JP2001517061A

JP2001517061A - 活性複合体の分離

Info

Publication number: JP2001517061A
Application number: JP50077497A
Authority: JP
Inventors: シー．ジュニアスコザ、フランシス; シュイ、ユホング; ワング、ジンカング
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1995-06-07
Filing date: 1996-05-28
Publication date: 2001-10-02
Also published as: ATE333289T1; WO1996040264A1; CA2223934A1; AU6024896A; EP0831923A4; AU714526B2; DE69636363D1; EP0831923B1; EP0831923A1; US5972600A

Abstract

(57)【要約】本発明は、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ペプチド、カチオン性ペプチド、デンドリマーまたはポリカチオンのような、トランスフェクション活性を増加させるトランスフェクティング成分とポリヌクレオチドとの会合によって形成された複合体から、密度、表面電荷または粒子サイズのような特定の物理化学的特徴を有する、組成の明らかな活性複合体を分離する。好ましい態様において、ポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分複合体を超遠心して、特異的ポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分相互作用を有する複合体に対応する１以上のバンドを分解する。カチオン性リポソームトランスフェクティング成分を有するポリヌクレオチド複合体は、過剰脂質条件下で、又は過剰ポリヌクレオチド条件下で、形成された複合体に対応する２つの主要バンドに分解される。別の態様において、ポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分複合体は、交差流動電気泳動を用いて分解され、特異的相互作用を有する複合体を同定され、また過剰の初発成分から分離される。

Description

【発明の詳細な説明】活性複合体の分離他の出願に対する関係本願は、現在放棄された１９９２年４月３日付け出願の米国出願第０７／８６４,８７６号の一部継続出願である１９９２年７月１４日付け出願の米国出願第０７／９１３,６６９号および１９９３年７月１４日付け出願の米国出願第０８／０９２,２００号の一部継続出願である。背景技術分子生物学は、非常に多数のヒト遺伝病における染色体欠陥を同定してきており、遺伝子治療を用いる治癒のための希望がでてきている。この出現しつつある医学分野は、クローン化され機能的に活性な遺伝子を患部細胞に導入することによって遺伝子欠陥を修正することを目的とするものである。ポリヌクレオチドの送達に適したいくつかの系およびポリマーが当該分野で知られている。加えて、遺伝子治療は治療遺伝子を送達して、種々の後天的および感染した病気、自己免疫疾患および癌を治療するのに有用であり得る。ポリリジンおよびＤＥＡＥ−デキストランのようなポリカチオンは、蛋白質および一本鎖および二本鎖ポリヌクレオチドの動物細胞への取り込みを促進する。ポリリジンはＤＮＡが密な構造に集合するのを助け、細胞膜を脱安定化させ、さらに核酸への他のエフェクターの付着を可能にする。ポリリジンによるＤＮＡの小さな（約１００ｎｍ）トロイド様構造への中和および縮合によって、イン・ビトロにおいて核酸の細胞へのエンドサイトーシスが促進される。エンドサイトーシスの過程は、トランスフェリン、アシアロオロソムコイドまたはインスリンのような特異的リガンドがポリカチオンに共有結合することによってさらに刺激される。他の有用なポリヌクレオチド複合体としては、ポリヌクレオチドをマスクして分解を防ぐ工程を含むものがある。赤血球ゴースト、復元されたウイルスエンベロープおよびリポソームのような微粒子が、遺伝子導入の際の保護材料として一部で使用されてきた。成功したリポソーム系の一つは、試薬リポフェクション^TM を形成するためにホスファチジルエタノールアミン［ＰＥ］と混合したカチオン性脂質塩化ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ− トリメチルアンモニウム［ＤＯＴＭＡ］を使用するものである。リポポリアミン、親油性ポリリジンおよびカチオン性コレステロールを含めたＤＯＴＭＡの代替物が、培養系における遺伝子導入を媒介させるために使用されてきた。他の有用な脂質として、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート［ＤＯＳＰＡ］、［ＤＯＴＡＰ］、［ＤＯＧＧ］、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム［ＤＤＡＢ］、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム［ＣＤＡＢ］、臭化セチルトリメチルエチルアンモニウム［ＣＴＡＢ］、臭化ジオクタデシルジメチルアンモニウム［ＤＤＭＢ］、ＤＬ−ステアリルステアロイルカルニチンエステル［ＤＬ−ＳＳＣＥ］、Ｌ−ステアリルステアロイルカルニチンエステル［Ｌ−ＳＳＣＥ］、ＤＬ−ステアリルオレオイルカルニチンエステル［ＤＬ−ＳＯＣＥ］、ＤＬ−パルミチルパルミトイルカルニチンエステル［ＤＬ −ＰＰＣＥ］、ＤＬ−ミリスチルミリストイルカルニチンエステル［ＤＬ−ＭＭＣＥ］、Ｌ−ミリスチルミリストイルカルニチンエステル［Ｌ−ＭＭＣＥ］、ジオレオイルホスファチジルコリン［ＤＯＰＣ］、モノオレオイル−グリセロール［ＭＯＧ］、およびコレステロール［Ｃｈｏｌ］が挙げられる。ポリヌクレオチド−リポソーム複合体に関連する難点は、２つの成分の比率、成分の濃度、および混合中のイオン条件に応じて、形成される複合体がサイズ、静電的特性、脂質およびポリヌクレオチド組成並びに生物学的系と相互作用する能力において大きく変化する点である。また、遺伝子導入効率は、選択した細胞にポリヌクレオチドを標的化することによって改良することができる。受容体媒介エンドサイトーシスに基づく遺伝子導入のための種々の手法が報告されている。細胞特異的リガンド−ポリリジン複合体は電荷相互作用を通じて核酸に結合し、得られた複合体は、標的細胞によって効率的に摂取される。イン・ビボでの、ヒト肝癌細胞系ＨｅｐＧ２の例、およびラット肝細胞の例では、リガンドとしてアシアロオロソムコイドが用いられてこの送達系が機能している。トランスフェリン−ポリカチオンを媒介として利用するヒト白血病細胞系Ｋ−５６２へのプラスミドの送達、およびそれに続くコードされたルシフェラーゼ遺伝子の発現のみならず、インスリンを特異的リガンドとして標的化に利用することにより、ＨｅｐＧ２細胞で安定的に酵素活性の発現が観察されたことが、報告されている。しかしながら、報告された遺伝子送達系では、高分子量の標的化蛋白質をポリリジンリンカーを通じてポリヌクレオチドへ連結する必要がある。また、これらの大きなリガンド−ポリカチオンコンジュゲート(conjugate)は、サイズおよび組成が不均一であり、化学的に定義され難く、再現性よく調製するのが困難である。