrGrUrArCrCrArGrUrArUrUdTdT-DBCO-3’(SEQ IDNO.15)
Antisense 5’-rArArUrArCrUrGrGrUrArCrArUrUrGrArCrGrCdCdT-3’(SEQ IDNO.16)
2DBCO-siRNANFKBIZ-m
Sense 5’-rGrCrGrUrCrArArUrGrUrArCrCrArGrUrArUrUdTdT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’(SEQ ID NO.17)
Antisense 5’-rArArUrArCrUrGrGrUrArCrArUrUrGrArCrGrCdCdT-3’(SEQ IDNO.18)
3DBCO-siRNANFKBIZ-m
Sense5’-rGrCrGrUrCrArArUrGrUrArCrCrArGrUrArUrUdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’
(SEQ ID NO.19)
Antisense 5’-rArArUrArCrUrGrGrUrArCrArUrUrGrArCrGrCrCdT-3’(SEQ IDNO.20)
环孢素A与siRNA偶联物合成方法为：分别将0.2mg、0.4mg、0.6mg CsA-N3(140nmol、280nmol、420nmol)溶于0.14mL DMSO中，分别加入5OD DBCO-siRNANFKBIZ Sense链、2DBCO-siRNANFKBIZ Sense链，3DBCO-siRNANFKBIZ Sense链(各28nmol)后，置于37℃下震荡反应24h。加入5mL水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的CsA-N3，浓缩蒸干后，即得到CsA-siRNANFKBIZ Sense链、2CsA-siRNANFKBIZ Sense链、3CsA-siRNANFKBIZ Sense链偶联物分子。将所制备的CsA-siRNANFKBIZ Sense链与等物质量siRNANFKBIZAntisense链在1×PBS中混合，Sense链和Antisense链互补配对即可形成可溶的CsA-siRNANFKBIZ偶联物双链分子。而对于修饰两个和三个CsA的CsA-siRNANFKBIZ Sense链，首先将2CsA-siRNANFKBIZ Sense链、3CsA-siRNANFKBIZ Sense链重新溶解于50μLDMSO中，然后滴入500μL 1×PBS缓冲溶液中进行组装，通过在1×PBS中透析除去DMSO得到2CsA-siRNANFKBIZ Sense链纳米胶束、3CsA-siRNANFKBIZSense链纳米胶束，最后与加入Antisense链互补配对形成2CsA-siRNANFKBIZ、和2CsA-siRNANFKBIZ纳米胶束。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳实验与琼脂糖凝胶电泳实验对所得产物进行表征，结果如图25所示。从图中可以看出，CsA-N3成功与siRNANFKBIZ Sense链偶联，且不影响后续与相应Antisense链的互补配对与组装。
5.2nCsA-siRNANFKBIZ-h(n＝1,2,3)及其组装结构对IκB-ζ蛋白的调控作用
nCsA-siRNANFKBIZ-h(n＝1,2,3)纳米胶束旨在降低细胞中的NFKBIZ mRNA水平，从而进一步降低蛋白层面的表达。为了检验HCEC细胞中的IκB-ζ蛋白表达水平以及不同药物对其的下调效果，因此进行western blot实验进行表征。将HCEC细胞按照1×105细胞/孔的密度接种于于6孔板中贴壁过夜后用100ng/mL LPS刺激过夜，去掉上清液后，分别加入含有siRNANFKBIZ-h+Lipo2000复合物以及nCsA-siRNANFKBIZ-h(n＝1,2,3)偶联物和纳米胶束的Opti-MEM培养基1mL(均含有10μM siRNA)，在37℃共孵育转染6h后换为DMEM培养基，继续孵育48h后提取细胞中的蛋白，进行western blot实验。
实验结果如图26所示，从数据中可以看出，LPS刺激过后的HCEC细胞中IκB-ζ蛋白表达水平约为正常细胞的1.5倍，使用Lipo2000转染siRNANFKBIZ-h后的IκB-ζ蛋白表达水平约为正常细胞的1.2倍，加入CsA-siRNANFKBIZ-h偶联物、2CsA-siRNANFKBIZ纳米胶束和3CsA-siRNANFKBIZ纳米胶束后IκB-ζ蛋白表达量降至正常细胞的0.5-0.8倍左右。因此nCsA-siRNANFKBIZ-h可以有效降低LPS刺激后炎症引起的IκB-ζ蛋白表达量，且随着CsA修饰个数的增加，其降低IκB-ζ蛋白的效果更佳；与此同时，nCsA-siRNANFKBIZ-h(n＝1,2,3)偶联物以及纳米胶束的效果均优于Lipo2000转染siRNANFKBIZ-h组。
5.3nCsA-siRNANFKBIZ-h(n＝1,2,3)及其组装结构对NFKBIZ基因的调控作用
将HCEC细胞按照1×105细胞/孔的密度接种于6孔板中贴壁过夜后用100ng/mLLPS刺激12h，去掉上清液后，分别加入含有siRNANFKBIZ-h+Lipo2000复合物以及nCsA-siRNANFKBIZ-h(n＝1,2,3)偶联物和纳米胶束的Opti-MEM培养基1mL(均含有10μM siRNA)，在37℃共孵育转染6h后换为DMEM培养基，继续孵育48h后收集细胞并提取RNA进行RT-qPCR实验以评估HCEC细胞中NFKBIZ mRNA的表达，实验结果如图27所示。
从数据中可以看出，相比于空白组(Mock组)，CsA-siRNANFKBIZ-h对NFKBIZ基因的表达量有明显降低作用，可将其降低至LPS刺激前的水平；与此同时，LPS刺激过后的HCEC细胞中NFKBIZ表达量增加至正常细胞的1.5倍左右，分别接枝了1个、2个和3个CsA的siRNANFKBIZ-h，随着CsA修饰个数的增加，其对NFKBIZ基因的降低作用增加，分别将细胞中NFKBIZ的表达量降低至正常细胞的0.5～0.7倍左右。这可能是由于CsA的疏水作用增强了siRNANFKBIZ-h的入胞能力，同时二者协同作用具有更好的炎症治疗能力。
5.4nCsA-siRNANFKBIZ-m(n＝1,2,3)及其组装结构对干眼症的治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周，建模成功后分别使用的院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，由上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)与CsA-siRNANFKBIZ-m(400μM CsA)、2CsA-siRNANFKBIZ-m纳米胶束(400μM CsA)、3CsA-siRNANFKBIZ-m纳米胶束(400μM CsA)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每次滴5μL，每日早晚各滴一次。在治疗的第0，7，14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线评估治疗效果，实验结果如图28所示。
荧光素钠染色结果显示，院配环孢素A滴眼液治疗后的小鼠眼部评分6分降至4.5分左右，酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增至2.5mm左右；CsA-siRNANFKBIZ治疗后的小鼠眼部评分6分降至3分左右，酚红棉线泪液测试结果由2mm增至2.5mm左右；2CsA-siRNANFKBIZ纳米胶束治疗后的小鼠眼部评分6分降至2分左右，酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增至2.5mm左右；3CsA-siRNANFKBIZ纳米胶束治疗后的小鼠眼部评分6分降至2分左右，酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增至2.5mm左右；从动物实验结果中可以看出，相比于病例组与单纯的CsA滴眼液组，CsA-siRNANFKBIZ-m偶联物、2CsA-siRNANFKBIZ-m纳米胶束、3CsA-siRNANFKBIZ-m纳米胶束对小鼠干眼的治疗效果更为明显，一是由于小分子药物与核酸药物协同治疗，可以更好的达到抑制小鼠眼部细胞炎症的目的，二是疏水的CsA赋予了siRNA更好的入胞能力。
实施例6多个环孢素A分子接枝NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物及其自组装纳米胶束用于干眼病的治疗
6.1羰乙基溴代环孢素A(CsA-Br)的合成与表征
如图29所示，首先将CsA(100mg)与三光气(9mg)置于烧瓶中，抽排空气三次后在氮气保护下加入16mL二氯甲烷进行溶解，然后将DMAP(31mg)用1mL二氯甲烷溶解后逐滴加入反应液中，室温反应30min，现象为溶液变为乳白色，随后将丁二醇(72mg)用1mL二氯甲烷溶解后逐滴加入反应液中，室温反应过夜，现象为溶液从乳白色变为无色透明。反应结束后根据DMAP的量，用稀盐酸溶液洗涤三次，饱和氯化钠溶液洗涤1次，无水硫酸钠粉末干燥超过2h。减压蒸馏浓缩有机相后再经硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯混合溶液，后得到白色固体，即丁二醇修饰的环孢素A分子。
将CsA-丁二醇(90mg)与DIPEA(8mg)置于烧瓶中，抽排空气三次后在氮气保护下加入16mL二氯甲烷，随后将溴乙酰溴(16mg)用1mL二氯甲烷溶解后逐滴加入反应液中，室温反应过夜。反应结束后根据DIPEA的量，用稀盐酸溶液洗涤三次，饱和氯化钠溶液洗涤1次，无水硫酸钠粉末干燥超过2h，减压蒸馏浓缩有机相后再经硅胶柱层析分离纯化，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯混合溶液，最后得到黄色固体，即制得羰乙基溴代环孢素A。1HNMR(700MHz,Chloroform-d)δ7.99(d,J＝9.7Hz,1H),7.64(d,J＝7.5Hz,1H),7.47(d,J＝8.3Hz,1H),7.41(s,1H),7.28(s,1H),7.16(d,J＝7.9Hz,2H),7.11(s,1H),5.70(d,J＝6.6Hz,1H),5.48(d,J＝6.3Hz,1H),5.36–5.32(m,3H),5.12(d,J＝10.9Hz,1H),5.08–5.02(m,3H),4.97(dd,J＝9.9,5.9Hz,1H),4.85–4.81(m,2H),4.72(d,J＝13.9Hz,1H),4.65(dd,J＝9.9,8.4Hz,2H),4.52(t,J＝7.3Hz,2H),3.80(t,J＝6.5Hz,2H),3.51(s,3H),3.40(s,3H),3.26(s,3H),3.20(s,1H),3.18(s,1H),3.11(d,J＝1.6Hz,5H),2.96(s,1H),2.89(s,1H),2.69(d,J＝5.8Hz,6H),2.41(dd,J＝12.1,7.7Hz,2H),2.13(d,J＝11.1Hz,2H),2.08–2.05(m,2H),1.99(s,1H),1.77(s,2H),1.73–1.69(m,2H),1.63(d,J＝7.4Hz,4H),1.58(s,6H),1.47(d,J＝6.5Hz,1H),1.43(s,1H),1.35(d,J＝7.3Hz,3H),1.25(d,J＝6.7Hz,6H),1.07(d,J＝6.5Hz,2H),1.02(dd,J＝14.8,6.6Hz,7H),0.97–0.93(m,8H),0.89–0.84(m,13H),0.83(d,J＝6.6Hz,3H),0.71(d,J＝6.1Hz,3H).
