JP2001029087A - 細胞内へ有用なアニオン性物質を送達するための複合体 - Google Patents
細胞内へ有用なアニオン性物質を送達するための複合体Info
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】目的とする少なくとも１種類のアニオン性物
質、特に核酸、を細胞中に送達することができ、かつイ
ン・ビボでの遺伝子治療への応用を見出すことができ
る、新規な複合体の提供。 【解決手段】(i) アニオン性物質に結合することがで
きる少なくとも１種類の第一のポリペプチド、及び（i
i）目的とするアニオン性物質を含んでなる目的とする
アニオン性物質を細胞中に送達するための複合体であっ
て、前記の第一のポリペプチドがＣ１補体因子のサブユ
ニットアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸
配列の全部又は一部を含んでなる、前記複合体及びその
製造法。前記複合体を少なくとも１個含んでなる、更に
少なくとも１種類のアジュバントを含んでなる目的とす
るアニオン性物質を細胞に送達するための医薬組成物。
ヒト又は動物の治療、予防又はワクチン治療用の医薬組
成物を製造するための複合体の使用。
質、特に核酸、を細胞中に送達することができ、かつイ
ン・ビボでの遺伝子治療への応用を見出すことができ
る、新規な複合体の提供。 【解決手段】(i) アニオン性物質に結合することがで
きる少なくとも１種類の第一のポリペプチド、及び（i
i）目的とするアニオン性物質を含んでなる目的とする
アニオン性物質を細胞中に送達するための複合体であっ
て、前記の第一のポリペプチドがＣ１補体因子のサブユ
ニットアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸
配列の全部又は一部を含んでなる、前記複合体及びその
製造法。前記複合体を少なくとも１個含んでなる、更に
少なくとも１種類のアジュバントを含んでなる目的とす
るアニオン性物質を細胞に送達するための医薬組成物。
ヒト又は動物の治療、予防又はワクチン治療用の医薬組
成物を製造するための複合体の使用。
Description
【０００１】
【発明の背景】本発明は、Ｃ１補体因子、および核酸な
どの目的とするアニオン性物質のアミノ酸配列の全部ま
たは一部を含んでなる、複合体に関する。これらの複合
体は、上記のアニオン性物質を細胞中に送達するのに有
用である。
どの目的とするアニオン性物質のアミノ酸配列の全部ま
たは一部を含んでなる、複合体に関する。これらの複合
体は、上記のアニオン性物質を細胞中に送達するのに有
用である。
【０００２】遺伝子治療は、 主として永久的治癒が機
能性遺伝子を導入することによって行うことができる遺
伝性の欠乏疾患（嚢胞性繊維症、ジストロフィー、血友
病など）に適用可能であると一般に考えられている。し
かしながら、遥かに大きな群の疾患、取り分け後天性疾
患（癌、ＡＩＤＳ、多発性硬化症など）は、宿主細胞を
一過性的に操作して有益なタンパク質を産生させること
によって治療可能な場合がある。
能性遺伝子を導入することによって行うことができる遺
伝性の欠乏疾患（嚢胞性繊維症、ジストロフィー、血友
病など）に適用可能であると一般に考えられている。し
かしながら、遥かに大きな群の疾患、取り分け後天性疾
患（癌、ＡＩＤＳ、多発性硬化症など）は、宿主細胞を
一過性的に操作して有益なタンパク質を産生させること
によって治療可能な場合がある。
【０００３】遺伝子治療のもう一つの応用は、ワクチン
接種である。これに関して、脊椎動物の細胞中に導入さ
れた核酸によってコードされる免疫原性生成物の全部ま
たは一部を主要な組織適合性抗原に関して上記細胞によ
って発現して放出し、または発現した免疫原に対して免
疫応答を誘導することができる。機能性核酸を様々な手
法によって細胞中に導入して、一過性トランスフェクシ
ョンと呼ばれる目的とする遺伝子の一過性発現、または
核酸の宿主ゲノムへの取り込みから生じる宿主細胞の永
久的形質転換を生じることができる。
接種である。これに関して、脊椎動物の細胞中に導入さ
れた核酸によってコードされる免疫原性生成物の全部ま
たは一部を主要な組織適合性抗原に関して上記細胞によ
って発現して放出し、または発現した免疫原に対して免
疫応答を誘導することができる。機能性核酸を様々な手
法によって細胞中に導入して、一過性トランスフェクシ
ョンと呼ばれる目的とする遺伝子の一過性発現、または
核酸の宿主ゲノムへの取り込みから生じる宿主細胞の永
久的形質転換を生じることができる。
【０００４】良好な遺伝子治療は、生体の細胞への遺伝
子情報の効率的送達と発現とによって変化する。現在用
いられているほとんどの送達機構は、ウイルスベクタ
ー、特にアデノウイルスのおよびレトロウイルスベクタ
ーに関係するものである。ウイルスは、多様かつ極めて
複雑な機構を開発し、細胞膜の通過、エンドソームおよ
びリソソーム分解の回避、および最後にウイルスゲノム
を核へ送達した後のウイルスゲノムの発現などのこの目
的を達成してきた。従って、ウイルスは、ヒトに適用さ
れるワクチン接種または遺伝子治療における多くの遺伝
子送達用途に用いられてきた（総説については、Robbin
s et al., 1998, Tibtech., 16, 35-40を参照）。ウイ
ルスの使用には、多くの欠点がある。レトロウイルスは
大きなＤＮＡ（例えば、ジストロフィン遺伝子、約１３
ｋｂ）を収容することができず、レトロウイルスゲノム
は宿主細胞ＤＮＡ中に組込まれ、従ってレシピエント細
胞において遺伝子変化を引起すことがあり、また感染性
ウイルス粒子が生体内または環境中に広がる恐れがあ
る。アデノウイルスは、治療を受けた患者に強い免疫応
答を誘発する可能性がある（Mc Coy et al., 1995, Hum
an Gene Therapy, 6, 1553-1560; Yang et al., 1996,
Immunity, 1, 433-442）。しかしながら、これらの欠点
にも拘わらず、ウイルスベクターは、それらの効率性ゆ
えに現在最も有用な送達系である。
子情報の効率的送達と発現とによって変化する。現在用
いられているほとんどの送達機構は、ウイルスベクタ
ー、特にアデノウイルスのおよびレトロウイルスベクタ
ーに関係するものである。ウイルスは、多様かつ極めて
複雑な機構を開発し、細胞膜の通過、エンドソームおよ
びリソソーム分解の回避、および最後にウイルスゲノム
を核へ送達した後のウイルスゲノムの発現などのこの目
的を達成してきた。従って、ウイルスは、ヒトに適用さ
れるワクチン接種または遺伝子治療における多くの遺伝
子送達用途に用いられてきた（総説については、Robbin
s et al., 1998, Tibtech., 16, 35-40を参照）。ウイ
ルスの使用には、多くの欠点がある。レトロウイルスは
大きなＤＮＡ（例えば、ジストロフィン遺伝子、約１３
ｋｂ）を収容することができず、レトロウイルスゲノム
は宿主細胞ＤＮＡ中に組込まれ、従ってレシピエント細
胞において遺伝子変化を引起すことがあり、また感染性
ウイルス粒子が生体内または環境中に広がる恐れがあ
る。アデノウイルスは、治療を受けた患者に強い免疫応
答を誘発する可能性がある（Mc Coy et al., 1995, Hum
an Gene Therapy, 6, 1553-1560; Yang et al., 1996,
Immunity, 1, 433-442）。しかしながら、これらの欠点
にも拘わらず、ウイルスベクターは、それらの効率性ゆ
えに現在最も有用な送達系である。
【０００５】興味深いことには、１９９０年にWolff et
al. (Science, 247, 1465-1468)は、特殊な送達系を持
たない裸のＲＮＡまたはＤＮＡをマウスの骨格筋に直接
注射すると、筋肉細胞内にレポーター遺伝子を発現する
ことを示した。しかしながら、これらの結果は、核酸は
それだけでイン・ビボである種の細胞の血漿膜を通過す
ることができるが、ほとんどの種類の細胞に見られるト
ランスフェクションの効率は、特に負に帯電した細胞膜
の通過を制限する核酸のポリアニオン性によって非常に
限定されたままである。
al. (Science, 247, 1465-1468)は、特殊な送達系を持
たない裸のＲＮＡまたはＤＮＡをマウスの骨格筋に直接
注射すると、筋肉細胞内にレポーター遺伝子を発現する
ことを示した。しかしながら、これらの結果は、核酸は
それだけでイン・ビボである種の細胞の血漿膜を通過す
ることができるが、ほとんどの種類の細胞に見られるト
ランスフェクションの効率は、特に負に帯電した細胞膜
の通過を制限する核酸のポリアニオン性によって非常に
限定されたままである。
【０００６】更に、１９８９年に、Felgner et al. (Na
ture, 337, 387-388)は既に、カチオン性脂質を用いて
核酸のような大きなアニオン性分子の細胞への導入を促
進することを提案した。これらのカチオン性脂質はアニ
オン性分子と複合体を形成することができるので、これ
らの分子の負電荷を中和し易く、複合体を圧縮し、細胞
中への導入を容易にする。この方法では、レセプターに
よって伝達される機構(Perables et al., 1994, Eur.
J. Biochem., 226, 255-266; Wagner et al., 1994, Ad
vanced Drug Delivery Reviews, 14, 113-135)、ポリア
ミドアミン(Haensler & Szoka, 1993, Bioconjugate Ch
em., 4, 372-379)、樹状ポリマー（ＷＯ９５／２４２２
１号明細書）、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレ
ンイミン（ＷＯ９６／０２６５５号明細書）、ポリリシ
ン（ＵＳ−Ａ−５，５９５，８９７号明細書またはＦＲ
２，７１９，３１６号明細書）のようなポリマーによっ
て伝達されるトランスフェクション、またはＤＯＴＭＡ
（Felgner et al., 1987,PNAS, 84, 7413-7417)、ＤＯ
ＧＳまたはTransfectamTM (Behr et al., 1989, PNAS,
86, 6982-6986)，ＤＭＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ(Felgner
et al., 1993, Methods 5, 67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ(G
ao & Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285)、ＤＯＴＡＰ
TM (McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674-6
22)またはLipofectamineTMのような脂質によって伝達さ
れるトランスフェクション(Felgner et al., 1989, Nat
ure, 337, 387-388)に基づく関連の非ウイルス性伝達系
が開発されてきた。これらの系は、トランスフェクショ
ン可能な細胞の大規模生産、安全性、ターゲッティン
グ、低免疫原性、およびＤＮＡの大きな断片を送達する
能力に関する利点を潜在的に提供する。
ture, 337, 387-388)は既に、カチオン性脂質を用いて
核酸のような大きなアニオン性分子の細胞への導入を促
進することを提案した。これらのカチオン性脂質はアニ
オン性分子と複合体を形成することができるので、これ
らの分子の負電荷を中和し易く、複合体を圧縮し、細胞
中への導入を容易にする。この方法では、レセプターに
よって伝達される機構(Perables et al., 1994, Eur.