ポリヌクレオチド電荷を中和するためにポリカチオンを使用すると、膜の透過性が高まりポリヌクレオチドが転移しやすくなる。また、カチオン性脂質もこの目的で使用されている。リポポリアミンおよびリポインターカラント（lipointe rcalant）と呼ばれるある種のカチオン性脂質も知られている。また、トランスフェクション効率は、ポリヌクレオチドが種々のペプチドと会合した場合に増加し得る。ある種の有用な両親媒性ペプチドはα−ヘリックスまたはβ−プリーツシート二次構造をとり、荷電した表面および中性の表面を呈する。カチオン性蛋白質はポリヌクレオチドを凝縮させることによってトランスフェクション効率を増大させる。他のポリカチオンが、ポリヌクレオチドと会合した場合にトランスフェクションを促進することが示されている。デンドリマー（dendrimer;種々の分子量およびサイズで調製され得る、コア分子の回りの反復した反応系列によって作成される嵩張った三次元ポリマー）と形成された複合体は、効率的にポリヌクレオチドを導入する。他の三次元の分岐鎖ポリカチオンも有用である。有用な自己集合ポリヌクレオチド送達系の特別の例は、１９９２年７月１４日に出願された米国特許出願第０８／０９２,２００号および１９９３年７月１４日に出願された第０７／９１３,６６９号に見い出すことができる。これらは、その全てを参考として本明細書に含まれる。ポリヌクレオチド送達系の有用性にも拘わらず、ポリヌクレオチドコンジュゲートはサイズおよび組成が不均一で、化学的に特定できず、かつ再現性よく調製するのが困難である。さらに、ポリヌクレオチドとの会合に利用される化合物には、細胞毒性であるものも多い。このため、複合体が送達されうる濃度は大きく制限される。従って、所望のポリヌクレオチド複合体を選択し、送達されるポリヌクレオチドの許容濃度を最大限にする手段が必要とされている。本発明は、この必要性および他の必要性を満足する。発明の要約本発明は、脂質、カチオン性脂質、リポソーム、ペプチド、カチオン性ペプチド、デンドリマーまたはポリカチオンのような、トランスフェクション活性を増大させるトランスフェクティング成分と、ポリヌクレオチドの会合によって形成された複合体から、物理化学的特性によって、化学的組成のはっきりとした活性を有する複合体を単離する。密度、表面電荷または粒子サイズのような特定の特性を有する活性複合体を、過剰混合成分から単離する。好ましい態様として、ポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分複合体は超遠心により、特異的ポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分相互作用を有する複合体に対応する１以上のバンドへと分解する。トランスフェクティング成分がカチオン性リポソームを含む場合、グラジエント処理された複合体は、胞質過剰条件下でも、またはポリヌクレオチド過剰条件下でも、形成された複合体に対応する２つの主要なバンドに分解されるであろう。複合体の分解は、実質的に最初の電荷比率とは独立している。平均粒子サイズおよびゼータ電位に関する分析において、この特異的複合体が物理的特性を共有することが示されており、従ってこれらが、特異的ポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分相互作用に対応しているようである。他の態様としては、ポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分複合体は、交差流動電気泳動を用いて分解され、特異的相互作用を有する複合体の同定後、過剰の初発成分から単離される。また、本発明は、前記方法によって単離される活性なポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分複合体を含む。活性複合体は同等量の未分解複合体よりも大きなトランスフェクション活性を呈する。この複合体を用いて、イン・ビトロでもイン・ビボでも、標的細胞へ遺伝情報を送達する。図面の簡単な記載図１は、ショ糖勾配でのポリヌクレオチド−リポソーム複合体の超遠心から得られたバンドのグラフ表示である。図２は、種々の電荷比率における、グラジエント処理されたポリヌクレオチド −リポソームの分布プロフィールを示す。図３は、グラジエント処理されたポリヌクレオチド−リポソームの粒子サイズ分布を電荷比率と関連づける。図４は、種々の電荷比率における、グラジエント処理されたポリヌクレオチド −リポソーム複合体のゼータ電位を示す。図５は、種々の血清濃度における、グラジエント処理された、正に荷電したポリヌクレオチド−リポソームの、イン・ビトロトランスフェクション活性を示す。図６は、種々の血清濃度における、グラジエント処理された、負に荷電したポリヌクレオチド−リポソームの、イン・ビトロトランスフェクション活性を示す。図７−１９は、特定のカチオン脂質を含むトランスフェクティング成分を示す。発明の詳細な記載本発明は、複合体の物理化学的特性によって、トランスフェクティング成分とポリヌクレオチドとの会合によって形成された、化学的に定義されうる活性な複合体を分離する。適当なトランスフェクティング成分として、脂質、カチオン性脂質、ペプチド、カチオン性ペプチド、炭水化物、デンドリマーまたはポリカチオンが挙げられる。広範囲のポリヌクレオチド複合体を、本発明の単離技術で調製することができる。ポリヌクレオチドは一本鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、または二本鎖ＤＮＡもしくはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドとすることができる。また、治療価値を持つ三本鎖または四本鎖ポリヌクレオチドも本発明の範囲内にあると考えられる。二本鎖ＤＮＡの例として、とりわけ、構造遺伝子、オペレーター制御および終止領域を含めた遺伝子、およびプラスミドＤＮＡのような自己複製系が挙げられる。一本鎖ポリヌクレオチド即ち「治療ストランド」として、アンチセンスポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）、リボザイムおよびトリプレックス形成性オリゴヌクレオチドが挙げられる。活性をより長く維持させるためには、治療ストランドは、非ホスホジエステル結合と同程度に安定化したヌクレオチド結合をいくつか有するかまたは全ての結合がそうであることが望ましい。このような結合として例えばとりわけ、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレネート、またはアルキル基がメチルまたはエチルであるようなＯ−アルキルホスホトリエステル結合が挙げられる。これらの一本鎖ポリヌクレオチドでは、投与される組成物の一部として治療ストランドに対して相補鎖または「リンカーストランド」を調製するのが好ましいであろう。リンカーストランドは、通常、細胞に侵入した後にそれが分解されるように、ホスホジエステル結合で合成される。「リンカーストランド」は別に独立したストランドであっても、治療ストランドに共有結合していても、治療ストランドが実質的に二本鎖に復帰し、それ自体にハイブリダイズするような、治療ストランドの単なる延長であってもよい。また、リンカーストランドは、それが複数のポリヌクレオチドストランドにハイブリダイズするように、相補的である多数のアームを有していてもよい。