羰乙基溴代环孢素A由于溴元素存在等位离子峰，其理论m/z值为1437.8098和1439.8077。高效液相色谱/四极杆飞行质谱联用仪测得的m/z值为1438.4549和1440.4506，归属于羰乙基溴代环孢素A的[M+H]+峰，证实目标产物成功合成，如图30所示。
6.220CsA-ASONFKBIZ偶联物与20CsA-ASONFKBIZ纳米胶束的制备与表征
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因的反义寡核苷酸均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，我们选择在反义核苷酸磷酸骨架中进行硫代(PS)修饰，使其能够与修饰在CsA-Br上的溴代羰乙基基团发生取代反应从而高效偶联，其序列如下：
靶向人源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(20PS-ASONFKBIZ-h)序列为：
5’-ATCAGACAACGAATCGGGCTTTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’(其中*表示硫代磷酸酯基团修饰位点，表示前后两个核苷酸单元通过硫代磷酸酯基团连接，以下实施例中如无特定说明核酸序列中硫代磷酸酯修饰均由*表示，下划线TTTTT为连接5’端ASO和3’端用于药物修饰序列的多个T碱基间隔序列，下述实施例中所列序列下划线部分均代表连接功能小核酸序列和药物修饰序列之间的间隔序列，不再一一赘述)(SEQ IDNO.21)；
其中靶向鼠源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(20PS-ASONFKBIZ-m)序列为：
5’-AATACTGGTACATTGACGCCTTTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’(SEQ ID NO.22)；
合成方法为：将7.5mg CsA-Br(5μmol)溶于0.063mL DMSO中，加入5OD20PS-ASONFKBIZ(12.5nmol)后，放置于50℃下震荡反应24h。加入5mL水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的CsA-Br，浓缩蒸干后，即得到20CsA-ASONFKBIZ偶联物分子。将20CsA-ASONFKBIZ偶联物溶于50μL DMSO中，逐滴加入至0.5mL磷酸盐缓冲液(PBS)中，搅拌30min。随后放入透析袋中并在PBS中透析过夜，除去DMSO，即可得到20CsA-ASONFKBIZ纳米胶束结构。通过10％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和1％琼脂糖凝胶电泳进行表征。从图31中可以看出，CsA-Br成功接枝20PS-ASONFKBIZ，并形成了尺寸较为均一的20PS-ASONFKBIZ纳米胶束组装体。
6.320CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因敲低作用
将HCEC细胞按照1×105细胞/孔的密度接于6孔板中贴壁，然后用100ng/mL LPS刺激12h，去掉上清液，分别加入含有ASONFKBIZ-h+Lipofectamine2000(Lipo2000)以及20CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束的Opti-MEM培养基1mL(均含有10μMASO)，在37℃共孵育转染6h后换为DMEM培养基，更换新的培养基后继续孵育48h，后收集细胞并提取RNA进行RT-qPCR实验，以检验HCEC细胞中NFKBIZ mRNA表达水平，实验结果如图32所示。
从图中可以看出，LPS刺激后的HCEC细胞，其NFKBIZ mRNA表达增至正常细胞的1.5倍左右，Lipo2000转染后的ASONFKBIZ-h可将其下调至与正常细胞水平，20CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因下调至正常细胞表达量的0.75倍左右，因此相比于单一的ASONFKBIZ-h，20CsA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因的表达下调能力更佳。
6.420CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束对干眼症的治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周。建模成功后分别使用院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，由上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)与20CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束(20μM，400μM CsA)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每次滴5μL，每日早晚各滴一次。同时在治疗的第0和14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线评估治疗效果，实验结果如图33所示。
从动物实验结果中可以看出，荧光素钠染色结果显示，院配环孢素A滴眼液治疗后的小鼠眼部评分9分升至11分左右，未取得明显改善，酚红棉线泪液测试结果维持2.5mm左右无明显变化；20CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束治疗后的小鼠眼部荧光素钠评分由9分降至7.5分左右，酚红棉线浸润长度由3mm增至5.5mm左右。因此可以看出相比于院配环孢素A滴眼液，在两周内20CsA-ASONFKBIZ-m纳米胶束对小鼠干眼病的治疗效果显著。
实施例7.环孢素A分子分别与靶向IL-17、IL-1β、IL-23以及TNF-α的小干扰核酸共价偶联物及其自组装纳米胶束用于干眼症的治疗
7.1环孢素A与不同靶点siRNA偶联物及其纳米胶束的制备
本实施例中所采用的靶向不同炎症因子基因的小干扰核酸均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，在siRNA正义链的3’端我们引入了3个二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne,DBCO)修饰，使其能够与修饰在CsA-N3上的叠氮基团通过点击反应高效偶联，其序列如下：
靶向人源不同炎症因子基因的siRNA序列为：
IL-17human(3DBCO-siRNAIL-17-h)
Sense5’-rCrUrCrUrArArUrGrArGrUrUrUrArGrUrCrCrGrAdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’(SEQ ID NO.23)
Antisense 5’-rUrCrGrGrArCrUrArArArCrUrCrArUrUrArGrArGdTdT-3'(SEQ IDNO.24)
IL-1βhuman(3DBCO-siRNAIL-1β-h)
Sense5’-rArGrGrCrUrGrArUrCrUrGrUrUrGrCrCrGrUrAdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’(SEQ ID NO.25)
Antisense 5’-rUrArCrGrGrCrArArCrArGrArUrCrArGrCrCrUdTdG-3’(SEQ IDNO.26)
IL-23human(3DBCO-siRNAIL-23-h)
Sense5’-rCrArGrCrArArCrCrCrUrGrArGrUrCrCrCrUrAdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’(SEQ ID NO.27)
Antisense 5’-rUrArGrGrGrArCrUrCrArGrGrGrUrUrGrCrUrGdTdT-3’(SEQ IDNO.28)
TNF-αhuman(3DBCO-siRNATNF-α-h)
Sense5′-rGrArCrArArCrCrArArCrUrArGrUrGrGrUrGrCdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3′(SEQ ID NO.29)
Antisense 5'-rGrCrArCrCrArCrUrArGrUrUrGrGrUrUrGrUrCdTdT-3'(SEQ IDNO.30)
其中靶向鼠源不同炎症因子基因的siRNA序列为：
IL-17mouse(3DBCO-siRNAIL-17-m)
Sense5’-rArArGrArGrArUrCrCrUrGrGrUrCrCrUrGrArAdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’(SEQ ID NO.31)
Antisense 5’-rUrUrCrArGrGrArCrCrArGrGrArUrCrUrCrUrUdGdC-3’(SEQ IDNO.32)
IL-1βmouse(3DBCO-siRNAIL-1β-m)
Sense5′-rGrGrArArGrGrCrArGrUrGrUrCrArCrUrCrArUdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3′(SEQ ID NO.33)
Antisense 5′-rArUrGrArGrUrGrArCrArCrUrGrCrCrUrUrCrCdTdT-3′(SEQ IDNO.34)
IL-23mouse(3DBCO-siRNAIL-23-m)
Sense 5'-rArCrArArCrCrArUrCrArCrCrArCrArCrUrGrGrArUrArCrGrGdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3'(SEQ ID NO.35)
Antisense 5’-rCrCrGrUrArUrCrCrArGrUrGrUrGrGrUrGrArUrGrGrUrUrGrUdTdT-3’(SEQ ID NO.36)
TNF-αmouse(3DBCO-siRNATNF-α-m)
Sense5′-rGrUrCrUrCrArGrCrCrUrCrUrUrCrUrCrArUrUrCrCrUdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3′(SEQ ID NO.37)
Antisense 5’-rArGrGrArArUrGrArGrArArGrArGrGrCrUrGrArGrArCdTdT-3’(SEQID NO.38)
针对不同靶点3CsA-siRNA偶联物的合成方法为：将30倍摩尔当量的CsA-N3溶于DMSO中，加入5OD不同靶点的3DBCO-siRNA Sense链后，使其反应浓度为200μM，然后置于37℃下震荡反应24h。加入水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的CsA-N3，浓缩蒸干后，即得到3CsA-siRNAIL-17Sense链、3CsA-siRNAIL-1βSense链、3CsA-siRNAIL-23Sense链以及3CsA-siRNATNF-αSense链偶联物分子。将其用50μL DMSO溶液重新溶解后滴入500μLPBS中进行组装形成3CsA-siRNAIL-17Sense链纳米胶束、3CsA-siRNAIL-1βSense链纳米胶束、3CsA-siRNAIL- 23Sense链纳米胶束以及3CsA-siRNATNF-αSense链纳米胶束，后在PBS中透析除去DMSO。与Antisense链互补配对后得到分散于PBS溶液中的3CsA-siRNAIL-17纳米胶束、3CsA-siRNAIL-1β纳米胶束、3CsA-siRNAIL-23纳米胶束以及3CsA-siRNATNF-α纳米胶束样品。
7.2针对不同靶点3CsA-siRNA纳米胶束对靶向基因的调控作用