J. Biochem., 226, 255-266; Wagner et al., 1994, Ad
vanced Drug Delivery Reviews, 14, 113-135)、ポリア
ミドアミン(Haensler & Szoka, 1993, Bioconjugate Ch
em., 4, 372-379)、樹状ポリマー（ＷＯ９５／２４２２
１号明細書）、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレ
ンイミン（ＷＯ９６／０２６５５号明細書）、ポリリシ
ン（ＵＳ−Ａ−５，５９５，８９７号明細書またはＦＲ
２，７１９，３１６号明細書）のようなポリマーによっ
て伝達されるトランスフェクション、またはＤＯＴＭＡ
（Felgner et al., 1987,PNAS, 84, 7413-7417)、ＤＯ
ＧＳまたはTransfectamTM (Behr et al., 1989, PNAS,
86, 6982-6986)，ＤＭＲＩＥまたはＤＯＲＩＥ(Felgner
et al., 1993, Methods 5, 67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ(G
ao & Huang, 1991, BBRC, 179, 280-285)、ＤＯＴＡＰ
TM (McLachlan et al., 1995, Gene Therapy, 2, 674-6
22)またはLipofectamineTMのような脂質によって伝達さ
れるトランスフェクション(Felgner et al., 1989, Nat
ure, 337, 387-388)に基づく関連の非ウイルス性伝達系
が開発されてきた。これらの系は、トランスフェクショ
ン可能な細胞の大規模生産、安全性、ターゲッティン
グ、低免疫原性、およびＤＮＡの大きな断片を送達する
能力に関する利点を潜在的に提供する。
【０００７】しかしながら、幾つかの研究（例えば、Ma
hato et al., J. Pharm. Sci., 1995, 84, 1267-1271;
Thierry et al., 1995, PNAS, 92, 9742-9746）は、複
合体形成したアニオン性巨大分子の細胞中への伝達効率
は、特にイン・ビボ伝達の場合には、複合体と細胞膜と
の相互作用、関与する細胞の種類、カチオン性成分の脂
質組成、アニオン性分子で形成される複合体の大きさ、
および特に複合体の様々な成分の正電荷と負電荷との比
に応じて変化することができる。現在のところは、複合
体と細胞膜との相互作用および複合体の細胞中への伝達
を可能にする機構に関しては極めて僅かしか知られてお
らず、進行中の研究は非常に経験的なものばかりであ
る。また、このような化合物は非自己分子であり、免疫
系によって認識されおよび／または代謝経路を妨げる可
能性がある。従って、特性が改良されたまたは既に報告
されているものとは異なる特性を有する、または先行技
術と組合わせることができる新規化合物、特にカチオン
性化合物を開発する必要がある。
hato et al., J. Pharm. Sci., 1995, 84, 1267-1271;
Thierry et al., 1995, PNAS, 92, 9742-9746）は、複
合体形成したアニオン性巨大分子の細胞中への伝達効率
は、特にイン・ビボ伝達の場合には、複合体と細胞膜と
の相互作用、関与する細胞の種類、カチオン性成分の脂
質組成、アニオン性分子で形成される複合体の大きさ、
および特に複合体の様々な成分の正電荷と負電荷との比
に応じて変化することができる。現在のところは、複合
体と細胞膜との相互作用および複合体の細胞中への伝達
を可能にする機構に関しては極めて僅かしか知られてお
らず、進行中の研究は非常に経験的なものばかりであ
る。また、このような化合物は非自己分子であり、免疫
系によって認識されおよび／または代謝経路を妨げる可
能性がある。従って、特性が改良されたまたは既に報告
されているものとは異なる特性を有する、または先行技
術と組合わせることができる新規化合物、特にカチオン
性化合物を開発する必要がある。
【０００８】
【発明の概要】本発明者らは、目的とする少なくとも１
種類のアニオン性物質、特に核酸、を細胞中に送達する
ことができ、かつイン・ビボでの遺伝子治療への応用を
見出すことができる、新規な複合体を同定した。
種類のアニオン性物質、特に核酸、を細胞中に送達する
ことができ、かつイン・ビボでの遺伝子治療への応用を
見出すことができる、新規な複合体を同定した。
【０００９】本発明は、第一に、(i) アニオン性物質
に結合することができる少なくとも１種類の第一のポリ
ペプチド、および(ii) 目的とするアニオン性物質、を
含んでなる、目的とするアニオン性物質を細胞中に送達
するための複合体であって、前記の第一のポリペプチド
がＣ１補体因子のサブユニットアミノ酸配列からなる群
から選択されるアミノ酸配列の全部または一部を含んで
なる、前記複合体、に関する。
に結合することができる少なくとも１種類の第一のポリ
ペプチド、および(ii) 目的とするアニオン性物質、を
含んでなる、目的とするアニオン性物質を細胞中に送達
するための複合体であって、前記の第一のポリペプチド
がＣ１補体因子のサブユニットアミノ酸配列からなる群
から選択されるアミノ酸配列の全部または一部を含んで
なる、前記複合体、に関する。
【００１０】
【発明の具体的説明】補体の免疫系は、総ての脊椎動物
の正常な血清中に低濃度で含まれる血清タンパク質また
は因子の極めて複雑な組合せである。上記の補体因子は
不活性な形態で天然に存在しており、活性化してＣ１〜
Ｃ９と呼ばれる少なくとも９種類の因子を含む精巧な酵
素経路（古典的Ｃ経路）を形成することができる（Weir
& Stewart, 1993, 免疫学(Immunology), 23-30頁, 第
７版, Churchill Livingstoneを参照）。
の正常な血清中に低濃度で含まれる血清タンパク質また
は因子の極めて複雑な組合せである。上記の補体因子は
不活性な形態で天然に存在しており、活性化してＣ１〜
Ｃ９と呼ばれる少なくとも９種類の因子を含む精巧な酵
素経路（古典的Ｃ経路）を形成することができる（Weir
& Stewart, 1993, 免疫学(Immunology), 23-30頁, 第
７版, Churchill Livingstoneを参照）。
【００１１】Ｃ１は上記の補体因子の１つである。これ
は、イオン性カルシウムの存在下で会合した少なくとも
３種類のサブユニット（Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）
を含んでなるポリペプチドである。Ｃ１ｑは詳細に解析
されており、これは１８本の鎖（Ｃ１ｑ分子当たりそれ
ぞれ６個のコピーを有するＡ、ＢおよびＣと呼ばれる３
本の異なる鎖）からなり、分子量は約４０００００であ
る。
は、イオン性カルシウムの存在下で会合した少なくとも
３種類のサブユニット（Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓ）
を含んでなるポリペプチドである。Ｃ１ｑは詳細に解析
されており、これは１８本の鎖（Ｃ１ｑ分子当たりそれ
ぞれ６個のコピーを有するＡ、ＢおよびＣと呼ばれる３
本の異なる鎖）からなり、分子量は約４０００００であ
る。
【００１２】ＤＮＡが古典的なＣ経路を活性化すること
は以前に示されており(Peltier etal., 1978, Immunolo
gy, 35, 779)、Jiang et al. (1992, J. of Exp. Medic
ine, 175, 1373-1379)は古典的Ｃ経路を活性化すること
ができるＣ１ｑ領域を初めて詳細に報告し、ＤＮＡがこ
のＣ１ｑ領域と相互作用することができることを示唆し
ているが、目的とするアニオン性物質の細胞へ送達する
ためのこのような化合物の使用は教示も示唆もされてい
ない。
は以前に示されており(Peltier etal., 1978, Immunolo
gy, 35, 779)、Jiang et al. (1992, J. of Exp. Medic
ine, 175, 1373-1379)は古典的Ｃ経路を活性化すること
ができるＣ１ｑ領域を初めて詳細に報告し、ＤＮＡがこ
のＣ１ｑ領域と相互作用することができることを示唆し
ているが、目的とするアニオン性物質の細胞へ送達する
ためのこのような化合物の使用は教示も示唆もされてい
ない。
【００１３】「目的とするアニオン性物質」とは、負に
帯電した分子を表し、電荷の数は限定されない。更に具
体的には、この分子はタンパク質または核酸からなる群
から選択することができる。好ましい態様によれば、目
的とするアニオン性物質は核酸である。
帯電した分子を表し、電荷の数は限定されない。更に具
体的には、この分子はタンパク質または核酸からなる群
から選択することができる。好ましい態様によれば、目
的とするアニオン性物質は核酸である。
【００１４】本発明の範囲で用いられる「核酸」という
用語は、一本鎖または二本鎖の、線状または円形の、天
然または合成の、改質したまたは改質していないＤＮＡ
および／またはＲＮＡ、またはそれらの断片を意味し
（改質例については、米国特許第５，５２５，７１１号
明細書、米国特許第４，７１１，９５５号明細書、米国
特許第５，７９２，６０８号明細書、または欧州特許第
３０２，１７５号明細書を参照されたい）、大きさは制
限されない。それは、取り分け、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、また
はこれらのＲＮＡをコードするＤＮＡであることができ
る。「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本発明に
関しては同義語である。核酸は線状ポリヌクレオチドの
形態を採ることができ、好ましくはプラスミドの形態で
あることができる。核酸は、例えばアンチセンスまたは
リボザイム機能のための細胞に送達しようとするオリゴ
ヌクレオチドであることもできる。本発明によれば、核
酸は好ましくは裸のポリヌクレオチドであるか(Wolff e
t al., Science, 247 (1990), 1465-1468)、またはポリ
ペプチド、好ましくはウイルス性ポリペプチド、または
カチオン性脂質またはポリペプチドの細胞への摂取に関
与することができるカチオン性ポリマー（総説について
は、Ledley, Human Gene Therapy, 6 (1995), 1129-114
4を参照）のような少なくとも１個の化合物、またはプ
ロトン性の極性化合物（例は本明細書で下記または欧州
特許第８９０３６２号明細書において提供される）を用
いて処方される。好ましくは、この核酸は、転写および
翻訳を行って目的とするポリペプチドおよびその発現を
可能にする要素を生成することができる少なくとも１個
の治療上有用な遺伝子配列を包含している。標的細胞に
よる発現に必要な遺伝子情報は、ＤＮＡのＲＮＡへの転
写および必要ならば、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳
に必要な総ての要素を含んでなる。様々な脊椎動物系で
用いるのに適している転写プロモーターは周知である。
例えば、適当なプロモーターとしては、ＲＳＶ、ＭＰＳ
Ｖ、ＳＶ４０、ＣＭＶまたは７．５ｋのようなウイルス
性プロモーター、ワクシニアプロモーター、誘導プロモ