またリンカーストランドは、３’および５’末端、炭水化物、または骨格に、治療ストランドの活性を増幅するための機能的成分として働く官能基を有していてもよい。例えば、ホスホジエステルリンカーストランドは、標的細胞の認識およびそれへのインターナリゼーションを可能とするフォレート誘導体のような標的化リガンドを含有することができる。もし分解に耐性な結合を含む相補的治療ストランドにリンカーが結合するならば、この結合体はインターナライズされるであろう。一旦細胞内に入れば、リンカーは分解され、治療ストランドが放出される。このようにして治療ストランドは、付随的な官能基を有さず、その機能は非必須部位による妨害を受けなくなるであろう。この戦略はいずれのアンチセンス、リボザイム又はトリプレックス−形成性ポリヌクレオチドにも適用でき、それを用いて、抗−ウイルス、抗−細菌、抗−新生物、抗−炎症、抗−増殖、抗− 受容体ブロッキングまたは抗−輸送ポリヌクレオチド等を送達する。治療ストランドに対して直接的に相補的配列を持つ、別に独立したリンカーストランドを合成して、一対一様式でそれにハイブリダイズさせることができる。またリンカーストランドは、該リンカーストランドの５’領域が治療ストランドの５’領域にハイブリダイズし、リンカーストランドの３’領域が治療ストランドの３’領域にハイブリダイズして、以下の構造のコンカテネートを形成するように構築することができる。このコンカテネートは、治療用核酸の見掛けの分子量を増大し、その薬物動態学特性および標的化リガンド：治療用オリゴヌクレオチド比率を、最高の治療効果を達成するよう調整することができる利点を持つ。また、リンカーストランドを分岐させ、ポリヌクレオチドの１を超えるコピーにハイブリダイズさせることができる。他の戦略を用いて、異なるポリヌクレオチドを同時に使用することもできる。これにより、多数の遺伝子を単一治療法の一部として送達することが可能なるであろう。ポリヌクレオチドと会合したトランスフェクティング成分は、ペプチド、カチオン性ペプチド、カチオン性脂質を含めた脂質、リポソームまたは脂質粒子、炭水化物、ポリリシンのようなポリカチオン、デンドリマーのような分岐ポリカチオンおよび１９９９２年７月１４日出願の米国特許出願第０８／０９２,２００号および１９９３年７月１４日出願の第０７／９１３,６９９号に見い出される組成物（上述で含まれる）または遺伝子導入を容易とする他の成分を含むことができる。好ましい態様として、カチオン性リポソームを種々の条件でポリヌクレオチドと混合して、ポリヌクレオチド−リポソーム複合体を形成させる。０〜３０％濃度の直線ショ糖勾配を、１５％ショ糖溶液を４〜６回凍結し解凍することにより調製する。ポリヌクレオチド−リポソーム複合休をグラジエントの頂部にのせ、特定の温度で４０,０００ｒｐｍにて１８時間超遠心する。グラジエント処理により、遊離リポソーム、遊離ＤＮＡ分子と共に、異なる複合体が、それらの密度に従ってグラジエント中を特定の位置まで移動する。異なるバンドは肉眼観察、ならびに他の光学的および化学的測定によっても検出される。遊離リポソームは通常、低密度であるため頂部（０−３％）に止まる一方、遊離ポリヌクレオチドは底部まで移動する（＞２５％）。個々の成分の中間密度を持つポリヌクレオチドおよびリポソームの活性複合体は、図１に示すように、グラジエントの中央（１０％−２０％）に分離したバンドを形成する。本発明の活性複合体は２つの主要バンドまで移動する。これは、２つの異なるリポソーム−ポリヌクレオチド成分：１０−１３％ショ糖濃度におけるより軽い複合体、および１６−１９％ショ糖濃度のより重い複合体に対応する。これらの２つの主要バンドの他に、特にリポソームおよびポリヌクレオチドを１／１近くの電荷比率で混合すると、場合によっては他のバンドが出現する。このようなバンドは非常に弱いかまたは不安定であって、予測できる特異的リポソーム−ポリヌクレオチド相互作用には対応しない。他の遠心グラジエントも本発明の実施に好適である。非イオン性グルコース、ラクトースおよびグリセロールその他が有用である。特に、フィコール^TMグラジエントを使用することができる。また、迅速な分離を可能とするために、不連続的または段階的グラジエントを用いることができる。例えば、１７％の下方溶液および７％の上方溶液よりなるフィコール段階グラジエントを用いて、活性な複合体を過剰成分から首尾よく分離することができる。過剰リポソームは７％相の頂部に止まり、活性複合体濃縮物は界面に止まり、遊離ＤＮＡは１７％相の底部まで移動する。活性複合体を効果的に分離するために選択した濃度で、他の段階的または不連続的グラジエントも使用できる。正確なパーセンテージは、活性化合物およびグラジエントの成分の物理的特性に依存するであろう。また、スピード、時間および温度を変更することにより、遠心法を望ましい条件に設計することもできる。特に、大規模の分離では、連続的流動遠心法を使用することが望ましいであろう。これは、商業的適用で特に有用であろう。ポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分複合体は交差流動電気泳動を用いる分離によっても同定することができる。他の二次元電気的分離法を使用することもできる。本発明によって分離された活性複合体の特徴を調べると、特定のバンド内の複合体が特異的ポリヌクレオチド−トランスフェクション成分相互作用に対応することがわかる。活性複合体は、カチオン性リポソーム−ＤＮＡ混合物を、前記したショ糖勾配を通過する超遠心に供する方法で分離した。分解に続き、グラジエントを分画し、各画分を脂質−ＤＮＡ組成につきアッセイし、複合体の物理化学的特性につきその特徴を調べる。蛍光標識脂質（Ｒｈ−ＰＥ）を用いて、脂質分布を検定し、ＤＮＡ抽出により、各画分のＤＮＡ濃度を測定する。カチオン性脂質：ポリヌクレオチド電荷比率の範囲を１６：１〜１：８までに設定した際に形成されるＰＥ−ＤＮＡ複合体のプロフィールを決定し、結果を図２に表示する。正に荷電した活性複合体は、ＤＮＡを過剰のカチオン性リポソームと混合した場合、すなわち、電荷比率１：１を超えて混合した場合に形成された。これらの複合体に対応する主要バンドは約１１％ショ糖濃度に位置する。遊離リポソームの量の増大が、高電荷比率混合物にて、グラジエントの頂部で見い出された。負に荷電した活性複合体は、過剰のＤＮＡをカチオン性リポソームと混合した場合、すなわち、電荷比率１：１未満で混合した場合に形成された。これらの複合体に対応する主要バンドはショ糖濃度約１７％に位置する。同様に、遊離ＤＮＡの量の増大がより低い電荷比率にてグラジエントの底部で見い出された。１：１により近い電荷比率では、非主要バンドが分解することも多くなる。しかしながら、これらのバンドはほとんど見えず、特異的相互作用によって形成された複合体に対応するようには見えない。主要バンドは、形成された活性複合体の電荷に依存して、常に２つの特異的位置に出現しており、正確な最初の電荷比率によっては影響されていなかった。脂質およびポリヌクレオチドを電荷比率１：１で混合したものを遠心した結果、沈殿が生じ、またいずれのバンドの位置も、恐らくは正確に１：１の複合体を混合する際の実験的変動のため、変化した。図３は、種々の電荷比率で形成した活性複合体のゼータ電位をプロットしている。過剰のカチオン性リポソームで形成した正に荷電した複合体は、約２０−３０ｍＶの間の範囲のゼータ電位を示し、より大きい電荷比率をとる際にも増大はわずかだった。