将密度为1×105细胞/孔的HCEC细胞置于6孔板中贴壁，然后用100ng/mL LPS刺激12h，去掉上清液后分别将1mL含有3CsA-siRNAIL-17-h纳米胶束、3CsA-siRNAIL-1β-h纳米胶束、3CsA-siRNAIL-23-h纳米胶束以及3CsA-siRNATNF-α-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(均含有10μMsiRNA)，对照组为1mL含有不同靶点siRNA与Lipo2000复合物的Opti-MEM培养基(siRNA浓度均为10μM)，在37℃下共孵育转染6h后换为DMEM培养基，继续孵育48h后收集细胞并提取RNA进行PCR实验，以检验HCEC细胞中不同靶点的mRNA表达水平。实验结果如图34所示。
从图中可以看出，LPS刺激过后，不同炎症因子的mRNA表达量均有上调，在正常细胞中各炎症mRNA表达水平的1.2-1.4倍左右。在加入Lipo2000转染不同靶点的siRNA后，不同炎症因子表达量降低至正常细胞水平的0.8-1.1倍之间；加入不同靶点的纳米胶束材料后，不同炎症因子表达量降低至正常细胞水平的0.75倍左右。此部分数据说明，不同靶点的3CsA-siRNA纳米胶束材料具有良好的炎症因子基因下调效果。
7.3针对不同靶点3CsA-siRNA纳米胶束对相关炎症因子表达的抑制作用
将HCEC细胞按照5×104细胞/孔的密度接种于12孔板中贴壁，然后用100ng/mLLPS刺激12h，去掉上清液后分别将1mL含有3CsA-siRNAIL-17-h纳米胶束、3CsA-siRNAIL-1β-h纳米胶束、3CsA-siRNAIL-23-h纳米胶束以及3CsA-siRNATNF-α-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(均含有10μMsiRNA)，对照组为1mL含有不同靶点siRNA与Lipo2000复合物的Opti-MEM培养基(siRNA浓度均为10μM)，在37℃下共孵育转染6h后换为DMEM培养基，继续孵育48h后收集上清液进行ELISA检测HCEC细胞不同炎症因子的表达量，实验结果如图35所示。
从图中可以看出，LPS刺激过后，HCEC细胞中各炎症因子表达量均有明显上升，上升区间在正常细胞的1.5～2.5倍左右；在加入lipo2000转染的不同靶点siRNA后，其炎症因子表达量有所下降；经各纳米胶束材料处理后的HCEC细胞炎症因子表达量降低最多，恢复至正常细胞表达水平。这是由于组装成纳米胶束后的药物核酸偶联物具有更好的入胞能力，其次因为环孢素A与siRNA协同作用，达到了更好的炎症抑制效果。
7.4针对不同靶点3CsA-siRNA纳米胶束对干眼症的治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周，建模成功后分别使用院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，由上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)、3CsA-siRNAIL-17-m纳米胶束、3CsA-siRNAIL-1β-m纳米胶束、3CsA-siRNAIL-23-m纳米胶束以及3CsA-siRNATNF-α-m纳米胶束(每组材料中的CsA浓度均为400μM)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每日每次滴5μL，每日早晚各滴一次。在治疗的第0和14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线评估治疗效果，实验结果如图36所示。
荧光素钠染色结果显示，无治疗对照组小鼠眼部评分13分降至10分左右，酚红棉线泪液测试结果由1mm增至1.3mm左右，没有明显好转；CsA滴眼液治疗的小鼠眼部评分由12分降至9分左右，酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增加至3mm左右；不同靶点的siRNA纳米胶束治疗组的小鼠荧光素钠染色评分约从13分降至8分左右，酚红棉线浸润长度从1.5mm升至4mm左右。由此部分数据结果可以看出，针对不同炎症因子靶点的3CsA-siRNA偶联物纳米胶束在两周时间内对小鼠干眼的治疗具有一定疗效。
实施例8.环孢素A分子分别与靶向NLRP3、JAK1和PDE4的小干扰核酸共价偶联物及其自组装纳米胶束用于干眼症的治疗
8.1环孢素A与不同靶点siRNA偶联物及其自组装纳米胶束的制备
本实施例中所采用的靶向细胞内不同炎症基因的小干扰RNA均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，在siRNA正义链3’端我们引入了3个二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne,DBCO)修饰，使其能够与修饰在CsA-N3上的叠氮基团通过点击反应高效偶联，其序列如下：
靶向人源不同炎症相关基因的siRNA序列为：
NLRP3 human(3DBCO-siRNANLRP3-h)
Sense5’-rGrUrGrGrArCrUrUrGrArArGrArArArUrUrUrAdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’(SEQ ID NO.39)
Antisense 5’-rUrArArArUrUrUrCrUrUrCrArArGrUrCrCrArCdTdT-3’(SEQ IDNO.40)
JAK1 human(3DBCO-siRNAJAK1-h)
Sense5’-rGrGrArUrUrArCrArArGrGrArUrGrArCrGrArArGrGdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’(SEQ ID NO.41)
Antisense 5’-rUrUrCrGrUrCrArUrCrCrUrUrGrUrArArUrCrCrArUdTdT-3’(SEQ IDNO.42)
PDE4 human(3DBCO-siRNAPDE4-h)
Sense5’-rGrArGrUrCrGrGrUrCrUrGrGrArArArUrCrArAdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3’(SEQ ID NO.43)
Antisense 5’-rUrUrGrArUrUrUrCrCrArGrArCrCrGrArCrUrCdTdT-3’(SEQ IDNO.44)
其中靶向鼠源不同炎症相关基因的siRNA序列为：
NLRP3 mouse(3DBCO-siRNANLRP3-m)
Sense 5'-rGrGrUrGrArArArUrGrUrArCrUrUrArArArUrCdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3'(SEQ ID NO.45)
Antisense 5′-rGrArUrUrUrArArGrUrArCrArUrUrUrCrArCrCdTdT-3′(SEQ IDNO.46)
JAK1 mouse(3DBCO-siRNAJAK1-m)
Sense 5'-rCrUrGrUrArUrGrGrCrGrArCrArUrUrCrUrCrCrArAdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3'(SEQ ID NO.47)
Antisense 5'-rUrUrGrGrArGrArArUrGrUrCrGrCrCrArUrArCrArGdTdT-3'(SEQ IDNO.48)
PDE4 mouse(3DBCO-siRNAPDE4-m)
Sense 5'-rArUrGrArGrCrGrUrGrUrArGrArGrArGrGrArCrArAdTdT/iDBCOdT/dT/iDBCOdT/dTdT-DBCO-3'(SEQ ID NO.49)
Antisense 5'-rUrUrGrUrCrCrUrCrUrCrUrArCrArCrGrCrUrCrArUdTdT-3'(SEQ IDNO.50)
针对不同靶点3CsA-siRNA偶联物的合成方法为：将30倍摩尔当量的CsA-N3溶于DMSO中，加入5OD不同靶点的3DBCO-siRNA Sense链后，使其反应浓度为200μM，然后置于37℃下震荡反应24h。加入水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的CsA-N3，浓缩蒸干后，即得到3CsA-siRNANLRP3 Sense链、3CsA-siRNAJAK1 Sense链以及3CsA-siRNAPDE4 Sense链偶联物分子。将其用50μL DMSO溶液重新溶解后滴入500μL PBS中进行组装形成3CsA-siRNANLRP3Sense链纳米胶束、3CsA-siRNAJAK1 Sense链纳米胶束以及3CsA-siRNAPDE4 Sense链纳米胶束，后在PBS中透析除去DMSO。与Antisense链互补配对后得到分散于PBS溶液中3CsA-siRNANLRP3纳米胶束、3CsA-siRNAJAK1纳米胶束以及3CsA-siRNAPDE4纳米胶束的样品。
8.2针对不同靶点3CsA-siRNA偶联物纳米胶束对靶向基因的调控作用
将密度为1×105细胞/孔的HCEC细胞置于6孔板中贴壁，然后用100ng/mL LPS刺激12h，去掉上清液后分别将1mL含有3CsA-siRNANLRP3-h纳米胶束、3CsA-siRNAJAK1-h纳米胶束以及3CsA-siRNAPDE4-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(均含有10μM siRNA)，对照组为1mL含有不同靶点siRNA与Lipo2000复合物的Opti-MEM培养基(siRNA浓度均为10μM)，在37℃下共孵育转染6h后换为DMEM培养基，继续孵育48h后收集细胞并提取RNA进行PCR实验，以检验HCEC细胞中不同靶点的mRNA表达水平。实验结果如图37所示。
从图中可以看出，LPS刺激过后，不同胞内炎症靶点的mRNA表达量均有明显上调，在正常细胞中各炎症mRNA表达水平的1.4倍左右。在加入Lipo2000转染不同靶点的siRNA后，不同胞内炎症靶点基因表达量降低至正常细胞水平的1.1倍左右；加入不同靶点的纳米胶束材料后，不同胞内炎症靶点基因表达量降低至正常细胞水平的0.8倍左右。此部分数据说明，不同靶点的3CsA-siRNA纳米胶束材料具有良好的胞内炎症基因下调效果。
8.3针对不同靶点3CsA-siRNA偶联物纳米胶束对干眼症的治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周，建模成功后分别使用院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，由上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)、3CsA-siRNANLRP3-m纳米胶束、3CsA-siRNAJAK1-m纳米胶束以及3CsA-siRNAPDE4-m纳米胶束(每组材料中的CsA浓度均为400μM)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每日每次滴5μL，每日早晚各滴一次。在治疗的第0和14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线评估治疗效果，实验结果如图38所示。
荧光素钠染色结果显示，无治疗对照组小鼠眼部评分12分降至10分左右，酚红棉线泪液测试结果都为1mm左右，没有明显好转；CsA滴眼液治疗后的小鼠眼部评分由10分降至8分左右，酚红棉线泪液测试结果由1mm增加至2mm左右；不同靶点的siRNA纳米胶束材料组的小鼠荧光素钠染色评分约从10分降至7分左右，酚红棉线浸润长度从1mm升至3～4.5mm之间。由此部分数据结果可以看出，针对不同胞内炎症靶点的药物-核酸偶联物纳米胶束在两周时间内对小鼠干眼的治疗具有明显疗效。
实施例9针对IL-17、IL-1β、IL-23和TNF-α不同靶点的三环孢素A反义寡核苷酸偶联物纳米胶束用于干眼病的治疗
9.1三个环孢素A分子与不同靶点ASO偶联物及其自组装纳米胶束的制备
本实施例中所采用的靶向不同炎症因子基因的反义寡核苷酸均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，在反义寡核苷酸3’端我们引入了3个二苯并环辛炔(dibenzocyclooctyne,DBCO)修饰，使其能够与修饰在CsA-N3上的叠氮基团通过点击反应高效偶联，本实施例中所用ASO详细序列信息如下：
其中靶向人源不同炎症因子基因的反义寡核苷酸序列为：
IL-17human(3DBCO-ASOIL-17-h)
5’-TCGGACTAAACTCATTAGAGTT/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3′(SEQ ID NO.51)