ーター、組織特異性プロモーター、合成プロモーターな
ど、またはそれらの組合せが挙げられる。核酸は、イン
トロン配列、ターゲッティング配列、輸送配列、複製ま
たは組込みに関与する配列を包含することもできる。こ
れらの配列は文献に記載されており、当業者が容易に入
手することができる。核酸は、改質を行ってスペルミン
（spermine）のような特異成分で安定化することもでき
る。これは、例えば化学修飾によって置換して、特異的
なポリペプチド、例えば本発明の第一および／または第
二のポリペプチドのような特異的ポリペプチドとの結合
を容易にすることもできる。このような置換を、下記に
例示する。本発明によれば、核酸を導入する標的細胞に
対して相同または異種性であることができる。核酸によ
ってコードされるポリペプチドの例は、酵素、ホルモ
ン、サイトカイン、膜受容体、構造ポリペプチド、輸送
ポリペプチド、アルブミン、腫瘍、ウイルスまたは感染
性抗原、付着因子、リガンド、転写因子、翻訳因子、複
製因子、安定化因子、抗体、ＨＰＶ由来のＥ６またはＥ
７、ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、インターフェロン、インタ
ーロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−
７、ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファー
ジコロニー刺激因子）、単純ヘルペスウイルス１型（Ｈ
ＳＶ−１）由来のｔｋ遺伝子、ｐ５３またはＶＥＧＦで
ある。ポリペプチドは、抗体をコードすることもでき
る。これに関して、「抗体」という用語は、いずれかの
クラスの総免疫グロブリン、キメラ抗体および二重また
は多重抗原またはエピトープ特異性とのハイブリッド抗
体、およびハイブリッド断片およびアンチ−イディオタ
イプなどＦ（ａｂ）′２、Ｆａｂ′、Ｆａｂのような断
片（米国特許第４，６９９，８８０号明細書）を包含す
る。有利なことには、上記核酸は免疫供与ポリペプチド
でありかつ内在免疫原として作用するポリペプチドの全
部または一部をコードして、細胞内ウイルスなどの感染
性物質および腫瘍細胞に対しても体液性または細胞性応
答または両方を刺激する。「免疫供与ポリペプチド」と
は、このポリペプチドがトランスフェクション細胞で産
生されるとき、治療を受ける患者における免疫応答に関
与することを意味する。更に具体的には、ＡＰＣのよう
な大飲細胞で産生されまたはこれによって吸収される上
記ポリペプチドが加工され、生成する断片がＭＨＣクラ
スＩおよび／またはII分子によってこれらの細胞の表面
に提供され、特異的免疫応答を誘導する。
用語は、一本鎖または二本鎖の、線状または円形の、天
然または合成の、改質したまたは改質していないＤＮＡ
および／またはＲＮＡ、またはそれらの断片を意味し
（改質例については、米国特許第５，５２５，７１１号
明細書、米国特許第４，７１１，９５５号明細書、米国
特許第５，７９２，６０８号明細書、または欧州特許第
３０２，１７５号明細書を参照されたい）、大きさは制
限されない。それは、取り分け、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮ
Ａ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、また
はこれらのＲＮＡをコードするＤＮＡであることができ
る。「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本発明に
関しては同義語である。核酸は線状ポリヌクレオチドの
形態を採ることができ、好ましくはプラスミドの形態で
あることができる。核酸は、例えばアンチセンスまたは
リボザイム機能のための細胞に送達しようとするオリゴ
ヌクレオチドであることもできる。本発明によれば、核
酸は好ましくは裸のポリヌクレオチドであるか(Wolff e
t al., Science, 247 (1990), 1465-1468)、またはポリ
ペプチド、好ましくはウイルス性ポリペプチド、または
カチオン性脂質またはポリペプチドの細胞への摂取に関
与することができるカチオン性ポリマー（総説について
は、Ledley, Human Gene Therapy, 6 (1995), 1129-114
4を参照）のような少なくとも１個の化合物、またはプ
ロトン性の極性化合物（例は本明細書で下記または欧州
特許第８９０３６２号明細書において提供される）を用
いて処方される。好ましくは、この核酸は、転写および
翻訳を行って目的とするポリペプチドおよびその発現を
可能にする要素を生成することができる少なくとも１個
の治療上有用な遺伝子配列を包含している。標的細胞に
よる発現に必要な遺伝子情報は、ＤＮＡのＲＮＡへの転
写および必要ならば、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳
に必要な総ての要素を含んでなる。様々な脊椎動物系で
用いるのに適している転写プロモーターは周知である。
例えば、適当なプロモーターとしては、ＲＳＶ、ＭＰＳ
Ｖ、ＳＶ４０、ＣＭＶまたは７．５ｋのようなウイルス
性プロモーター、ワクシニアプロモーター、誘導プロモ
ーター、組織特異性プロモーター、合成プロモーターな
ど、またはそれらの組合せが挙げられる。核酸は、イン
トロン配列、ターゲッティング配列、輸送配列、複製ま
たは組込みに関与する配列を包含することもできる。こ
れらの配列は文献に記載されており、当業者が容易に入
手することができる。核酸は、改質を行ってスペルミン
（spermine）のような特異成分で安定化することもでき
る。これは、例えば化学修飾によって置換して、特異的
なポリペプチド、例えば本発明の第一および／または第
二のポリペプチドのような特異的ポリペプチドとの結合
を容易にすることもできる。このような置換を、下記に
例示する。本発明によれば、核酸を導入する標的細胞に
対して相同または異種性であることができる。核酸によ
ってコードされるポリペプチドの例は、酵素、ホルモ
ン、サイトカイン、膜受容体、構造ポリペプチド、輸送
ポリペプチド、アルブミン、腫瘍、ウイルスまたは感染
性抗原、付着因子、リガンド、転写因子、翻訳因子、複
製因子、安定化因子、抗体、ＨＰＶ由来のＥ６またはＥ
７、ＭＵＣ１、ＢＲＣＡ１、インターフェロン、インタ
ーロイキン（ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−
７、ＩＬ−１２）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファー
ジコロニー刺激因子）、単純ヘルペスウイルス１型（Ｈ
ＳＶ−１）由来のｔｋ遺伝子、ｐ５３またはＶＥＧＦで
ある。ポリペプチドは、抗体をコードすることもでき
る。これに関して、「抗体」という用語は、いずれかの
クラスの総免疫グロブリン、キメラ抗体および二重また
は多重抗原またはエピトープ特異性とのハイブリッド抗
体、およびハイブリッド断片およびアンチ−イディオタ
イプなどＦ（ａｂ）′２、Ｆａｂ′、Ｆａｂのような断
片（米国特許第４，６９９，８８０号明細書）を包含す
る。有利なことには、上記核酸は免疫供与ポリペプチド
でありかつ内在免疫原として作用するポリペプチドの全
部または一部をコードして、細胞内ウイルスなどの感染
性物質および腫瘍細胞に対しても体液性または細胞性応
答または両方を刺激する。「免疫供与ポリペプチド」と
は、このポリペプチドがトランスフェクション細胞で産
生されるとき、治療を受ける患者における免疫応答に関
与することを意味する。更に具体的には、ＡＰＣのよう
な大飲細胞で産生されまたはこれによって吸収される上
記ポリペプチドが加工され、生成する断片がＭＨＣクラ
スＩおよび／またはII分子によってこれらの細胞の表面
に提供され、特異的免疫応答を誘導する。
【００１５】目的とするアニオン性物質の細胞への導入
または伝達（送達）工程（introduction or transfer p
rocess）は、それだけでよく知られている。「導入また
は送達」とは、アニオン性物質が細胞中に送達され、こ
の工程の終了時に上記細胞の内側にまたはその膜の内部
または上に配置されることを意味する。アニオン性物質
が核酸であるときには、これは「トランスフェクショ
ン」と呼ばれる。トランスフェクションは、例えば上記
核酸によってコードされた遺伝子の発現を測定すること
による、または発現したタンパク質またはそのｍＲＮＡ
の濃度を測定することによる、またはその生物学的効果
を測定することによるなどの任意の適当な方法によって
証明することができる。
または伝達（送達）工程（introduction or transfer p
rocess）は、それだけでよく知られている。「導入また
は送達」とは、アニオン性物質が細胞中に送達され、こ
の工程の終了時に上記細胞の内側にまたはその膜の内部
または上に配置されることを意味する。アニオン性物質
が核酸であるときには、これは「トランスフェクショ
ン」と呼ばれる。トランスフェクションは、例えば上記
核酸によってコードされた遺伝子の発現を測定すること
による、または発現したタンパク質またはそのｍＲＮＡ
の濃度を測定することによる、またはその生物学的効果
を測定することによるなどの任意の適当な方法によって
証明することができる。
【００１６】「に結合することができる」とは、検討し
た化合物がもう一つの化合物と、好ましくは可逆的に、
例えばイオン的相互作用により、ジスルフィドまたは水
素結合を形成することにより、疎水的相互作用または共
有結合により、相互作用し、結合することができること
を意味する。特定の態様によれば、本発明のポリペプチ
ドは、目的とするアニオン性物質と、好ましくは一本鎖
および／または二本鎖核酸に相互作用し、結合すること
ができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、少な
くともイオン的相互作用の中間体によって目的とするア
ニオン性物質と相互作用し、結合することができる。更
に、上記相互作用／結合は、自然に、または直接または
リンカー基によって互いに結合した上記ポリペプチドま
たは目的とする上記アニオン性物質の改質または置換の
後に生じることができる。このような改質または置換の
例を、下記に示す。更に、上記結合は、特異的または非
特異的にターゲッティングを行うことができる。特定の
態様では、「に結合することができる」とは、相互作用
／結合がジスルフィド結合の形成によって生じることを
意味する。この特定の場合には、ポリペプチドは上記結
合、例えば上記の第一および第二のポリペプチドに関与
する。ジスルフィド結合は、上記の第一および／または
第二のポリペプチドによって形成させ、または目的とす
る上記のアニオン性物質上で置換することができる。上
記のジスルフィド結合は、イン・ビボでは不安定であ
り、アニオン性物質が細胞中へ移行した後に自然に開裂
することができる。この態様は、様々なポリペプチドで
あってそれだけでは免疫原性ではないが、他の分子に会
合しているものからなる複合体の巨大分子に対して指定
された可能な免疫応答を制限する上で特に興味深い。
た化合物がもう一つの化合物と、好ましくは可逆的に、
例えばイオン的相互作用により、ジスルフィドまたは水
素結合を形成することにより、疎水的相互作用または共
有結合により、相互作用し、結合することができること
を意味する。特定の態様によれば、本発明のポリペプチ