過剰のＤＮＡにて形成された負に荷電した複合体は約−３０ｍＶのゼータ電位を示し、これは、正確な最初の電荷比率からは実質的に独立していた。観察された分極プロフィールは、リポソームおよびポリヌクレオチド成分の間の特異的相互作用が各活性複合体を生じることを示している。図４は、電荷比率を変化させて形成した活性複合体のサイズ分布をプロットしている。約５：１を超える電荷比率、および約１：５未満の電荷比率において、活性複合体は、ほぼ６０ｎｍの平均粒子サイズを有する。これらの結果は、ＤＮＡ濃度１ｍｇ／ｍｌまでのような、高い混合濃度においてさえ観察された。２：１および１：２の比率で形成された複合体はより大きな平均粒子サイズを有し、１：１に近い比率では、混合物が沈殿した。複合体サイズは、高分子電解質相互作用で予測されたように、混合電荷比率が変化すると共に変化した。電荷比率が１：１に近づくにつれ、各複合体のポリヌクレオチドは相互に架橋できる未保護領域を有することができ、平均粒子サイズを増大させる弱い凝集を形成するものと思われる。それにも拘わらず、これらの結果は、活性複合体がポリヌクレオチドおよびトランスフェクティング成分の間の特異的相互作用に対応することも示している。グラジエント分離後、リポソームまたはＤＮＡのいずれかを大過剰にして形成した複合体の安定性は非常に良好であり、それらの平均直径は１カ月以上変化しないままである。恐らくは、もし複合体が安定でなければ、特に混合物の電荷比率が１：１あたりである場合、遠心の際に発生する力のため、グラジエント分離手法は沈殿プロセスを加速するようである。本発明の分離手法によって得られた活性複合体は、複合体化ポリヌクレオチドを標的細胞に導入するのに有用である。通常の手法では大量の過剰成分を有し、高い複合体濃度で変性細胞毒性問題を招く。本発明の分離手法により活性複合体を単離することでこれらの問題は回避される。例えば、本発明の正に荷電した活性複合体は、１０００μｇ／ｍｌと高いポリヌクレオチド濃度で処方することができる。この濃度においては、その不安定性および細胞毒性のために通常の処方は不可能である。負に荷電した活性複合体についての濃度は、１０００μｇ／ｍｌと高い範囲である。本発明の活性複合体の導入効率を非グラジエント処理ポリヌクレオチド−リポソーム混合物のそれと比較した。高い電荷比率混合物から分離した正に荷電した複合体および過剰のＤＮＡを持つ混合物から分離した負に荷電した複合体を共に用いて、イン・ビトロでトランスフェクション活性をテストした。通常のトランスフェクション手法は以下の通りであった。細胞をトランスフェクションの前に２４時間培養した。ＣＭＶプロモーター（ＣＭＶ−β−ｇａｌ）によって駆動されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子をコードするプラスミドＤＮＡとカチオン性リポソームからなる活性ポリヌクレオチド−脂質複合体を前記したようにショ糖勾配で分離した。複合体を、種々の濃度の血清を含有する細胞培養培地に添加し、５時間インキュベートした。培地を１０％血清を含有する培地で置き換えた。４８時間後、細胞を回収し、レポーター遺伝子活性につきアッセイした。図４に示すごとく、正に荷電した活性複合体は、正常量において超遠心分離を受けなかった通常のリポソーム−ＤＮＡ複合体よりもかなり高い活性を有し、かつ最適トランスフェクション条件において未加工複合体の活性と同等である。未加工複合体の量を２倍にすると、その毒性効果のために活性は向上しない。それに対して、活性複合体の濃度を２倍に出来たグラジエント処理分は、実質的に活性を増加した。血清をトランスフェクション培地に存在させると、全ての正に荷電した複合体の活性は減少するが、グラジエント処理活性複合体を用い、かつ量を増加させることによって活性は回復し、１０％血清濃度では改良さえされた。血清含有量のさらなる増加は活性を減少させ、３０％血清濃度では、高ＤＮＡ量でさえ、活性はわずかに残存したに過ぎなかった。負に荷電した活性複合体は、未処理複合体よりも著しく改良された活性を示すが、負に荷電した活性複合体の絶対活性は正に荷電した活性複合体と比較して低い。しかしながら、負に荷電した活性複合体は、血清濃度３０％まで著しい活性を維持し、活性は図５に示すごとく量と相関した。これらの特性のため、負に荷電した活性複合体はある種の応用では望ましいものとなるであろう。本発明の分離方法を用いて単離された活性複合体は、多数の利点を供する：活性複合体は等しい適用量にてより大きいトランスフェクション活性を供する；複合体のより高い濃度は細胞毒性なくして使用できる；および、複合体は安定性および均一性を大いに促進されるのみならず、小さな粒子サイズを有する。これらの特徴は活性複合体をイン・ビボプロトコルにもよく適合させる。本発明の実施に好適な従来のカチオン性脂質として、ホスファチジルエタノールアミン［ＰＥ］、ジオレイルオキシホスファチジルエタノールアミン［ＤＯＰＥ］、塩化ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ− トリメチルアンモニウム［ＤＯＴＭＡ］、ジオレイルホスファチジルコリン［ＤＯＰＣ］、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパミニウムトリフルオロアセテート［ＤＯＳＰＡ］、［ＤＯＴＡＰ］、［ＤＯＧＧ］、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム［ＤＤＡＢ］、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム［ＣＤＡＢ］、臭化セチルトリメチルエチルアンモニウム［ＣＴＡＢ］、モノオレイル− グリセロール［ＭＯＧ］、臭化１，２ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム［ＤＭＲＩＥ］、１，２ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＤＭＰＣ］、１，２ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＤＯＰＣ］、１パルミトイル、２ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＰＭＰＣ］、コレステロール［Ｃｈｏｌ］およびカチオン性胆汁塩が挙げられる。他の有用なカチオン性脂質は以下のようにして調製できる。スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’−オレイル）アミドテトラトリフルオロ酢酸塩（ＪＫ−７５）図７標準的な方法によってｐ−ニトロフェニルオレイネートを調製した。この活性エステルをオクタデシルアミンとカップリングさせてＮ−オクタデシルオレイックアミドを得た。水素化リチウムアルミニウムでこのアミドを還元すると、Ｎ− ステアリルＮ−オレイルアミンが形成された。Ｎ−ステアリルＮ−オレイルアミン、Ｎ−ブトキシカルボニルグリシン、ｐ−ニトロフェニルエステルおよびトリエチルアミンのジクロロメタン中混合物をアルゴン下、室温で２４時間撹拌した。有機溶液を０.５Ｍ炭酸ナトリウムで３回抽出し、続いて水で抽出し、次いで、硫酸ナトリウムで乾燥した。減圧下で溶媒を除去し、残渣をシリカゲルフラッシュカラムによって精製してＮ−ｔ−ブトキシカルボニルグリシン（Ｎ’− ステアリル−Ｎ’−オレイル）アミドを得た。