IL-1βhuman(3DBCO-ASOIL-1β-h)
5′-GGTACTTCTGCCATGGCTGCTT/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3′(SEQ ID NO.52)
IL-23human(3DBCO-ASOIL-23-h)
5’-CATTACAGCTCTGCTCCCCAGCATCTT/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3’(SEQ IDNO.53)
TNF-αhuman(ASOTNF-α-h)
5‘-CAGTGCTCATGGTGTCTT/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3’(SEQ ID NO.54)
其中靶向鼠源不同炎症因子基因的反义寡核苷酸序列为：
IL-17mouse(3DBCO-ASOIL-17-m)
5’-TTCAGGACCAGGATCTCTTGCTT/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3′(SEQ ID NO.55)
IL-1βmouse(3DBCO-ASOIL-1β-m)
5′-ATGAGTGACACTGCCTTCCTT/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3′(SEQ ID NO.56)
IL-23mouse(3DBCO-ASOIL-23-m)
5’-CCGTATCCAGTGTGGTGATGGTTGTTT/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3’(SEQ IDNO.57)
TNF-αmouse(3DBCO-ASOTNF-α-m)
5’-AACCCATCGGCTGGCACCACTT/iDBCOdT/T/iDBCOdT/TT-DBCO-3’(SEQ ID NO.58)
本实施例中小分子药物与针对不同靶点的ASO偶联物合成方法为：将30倍摩尔当量的CsA-N3溶于DMSO中，加入5OD不同靶点的3DBCO-ASOX后，使其反应浓度为200μM，然后置于50℃下震荡反应24h。加入水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的CsA-N3，浓缩蒸干后，即得到3CsA-ASOIL-17、3CsA-ASOIL-1β、3CsA-ASOIL-23以及3CsA-ASOTNF-α偶联物分子，然后将其用50μL DMSO溶液重新溶解，滴入500μL PBS中进行组装形成3CsA-ASOIL-17纳米胶束、3CsA-ASOIL-1β纳米胶束、3CsA-ASOIL-23纳米胶束以及3CsA-ASOTNF-α纳米胶束，后在PBS中透析除去DMSO得到分散于PBS溶液中的不同纳米胶束样品。
9.2针对不同靶点纳米胶束对相应基因的敲低效果
将1×105细胞/孔的HCEC细胞置于6孔板中贴壁，然后用100ng/mL LPS刺激12h，去掉上清液，分别加入1mL含有3CsA-ASOIL-17-h纳米胶束、3CsA-ASOIL-1β-h纳米胶束、3CsA-ASOIL-23-h纳米胶束以及3CsA-ASOTNF-α-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(均含有10μMASO)，对照组为1mL含有不同靶点ASO与Lipo2000复合物的Opti-MEM培养基(ASO浓度均为10μM)，在37℃共孵育转染6h后换为DMEM培养基，继续于37℃孵育48h，后收集细胞并提取RNA进行RT-qPCR检测，以检验HCEC细胞中不同靶点的mRNA表达水平。实验结果如图39所示。
从图中可以看出，LPS刺激过后，不同炎症因子的mRNA表达量均有上调，是正常细胞的1.3-1.5倍左右。在加入Lipo2000转染的不同靶点ASO后，不同炎症因子表达量降低至正常细胞中不同炎症因子表达量0.8-1.1倍之间；加入不同靶点的纳米胶束材料后，不同炎症因子表达量降低至正常细胞表达量的0.6-0.8倍之间。此部分数据说明，不同靶点的3CsA-ASO纳米胶束材料具有良好的炎症因子基因下调效果。
9.3不同靶点纳米胶束的炎症因子抑制作用
将HCEC细胞按照5×104细胞/孔的密度为接种于12孔板中贴壁，然后用100ng/mLLPS刺激12h，去掉上清液，分别将1mL含有3CsA-ASOIL-17-h纳米胶束、3CsA-ASOIL-1β-h纳米胶束、3CsA-ASOIL-23-h纳米胶束以及3CsA-ASOTNF-α-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(均含有10μMASO)，对照组为1mL含有不同靶点ASO与Lipo2000复合物的Opti-MEM培养基(ASO浓度均为10μM)，37℃共孵育转染6h后换为DMEM培养基，继续于37℃孵育48h，后收集上清液进行ELISA检测HCEC细胞不同炎症因子的表达量，实验结果如图40所示。
从图中可以看出，LPS刺激过后，HCEC细胞中各炎症因子表达量均有明显上升，上升区间在正常细胞的1.5-2.5倍左右；在加入Lipo2000转染不同靶点的ASO后，其炎症因子表达量有所下降；经各纳米胶束材料处理后的HCEC细胞炎症因子表达量降低最多，恢复至正常细胞水平。此部分数据说明，不同靶点的3CsA-ASO纳米胶束材料具有良好的炎症因子下调效果。
9.4不同靶点纳米胶束对干眼症的治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周。建模成功后分别使用院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，由上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)、3CsA-ASOIL-17-m纳米胶束、3CsA-ASOIL-1β-m纳米胶束、3CsA-ASOIL-23-m纳米胶束以及3CsA-ASOTNF-α-m纳米胶束材料(每个样品组中的CsA浓度均为400μM)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每日每次滴5μL，每日早晚各滴一次。在治疗的第0和14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线评估治疗效果，实验结果如图41所示。
荧光素钠染色结果显示，无治疗对照组小鼠眼部评分11分降至10分左右，酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增至1.8mm左右，没有明显好转；CsA滴眼液治疗后的小鼠眼部评分由11分降至8分左右，酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增加至3mm左右；不同靶点的3CsA-ASO纳米胶束材料组的小鼠荧光素钠染色评分约从11分降至5.5分左右，酚红棉线浸润长度从1mm升至3mm左右。由此部分数据结果可以看出，针对不同炎症因子靶点的药物-反义寡核苷酸偶联物纳米胶束在两周时间内对小鼠干眼的治疗具有明显疗效。
实施例10.针对NLRP3、JAK1和PDE4不同靶点的环孢素A接枝反义寡核苷酸自组装纳米胶束用于干眼病的治疗
10.1溴代环孢素A(CsA-Br)的合成与表征
溴代环孢素A(CsA-Br)的合成参照实施例6中相应合成步骤。
10.2溴代环孢素A与不同靶点PS-ASO接枝以及纳米胶束的制备与表征
本实施例中所采用的靶向胞内不同炎症通路基因的反义寡核苷酸序列均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，我们选择在核酸磷酸骨架中进行硫代(PS)修饰，使其能够与修饰在CsA-Br上的溴乙酰溴基团发生取代反应从而高效偶联，其序列如下：
其中靶向人源不同炎症因子基因的反义寡核苷酸序列为：
NLRP3 human(20PS-ASONLRP3-h)
5’-AGCTGCTGCCCCGACCCAAACCTTTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’(SEQ ID NO.59)
JAK1 human(20PS-ASOJAK1-h)
5’-TTCGTCATCCTTGTAATCCATTTTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’(SEQ ID NO.60)
PDE4 human(20PSASOPDE4-h)
5’-TTGATTTCCAGACCGACTTTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’(SEQ ID NO.61)
其中靶向鼠源不同炎症因子基因的反义寡核苷酸序列为：
NLRP3 mouse(20PS-ASONLRP3-m)
5′-GATTTAAGTACATTTCACCTTTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3′(SEQ ID NO.62)
JAK1 mouse(20PS-ASOJAK1-m)
5'-TTGGAGAATGTCGCCATACAGTTTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3'(SEQ ID NO.63)
PDE4 mouse(20PS ASOPDE4-m)
5'-TTGTCCTCTCTACACGCTCATTTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3'(SEQ ID NO.64)
合成方法为：将400倍摩尔当量的CsA-Br溶于DMSO中，加入5OD不同靶点的20PS-ASO后，使其反应浓度为200μM，然后置于50℃下震荡反应24h。加入水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的CsA-Br，浓缩蒸干后，即得到20CsA-ASONLRP3、20CsA-ASOJAK1和20CsA-ASOPDE4偶联物分子，然后将其用50μL DMSO溶液重新溶解并滴入500μLPBS中进行组装形成20CsA-ASONLRP3纳米胶束、20CsA-ASOJAK1纳米胶束以及20CsA-ASOPDE4纳米胶束，后在PBS中透析除去DMSO得到分散于PBS溶液中的不同纳米胶束材料。
10.3不同靶点纳米胶束对靶标基因的调控作用
将HCEC细胞按照1×105细胞/孔的密度接种于6孔板中贴壁，然后用100ng/mL LPS刺激12h，去掉上清液后分别加入1mL含有20CsA-ASONLRP3-h纳米胶束、20CsA-ASOJAK1-h纳米胶束以及20CsA-ASOPDE4-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(均含有10μMASO)，对照组为1mL含有不同靶点ASO与Lipo2000复合物的Opti-MEM培养基(ASO浓度均为10μM)，在37℃下共孵育转染6h后换为DMEM培养基，继续孵育48h后提取RNA进行PCR实验，以检验HCEC细胞中不同靶点的mRNA表达水平。实验结果如图42所示。
从图中可以看出，LPS刺激过后，不同炎症因子的mRNA表达量均有上调，在正常细胞表达量的1.3～1.5倍左右。在加入Lipo2000转染不同靶点的ASO后，不同炎症因子表达量降低至正常细胞表达量的1-1.2倍之间；加入不同靶点的纳米胶束材料后，不同炎症因子表达量降低至正常细胞表达量的0.8倍左右。此部分数据说明，不同靶点的20CsA-ASO纳米胶束材料具有良好的炎症因子基因下调效果。
10.4不同靶点纳米胶束对干眼症的治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行眼部干眼模型的构建，小鼠每只眼睛滴5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，建模两周后分别使用院配环孢素A滴眼液(400μM CsA，由上海复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)、20CsA-ASONLRP3-m纳米胶束、20CsA-ASOJAK1-m纳米胶束以及20CsA-ASOPDE4-m纳米胶束材料(各样品组CsA浓度均为400μM)进行眼部滴眼治疗，每只眼睛每日每次滴5μL，每日早晚各滴一次。在治疗的第0和14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线评估治疗效果，实验结果如图43所示。