ドは、目的とするアニオン性物質と、好ましくは一本鎖
および／または二本鎖核酸に相互作用し、結合すること
ができる。好ましくは、本発明のポリペプチドは、少な
くともイオン的相互作用の中間体によって目的とするア
ニオン性物質と相互作用し、結合することができる。更
に、上記相互作用／結合は、自然に、または直接または
リンカー基によって互いに結合した上記ポリペプチドま
たは目的とする上記アニオン性物質の改質または置換の
後に生じることができる。このような改質または置換の
例を、下記に示す。更に、上記結合は、特異的または非
特異的にターゲッティングを行うことができる。特定の
態様では、「に結合することができる」とは、相互作用
／結合がジスルフィド結合の形成によって生じることを
意味する。この特定の場合には、ポリペプチドは上記結
合、例えば上記の第一および第二のポリペプチドに関与
する。ジスルフィド結合は、上記の第一および／または
第二のポリペプチドによって形成させ、または目的とす
る上記のアニオン性物質上で置換することができる。上
記のジスルフィド結合は、イン・ビボでは不安定であ
り、アニオン性物質が細胞中へ移行した後に自然に開裂
することができる。この態様は、様々なポリペプチドで
あってそれだけでは免疫原性ではないが、他の分子に会
合しているものからなる複合体の巨大分子に対して指定
された可能な免疫応答を制限する上で特に興味深い。
【００１７】特定の態様によれば、複合体のポリペプチ
ドは、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓアミノ酸配列サブユ
ニットからなる群から選択され、有利にはＣ１ｑサブユ
ニットのＣ１ｑＡ、Ｃ１ｑＢおよびＣ１ｑＣアミノ酸配
列からなる群から選択される、アミノ酸配列の全部また
は一部を含んでなる。
ドは、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ１ｓアミノ酸配列サブユ
ニットからなる群から選択され、有利にはＣ１ｑサブユ
ニットのＣ１ｑＡ、Ｃ１ｑＢおよびＣ１ｑＣアミノ酸配
列からなる群から選択される、アミノ酸配列の全部また
は一部を含んでなる。
【００１８】更に好ましい態様では、複合体のポリペプ
チドは、配列番号１［Ｃ１ｑＡ（４〜２６）］、配列番
号２［Ｃ１ｑＡ（１４〜２６）］および配列番号３［Ｃ
１ｑＡ（７６〜９２）］に記載のアミノ酸配列からなる
群から選択されるアミノ酸配列の全部または一部を含ん
でなる（Jiang et al., １９９２年, 上記）。あるい
は、複合体のポリペプチドは、誘導体であるそのアミノ
酸配列であって、追加のアミノ酸残基をＮ−およまＣ−
末端に付加したものを含んでなりまたはからなることが
できる。このようなアミノ酸配列の例を、配列番号７〜
配列番号１３に記載する。
チドは、配列番号１［Ｃ１ｑＡ（４〜２６）］、配列番
号２［Ｃ１ｑＡ（１４〜２６）］および配列番号３［Ｃ
１ｑＡ（７６〜９２）］に記載のアミノ酸配列からなる
群から選択されるアミノ酸配列の全部または一部を含ん
でなる（Jiang et al., １９９２年, 上記）。あるい
は、複合体のポリペプチドは、誘導体であるそのアミノ
酸配列であって、追加のアミノ酸残基をＮ−およまＣ−
末端に付加したものを含んでなりまたはからなることが
できる。このようなアミノ酸配列の例を、配列番号７〜
配列番号１３に記載する。
【００１９】本発明によれば、この複合体は、(i) 細
胞特異的ターゲッティングおよび／または膜不安定化に
関与し、および／または、目的とするアニオン性物質の
細胞中への送達を促進する、少なくとも１種類の第二の
ポリペプチド、および／または(ii) カチオン性脂質お
よびカチオン性ポリマーからなる群から選択される少な
くとも１種類のカチオン性化合物、および／または(ii
i) 例えば、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ
Ｅ）、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、スフィン
ゴミエリン、セラミド、セレブロシド、ジオレイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびそれら
の誘導体の１つから選択される、少なくとも１種類の負
に帯電した、中性のまたは双性イオン性の脂質、をさら
に含んでなることができる。
胞特異的ターゲッティングおよび／または膜不安定化に
関与し、および／または、目的とするアニオン性物質の
細胞中への送達を促進する、少なくとも１種類の第二の
ポリペプチド、および／または(ii) カチオン性脂質お
よびカチオン性ポリマーからなる群から選択される少な
くとも１種類のカチオン性化合物、および／または(ii
i) 例えば、ホスファチジルエタノールアミン（Ｐ
Ｅ）、ホスファチジルコリン、ホスホコリン、スフィン
ゴミエリン、セラミド、セレブロシド、ジオレイルホス
ファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびそれら
の誘導体の１つから選択される、少なくとも１種類の負
に帯電した、中性のまたは双性イオン性の脂質、をさら
に含んでなることができる。
【００２０】上記の第二のポリペプチドは、本発明の複
合体に独立したポリペプチド（上記の第一のポリペプチ
ドまたは上記のアニオン性物質に結合していない）とし
て、または上記の第一のポリペプチドまたは目的とする
上記のアニオン性物質に結合することができるポリペプ
チドとして含まれていることがある。上記の第二のポリ
ペプチドが結合することができる場合には、当然のこと
ながらその標的（リガンド／アンチリガンドモデル）に
結合することができ、または改質されて上記の結合を促
進しまたはその結合を生じさせる。分子の改質の例を、
下記に示す。第二のポリペプチドは、好ましくは少なく
とも１個のジスルフィド結合によって介在された第一の
ポリペプチドへ結合することができる。
合体に独立したポリペプチド（上記の第一のポリペプチ
ドまたは上記のアニオン性物質に結合していない）とし
て、または上記の第一のポリペプチドまたは目的とする
上記のアニオン性物質に結合することができるポリペプ
チドとして含まれていることがある。上記の第二のポリ
ペプチドが結合することができる場合には、当然のこと
ながらその標的（リガンド／アンチリガンドモデル）に
結合することができ、または改質されて上記の結合を促
進しまたはその結合を生じさせる。分子の改質の例を、
下記に示す。第二のポリペプチドは、好ましくは少なく
とも１個のジスルフィド結合によって介在された第一の
ポリペプチドへ結合することができる。
【００２１】本発明の複合体のポリペプチドおよびアニ
オン性部分は、当業者によって広く用いられている化学
的または自然の工程によって改質または置換されて、例
えばイン・ビトロまたはイン・ビボ投与の後にポリペプ
チドまたは核酸または本発明の複合体の分布を視覚化す
ることができる標識分子（例えば、ＵＳ−Ａ−４，７１
１，９５５号明細書に開示されている分子を参照）、細
胞ターゲッティング分子（リガンド）または固定分子(a
nchoring molecules)、細胞中への浸透、エンドソーム
のリーシスまたは核への細胞内輸送を促進する要素で改
質または置換された化合物を得ることができる。これら
の要素は、糖、グリコール、ペプチド（例えば、ガスト
リン放出ペプチド（ＧＲＰ）、Gottschalk et al., 199
6, GeneTherapy, 3, 448-457に記載のＪＰＳ１；配列番
号４）、オリゴヌクレオチド、脂質（特にＣ２〜Ｃ２２
を有するもの）、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体（ま
たはその断片）、特異的膜受容体リガンド、アンチリガ
ンドと反応することができるリガンド、フソゲニックペ
プチド(fusogenic peptides)（例えば、ＪＴＳ１ペプチ
ド配列番号４またはＭＰＧペプチド配列番号１５, Morr
is et al., 1999,Nucleic Acid Res., 27, 3510-351
7）、核局在化ペプチド（すなわち、ＮＬＳ、例えば配
列番号１４）、または上記化合物の組合せ、例えば血液
細胞の表面のアシアロ糖タンパク質、膜融合のためのイ
ンフルエンザウイルス血球凝集素のＨＡ−２サブユニッ
ト由来のＩＮＦ−７を標的とするためのガラクトシル残
基(Plank et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 12918-
12924)、またはスタフィロコッカスαおよびδ毒素、マ
ガイニン(magainins)、セクロピン(cecropins)、ストレ
ブトリシンＯ、刺胞動物毒素、パーフォリンおよびエア
ロリシン(aerolysin)のような細孔形成ペプチド(Ojcius
et al., 1991, TIBS, 16, 225-228)、またはＳＶ−４
０ウイルスのＴ−抗原(Lanford & Butel, 1984, Cell,
37, 801-813)またはEpstein BarrウイルスのＥＢＮＡ−
１タンパク質(Ambinder et al., 1991, J.Virol., 65,
1466-1478)由来の核シグナル配列の全部または一部から
なっていてもよい。
オン性部分は、当業者によって広く用いられている化学
的または自然の工程によって改質または置換されて、例
えばイン・ビトロまたはイン・ビボ投与の後にポリペプ
チドまたは核酸または本発明の複合体の分布を視覚化す
ることができる標識分子（例えば、ＵＳ−Ａ−４，７１
１，９５５号明細書に開示されている分子を参照）、細
胞ターゲッティング分子（リガンド）または固定分子(a
nchoring molecules)、細胞中への浸透、エンドソーム
のリーシスまたは核への細胞内輸送を促進する要素で改
質または置換された化合物を得ることができる。これら
の要素は、糖、グリコール、ペプチド（例えば、ガスト
リン放出ペプチド（ＧＲＰ）、Gottschalk et al., 199
6, GeneTherapy, 3, 448-457に記載のＪＰＳ１；配列番
号４）、オリゴヌクレオチド、脂質（特にＣ２〜Ｃ２２
を有するもの）、ホルモン、ビタミン、抗原、抗体（ま
たはその断片）、特異的膜受容体リガンド、アンチリガ
ンドと反応することができるリガンド、フソゲニックペ
プチド(fusogenic peptides)（例えば、ＪＴＳ１ペプチ
ド配列番号４またはＭＰＧペプチド配列番号１５, Morr
is et al., 1999,Nucleic Acid Res., 27, 3510-351
7）、核局在化ペプチド（すなわち、ＮＬＳ、例えば配
列番号１４）、または上記化合物の組合せ、例えば血液
細胞の表面のアシアロ糖タンパク質、膜融合のためのイ
ンフルエンザウイルス血球凝集素のＨＡ−２サブユニッ
ト由来のＩＮＦ−７を標的とするためのガラクトシル残
基(Plank et al., 1994, J. Biol. Chem., 269, 12918-
12924)、またはスタフィロコッカスαおよびδ毒素、マ
ガイニン(magainins)、セクロピン(cecropins)、ストレ
ブトリシンＯ、刺胞動物毒素、パーフォリンおよびエア
ロリシン(aerolysin)のような細孔形成ペプチド(Ojcius
et al., 1991, TIBS, 16, 225-228)、またはＳＶ−４
０ウイルスのＴ−抗原(Lanford & Butel, 1984, Cell,