この化合物をトリフルオロ酢酸によって脱保護して、グリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’−オレイル）アミドが得られ、これを次いでアルゴン下、室温にて、暗所でジクロロメタン中のテトラ− ｔ−ブトキシカルボニルスペルミン−５−カルボン酸（オルニチンのシアノエチル化、続いての水素化及びＢｏｃ−ｏｎでの保護によって調製）、ジシクロヘキシルカルボジイミド及びＮ−フドロキシスクシンイミドで４８時間処理した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルカラムによって精製した。次いで、室温にて、所望の化合物をトリフルオロ酢酸中で１０分間脱保護した。過剰の酸を減圧下で除去してスペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’ −オレイル）アミドテトラトリフルオロ酢酸塩を淡黄色ワックスとして得た。スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’−エライジル）アミドテトラトリフルオロ酢酸塩（ＪＫ−７６）図８適正な出発物質で置き換えることによって、同様の手法で製造した。アグマチニルカルボキシコレステロール酢酸塩（ＡＧ−Ｃｈｏｌ）図９アグマチン硫酸（１００ｍｇ、０.４３８ミリモル）をメタノール（１５ｍｌ）中の水酸化テトラメチルアンモニウム（１５８ｍｇ、０.８７６ミリモル）で１時間処理した。減圧下で溶媒を除去した。残渣およびクロロギ酸コレステリル（１９７ｍｇ、０.４３８ミリモル）のＤＭＦ（１５ｍｌ）中懸濁溶液を室温で３日間撹拌した。反応混合物の濾過により粗生成物が淡黄色固体として得られ、これをクロロホルム−メチノール−酢酸（１０：２：１）を溶離剤として用いるシリカゲルカラムによって精製してアグマチニルカルボキシコレステロール酢酸塩を白色固体として得た。スペルミン−５−カルボキシ−β−アラニンコレステリルエステルテトラトリフルオロ酢酸塩（ＣＡＳ）図１０標準的手法によって調製したコレステリルβ−アラニンエステル（０.２ミリモル）のジクロロメタン（乾燥、２ｍｌ）溶液を、テトラ−ｔ−ブトキシカルボニルスペルミン−５−カルボン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（０. １５５ミリモル）のジクロロメタン（５ｍｌ）溶液および４−メチルモルホリン（０.４ｍｌ）の溶液に添加した。反応混合物をアルゴン下、室温で６日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、溶離剤としてエタノール−ジクロロメタン（１：２０）を用いるシリカゲルカラムによって残渣を精製して所望の生成物を淡黄色油として得た。この化合物をアルゴン下、室温にてトリフルオロ酢酸（０.５ｍｌ）で１０分間処理した。過剰のトリフルオロ酢酸を減圧下で除去してスペルミン−５−カルボキシ−β−アラニンコレステリルエステルテトラトリフルオロ酢酸塩を白色固体として得た。２，６−ジアミノヘキサノエイルβ−アラニンコレステリルエステルビストリフルオロ酢酸塩（ＣＡＬ）図１１適切な出発物質で置き換えることによって、ＣＡＳと同様に製造した。２，４−ジアミノブチロイルβ−アラニンコレステリルエステルビトトリフルオロ酢酸塩（ＣＡＢ）図１２適切な出発物質で置き換えることによって、ＣＡＳと同様に製造した。Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−３−アミノプロピオニルβ−アラニンコレステリルエストルトリフルオロ酢酸塩（ＣＡＳＤ）図１３１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンの存在下でβ−アラニンをアクリルニトリルで９０℃で１５時間シアノエチル化することによりＮ，Ｎ−ビス（２−シアノエチル）−３−アミノプロピオン酸を得た。ラネーニッケルを触媒として用いてエタノール−水（１：１）中でＮ，Ｎ−ビス（２−シアノエチル） −３−アミノプロピオン酸を水素化することによりＮ，Ｎ−ビス（３−アミノエチル）−３−アミノプロピオン酸を得た。該化合物のアミノ基をアセトン−水（４：１）中の２−（ｔ−ブトキシカルボニルオキシルミノ）−２−フェニルアセトニトリルによって保護して、Ｎ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル−３−アミノエチル）−３−アミノプロピオン酸を得た。この化合物をクロロアセトニトリルおよびトリエチルアミンによって活性化して、シアノメチルＮ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル−３−アミノエチル）−３−アミノプロピオネートを得た。該シアノメチルエステルおよびコレステリルβ−アラニンエステルのクロロメタン溶液をアルゴン下、室温にて暗所で１０日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、メタリール−クロロホルム（１：１０）を溶離剤として用いるシリカゲルカラムによって残渣を精製してＮ，Ｎ−ビス（ｔ−ブトキシカルボニル−３−アミノエチル）−３−アミノプロピオノイルβ−アラニンコレステリルエステルを得た。この化合物をトリフルオロ酢酸で処理して、Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−３−アミノプロピオノイルβ−アラニンコレステリルエステルトリフルオロ酢酸塩を得た。［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエチル］アミノカルボキシコレステリルエステル（ＪＫ−１５４）図１４クロロギ酸コレステリル（０.６７６ｇ、１.５１ミリモル）およびエテレンジアミン（４ｍｌ）のクロロホルム（１０ｍｌ）溶液をアルゴン下、室温にて暗所で１６時間撹拌した。溶媒および過剰のエチレンジアミンを減圧下で除去し、ＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃（ＮＨ₃）（ｖ／ｖ，０−２０％）を溶離剤として用いるシリカゲルカラムによって残渣を精製してエチレンジアミンコレステリルカルボキシモノアミドを白色固体として得た。この化合物（８０ｍｇ、０.１７ミリモル）、臭化２−ヒドロキシル（２ｍｌ）およびトリエチルアミン（２ｍｌ）の混合物をアルゴン下、室温にて暗所で１４日間撹拌した。過剰のトリエチルアミンおよび臭化２−ヒドロキシエチルを減圧下で除去し、残渣をＣＨ₃ＯＨ−ＣＨＣｌ₃ （ｖ／ｖ、１：３）を溶離剤として用いるシリカゲルカラムによって精製して２ −［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）アミノエチル］アミノカルボキシコレステリルエステルを白色固体として得た。カルニチンエステル脂質標準的な方法によってＬ−カルニチンのヒドロキシ基をアシル化してモノアシルカルニチンを得ることによってカルニチン脂質を合成した。該カルニチンのカルボキシ基を第２アシル鎖で修飾して、単一の第四級アンモニウムカチオン基を持つリン脂質類似体を得た。他のカルニチン立体異性体Ｄ−およびＤ，Ｌ−は適当であるが、Ｌ−形態が好ましい。アシル鎖は炭素が２〜３０個であり、飽和または不飽和でもよく、シスまたはトランスいずれかの立体配置の１〜６個の不飽和基を有してもよい。また、アシル鎖はイソ形態を含有することもある。