荧光素钠染色结果显示，无治疗对照组小鼠眼部评分13分降至12分左右，酚红棉线泪液测试结果由0.5mm增至1mm左右，没有明显好转；CsA滴眼液治疗后小鼠眼部评分由13分降至10分左右，酚红棉线泪液测试结果由1.5mm增至2.5mm左右；不同靶点的20CsA-ASO纳米胶束材料组的小鼠荧光素钠染色评分约从13分降至7.5分左右，酚红棉线浸润长度从1mm升至3.5mm左右。由此部分数据结果可以看出，针对不同胞内炎症靶点的药物-反义寡核苷酸偶联物纳米胶束在两周时间内对小鼠干眼的治疗具有明显疗效。
实施例11雷帕霉素-反义寡核苷酸偶联物及其纳米胶束组装体用于干眼症的治疗
11.1苄溴修饰的雷帕霉素(RAP-Bz-Br)合成，具体合成步骤见图44
a)苄溴修饰的酮缩硫醇(TK-Bz-Br)的合成。3-巯基丙酸(2.2当量)、丙酮(1当量)和催化量的三氟乙酸(TFA)在室温下搅拌过夜，然后将所得混合物置于冰浴中冷却结晶。对所制备晶体进行过滤并进一步用正己烷进行洗涤，然后在真空烘箱中保持45℃干燥一夜后得到白色产品，制备得到具有活性氧(ROS)响应裂解特性的酮缩硫醇化合物(化合物TK)。进一步地，将4-溴甲基苯甲醇(1当量)和化合物TK(3当量)溶于超干的二氯甲烷中，然后加入4-二甲氨基吡啶(DMAP，0.5当量)，室温条件下搅拌5min后滴加二环己基碳二亚胺(DCC，1.2当量，溶于超干的二氯甲烷中)，反应过程中利用硅胶薄层层析检测反应进度。反应结束后，经过滤除去杂质，利用旋转蒸发仪将滤液中溶剂蒸干，通过硅胶柱层析纯化得到苄溴修饰的酮缩硫醇(化合物TK-Bz-Br)，层析纯化过程中洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯混合溶液，最终产率为65％。产物经核磁共振波谱进行分析检测，核磁共振波谱图及各峰归属见图45。
b)将1g雷帕霉素(RAP，1当量)溶于20mL乙酸乙酯中。将混合液置于冰浴中搅拌，加入咪唑(10当量)搅拌至溶解。同时将三甲基氯硅烷(TMS-Cl)溶于5mL乙酸乙酯后逐滴滴入上述反应液中，搅拌约2h，得到雷帕霉素31和42位均被TMS保护的中间产物(化合物RAP-31,42-bis-O-TMS)。然后将6mL 0.5M硫酸(H2SO4)溶液逐滴滴入上述混合液中，冰浴过夜。反应液中加入60mL乙酸乙酯后，分别用饱和碳酸氢钠(NaHCO3，2次)和去离子水(3次)进行萃取，水溶液层pH控制在6.0～7.0之间。萃取收集乙酸乙酯溶液部分，然后加入无水硫酸钠除去水分后通过旋蒸蒸干，得到仅31位羟基被TMS保护的雷帕霉素(化合物RAP-31-O-TMS)。化合物RAP-31-O-TMS产率：90％，质谱检测得到其m/z：1008.61，可归属于[M+Na]+。将a)中所得的化合物TK-Bz-Br(1当量)和化合物RAP-31-O-TMS(0.8当量)溶解于无水二氯甲烷中，室温下加入DMAP(0.5当量)，搅拌至溶解。然后加入溶解于二氯甲烷的二异丙基碳二亚胺(DIC，2当量)，混合物室温搅拌过夜。产物通过硅胶柱层析得到化合物RAP-31-O-TMS-42-Bz-Br。化合物RAP-31-O-TMS-42-Bz-Br产率：35％；质谱检测得到其m/z：1419.64/1421.64,可归属于[M+NH4]+。核磁共振氢谱和核磁共振碳谱结果如图46。最后，0.4g化合物RAP-31-O-TMS-42-Bz-Br溶解于10mL乙腈和20mL乙酸乙酯混合溶液中，缓慢滴加3mL 1M H2SO4并连续搅拌2h，最后再加入50mL乙酸乙酯，加入50mL进行水洗两次并萃取。收集乙酸乙酯层后用无水硫酸钠除去水分然后旋蒸蒸干，得到最终产物苄溴修饰的雷帕霉素(化合物RAP-Bz-Br)，化合物RAP-Bz-Br产率：85％，质谱检测得到m/z：1347.59/1349.59，可归属于[M+NH4]+。
11.210个雷帕霉素分子-NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物的合成(10RAP-ASONFKBIZ)
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因的核苷酸序列均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，我们选择在核酸磷酸骨架中进行硫代(PS)修饰，使其能够与修饰在CsA-Br上的溴乙酰溴基团反应从而高效偶联，其序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ-h)序列为
Human:5’-ATCAGACAACGAATCGGGCTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’；(SEQ IDNO.65)
其中靶向小鼠的NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ-m)序列为
Mouse:5’-AATACTGGTACATTGACGCCTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’(SEQ IDNO.66)。
10个雷帕霉素分子-NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物(10RAP-ASONFKBIZ)合成方法为：将2.2mg化合物RAP-Bz-Br(1.63μmol)溶于100μL DMSO中，然后加入5OD ASO(20.55nmol)后，置于50℃下震荡反应1h。然后加入水后，用乙酸乙酯萃取除去反应中过量的RAP-Bz-Br，浓缩蒸干后，即得到10RAP-ASONFKBIZ偶联物分子。所得产物通过15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证反义寡核苷酸成功接枝雷帕霉素，见图47。
11.310雷帕霉素-NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物(10RAP-ASONFKBIZ)纳米胶束的制备和表征
将10RAP-ASONFKBIZ偶联物(10OD ASO)溶于100μL DMSO中，逐滴加入至300μL连续搅拌的磷酸盐缓冲液(PBS)中。随后将溶液放入透析袋中在PBS中透析过夜除去DMSO。3000rpm离心5min后，即可得到10RAP-ASONFKBIZ纳米胶束。通过动态光散射(Dynamic LightScattering，DLS)、透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)表征其水合粒径和形貌，如图48所示。
11.410RAP-ASONFKBIZ-h纳米胶束的基因调控作用
将人角膜上皮细胞(HCEC)细胞按照1×105细胞/孔的密度接种于6孔板中培养过夜，加入100ng/mL LPS刺激过夜，分别加入1mL含有ASONFKBIZ-h+Lipo2000复合物以及10RAP-ASONFKBIZ-h的Opti-MEM培养基(ASO浓度均为10μM)，37℃下共孵育转染6h，更换为DMEM培养基后在37℃继续孵育48h，后收集细胞并提取RNA进行实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测，评估HCEC细胞中NFKBIZ mRNA的表达水平，实验结果如图49所示。从图中可以看出，LPS刺激过后的HCEC细胞中NFKBIZ mRNA表达水平约为正常细胞的1.4倍，使用Lipo2000转染ASONFKBIZ-h后NFKBIZ mRNA的表达水平约为正常细胞的0.75倍，加入10RAP-ASONFKBIZ-h纳米胶束共孵育后NFKBIZ mRNA表达量降至正常细胞的0.6倍左右。由此可见10RAP-ASONFKBIZ-h纳米胶束可有效调控HCEC细胞中NFKIBZ基因表达，显著敲低NFKBIZ mRNA表达。
11.510RAP-ASONFKBIZ-m纳米胶束对干眼症治疗作用
使用0.2％苯扎氯氨进行干眼模型构建，选择6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)，小鼠每只眼睛滴加5μL 0.2％苯扎氯氨，每日早晚各滴一次，连续滴加两周。建模成功后使用不同药物进行眼部滴眼治疗，分组如下：未治疗组(mock)，院配环孢素A滴眼液(400μMCsA，由复旦大学医学院附属眼耳鼻喉专科医院提供)，以及10RAP-ASONFKBIZ-m纳米胶束(400μM雷帕霉素)。每只眼睛每次滴5μL，每日早晚各滴一次。在治疗的第0、7、14d进行荧光素钠染色评估与酚红棉线评估治疗效果，实验结果如图50所示。对于未治疗的对照组(control对照组)，治疗14d后，荧光素钠染色评分和酚红棉线实验结果与治疗前相差不大，说明未治疗的干眼小鼠的眼睛自身不会恢复正常。对于CsA滴眼液组，治疗后荧光素钠染色评分稍微降低、酚红棉线所测的泪液分泌均有所增加，并且伴随着治疗时间的增加效果更为明显。但治疗14d后，酚红棉线所测得泪液分泌平均～3mm，并未恢复到正常。对于10RAP-ASONFKBIZ-m纳米胶束实验组，治疗效果最为显著，其中，治疗14d后，荧光素钠染色评分最低，平均值为5，泪液分泌最多，平均值4mm。
实施例12环孢素A三聚体(CsA3)与NFKBIZ反义寡核苷酸共价偶联物(CsA3-ASONFKBIZ)及其纳米胶束组装结构用于银屑病治疗
12.1CsA3-ASONFKBIZ共价偶联物的合成
所用CsA3-ASONFKBIZ共价偶联物与实施例5中所用偶联物相同，其具体合成步骤参见实施例中5.1-5.2部分。
12.2CsA3-ASONFKBIZ自组装纳米胶束的制备和表征
环孢素A纳米胶束(CsA3-ASONFKBIZ纳米胶束)的制备和表征步骤参见实施例中5.3部分。
12.3CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束对靶标基因的调控作用
将1×105细胞/孔的人角质生成细胞系HaCaT细胞置于6孔板中贴壁，然后用100ng/mL重组人白细胞介素-36(IL-36)刺激2h，用1×PBS缓冲溶液清洗后分别将1mL包含了ASONFKBIZ-h+Lipo2000复合物、CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(每组样品ASONFKBIZ-h的浓度为10μM)加入孔板中，与HaCaT细胞孵育转染6h后更换新鲜DMEM培养基，同时以不进行任何处理以及只添加IL-36进行刺激的细胞作为对照，37℃孵育48h后提取RNA进行RT-qPCR实验，以检验HaCaT细胞中NFKBIZ mRNA表达水平，实验结果如图51所示。
从图中可以看出，IL-36刺激后的HaCaT细胞，其NFKBIZ mRNA表达增至正常细胞的2.1倍左右，Lipo2000转染后的ASONFKBIZ-h可将其下调至1.2左右，CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因下调至0.8左右，因此相比于单一的ASONFKBIZ-h，CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因的表达下调能力更佳。
12.4CsA3-ASONFKBIZ纳米胶束对炎症因子的调控作用
将5×104细胞/孔的人角质生成细胞系HaCaT细胞置于12孔板中贴壁，然后用100ng/mL重组人白细胞介素-36(IL-36)刺激2h，用1×PBS缓冲溶液清洗后分别将1mL包含了ASONFKBIZ-h+Lipo2000复合物、CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(每组样品ASONFKBIZ-h的浓度为10μM)加入孔板中，与HaCaT细胞孵育转染6h后更换新鲜DMEM培养基，同时以不进行任何处理以及只添加IL-36进行刺激的细胞作为对照，37℃孵育48h后收集上清液，以ELISA试剂盒检测TNFα、IL-17A和IL-33分泌水平，实验结果如图52所示。
从图中可以看出，IL-36刺激后的HaCaT细胞，其TNFα、IL-17A和IL-33水平分别增至未刺激细胞的2.1倍、1.7倍和2.0倍左右，Lipo2000转染后的ASONFKBIZ-h可将TNFα、IL-17A和IL-33水平下调至1.1、1.0和0.9倍左右，CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束对TNFα、IL-17A和IL-33水平下调至0.8-0.9倍左右，因此相比于单一的ASONFKBIZ-h，CsA3-ASONFKBIZ-h纳米胶束对TNFα、IL-17A和IL-33等炎症因子抑制作用更强。
12.5CsA3-ASONFKBIZ-m纳米胶束对银屑病治疗作用