37, 801-813)またはEpstein BarrウイルスのＥＢＮＡ−
１タンパク質(Ambinder et al., 1991, J.Virol., 65,
1466-1478)由来の核シグナル配列の全部または一部から
なっていてもよい。
【００２２】特定の具体的態様によれば、上記の第二の
ポリペプチドは、上記の置換または改質ポリペプチドの
全部または一部を含んでなる。好ましい態様では、上記
の第二のポリペプチドは、抗ＤＮＡ抗体（例えば、Avra
meas et al., 1998, PNAS, 95, 601-606に記載のＰ１お
よびＰ２ペプチド）、Gottschalk et al. (1996, Gene
Therapy, 3, 448-457)に記載のＪＴＳ１、またはポリリ
シンポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を含
んでなる。有利なことには、上記の第二のポリペプチド
は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１
５または配列番号１４に記載のアミノ酸配列の全部また
は一部を含んでなる。
ポリペプチドは、上記の置換または改質ポリペプチドの
全部または一部を含んでなる。好ましい態様では、上記
の第二のポリペプチドは、抗ＤＮＡ抗体（例えば、Avra
meas et al., 1998, PNAS, 95, 601-606に記載のＰ１お
よびＰ２ペプチド）、Gottschalk et al. (1996, Gene
Therapy, 3, 448-457)に記載のＪＴＳ１、またはポリリ
シンポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を含
んでなる。有利なことには、上記の第二のポリペプチド
は、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号１
５または配列番号１４に記載のアミノ酸配列の全部また
は一部を含んでなる。
【００２３】本発明の複合体は、更に（ii）カチオン性
脂質およびカチオン性ポリマーからなる群から選択され
る少なくとも１個のカチオン性化合物を含んでなること
ができる。これらのカチオン性化合物は、科学文献に広
汎に記載されている（例えば、上記の非ウイルス送達系
に関する文献、または特許出願ＷＯ９７／２９１１８号
明細書、ＷＯ９８／０８４８９号明細書、ＷＯ９８／１
７６９３号明細書を参照されたい）。本発明に用いるこ
とができるカチオン性脂質またはカチオン性脂質の混合
物としては、LipofectinTM、ＤＯＴＭＡ、すなわちＮ−
［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム(Felgner, PNAS, 84
(1987), 7413-7417)、ＤＯＧＳ、すなわちジオクタデシ
ルアミドグリシルスペルミンまたはTransfectamTM(Beh
r, PNAS, 86 (1989), 6982-6986)、ＤＭＲＩＥ、すなわ
ち１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル
−ヒドロキシエチルアンモニウム、およびＤＯＲＩＥ、
すなわち１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメ
チル−ヒドロキシエチルアンモニウム(Felgner, Method
s, 5 (1993), 67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ、すなわち３−
［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバ
モイル］コレステロール(Gao, BBRC, 179 (1991), 280-
285)、ＤＯＴＡＰ(McLachlan, Gene Therapy, 2 (199
5), 674-622),LipofectamineTM、スペルミンまたはスペ
ルミジン−コレステロール、LipofectaceTM（総説につ
いては、例えばLegendre, Medecine/Science, 12 (199
6), 1334-1341またはGao, Gene Therapy, 2 (1995), 71
0-722を参照）、特許出願ＷＯ９８／３４９１０号公
報、ＷＯ９８／１４４３９号公報、ＷＯ９７／１９６７
５号公報、ＷＯ９７／３７９６６号公報、ＷＯ９８３７
９１６号公報またはＷＯ９８５６４２３号公報に記載の
カチオン性脂質、およびそれらの異性体からなる群から
選択されるカチオン性脂質が挙げられる。
脂質およびカチオン性ポリマーからなる群から選択され
る少なくとも１個のカチオン性化合物を含んでなること
ができる。これらのカチオン性化合物は、科学文献に広
汎に記載されている（例えば、上記の非ウイルス送達系
に関する文献、または特許出願ＷＯ９７／２９１１８号
明細書、ＷＯ９８／０８４８９号明細書、ＷＯ９８／１
７６９３号明細書を参照されたい）。本発明に用いるこ
とができるカチオン性脂質またはカチオン性脂質の混合
物としては、LipofectinTM、ＤＯＴＭＡ、すなわちＮ−
［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，
Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウム(Felgner, PNAS, 84
(1987), 7413-7417)、ＤＯＧＳ、すなわちジオクタデシ
ルアミドグリシルスペルミンまたはTransfectamTM(Beh
r, PNAS, 86 (1989), 6982-6986)、ＤＭＲＩＥ、すなわ
ち１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチル
−ヒドロキシエチルアンモニウム、およびＤＯＲＩＥ、
すなわち１，２−ジオレイルオキシプロピル−３−ジメ
チル−ヒドロキシエチルアンモニウム(Felgner, Method
s, 5 (1993), 67-75)、ＤＣ−ＣＨＯＬ、すなわち３−
［Ｎ−（Ｎ′，Ｎ′−ジメチルアミノエタン）−カルバ
モイル］コレステロール(Gao, BBRC, 179 (1991), 280-
285)、ＤＯＴＡＰ(McLachlan, Gene Therapy, 2 (199
5), 674-622),LipofectamineTM、スペルミンまたはスペ
ルミジン−コレステロール、LipofectaceTM（総説につ
いては、例えばLegendre, Medecine/Science, 12 (199
6), 1334-1341またはGao, Gene Therapy, 2 (1995), 71
0-722を参照）、特許出願ＷＯ９８／３４９１０号公
報、ＷＯ９８／１４４３９号公報、ＷＯ９７／１９６７
５号公報、ＷＯ９７／３７９６６号公報、ＷＯ９８３７
９１６号公報またはＷＯ９８５６４２３号公報に記載の
カチオン性脂質、およびそれらの異性体からなる群から
選択されるカチオン性脂質が挙げられる。
【００２４】好ましくは、本発明のカチオン性脂質は、
次式のカチオン性脂質（ＷＯ９８／３４９１０号公報）
から選択される。
次式のカチオン性脂質（ＷＯ９８／３４９１０号公報）
から選択される。
【化１】 （上記式中、Ｒ１、Ｒ２は同一であるかまたは異なり、
線状または分岐状のＣ６〜Ｃ２３アルキルまたはアルケ
ニル、または線状または分岐状の−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６
〜Ｃ ２３）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ
２３）アルケニルであり、ＸはＯまたは−ＮＲ３であ
り、Ｒ３はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｎ＝１−６であ
り、ｍ＝１〜６であり、ｎ＞１であるときには、ｍは同
一であるかまたは異なるものであることができる）。
線状または分岐状のＣ６〜Ｃ２３アルキルまたはアルケ
ニル、または線状または分岐状の−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６
〜Ｃ ２３）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６〜Ｃ
２３）アルケニルであり、ＸはＯまたは−ＮＲ３であ
り、Ｒ３はＣ１〜Ｃ４アルキルであり、ｎ＝１−６であ
り、ｍ＝１〜６であり、ｎ＞１であるときには、ｍは同
一であるかまたは異なるものであることができる）。
【００２５】もう一つの態様によれば、カチオン性脂質
は、次式のカチオン性脂質（仏国特許出願第９７ ０２
４２０号明細書）から選択される。
は、次式のカチオン性脂質（仏国特許出願第９７ ０２
４２０号明細書）から選択される。
【化２】 （上記式中、Ｒは、互いに独立して、Ｈまたは
【化３】 であり、但し、Ｒ１、Ｒ２は互いに独立して、線状また
は分岐状のＣ６〜Ｃ２３アルキルまたはアルケニル、ま
たは線状または分岐状の−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６〜
Ｃ２３）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６〜
Ｃ２３）アルケニル、アリール、シクロアルキル、フル
オロアルキルであり、ポリエチレングリコール、オキシ
エチレンまたはオキシメチレン基であり、 ｐ＝１〜４、 ｎ＝１−６、 ｍ＝１−６である）。
は分岐状のＣ６〜Ｃ２３アルキルまたはアルケニル、ま
たは線状または分岐状の−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６〜
Ｃ２３）アルキルまたは−Ｃ（＝Ｏ）−（Ｃ６〜
Ｃ２３）アルケニル、アリール、シクロアルキル、フル
オロアルキルであり、ポリエチレングリコール、オキシ
エチレンまたはオキシメチレン基であり、 ｐ＝１〜４、 ｎ＝１−６、 ｍ＝１−６である）。
【００２６】本発明で用いることができるカチオン性ポ
リマーまたはカチオン性ポリマーの混合物としては、キ
トサン、ポリリシンのようなポリ（アミノ酸）（ＵＳ−
Ａ−５，５９５，８９７号明細書およびＦＲ２，７１
９，３１６号明細書）、ポリ第四化合物、プロタミン、
ポリイミン、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレン
イミン（ＷＯ９６／０２６５５号明細書）、ポリビニル
アミン、ＤＥＡＥで誘導体形成したポリカチオン性ポリ
マー、例えばプルーラン、セルロース、ポリビニルピリ
ジン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリオ
キセタン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレン（Ｐ
（ＴＤＡＥ））、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポ
リ−ｐ−アミノスチレン、ポリオキセタン、コ−ポリメ
タクリレート（例えば、ＨＰＭＡのコポリマー、Ｎ−
（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド）、Ｕ
Ｓ−Ａ−３，９１０，８６２号明細書に開示されている