オレオイル基を有し、Ｃ₉にシス不飽和結合を持つ１８炭素鎖であることが好ましい。この総括的カルシトニンエステルを図１５に示す。現在好ましいカルシトニンエステルは以下の通りである。ステアリルカルニチンエステルＤＬ−カルトニン塩酸塩（１．０ｇ、５.０５ミリモル）および水酸化ナトリウム（０.３０３ｇ、７.５８ミリモル）のエタノール（１５ｍｌ）溶液を室温で２時間撹拌した。形成された白色固体（ＮａＣｌ）を濾過によって除去し、溶媒を減圧下で蒸発させて白色固体、カルニチン内部塩を得た。ＤＭＦ−ジオキサン（３：５、４０ｍｌ）中のカルニチン内部塩および１−ヨードオクタデカン（２ .３１ｇ、６.０６ミリモル）の懸濁液をアルゴン下、１２０℃で油浴で４時間加熱した。溶媒をロタベーパー(rotavapor)および真空によって除去し、残渣をＣＨ₃ＯＨ−ＣＨ₃Ｃｌを溶離剤として用いるシリカゲルカラムを用いるクロマトグラフィーに付して２.２２ｇ（８１％）のステアリルカルニチンエステルを白色固体として得た。パルミチルカルニチンエステルステアリルカルニチンエステルの調製で用いた手法により、０.７７ｇ（４.７７ミリモル）のカルニチン内部塩および２.５２ｇ（７.１５ミリモル）の１−ヨードヘキサデカンより１.５９ｇ（６５％）のパルミチルカルニチンエステルを白色固体として得た。ミリスチルカルニチンエステルステアリルカルニチンエステルの調製で使用した手法により、０.７７ｇ（４. ７７ミリモル）のカルニチン内部塩および２.３１ｇ（７.１５ミリモル）の１− ヨードテトラデカンより１.７０ｇ（７４％）のミノスチルカルニチンエステルを白色固体として得た。ステアリルステアロイルカルニチンエステル塩化物塩（ＳＳＣＥ）図１６ＤＬ−カルニチン塩酸塩（１.０ｇ、５.０５ミリモル）および水酸化ナトリウム（０.３０３ｇ、７.５８ミリモル）のエタノール（１５ｍｌ）溶液を室温で２時間撹拌した。形成された沈殿（ＮａＣｌ）を濾過によって除去し、溶媒を減圧下で蒸発させて、白色固体、カルニチン内部塩を得た。ＤＭＦ−ジオキサン（３：５、４０ｍｌ）中のカルニチン内部塩および１−ヨードオクタデカン（２.３１ｇ、６.０６ミリモル）の懸濁液をアルゴン下、１２０℃にて油浴で４時間加熱した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＣＨ₃ＯＨ−ＣＨ₃Ｃｌ（ｖ／ｖ、０−１０％）を溶離剤として用いるシリカゲルカラムによって精製してステアリルカルニチンエステルを白色固体として得た。ＣＨ₃Ｃｌ（乾燥、１５ｍｌ）中の新たに調製した無水ステアリン酸（１.９４ｇ、３.５２ミリモル）、ステアリルカルニチンエステル（０.９５３ｇ、１.７６ミリモル）および４−ジメチルアミンピリジン（０.４２９ｇ、３.５２ミリモル）の溶液をアルゴン下、室温で４日間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣を冷ジエチルエーテルで２回洗浄した。固体をＭｅＯＨ−ＣＨＣｌ₃（ｖ／ｖ、１：５）を溶離剤として用いるシリカゲルカラム上のクロマトグラフィーに付して、ヨウ化ステアリルステアロイルカルニチンエステルを得た。アニオン交換カラムで該ヨウ化物を塩化物に交換して、塩化ステアリルステアロイルカルニチンエステルを白色固体として得た。Ｌ−ステアリルステアロイルカルニチンエステル（Ｌ−ＳＳＣＥ）はＬ−カルニチンを出発物質として用い、同一手法にて調製した。分析データはＤＬ−ＳＳＣＥと同一である。ステアリルオレオイルカルニチンエステル塩化物（ＳＯＣＥ）図１７適当な出発物質に置き換えて、ＳＳＣＥと同様に調製した。塩化パルミチルパルミトイルカルニチンエステル（ＰＰＣＥ）図１８適当な出発物質に置き換えて、ＳＳＣＥと同様に調製した。塩化ミリスチルミリストイルカルニチンエステル（ＭＭＣＥ）図１９適当な出発物質に置き換えて、ＳＳＣＥと同様に調製した。塩化Ｌ−ミリスチルミリストイルカルニチンエステル（Ｌ−ＭＭＣＥ）はＬ−カルニチンを出発物質として同一手法により調製した。分析データはＤＬ−ＭＭＣＥと同一である。融点１５７℃（分解）。これらの脂質で形成された複合体、ならびに本発明の他の複合体は、サイズおよび電荷の差に基づいてコロイドと粒子を分画できる方法によって分離することもできる。特に有用な技術の一つは電場流動分画(electrical field-flow fract ionation)である。この技術はグラファイトから調製したもののような平滑および剛直な電極の間の狭いチャンネル（約２００ミクロン）で行う。試料を低イオン強度の流動する流体中のチャンネルの一端に添加する。電圧（約２ボルト）を流動に対して鉛直に印加する。物質がチャンネルを流動するに従い、負に荷電した粒子は１つの電極に誘因される一方、正に荷電した粒子は反対電極に誘因される。粒子を各電極に誘因する力は、粒子の径およびそのゼータ電位に依存する。電極の表面に向けて移動する粒子は、チャンネルの中央に止まる粒子よりもチャンネルに保持される割合が高い。活性複合体を出発成分から分離するには、成分をまず適当な比率で混合する。次いで、混合物をチャンネルに導入する。流動する流体はチャンネルを通る粒子を担持し；同一直径の粒子については、より大きいゼータ電位を持つ粒子はゼロに近いゼータ電位を持つ粒子よりもチャンネルに保持される割合が高い。同一ゼータ電子を持つ粒子では、より大きな直径を持つ粒子がより小さい直径を持つ粒子よりもチャンネルに保持される割合が高い。過剰のカチオン性リポソームで形成されたカチオン性脂質複合体の場合、複合体は出発カチオン性リポソームよりも迅速にチャンネルから溶出される。過剰のＤＮＡの存在下で形成されたプラスミドＤＮＡ−脂質複合体の場合、複合体はプラスミドＤＮＡよりも迅速に溶出される。電場流動分画を用いて複合体を分離する利点は、分離が迅速であって、流動速度および場の強さの双方を用いて条件を調整することができる点にある。この技術はこのままスケールアップ可能である。本発明を主に現時点で好ましい態様を参照して説明したが、依然として本発明の範囲内にある種々の修飾および改良をなすことができることは認識されるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者シュイ、ユホングアメリカ合衆国 94122 カリフォルニア州サンフランシスコテンスアベニュナンバー１ 1269 (72)発明者ワング、ジンカングアメリカ合衆国 94122 カリフォルニア州サンフランシスコエイティーンスアベニュナンバー１ 1248

Claims