使用5％咪喹莫特乳膏对6～8周龄小鼠(C57BL/6，苏州西山生物技术有限公司)进行背部和双耳银屑病模型的构建，剔除小鼠背部毛发后，每只小鼠涂抹60mg 5％咪喹莫特乳膏于背部和双耳，连续涂抹6d。建模6d后，如图53所示小鼠背部和耳朵出现明显的红斑、鳞屑、皮肤明显增厚等银屑病样表型，即模型构建成功。将CsA3-ASONFKBIZ-m纳米胶束与卡波姆凝胶混匀后，涂抹于皮损处进行治疗。以未添加CsA3-ASONFKBIZ-m纳米胶束的卡波姆凝胶作为对照组(control)进行疗效测试。在治疗的第7d对背部皮损处皮肤厚度及耳朵厚度进行测量，并对皮损处红斑、鳞屑、皮肤增厚程度及银屑病皮损面积严重程度进行评分。实验结果如图54，图55和图56所示。治疗7d后，相较于对照组，CsA3-ASONFKBIZ-m纳米胶束组小鼠皮损处的红斑和鳞屑明显减轻，耳部和皮损处皮肤厚度减小，该结果表明CsA3-ASONFKBIZ-m纳米胶束可有效缓解患病小鼠的银屑病样表型。
实施例13曲安奈德分子与NFKBIZ反义寡核苷酸共价偶联物(10TA-ASONFKBIZ)及其纳米胶束组装结构用于银屑病的协同治疗
13.1羰乙基溴代曲安奈德(TA-Br)合成
羰乙基溴代曲安奈德(TA-Br)具体合成步骤见图57，首先在氮气保护下，将曲安奈德(200mg)置于干燥的250mL圆底烧瓶中，加50mL无水二氯甲烷溶解，逐滴加入130μLN,N-二异丙基乙胺，冰浴条件下逐滴加入105mg溴乙酰溴，转移至室温，搅拌反应12h，反应完毕后，加入50mL饱和碳酸氢钠溶液洗涤3次，50mL饱和氯化钠溶液洗涤一次，收集有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏浓缩有机相，经硅胶柱层析分离，洗脱液为石油醚/乙酸乙酯，得浅黄色色固体(140mg)，即制得羰乙基溴代曲安奈德。
羰乙基溴代曲安奈德的1HNMR谱图，如图58所示，测试溶剂DMSO-d6，各质子峰的归属如下：δ(ppm):7.30(1H,d),6.25(1H,dd),6.02(1H,s),5.50(1H,s),5.27(1H,d),4.86(1H,d),4.82(1H,d),4.32-4.15(2H,d),4.21(1H,s),3.78(6H,s),2.64(1H,m),2.34(1H,dd),2.05(1H,m),1.95(1H,q),1.82(1H,t),1.73(1H,d),1.55(2H,m),1.50(3H,s),1.35(4H,s),1.26(1H,t),1.16(3H,s),0.80(3H,s)。羰乙基溴代曲安奈德的13C NMR谱图，如图59所示，测试溶剂为DMSO-d6，偶联羰乙基溴后的特征碳的归属如下：210.50,185.68,167.04,153.19,129.78,124.69,110.83,102.06,97.28,81.62,70.66,66.28,48.43,45.14,42.95,35.48,33.47,32.89,30.57,27.95,26.77,25.72,23.26,16.83。羰乙基溴代曲安奈德的理论分子量为555.43，高效液相色谱/四极杆飞行质谱联用仪测得的分子量为557.1391和1113.2782，分别对应羰乙基溴代曲安奈德的[M+1]+和[2M+1]+峰，证实目标产物成功合成，如图60所示。
13.2曲安奈德-NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物的合成(10TA-ASONFKBIZ)
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因的核苷酸序列均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，我们选择在核酸磷酸骨架中进行硫代(PS)修饰，使其能够与修饰在TA-Br上的羰乙基溴基团反应从而高效偶联，其序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ-h)序列为
Human:5’-ATCAGACAACGAATCGGGCTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’；(SEQ IDNO.67)
其中靶向小鼠的NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ-m)序列为
Mouse:5’-AATACTGGTACATTGACGCCTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’(SEQ IDNO.68)。
10TA-ASONFKBIZ共价偶联物的合成方法为：将羰乙基溴代曲安奈德化合物溶于20μL二甲基亚砜溶液中，加入2μL硫代磷酸酯基团修饰反义寡核苷酸溶液，寡核苷酸浓度在200μM(硫代磷酸酯基团与羰乙基溴代曲安奈德的比例范围为1:1～1:50)，置于55℃下，震荡反应过夜。反应结束后，加入500μL超纯水，利用乙酸乙酯多次萃取除去反应中过量的羰乙基溴代曲安奈德，减压蒸馏除去溶剂后，重新溶于超纯水中，即得到曲安奈德-反义寡核苷酸偶联物。通过15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳验证羰乙基溴代曲安奈德成功接枝至硫代磷酸酯修饰寡核苷酸，见图61。
13.310TA-ASONFKBIZ纳米胶束的制备和表征
将10TA-ASONFKBIZ共价偶联物(10ODASO)溶于100μL DMSO中，逐滴加入至300μL连续搅拌的1×PBS缓冲溶液中。随后将溶液放入透析袋中在PBS中透析过夜除去DMSO，即可得到10TA-ASONFKBIZ纳米胶束粒子。通过1％琼脂糖凝胶电泳表征10TA-ASONFKBIZ纳米胶束的成功制备，如图62所示。
13.410TA-ASONFKBIZ纳米胶束的基因调控作用
将1×105细胞/孔的人角质生成细胞系HaCaT细胞置于6孔板中贴壁，然后用100ng/mL重组人白细胞介素-36(IL-36)刺激2h，用1×PBS缓冲溶液清洗后分别将1mL包含了ASONFKBIZ-h+Lipo2000复合物、10TA-ASONFKBIZ-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(每组样品ASONFKBIZ-h的浓度为10μM)加入孔板中，与HaCaT细胞孵育转染6h后更换新鲜DMEM培养基，同时以不进行任何处理以及只添加IL-36进行刺激的细胞作为对照，37℃孵育48h后提取RNA进行RT-qPCR实验，以检验HaCaT细胞中NFKBIZ mRNA表达水平，实验结果如图63所示。
从图63中可以看出，IL-36刺激后的HaCAT细胞，其NFKBIZ mRNA表达增至正常细胞的2.2倍左右，Lipo2000转染后的ASONFKBIZ-h可将其下调至0.85左右，10TA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因下调至0.7左右，因此相比于单一的ASONFKBIZ-h，10TA-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因的表达下调能力更佳。
13.510TA-ASONFKBIZ-m纳米胶束对银屑病治疗作用
使用5％咪喹莫特乳膏对6～8周龄小鼠进行背部和双耳银屑病模型的构建，剔除小鼠背部毛发后，每只小鼠涂抹60mg 5％咪喹莫特乳膏于背部和双耳，连续涂抹6d。建模6d后，小鼠背部和耳朵出现明显的红斑、鳞屑、皮肤明显增厚等银屑病样表型，即模型构建成功。将10TA-ASONFKBIZ-m纳米胶束与卡波姆凝胶混匀后，涂抹于皮损处进行治疗。以未添加10TA-ASONFKBIZ-m纳米胶束的卡波姆凝胶作为对照组(control)进行疗效测试。在治疗的第7d对背部皮损处皮肤厚度及耳朵厚度进行测量，并对皮损处红斑、鳞屑、皮肤增厚程度及银屑病皮损面积严重程度进行评分。实验结果如图64、图65和图66所示，治疗7d后，相较于未治疗组，10TA-ASONFKBIZ-m纳米胶束组小鼠皮损处的红斑和鳞屑明显减轻，皮损处皮肤厚度减小，表明10TA-ASONFKBIZ-m纳米胶束可有效缓解患病小鼠的银屑病样表型。
实施例14卡泊三醇分子与NFKBIZ反义寡核苷酸共价偶联物(10Cal-ASONFKBIZ)及其纳米胶束组装结构用于银屑病的协同治疗
14.1苄溴修饰卡泊三醇(Cal-Bz-Br)的合成
苄溴修饰卡泊三醇(Cal-Bz-Br)的合成步骤见图67，包括a)苄溴修饰的二硫代二丙酸的合成(DTPA-Bz-Br)。取4-溴甲基苯甲醇500mg和3,3’-二硫代二丙酸(DTPA)2.6g溶于超干的二氯甲烷和四氢呋喃的混合溶液(1/1，v/v)；然后加入4-二甲氨基吡啶91mg，搅拌5min后滴加二环己基碳二亚胺615mg(溶于超干的二氯甲烷中)，室温反应过夜后，利用旋转蒸发仪将溶剂蒸干，通过硅胶柱层析分离得到含有二硫键的苄溴结构(DTPA-Bz-Br)，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯。产物1H NMR及归属见图68。
b)取卡泊三醇(Cal)135mg和二环己基碳二亚胺81mg，加入30mL无水二氯甲烷搅拌溶解，加入10mg 4-二甲氨基吡啶(溶于无水二氯甲烷中)，滴加DTPA-Bz-Br 10mg(溶于无水的二氯甲烷中)，室温搅拌反应3h，利用旋转蒸发仪将溶剂蒸干，通过硅胶柱层析分离得到苄溴修饰的卡泊三醇前药分子(Cal-Bz-Br)，洗脱剂为石油醚/乙酸乙酯体系。产物核磁图见图69，测试溶剂DMSO-d6，各质子峰的归属如下：δ(ppm):7.43,H3(2H,s),7.36,H2(2H,m),6.35,H10(1H,d),6.02H9(1H,d),5.52,H12(2H,m),5.35,H17(1H,d),5.14,H4(2H,s),5.06,H8(1H,d),4.51,H1(2H,s),4.15,H14(1H,m),3.48,H13(1H,m),2.94,H15(2H,m),2.91,H16(2H,m),0.58,H11(3H,d),0.52,H6(2H,m),0.33,H5(1H,m),0.25,H7(1H,m)。Cal-Bz-Br的理论分子量为785.2，高效液相色谱/四极杆飞行质谱联用仪测得的分子量为786.25，对应Cal-Bz-Br的[M+1]+峰，证实目标产物成功合成，如图70所示。
14.2卡泊三醇-NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物的合成(10Cal-ASONFKBIZ)
本实施例中所采用的靶向NFKBIZ基因的核苷酸序列均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，我们选择在核酸磷酸骨架中进行硫代(PS)修饰，使其能够与修饰在Cal-Br上的卞溴基团反应从而高效偶联，其序列如下：
其中靶向人源NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ-h)序列为
Human:5’-ATCAGACAACGAATCGGGCTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’(SEQ IDNO.69)；
其中靶向小鼠的NFKBIZ基因的反义寡核苷酸(ASONFKBIZ-m)序列为
Mouse:5’-AATACTGGTACATTGACGCCTTTT*T*T*T*T*T*T*T*T*T*T-3’(SEQ IDNO.70)。
卡泊三醇-NFKBIZ反义寡核苷酸偶联物(10Cal-ASONFKBIZ)合成方法为：取Cal-Bz-Br化合物溶于20μL二甲基亚砜溶液中，加入2μL硫代磷酸酯基团修饰反义寡核苷酸溶液，寡核苷酸浓度在200μM(硫代磷酸酯基团与Cal-Bz-Br化合物的比例为1:5)，置于55℃下，震荡反应过夜。反应结束后，加入500μL超纯水，利用乙酸乙酯多次萃取除去反应中过量的Cal-Bz-Br化合物，减压蒸馏除去溶剂后，即得到卡泊三醇-反义寡核苷酸结合物前药。通过15％变性聚丙烯酰胺(PAGE)凝胶电泳验证卡泊三醇成功接枝至硫代磷酸酯修饰寡核苷酸，见图71。
14.310Cal-ASONFKBIZ纳米胶束的制备和表征
将10Cal-ASONFKBIZ偶联物(10OD ASO)溶于100μL DMSO中，逐滴加入至300μL连续搅拌的1×PBS缓冲溶液中。随后将溶液放入透析袋中在PBS中透析过夜除去DMSO，即可得到10Cal-ASONFKBIZ纳米胶束粒子。通过1％的琼脂糖凝胶电泳证明其组装成功，结果见图72。此外利用动态光散射法测定卡泊三醇-反义寡核苷酸偶联物自组装纳米胶束的水合粒径，如图73所示，卡泊三醇-反义寡核苷酸偶联物自组装纳米胶束的水合粒径约为150nm。图73中透射电子显微镜图片揭示所制备的纳米胶束为球形形貌。10Cal-ASONFKBIZ偶联物的临界胶束浓度测定为0.527μM，结果见图74。