化合物、ＤＥＡＥとメタクリレート、デキストラン、ア
クリルアミド、ポリイミン、アルブミン、オンジメチル
アミノメチルメタクリレートおよびポリビニルピロリド
ン−メチルアクリルアミノプロピルトリメチルアンモニ
ウムクロリドとのポリビニルピロリド複合体、ポリアミ
ドアミン、テロメル化合物（特許出願ＥＰ９８．４０１
４７１．２号明細書）からなる群から選択されるカチオ
ン性ポリマーが挙げられる。しかしながら、このリスト
は完全なものではなく、当該技術分野で周知の他のカチ
オン性ポリマーも本発明の方法に用いることができる。
リマーまたはカチオン性ポリマーの混合物としては、キ
トサン、ポリリシンのようなポリ（アミノ酸）（ＵＳ−
Ａ−５，５９５，８９７号明細書およびＦＲ２，７１
９，３１６号明細書）、ポリ第四化合物、プロタミン、
ポリイミン、ポリエチレンイミンまたはポリプロピレン
イミン（ＷＯ９６／０２６５５号明細書）、ポリビニル
アミン、ＤＥＡＥで誘導体形成したポリカチオン性ポリ
マー、例えばプルーラン、セルロース、ポリビニルピリ
ジン、ポリメタクリレート、ポリアクリレート、ポリオ
キセタン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレン（Ｐ
（ＴＤＡＥ））、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポ
リ−ｐ−アミノスチレン、ポリオキセタン、コ−ポリメ
タクリレート（例えば、ＨＰＭＡのコポリマー、Ｎ−
（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド）、Ｕ
Ｓ−Ａ−３，９１０，８６２号明細書に開示されている
化合物、ＤＥＡＥとメタクリレート、デキストラン、ア
クリルアミド、ポリイミン、アルブミン、オンジメチル
アミノメチルメタクリレートおよびポリビニルピロリド
ン−メチルアクリルアミノプロピルトリメチルアンモニ
ウムクロリドとのポリビニルピロリド複合体、ポリアミ
ドアミン、テロメル化合物（特許出願ＥＰ９８．４０１
４７１．２号明細書）からなる群から選択されるカチオ
ン性ポリマーが挙げられる。しかしながら、このリスト
は完全なものではなく、当該技術分野で周知の他のカチ
オン性ポリマーも本発明の方法に用いることができる。
【００２７】特定の態様によれば、カチオン性ポリマー
は、次式によって定義されるような置換ポリビニルアミ
ン（ＰＣＴ特許出願、出願番号ＰＣＴ／ＦＲ９８／０１
５８１号）である。
は、次式によって定義されるような置換ポリビニルアミ
ン（ＰＣＴ特許出願、出願番号ＰＣＴ／ＦＲ９８／０１
５８１号）である。
【化４】 （式中、ｎ＝０〜５であり、ｐ＝２−２００００であ
り、遊離のＮＨ２の少なくとも１０％はＲで置換されて
おり、Ｒは親水性基である）。
り、遊離のＮＨ２の少なくとも１０％はＲで置換されて
おり、Ｒは親水性基である）。
【００２８】もう一つの態様によれば、上記のカチオン
性ポリマーは、次の一般式のポリマー（欧州特許出願第
９８／４０２１４２．８号明細書）である。
性ポリマーは、次の一般式のポリマー（欧州特許出願第
９８／４０２１４２．８号明細書）である。
【化５】 （上記式中、重合度ｐは２〜１００００００の範囲であ
りＲ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれの反復［ＣＨ−Ｃ
Ｈ２］において互いに独立しており、Ｈ、１〜２０個の
炭素原子を有するアルキル、または５〜７個の炭素原子
を有するアリールから選択され、ｎは０または１であ
り、但し、少なくとも１個のｎはポリマーの全長におい
て１である）。
りＲ１、Ｒ２およびＲ３は、それぞれの反復［ＣＨ−Ｃ
Ｈ２］において互いに独立しており、Ｈ、１〜２０個の
炭素原子を有するアルキル、または５〜７個の炭素原子
を有するアリールから選択され、ｎは０または１であ
り、但し、少なくとも１個のｎはポリマーの全長におい
て１である）。
【００２９】補助脂質(colipids)は、場合によっては本
発明の複合体に包含され、核酸の細胞への移行を促進す
る。本発明によれば、補助脂質は、正または負に帯電し
た、中性および双性イオン性の脂質からなる群から選択
される。これらの補助脂質は、天然または合成化合物、
またはそれぞれの組合せであることができた。
発明の複合体に包含され、核酸の細胞への移行を促進す
る。本発明によれば、補助脂質は、正または負に帯電し
た、中性および双性イオン性の脂質からなる群から選択
される。これらの補助脂質は、天然または合成化合物、
またはそれぞれの組合せであることができた。
【００３０】好ましくは、補助脂質は、ホスファチジル
エタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン、ホ
スホコリン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミ
ン（ＤＯＰＥ）、スフィンゴミエリン、セラミドまたは
セレブロシド、またはそれらの誘導体の一つからなる群
から選択される。
エタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン、ホ
スホコリン、ジオレイルホスファチジルエタノールアミ
ン（ＤＯＰＥ）、スフィンゴミエリン、セラミドまたは
セレブロシド、またはそれらの誘導体の一つからなる群
から選択される。
【００３１】カチオン性トランスフェクション分子対補
助脂質の比（重量対重量）は、これらの化合物が複合体
に共存しているときには、１：０〜１：１０の範囲であ
ることができる。好ましい態様では、この比は１：０．
５〜１：４の範囲である。
助脂質の比（重量対重量）は、これらの化合物が複合体
に共存しているときには、１：０〜１：１０の範囲であ
ることができる。好ましい態様では、この比は１：０．
５〜１：４の範囲である。
【００３２】本発明の特定の態様では、本発明による複
合体の大きさは小さい（２μｍ未満、更に有利には５０
０nm未満であり、好ましくは２０〜１００nmの範囲であ
る）。複合体の大きさは、特定の用途で最適に使用され
るように選択することができる。複合体の大きさは、動
的レーザー光散乱（光子相関分光光度法、ＰＣＳ）、並
びに当業者に知られている他の手法などの多数の手法に
よって測定されるが、これらに限定されない（Washingt
on, 医薬および他の産業における粒度分析(Particle An
alysis in Pharmaceutics and other Industries), Ell
is Horwood, New York, １９９２年, １３５〜１６９頁
を参照）。サイジング手順を複合体に応用して、特定の
複合体の大きさを選択することもできる。このサイジン
グ段階に用いることができる方法としては、押出し、音
波処理および微小流動化、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、電界流分画(field flow fractionation)、電気泳
動、および超遠心が挙げられるが、これらに限定されな
い。本発明の複合体は、総ての潜在的なカチオン性基は
実際にカチオン性状態でありまた総ての潜在的なアニオ
ン性基は実際にアニオン性状態であると仮定すれば、複
合体における少なくとも第一のポリペプチドによって提
供される正電荷対アニオン性物質によって提供される負
電荷の比であるその理論電荷比（＋／−）によって特徴
づけることもできる。このような比を得るには、計算は
アニオン性物質の総ての負電荷を考慮し、次いで上記の
所望な理論電荷比を得るのに必要なポリペプチドの量を
調整しなければならない。他姓分の量および濃度は、そ
れぞれのモル質量および正電荷の数に応じて調整しなけ
ればならない。この比は、特定のものに限定されず、ポ
リペプチドにおける正電荷の数とアニオン性物質におけ
る負電荷の数の比が０．０５〜２０、好ましくは２．５
〜１５、最も好ましくは約２．５〜１０となるように量
が選択される。更に、本発明の上記複合体を形成するた
めにポリマーに添加することができる負に帯電したアニ
オン性物質の濃度は、１０μｇ／ml〜５０００μｇ／ml
の範囲であることができる。本発明の好ましい態様で
は、アニオン性物質の濃度は１００μｇ／ml〜１０００
μｇ／mlの範囲である。
合体の大きさは小さい（２μｍ未満、更に有利には５０
０nm未満であり、好ましくは２０〜１００nmの範囲であ
る）。複合体の大きさは、特定の用途で最適に使用され
るように選択することができる。複合体の大きさは、動
的レーザー光散乱（光子相関分光光度法、ＰＣＳ）、並
びに当業者に知られている他の手法などの多数の手法に
よって測定されるが、これらに限定されない（Washingt
on, 医薬および他の産業における粒度分析(Particle An
alysis in Pharmaceutics and other Industries), Ell
is Horwood, New York, １９９２年, １３５〜１６９頁
を参照）。サイジング手順を複合体に応用して、特定の
複合体の大きさを選択することもできる。このサイジン
グ段階に用いることができる方法としては、押出し、音
波処理および微小流動化、サイズ排除クロマトグラフィ
ー、電界流分画(field flow fractionation)、電気泳
動、および超遠心が挙げられるが、これらに限定されな
い。本発明の複合体は、総ての潜在的なカチオン性基は
実際にカチオン性状態でありまた総ての潜在的なアニオ
ン性基は実際にアニオン性状態であると仮定すれば、複
合体における少なくとも第一のポリペプチドによって提
供される正電荷対アニオン性物質によって提供される負
電荷の比であるその理論電荷比（＋／−）によって特徴
づけることもできる。このような比を得るには、計算は
アニオン性物質の総ての負電荷を考慮し、次いで上記の
所望な理論電荷比を得るのに必要なポリペプチドの量を
調整しなければならない。他姓分の量および濃度は、そ
れぞれのモル質量および正電荷の数に応じて調整しなけ
ればならない。この比は、特定のものに限定されず、ポ
リペプチドにおける正電荷の数とアニオン性物質におけ
る負電荷の数の比が０．０５〜２０、好ましくは２．５
〜１５、最も好ましくは約２．５〜１０となるように量
が選択される。更に、本発明の上記複合体を形成するた
めにポリマーに添加することができる負に帯電したアニ
オン性物質の濃度は、１０μｇ／ml〜５０００μｇ／ml
の範囲であることができる。本発明の好ましい態様で
は、アニオン性物質の濃度は１００μｇ／ml〜１０００
μｇ／mlの範囲である。
【００３３】本発明は、また、アニオン性物質に結合す
ることができ、かつＣ１補体因子のサブユニットアミノ
酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の全部ま
たは一部を含んでなる少なくとも１種類の第一のポリペ
プチドを、目的とする少なくとも１種類のアニオン性物
質と接触させ、必要に応じて精製工程の後に、前記複合
体を回収する工程を含んでなる、上記複合体の製造法に
も関する。
ることができ、かつＣ１補体因子のサブユニットアミノ
酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列の全部ま
たは一部を含んでなる少なくとも１種類の第一のポリペ
プチドを、目的とする少なくとも１種類のアニオン性物
質と接触させ、必要に応じて精製工程の後に、前記複合
体を回収する工程を含んでなる、上記複合体の製造法に
も関する。