【特許請求の範囲】１．ａ）物理的特性によって混合物を画分に分離する工程；ｂ）分離した混合物を可視化する工程；ｃ）特定の物理特性に対応する活性複合体を同定する工程；及び、ｄ）特定の物理特性に対応する画分から活性複合体を抽出する工程；を有する、トランスフェクティング成分と会合したポリヌクレオチドの混合物から活性複合体を単離する方法。２．混合物を分離する工程が密度、粒子サイズおよび表面電荷よりなる群から選択される物理特性によって混合物を分離する工程を有する請求項１記載の方法。３．混合物を分離する工程が密度勾配を横切って混合物を超遠心する工程を有する請求項２記載の方法。４．混合物を分離する工程が３０％の直線ショ糖グラジエントを通過させて混合物を超遠心する工程を有する請求項３記載の方法。５．特定密度画分から活性複合体を抽出する工程が、ショ糖濃度約１１％〜１３％から複合体を抽出する工程を有する請求項４記載の方法。６．特定密度画分から活性複合体を抽出する工程が、ショ糖濃度約１６％〜１９％から複合体を抽出する工程を有する請求項４記載の方法。７．混合物を分離する工程がフィコール勾配を通過させて混合物を超遠心する工程を有する請求項１記載の方法。８．混合物を分離する工程が交差流動ゲル電気泳動電場流動分画を行う工程を有する請求項２記載の方法。９．ポリヌクレオチドをトランスフェクティング成分と混合する工程が、電荷比率２：１以上でポリヌクレオチドをカチオン性リポソームと混合する工程を有する請求項１記載の方法。 10．ポリヌクレオチドをトランスフェクティング成分と混合する工程が、電荷比率１：２以下でポリヌクレオチドをカチオン性リポソームと混合する工程を有する請求項１記載の方法。 11．ａ）ポリヌクレオチドをトランスフェクティング成分と混合する工程；ｂ）密度勾配を横切って混合物を超遠心して、混合物を分離する工程；ｃ）分離した混合物を可視化する工程；ｄ）特定密度に対応する活性複合体を同定する工程；及び、ｄ）密度勾配から活性複合体を抽出するする工程；を有するトランスフェクティング成分と会合したポリヌクレオチドの混合物から活性複合体を単離する方法によって生産された生成物。 12．トランスフェクティング成分がカチオン性リポソームを有する請求項１１記載の生成物。 13．電荷比率約２：１以上でリポソームをポリヌクレオチドと混合する請求項１２記載の生成物。 14．電荷比率約５：１以上でリポソームをポリヌクレオチドと混合する請求項１３記載の生成物。 15．電荷比率約１：２以下でリポソームをポリヌクレオチドと混合する請求項１２記載の生成物。 16．電荷比率約１：５以下でリポソームをポリヌクレオチドと混合する請求項１５記載の生成物。 17．リポソームが、ホスファチジルエタノールアミン［ＰＥ］、ホスファチジルコリン［ＰＣ］、ジオレイルオキシホスファチジルエタノールアミン［ＤＯＰＥ］、塩化ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム［ＤＯＴＭＡ］、ジオレオイルホスファチジルコリン［ＤＯＰＣ］、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート［ＤＯＳＰＡ］、［ＤＯＴＡＰ］、［ＤＯＧＧ］、スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’−ステアリル）アミドテトラ−トリフルオロ酢酸塩［ＤＯＧＳ］、臭化１，２ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム［ＤＭＲＩＥ］、１，２ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＤＭＰＣ］、１，２ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＤＯＰＣ］、１パルミトイル、２ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＰＭＰＣ］、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム［ＤＤＡＢ］、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム［ＣＤＡＢ］、臭化セチルトリメチルエチルアンモニウム［ＣＴＡＢ］、モノオレオイル−グリセロール［ＭＯＧ］、コレステロール［Ｃｈｏｌ］、カチオン性胆汁塩、スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ ’−オレイル）アミドテトラトリフルオロ酢酸塩［ＪＫ−７５］、スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’−エライジル）アミドテトラトリフルオロ酢酸塩［ＪＫ−７６］、アグマチルカルボキシコレステロール酢酸塩［ＡＧ−Ｃｈｏｌ］、スペルミン−５−カルボキシ−β−アラニンコレステリルエステルテトラトリフルオロ酢酸塩［ＣＡＳ］、２，６ −ジアミノヘキサノエイルβ−アラニンコレステリルエステルビストリフルオロ酢酸塩［ＣＡＬ］、２，４−ジアミノブチロイルβ−アラニンコレステリルエステルビストリフルオロ酢酸塩［ＣＡＢ］、Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−３−アミノプロピオニルβ−アラニンコレステリルエステルトリストリフルオロ酢酸塩［ＣＡＳＤ］、［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエチル］アミノカルボキシコレステリルエステル［ＪＫ−１５４］、カルニチンエステル脂質、ステアリルカルニチンエステル、ミリスチルカルニチンエステル、ステアリルステアロイルカルニチンエステル塩化物塩［ＳＳＣＥ］、Ｌ−ステアリルステアロイルカルニチンエステル［Ｌ−ＳＳＣＥ］、ステアリルオレオイルカルニチンエステル塩化物［ＳＯＣＥ］、パルミチルパルミトイルカルニチンエステル塩化物［ＰＰＣＥ］、ミリスチルミリストイルカルニチンエステル塩化物［ＭＭＣＥ］、Ｌ−ミリスチルミリストイルカルニチンエステル塩化物［Ｌ−ＭＭＣＥ］よりなる群から選択される請求項６記載の生成物。 18．ａ）ポリヌクレオチドをトランスフェクティング成分と混合する工程；ｂ）物理的特性によって混合物を画分に分離する工程；ｃ）分離した混合物を可視化する工程；ｄ）特定物理特性に対応する活性複合体を同定する工程；ｅ）特定物理的特性に対応する画分から活性複合体を抽出する工程；及びｆ）細胞を活性複合体と接触させるする工程；を有する、ポリヌクレオチドを細胞に送達させる方法。 19．ポリヌクレオチドをトランスフェクティング成分と混合する工程が、ポリヌクレオチドをカチオン性リポソームと混合する工程を有する請求項１８記載の方法。 20．ポリヌクレオチドをトランスフェクティング成分と混合する工程が、ポリヌクレオチドを、ホスファチジルエタノールアミン［ＰＥ］、ホスファチジルコリン［ＰＣ］、ジオレイルオキシホスファチジルエタノールアミン［ＤＯＰＥ］、塩化ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム［ＤＯＴＭＡ］、ジオレオイルホスファチジルコリン［ＤＯＰＣ］、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート［ＤＯＳＰＡ］、［ＤＯＴＡＰ］、［ＤＯＧＧ］、スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’−ステアリル）アミドテトラ−トリフルオロ酢酸塩［ＤＯＧＳ］、臭化１，２ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム［ＤＭＲＩＥ］、１，２ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＤＭＰＣ］、１，２ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＤＯＰＣ］、１パルミトイル、２ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＰＭＰＣ］、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム［ＤＤＡＢ］、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム［ＣＤＡＢ］、臭化セチルトリメチルエチルアンモニウム［ＣＴＡＢ］、モノオレイル−グリセロール［ＭＯＧ］、コレステロール［Ｃｈｏｌ］、カチオン性胆汁塩、スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’ −オレイル）アミドテトラトリフルオロ酢酸塩［ＪＫ−７５］、スペルミン −５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’−エライジル）アミドテトラトリフルオロ酢酸塩［ＪＫ−７６］、アグマチルカルボキシコレステロール酢酸塩［ＡＧ−Ｃｈｏｌ］、スペルミン−５−カルボキシ−β−アラニンコレステリルエステルテトラトリフルオロ酢酸塩［ＣＡＳ］、２，６− ジアミノヘキサノエイルβ−アラニンコレステリルエステルビストリフルオロ酢酸塩［ＣＡＬ］、２，４−ジアミノブチロイルβ−アラニンコレステリルエステルビストリフルオロ酢酸塩［ＣＡＢ］、Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−３−アミノプロピオニルβ−アラニンコレステリルエステルトリストリフルオロ酢酸塩［ＣＡＳＤ］、［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエチル］アミノカルボキシコレステリルエステル［ＪＫ −１５４］、カルニチンエステル脂質、ステアリルカルニチンエステル、ミリスチルカルニチンエステル、ステアリルステアロイルカルニチンエステル塩化物塩［ＳＳＣＥ］、Ｌ−ステアリルステアロイルカルニチンエステル［Ｌ−ＳＳＣＥ］、ステアリルオレオイルカルニチンエステル塩化物［ＳＯＣＥ］、パルミチルパルミトイルカルニチンエステル塩化物［ＰＰＣＥ］、ミリスチルミリストイルカルニチンエステル塩化物［ＭＭＣＥ］、Ｌ−ミリスチルミリストイルカルニチンエステル塩化物［Ｌ−ＭＭＣＥ］よりなる群から選択されるカチオン性リポソームと混合する工程を有する請求項１９記載の方法。 21．混合物を密度によって画分に分離する工程が、密度勾配を通過させて混合物を超遠心する工程を有する請求項１８記載の方法。 22．活性ポリヌクレオチド−トランスフェクティング成分複合体を含有し、該活性複合体が、密度勾配を通過して超遠心した場合に特定の密度濃度まで移動する、ポリヌクレオチドを細胞に送達するための組成物。 23．活性複合体が３０％ショ糖直線密度勾配にて約１１％〜約１３％の濃度まで移動する請求項２２記載の組成物。 24．活性複合体が３０％ショ糖直線密度勾配にて約１６％〜約１９％の濃度まで移動する請求項２２記載の組成物。 25．トランスフェクティング成分がポリカチオン、脂質、カチオン性脂質、デンドリマーペプチド、カチオン性ペプチドおよび炭水化物よりなる群から選択される請求項２２記載の成分。 26．トランスフェクティング成分が、ホスファチジルエタノールアミン［ＰＥ］、ホスファチジルコリン［ＰＣ］、ジオレイルオキシホスファチジルエタノールアミン［ＤＯＰＥ］、塩化ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］ −Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム［ＤＯＴＭＡ］、ジオレオイルホスファチジルコリン［ＤＯＰＣ］、２，３−ジオレイルオキシ−Ｎ−［２−（スペルミンカルボキシアミド）エチル］−Ｎ，Ｎ−ジメチル−１−プロパナミニウムトリフルオロアセテート［ＤＯＳＰＡ］、［ＤＯＴＡＰ］、［ＤＯＧＧ］、スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’−ステアリル）アミドテトラ−トリフルオロ酢酸塩［ＤＯＧＳ］、臭化１，２ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル−ヒドロキシエチルアンモニウム［ＤＭＲＩＥ］、１，２ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＤＭＰＣ］、１，２ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＤＯＰＣ］、１パルミトイル、２ミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−エチルホスホコリン［ＥＰＭＰＣ］、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム［ＤＤＡＢ］、臭化セチルジメチルエチルアンモニウム［ＣＤＡＢ］、臭化セチルトリメチルエチルアンモニウム［ＣＴＡＢ］、モノオレイル−グリセロール［ＭＯＧ］、コレステロール［Ｃｈｏｌ］、カチオン性胆汁塩、スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’ −ステアリル−Ｎ’−オレイル）アミドテトラトリフルオロ酢酸塩［ＪＫ−７５］、スペルミン−５−カルボキシグリシン（Ｎ’−ステアリル−Ｎ’−エライジル）アミドテトラトリフルオロ酢酸塩［ＪＫ−７６］、アグマチルカルボキシコレステロール酢酸塩［ＡＧ−Ｃｈｏｌ］、スペルミン−５−カルボキシ−β−アラニンコレステリルエステルテトラトリフルオロ酢酸塩［ＣＡＳ］、２，６−ジアミノヘキサノエイルβ−アラニンコレステリルエステルビストリフルオロ酢酸塩［ＣＡＬ］、２，４−ジアミノブチロイルβ−アラニンコレステリルエステルビストリフルオロ酢酸塩［ＣＡＢ］、Ｎ，Ｎ−ビス（３−アミノプロピル）−３ −アミノプロピオニルβ−アラニンコレステリルエステルトリストリフルオロ酢酸塩［ＣＡＳＤ］、［Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエチル］アミノカルボキシコレステリルエステル［ＪＫ−１５４］、カルニチンエステル胞質、ステアリルカルニチンエステル、ミリスチルカルニチンエステル、ステアリルステアロイルカルニチンエステル塩化物塩［ＳＳＣＥ］、Ｌ−ステアリルステアロイルカルニチンエステル［Ｌ−ＳＳＣＥ］、ステアリルオレオイルカルニチンエステル塩化物［ＳＯＣＥ］、パルミチルパルミトイルカルニチンエステル塩化物［ＰＰＣＥ］、ミリスチルミリストイルカルニチンエステル塩化物［ＭＭＣＥ］、Ｌ−ミリスチルミリストイルカルニチンエステル塩化物［Ｌ−ＭＭＣＥ］よりなる群から選択されるカチオン性脂質を含む、請求項２５記載の組成物。 27．トランスフェクティング成分が２以上の異なる成分を含む請求項２２記載の組成物。 28．トランスフェクティング成分が両親媒性ペプチドを含む請求項２５記載の組成物。 29．トランスフェクティング成分がデンドリマーを含む請求項２５記載の組成物。 30．トランスフェクティング成分がカチオン性ペプチドを含む請求項２５記載の組成物。 31．真核生物細胞を請求項２２記載の組成物と接触させる工程を含む遺伝子治療方法。 32．細胞をイン・ビボ条件下で接触させる工程を含む請求項３１記載の方法。 33．細胞をイン・ビトロ条件下で接触させる工程を含む請求項３１記載の方法。 34．哺乳動物細胞を接触させる工程を含む請求項３２記載の方法。 35．ヒト細胞を接触させる工程を含む請求項３２記載の方法。 36．哺乳動物細胞を接触させる工程を含む請求項３３記載の方法。 37．ヒト細胞を接触させる工程を含む請求項３３記載の方法。 38．密度勾配が不連続的なものである請求項３記載の方法。