14.410Cal-ASONFKBIZ纳米胶束的基因调控作用
将1×105细胞/孔的人角质生成细胞系HaCaT细胞置于6孔板中贴壁，然后用100ng/mL重组人白细胞介素-36(IL-36)刺激2h，用1×PBS缓冲溶液清洗后分别将1mL包含了ASONFKBIZ-h+Lipo2000复合物、10Cal-ASONFKBIZ-h纳米胶束的Opti-MEM培养基(每组样品ASONFKBIZ-h的浓度为10μM)加入孔板中，与HaCaT细胞孵育转染6h后更换新鲜DMEM培养基，同时以不进行任何处理以及只添加IL-36进行刺激的细胞作为对照，37℃孵育48h后提取RNA进行RT-qPCR实验，以检验HaCaT细胞中NFKBIZ mRNA表达水平，实验结果如图75所示。
从图中可以看出，IL-36刺激后的HaCaT细胞，其NFKBIZ mRNA表达增至正常细胞的1.9倍左右，Lipo2000转染后的ASONFKBIZ-h可将其下调至0.85倍左右，10Cal-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因下调至0.65倍左右，因此相比于单一的ASONFKBIZ-h，10Cal-ASONFKBIZ-h纳米胶束对NFKBIZ基因的表达下调能力更佳。
14.510Cal-ASONFKBIZ-m纳米胶束对银屑病治疗作用
使用5％咪喹莫特乳膏(四川明欣药业有限责任公司)对6～8周龄小鼠进行背部和双耳银屑病模型的构建，剔除小鼠背部毛发后，每只小鼠涂抹60mg 5％咪喹莫特乳膏于背部和双耳，连续涂抹6d。建模6d后，小鼠背部和耳朵出现明显的红斑、鳞屑、皮肤明显增厚等银屑病样表型，即模型构建成功。将10Cal-ASONFKBIZ-m纳米胶束与卡波姆凝胶混匀后，涂抹于皮损处进行治疗。以未添加10Cal-ASONFKBIZ-m纳米胶束的卡波姆凝胶作为对照组(control)进行疗效测试。在治疗的第7d对背部皮损处皮肤厚度及耳朵厚度进行测量，并对皮损处红斑、鳞屑、皮肤增厚程度及银屑病皮损面积严重程度进行评分。实验结果如图76、图77以及图78所示，治疗7d后，相较于未治疗组，10Cal-ASONFKBIZ-m纳米胶束组小鼠皮损处的红斑和鳞屑明显减轻，皮损处皮肤厚度减小，表明10Cal-ASONFKBIZ-m纳米胶束可有效缓解患病小鼠的银屑病样表型。
尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。
序列表
<110> 浙江浥眸生物科技有限公司
<120> 一种小分子药物-寡核苷酸偶联物及其应用
<160> 70
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcagacaac gaatcgggc 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aatactggta cattgacgcc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atcagacaac gaatcgggct tt 22
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatactggta cattgacgcc ttt 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcagacaac gaatcgggct tttt 24
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aatactggta cattgacgcc ttttt 25
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcagacaac gaatcgggc 19
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aatactggta cattgacgcc 20
<210> 9
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gcccgauucg uugucugaut t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aucagacaac gaaucgggct t 21
<210> 11
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gcccgauucg uugucugaut tttt 24
<210> 12
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
aucagacaac gaaucgggct t 21
<210> 13
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gcccgauucg uugucugaut tttttt 26
<210> 14
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aucagacaac gaaucgggct t 21
<210> 15
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gcgucaaugu accaguauut t 21
<210> 16
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
aauacuggua cauugacgcc t 21
<210> 17
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gcgucaaugu accaguauut tttt 24
<210> 18
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aauacuggua cauugacgcc t 21
<210> 19
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gcgucaaugu accaguauut tttttt 26
<210> 20
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aauacuggua cauugacgcc t 21
<210> 21
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
atcagacaac gaatcgggct tttttttttt tttttttttt ttttt 45
<210> 22
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
aatactggta cattgacgcc tttttttttt tttttttttt tttttt 46
<210> 23
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
cucuaaugag uuuaguccga ttttttt 27
<210> 24
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ucggacuaaa cucauuagag tt 22
<210> 25
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aggcugaucu guugccguat tttttt 26
<210> 26
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
uacggcaaca gaucagccut g 21
<210> 27
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
cagcaacccu gagucccuat tttttt 26
<210> 28
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
uagggacuca ggguugcugt t 21
<210> 29
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gacaaccaac uaguggugct tttttt 26
<210> 30
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
gcaccacuag uugguuguct t 21
<210> 31
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
aagagauccu gguccugaat tttttt 26
<210> 32
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
uucaggacca ggaucucuug c 21
<210> 33
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggaaggcagu gucacucaut tttttt 26
<210> 34
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
augagugaca cugccuucct t 21
<210> 35
<211> 32
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
acaaccauca ccacacugga uacggttttt tt 32
<210> 36
<211> 27
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ccguauccag uguggugaug guugutt 27
<210> 37
<211> 29
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
gucucagccu cuucucauuc cuttttttt 29
<210> 38
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
aggaaugaga agaggcugag actt 24
<210> 39
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
guggacuuga agaaauuuat tttttt 26
<210> 40
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
uaaauuucuu caaguccact t 21
<210> 41
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
ggauuacaag gaugacgaag gttttttt 28
<210> 42
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
uucgucaucc uuguaaucca utt 23
<210> 43
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gagucggucu ggaaaucaat tttttt 26
<210> 44
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
uugauuucca gaccgacuct t 21
<210> 45
<211> 26
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
ggugaaaugu acuuaaauct tttttt 26
<210> 46
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gauuuaagua cauuucacct t 21
<210> 47
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cuguauggcg acauucucca attttttt 28
<210> 48
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