【００３４】本発明の複合体が、(i) 細胞特異的ター
ゲッティングおよび／または膜不安定化に関与し、およ
び／または、目的とするアニオン性物質の細胞中への送
達を促進する、少なくとも１種類のポリペプチド、およ
び／または（ii）カチオン性脂質およびカチオン性ポリ
マーからなる群から選択される少なくとも１種類のカチ
オン性化合物、および／または（iii） 少なくとも１
種類の負に帯電した、中性のまたは双性イオン性の脂
質、をさらに含んでなる場合には、上記の方法は、最初
に上記の第一のポリペプチドを前記追加要素(i)および
／または（ii）および／または（iii）と混合した後、
目的とするアニオン性物質と複合体を形成させる工程、
または最初に上記の第一のポリペプチドを、目的とする
アニオン性物質と複合体を形成させた後、この複合体を
上記追加要素(i)および／または（ii）および／または
（iii）と混合する工程、を含んでなる。
ゲッティングおよび／または膜不安定化に関与し、およ
び／または、目的とするアニオン性物質の細胞中への送
達を促進する、少なくとも１種類のポリペプチド、およ
び／または（ii）カチオン性脂質およびカチオン性ポリ
マーからなる群から選択される少なくとも１種類のカチ
オン性化合物、および／または（iii） 少なくとも１
種類の負に帯電した、中性のまたは双性イオン性の脂
質、をさらに含んでなる場合には、上記の方法は、最初
に上記の第一のポリペプチドを前記追加要素(i)および
／または（ii）および／または（iii）と混合した後、
目的とするアニオン性物質と複合体を形成させる工程、
または最初に上記の第一のポリペプチドを、目的とする
アニオン性物質と複合体を形成させた後、この複合体を
上記追加要素(i)および／または（ii）および／または
（iii）と混合する工程、を含んでなる。
【００３５】この方法は、更に上記のサイジング手順を
含んでなることができる。
含んでなることができる。
【００３６】本発明は、目的とするアニオン性物質を細
胞中に送達するための医薬組成物をも包含し、上記組成
物は上記で開示した複合体を少なくとも１個含んでな
る。上記の医薬組成物は、遺伝子療法においてポリヌク
レオチドを患者の細胞または組織に送達する上で特に有
用であるが、このような用途に限定されない。「遺伝子
療法」という用語は、イン・ビボでポリヌクレオチドを
細胞中に導入する方法またはイン・ビトロで細胞中に導
入した後、患者に再移植することによる方法として好ま
しく理解される。「遺伝子治療」は、特に遺伝子生成物
が標的組織で発現される場合、並びに遺伝子生成物が、
特に血流中に排出される場合に関係する。
胞中に送達するための医薬組成物をも包含し、上記組成
物は上記で開示した複合体を少なくとも１個含んでな
る。上記の医薬組成物は、遺伝子療法においてポリヌク
レオチドを患者の細胞または組織に送達する上で特に有
用であるが、このような用途に限定されない。「遺伝子
療法」という用語は、イン・ビボでポリヌクレオチドを
細胞中に導入する方法またはイン・ビトロで細胞中に導
入した後、患者に再移植することによる方法として好ま
しく理解される。「遺伝子治療」は、特に遺伝子生成物
が標的組織で発現される場合、並びに遺伝子生成物が、
特に血流中に排出される場合に関係する。
【００３７】好ましくは、医薬組成物は、薬学上許容可
能なキャリヤーをさらに含んでなる。このキャリヤー
は、好ましくは等張性、低張性または若干高張性であ
り、スクロース、グルコース溶液または人工血清によっ
て提供されるような比較的低イオン強度を有する。更
に、これは、任意の関連溶媒、滅菌した発熱物質不含水
を含んでなる水性または部分的に水性の液体キャリヤ
ー、分散媒、コーティングなどを含むことができる。医
薬製剤のｐＨは、適当に調整され、緩衝される。
能なキャリヤーをさらに含んでなる。このキャリヤー
は、好ましくは等張性、低張性または若干高張性であ
り、スクロース、グルコース溶液または人工血清によっ
て提供されるような比較的低イオン強度を有する。更
に、これは、任意の関連溶媒、滅菌した発熱物質不含水
を含んでなる水性または部分的に水性の液体キャリヤ
ー、分散媒、コーティングなどを含むことができる。医
薬製剤のｐＨは、適当に調整され、緩衝される。
【００３８】本発明は、更に具体的には、少なくとも１
個の上記の複合体を含んでなり、かつまた上記複合体の
トランスフェクション容量を向上させることができる少
なくとも１種類のアジュバントを配合している医薬組成
物に関する。アジュバントは、クロロキン、プロピレン
グリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、
ＥｔＯＨ、１−メチル＝Ｌ−２−ピロリドンまたはそれ
らの誘導体のようなプロトン性極性化合物、、またはジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシ
ド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホ
ン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセ
タミド、テトラメチル尿素、アセトニトリルおよびそれ
らの誘導体のような非プロトン性極性化合物からなる群
から選択することができる。
個の上記の複合体を含んでなり、かつまた上記複合体の
トランスフェクション容量を向上させることができる少
なくとも１種類のアジュバントを配合している医薬組成
物に関する。アジュバントは、クロロキン、プロピレン
グリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール、
ＥｔＯＨ、１−メチル＝Ｌ−２−ピロリドンまたはそれ
らの誘導体のようなプロトン性極性化合物、、またはジ
メチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジエチルスルホキシ
ド、ジ−ｎ−プロピルスルホキシド、ジメチルスルホ
ン、スルホラン、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセ
タミド、テトラメチル尿素、アセトニトリルおよびそれ
らの誘導体のような非プロトン性極性化合物からなる群
から選択することができる。
【００３９】本発明の医薬組成物は、脊椎動物の組織に
投与することができる。この投与は、シリンジまたは他
の装置による皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、脳
内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜腔内、冠状
動脈内または粘膜内注射によって行うことができる。経
皮投与も、吸入、エアゾール経路、点滴注入または局所
適用と同様に考えられる。
投与することができる。この投与は、シリンジまたは他
の装置による皮内、皮下、静脈内、筋肉内、鼻内、脳
内、気管内、動脈内、腹腔内、膀胱内、胸膜腔内、冠状
動脈内または粘膜内注射によって行うことができる。経
皮投与も、吸入、エアゾール経路、点滴注入または局所
適用と同様に考えられる。
【００４０】本発明によれば、医薬組成物は、筋肉、皮
膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、
骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子
宮、直腸、神経系、眼、腺、結合組織、血液、腫瘍など
の脊椎動物体の標的組織に投与することができる。
膚、脳、肺、肝臓、脾臓、骨髄、胸腺、心臓、リンパ、
骨、軟骨、膵臓、腎臓、胆嚢、胃、腸、精巣、卵巣、子
宮、直腸、神経系、眼、腺、結合組織、血液、腫瘍など
の脊椎動物体の標的組織に投与することができる。
【００４１】イン・ビボでの遺伝子治療に当たっては、
本発明は患者に繰返し投与を行うことができ、投与した
製剤には有意な免疫反応を引起す危険性はない。投与
は、単回または反復投与によって、一定期間の後一度に
または数回行うことができる。反復投与では、単一時点
で投与した活性成分、特にＤＮＡの投与量を減らすこと
ができる。投与経路および適当な投与量は、幾つかのパ
ラメーター、例えば個々の患者、治療を行う疾患または
移行される核酸によって変化する。
本発明は患者に繰返し投与を行うことができ、投与した
製剤には有意な免疫反応を引起す危険性はない。投与
は、単回または反復投与によって、一定期間の後一度に
または数回行うことができる。反復投与では、単一時点
で投与した活性成分、特にＤＮＡの投与量を減らすこと
ができる。投与経路および適当な投与量は、幾つかのパ
ラメーター、例えば個々の患者、治療を行う疾患または
移行される核酸によって変化する。
【００４２】本発明によれば、「細胞」としては原核細
胞および真核細胞、酵母細胞、植物細胞、一間他は動物
細胞、特に哺乳類細胞が挙げられる。特に、癌細胞を挙
げるべきである。本発明は、肺の組織の間隙または管
腔、気管、皮膚、筋肉、脳、肝臓、心臓、脾臓、骨髄、
胸腺、膀胱、リンパ系、血液、膵臓、胃、腎臓、卵巣、
精巣、直腸、末梢または中枢神経系、眼、リンパ様器
官、軟骨、または内皮にイン・ビボで適用することがで
きる。好ましい態様では、細胞は筋肉細胞、造血系幹細
胞、または気道細胞であり、更に具体的には気管または
肺細胞であり、好ましくは気道上皮の細胞である。
胞および真核細胞、酵母細胞、植物細胞、一間他は動物
細胞、特に哺乳類細胞が挙げられる。特に、癌細胞を挙
げるべきである。本発明は、肺の組織の間隙または管
腔、気管、皮膚、筋肉、脳、肝臓、心臓、脾臓、骨髄、
胸腺、膀胱、リンパ系、血液、膵臓、胃、腎臓、卵巣、
精巣、直腸、末梢または中枢神経系、眼、リンパ様器
官、軟骨、または内皮にイン・ビボで適用することがで
きる。好ましい態様では、細胞は筋肉細胞、造血系幹細
胞、または気道細胞であり、更に具体的には気管または
肺細胞であり、好ましくは気道上皮の細胞である。
【００４３】本発明は、核酸を細胞中に移行させる方法
であって、この細胞を少なくとも１種類の本発明による
複合体または組成物と接触させることを含んでなる方法
も包含する。この方法は、イン・ビボではこの複合体ま
たは組成物を動物の細胞に直接投与することによって、
または動物から回収した細胞をイン・ビトロ処理した
後、動物体に再導入することによって（エクス・ビボ法
(ex vivo process)）適用することができる。イン・ビ
トロ用途では、適当な培地で培養した細胞を本発明の複
合体または組成物からなる懸濁液と接触させる。インキ
ュベーション期間の後、細胞を洗浄して回収する。活性
物質の導入は、任意の適当な方法によって（最終的には
細胞をリーシスした後に）明らかにすることができる。
であって、この細胞を少なくとも１種類の本発明による
複合体または組成物と接触させることを含んでなる方法
も包含する。この方法は、イン・ビボではこの複合体ま
たは組成物を動物の細胞に直接投与することによって、
または動物から回収した細胞をイン・ビトロ処理した
後、動物体に再導入することによって（エクス・ビボ法
(ex vivo process)）適用することができる。イン・ビ
トロ用途では、適当な培地で培養した細胞を本発明の複
合体または組成物からなる懸濁液と接触させる。インキ
ュベーション期間の後、細胞を洗浄して回収する。活性
物質の導入は、任意の適当な方法によって（最終的には
細胞をリーシスした後に）明らかにすることができる。
【００４４】本発明によるイン・ビボ処理の場合には、