uuggagaaug ucgccauaca gtt 23
<210> 49
<211> 28
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
augagcgugu agagaggaca attttttt 28
<210> 50
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
uuguccucuc uacacgcuca utt 23
<210> 51
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
tcggactaaa ctcattagag ttttttt 27
<210> 52
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggtacttctg ccatggctgc ttttttt 27
<210> 53
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cattacagct ctgctcccca gcatcttttt tt 32
<210> 54
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cagtgctcat ggtgtctttt ttt 23
<210> 55
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
ttcaggacca ggatctcttg cttttttt 28
<210> 56
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
atgagtgaca ctgccttcct tttttt 26
<210> 57
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
ccgtatccag tgtggtgatg gttgtttttt tt 32
<210> 58
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
aacccatcgg ctggcaccac ttttttt 27
<210> 59
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
agctgctgcc ccgacccaaa cctttttttt tttttttttt tttttttt 48
<210> 60
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ttcgtcatcc ttgtaatcca tttttttttt tttttttttt ttttttt 47
<210> 61
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ttgatttcca gaccgacttt tttttttttt tttttttttt ttt 43
<210> 62
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
gatttaagta catttcacct tttttttttt tttttttttt ttttt 45
<210> 63
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
ttggagaatg tcgccataca gttttttttt tttttttttt ttttttt 47
<210> 64
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
ttgtcctctc tacacgctca tttttttttt tttttttttt tttttt 46
<210> 65
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
atcagacaac gaatcgggct tttttttttt ttt 33
<210> 66
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
aatactggta cattgacgcc tttttttttt tttt 34
<210> 67
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
atcagacaac gaatcgggct tttttttttt ttt 33
<210> 68
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
aatactggta cattgacgcc tttttttttt tttt 34
<210> 69
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
atcagacaac gaatcgggct tttttttttt ttt 33
<210> 70
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
aatactggta cattgacgcc tttttttttt tttt 34

Claims (10)

1.一种小分子药物-寡核苷酸偶联物，由具有免疫调节功能的小分子药物和能够调控炎症相关基因表达的功能寡核苷酸分子共价偶联得到。
2.根据权利要求1所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物，其特征在于，所述小分子药物和功能寡核苷酸分子之间通过化学连接子共价偶联。
3.根据权利要求1所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物，其特征在于，所选小分子药物为作用于免疫相关信号通路并能够调控免疫反应的小分子药物；优选的，所述小分子药物包括钙调磷酸酶抑制剂、糖皮质激素、mTOR抑制剂和维生素D类似物中的一种或几种。
4.根据权利要求1所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物，其特征在于，所述炎症相关基因包括肿瘤坏死因子-a基因、白介素1b基因、白介素17基因、白介素23基因、NFKBIZ基因、炎性小体NLRP3基因、JAK基因和PDE4基因中的一种或几种。
5.根据权利要求1或4所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物，其特征在于，所述功能寡核苷酸分子包括双链小干扰核酸、微小核酸和单链反义寡核苷酸中的一种。
6.根据权利要求5所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物，其特征在于，当所述功能寡核苷酸分子为双链小干扰核酸或微小核酸时，所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的正义链的3’端；当所述功能寡核苷酸分子为单链反义寡核苷酸时，所述小分子药物共价偶联于单链反义寡核苷酸的3’端或5’端。
7.根据权利要求6所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物，其特征在于，每个功能寡核苷酸分子上共价偶联的小分子药物的数量为1～40个。
8.根据权利要求7所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物，其特征在于，所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的末端或者所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的3’端或5’端延伸序列的侧链碱基或者磷酸骨架上；
优选的，当所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的末端时，所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物的化学结构式如式1～式14所示：
Figure FDA0003704601880000011
Figure FDA0003704601880000021
Figure FDA0003704601880000031
在所述式1～式14中，L、T各自独立地为不存在、-(CH2)h-或-(CH2)h-中的任意一个或多个亚烷基被A基团所取代后的基团；所述h为0～15；所述A基团包括：-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-CH(RC)-、-C(R’)(R”)-、-NH-、-N(RN)-、-S-S-、-C(R’)＝C(R”)-、-C≡C-、
Figure FDA0003704601880000032
中的一种或几种；所述A基团中的RC、RN、R’、R”表示指定原子上的任何一个或多个氢原子被B基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物，所述指定原子包括碳原子或氮原子；所述B基团包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素；所述卤素包括F、C1、Br或I；所述A基团中(O)代表羰基氧原子；
在所述式1～式14中，Q、Y、Z各自独立地为不存在、-O-、-S-、-C(O)-、-NH-、-CH2-、-C(O)NH-、-NHC(O)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)NH-、-NHC(O)O-和
Figure FDA0003704601880000041
中的一种或几种；所述Q、Y、Z基团中(O)代表羰基氧原子；所述
Figure FDA0003704601880000042
为连接位点；
在所述式1～式14中，G表示小分子免疫调节药物；m、n、k独立地为1～15；
X表示O或S；
优选的，当所述小分子药物共价偶联于功能寡核苷酸分子的3’端或5’端延伸序列的侧链碱基或者磷酸骨架上时，所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物的化学结构式如式15～式20所示：
Figure FDA0003704601880000043
Figure FDA0003704601880000051
在所述式15～式20中，T各自独立地为不存在、-(CH2)h-或-(CH2)h-中的任意一个或多个亚烷基被A基团所取代后的基团；所述h为0～15；所述A基团包括：-O-、-S-、-C(O)-、-C(O)O-、-C(O)NH-、-CH(RC)-、-C(R’)(R”)-、-NH-、-N(RN)-、-S-S-、-C(R’)＝C(R”)-、-C≡C-、
Figure FDA0003704601880000052
中的一种或几种；所述A基团中的RC、RN、R’、R”表示指定原子上的任何一个或多个氢原子被B基团所替代，条件是不超过所述指定原子的正常化合价并且取代生成稳定化合物，所述指定原子包括碳原子或氮原子；所述B基团包括C1-C6烷基、C2-C6烯基、C2-C6炔基、氰基、羟基、氧代基、羧基、环烷基、环烯基、杂环基、杂芳基、芳基、酮、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基或卤素；所述卤素包括F、C1、Br或I；所述A基团中(O)代表羰基氧原子；
在所述式15～式20中，Y、Z各自独立地为不存在、O、S、C(O)、NH、CH2、C(O)NH、NHC(O)、C(O)O、OC(O)、OC(O)O、OC(O)NH、NHC(O)O和
Figure FDA0003704601880000053
中的一种或几种；所述Y、Z基团中(O)代表羰基氧原子；所述
Figure FDA0003704601880000054
为连接位点；
在所述式15～式20中，G表式免疫调节抑制剂；n独立地为1～15；m、i独立地为0～5，k、j独立地为1～20；R表示H；B表示核酸碱基。
9.权利要求1～8任意一项所述的小分子药物-寡核苷酸偶联物在制备治疗炎症相关疾病的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述炎症相关疾病包括干眼症、银屑病、干燥综合症、葡萄膜炎、角膜炎、结膜炎、特应性皮炎、类风湿性关节炎、炎症性肠炎和克罗恩病中的一种或几种。
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