トランスフェクション速度を向上させるため、患者は、
上記の医薬製剤を投与する前にマクロファージ除去処理
を行うことができる。このような手法は、文献に記載さ
れている（特に、Van Rooijen et al., 1997, TibTech,
15, 178-184を参照されたい）。
トランスフェクション速度を向上させるため、患者は、
上記の医薬製剤を投与する前にマクロファージ除去処理
を行うことができる。このような手法は、文献に記載さ
れている（特に、Van Rooijen et al., 1997, TibTech,
15, 178-184を参照されたい）。
【００４５】本発明は、ヒトまたは動物の治療、予防ま
たはワクチン治療のための医薬組成物の製造、および更
に具体的には遺伝子治療での使用のための上記複合体の
使用にも関する。
たはワクチン治療のための医薬組成物の製造、および更
に具体的には遺伝子治療での使用のための上記複合体の
使用にも関する。
【００４６】本発明は、目的とするアニオン性物質を細
胞中へ移行させるための複合体を製造するための、Ｃ１
補体因子のサブユニット、特にＣ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ
１ｓに相当する少なくとも１個のアミノ酸配列の全部ま
たは一部の使用にも関する。好ましい態様によれば、上
記アミノ配列は、Ｃ１ｑサブユニットのＣ１ｑＡ、Ｃ１
ｑＢおよびＣ１ｑＣアミノ酸配列からなる群、更に具体
的には上記のものから選択される。
胞中へ移行させるための複合体を製造するための、Ｃ１
補体因子のサブユニット、特にＣ１ｑ、Ｃ１ｒおよびＣ
１ｓに相当する少なくとも１個のアミノ酸配列の全部ま
たは一部の使用にも関する。好ましい態様によれば、上
記アミノ配列は、Ｃ１ｑサブユニットのＣ１ｑＡ、Ｃ１
ｑＢおよびＣ１ｑＣアミノ酸配列からなる群、更に具体
的には上記のものから選択される。
【００４７】これらおよび他の態様は、本発明の説明お
よび実施例によって開示され、明らかにされ、かつ包含
される。本発明によって用いられる方法、使用および化
合物の任意の１つに関する他の文献は、例えば電子装置
を用いて公共図書館から検索することができる。例え
ば、公共のデーターベース「Medicine」を利用すること
ができ、これは、インターネットで、例えばhttp://ww
w.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlで利用可能で
ある。さらに、http://www.ncbi.nlm.nih.gov, http://
www.infobiogen.fr., http://www.fmi.ch/biology/rese
arch tools.html,http://www.tigr.orgのような他のデ
ーターベースおよびアドレスは当業者に知られており、
また、例えばhttp://www.lycos.comを用いて得ることも
できる。バイオテクノロジーにおける特許情報の総説お
よび過去の検索および現在の知見について有用な特許情
報の関連供給源の概説は、Berks, TIBTECH, 12 (1994),
352-364に記載されている。
よび実施例によって開示され、明らかにされ、かつ包含
される。本発明によって用いられる方法、使用および化
合物の任意の１つに関する他の文献は、例えば電子装置
を用いて公共図書館から検索することができる。例え
ば、公共のデーターベース「Medicine」を利用すること
ができ、これは、インターネットで、例えばhttp://ww
w.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/medline.htmlで利用可能で
ある。さらに、http://www.ncbi.nlm.nih.gov, http://
www.infobiogen.fr., http://www.fmi.ch/biology/rese
arch tools.html,http://www.tigr.orgのような他のデ
ーターベースおよびアドレスは当業者に知られており、
また、例えばhttp://www.lycos.comを用いて得ることも
できる。バイオテクノロジーにおける特許情報の総説お
よび過去の検索および現在の知見について有用な特許情
報の関連供給源の概説は、Berks, TIBTECH, 12 (1994),
352-364に記載されている。
【００４８】本発明の方法、組成物および使用は、治療
および／または診断が核酸の細胞中への移行に関連また
は依存しているあらゆる種類の疾患の治療に適用するこ
とができる。本発明の組成物および使用は、ヒトで好ま
しく用いることができるが、動物の治療も本発明に記載
の使用によって包含される。
および／または診断が核酸の細胞中への移行に関連また
は依存しているあらゆる種類の疾患の治療に適用するこ
とができる。本発明の組成物および使用は、ヒトで好ま
しく用いることができるが、動物の治療も本発明に記載
の使用によって包含される。
【００４９】本発明を例示的に記載してきたが、用いら
れてきた用語は、単語の本質が限定的なものであるより
はむしろ説明的なものとしようとすることを理解すべき
である。本発明の多くの改質および変更が、上記の教示
の観点から可能であることは明らかである。従って、特
許請求の範囲内において、本発明において具体的に記載
されているものとは異なって実施することができること
を理解すべきである。上記の論文または文献の内容は、
その開示の一部として本明細書に引用される。
れてきた用語は、単語の本質が限定的なものであるより
はむしろ説明的なものとしようとすることを理解すべき
である。本発明の多くの改質および変更が、上記の教示
の観点から可能であることは明らかである。従って、特
許請求の範囲内において、本発明において具体的に記載
されているものとは異なって実施することができること
を理解すべきである。上記の論文または文献の内容は、
その開示の一部として本明細書に引用される。
【００５０】図１： ルシフェラーゼコード遺伝子の発
現レベル（ＲＬＵ／mgタンパク質）： ２９３ＥＢＮＡ
１細胞中にＣ１ｑＡまたはＫ８およびプラスミドｐＴＧ
１１０３３を含んでなる複合体のトランスフェクション
効率の比較。図２ ： ルシフェラーゼコード遺伝子の発現レベル（Ｒ
ＬＵ／mgタンパク質）： ２９３ＥＢＮＡ１細胞中にプ
ラスミドｐＴＧ１１０３３およびＣ１ｑＡ−Ｐ３を含ん
でなる複合体のトランスフェクション効率。
現レベル（ＲＬＵ／mgタンパク質）： ２９３ＥＢＮＡ
１細胞中にＣ１ｑＡまたはＫ８およびプラスミドｐＴＧ
１１０３３を含んでなる複合体のトランスフェクション
効率の比較。図２ ： ルシフェラーゼコード遺伝子の発現レベル（Ｒ
ＬＵ／mgタンパク質）： ２９３ＥＢＮＡ１細胞中にプ
ラスミドｐＴＧ１１０３３およびＣ１ｑＡ−Ｐ３を含ん
でなる複合体のトランスフェクション効率。
【００５１】
【実施例】細胞 ２９３ＥＢＮＡ細胞(Invitrogen)を、３７℃および５％
ＣＯ２でインキュベター中１０％ウシ胎児血清、１％ゲ
ンタマイシン、１％グルタミン、２５０μｇ／mlのＧ４
１８および３ｇ／ｌのグルコースを補足したＤＭＥＭ培
地で培養する。トランスフェクションの２４時間前に、
細胞を２．５×１０５個／細胞の濃度で６マルチウェル
プレートに播種する。
ＣＯ２でインキュベター中１０％ウシ胎児血清、１％ゲ
ンタマイシン、１％グルタミン、２５０μｇ／mlのＧ４
１８および３ｇ／ｌのグルコースを補足したＤＭＥＭ培
地で培養する。トランスフェクションの２４時間前に、
細胞を２．５×１０５個／細胞の濃度で６マルチウェル
プレートに播種する。
【００５２】HeLaを、３７℃および５％ＣＯ２でインキ
ュベター中１０％ウシ胎児血清、１％ゲンタマイシン、
１％グルタミンおよび３ｇ／ｌのグルコースを補足した
ＤＭＥＭ培地で培養する。トランスフェクションの２４
時間前に、細胞を２．５×１０５個／細胞の濃度で６マ
ルチウェルプレートに播種する。
ュベター中１０％ウシ胎児血清、１％ゲンタマイシン、
１％グルタミンおよび３ｇ／ｌのグルコースを補足した
ＤＭＥＭ培地で培養する。トランスフェクションの２４
時間前に、細胞を２．５×１０５個／細胞の濃度で６マ
ルチウェルプレートに播種する。
【００５３】プラスミド ＣＭＶプロモーターの制御下に置いたルシフェラーゼを
コードする遺伝子、ＨＭＧ遺伝子のイントロン１および
ＳＶ４０ポリＡシグナルを含むプラスミドｐＴＧ１１０
５６(Laengle-Rouaulrotal, J. of Virology, 72 (199
8), 6181-6185)を用いる。
コードする遺伝子、ＨＭＧ遺伝子のイントロン１および
ＳＶ４０ポリＡシグナルを含むプラスミドｐＴＧ１１０
５６(Laengle-Rouaulrotal, J. of Virology, 72 (199
8), 6181-6185)を用いる。
【００５４】ポリペプチド ポリペプチドは、milliQ水溶液をALTERGENから購入し
た。
た。
【００５５】実施例１： ポリペプチド／ＤＮＡ複合体
の調製およびトランスフェクションのプロトコール ポリペプチド／ＤＮＡ複合体は、下記のようにして調製
する。プラスミドＤＮＡ３μｇおよび所望量の試験ポリ
ペプチド（電荷比＝１：４）を７５０μlの１０％スク
ロースまたは５％グルコースまたは除タンパクした血清
溶液中で混合し、攪拌する。室温にて３０分間インキュ
ベーションした後、複合体を細胞に加える。
の調製およびトランスフェクションのプロトコール ポリペプチド／ＤＮＡ複合体は、下記のようにして調製
する。プラスミドＤＮＡ３μｇおよび所望量の試験ポリ
ペプチド（電荷比＝１：４）を７５０μlの１０％スク
ロースまたは５％グルコースまたは除タンパクした血清
溶液中で混合し、攪拌する。室温にて３０分間インキュ
ベーションした後、複合体を細胞に加える。
【００５６】トランスフェクション複合体を加える前
に、培地（ＤＭＥＭ，GIBCO BRL）を除去し、無血清培
地２mlおよび複合体溶液７５０μlに置き換える。２４
時間後、培地を除き、リーシス緩衝液(Promega)２５０
μlを加え、ルシフェラーゼ活性を測定するまで細胞を
−８０℃で凍結する。
に、培地（ＤＭＥＭ，GIBCO BRL）を除去し、無血清培
地２mlおよび複合体溶液７５０μlに置き換える。２４
時間後、培地を除き、リーシス緩衝液(Promega)２５０
μlを加え、ルシフェラーゼ活性を測定するまで細胞を
−８０℃で凍結する。
【００５７】上清２０μlを、ルシフェラーゼ分析シス
テム(Promega)を用いて９６マルチウェルプレート(Biol
umat LB 9500, Berthold, Wilbach, ドイツ）で分析す
る。それぞれのトランスフェクションは、３回ずつ行
う。値は、平均相対光単位（ＲＬＵ）／mg細胞タンパク
質(BCA assay, Pierce)として示す。測定するルシフェ
ラーゼ活性を、市販ルシフェラーゼ(Promega)を用いて
得られる標準的尺度を用いてタンパク質の量に対して標
準化する。総タンパク質の量も、上清の一部を用いてビ
シンコニン酸（ＢＣＡ）比色定量法(Smith, Anal. Bioc
hem., 150 (1985),76-85)によって測定する。これによ
り、ルシフェラーゼ活性を細胞から抽出したタンパク質
１mg当たりのＲＬＵで表すことができる。
テム(Promega)を用いて９６マルチウェルプレート(Biol
umat LB 9500, Berthold, Wilbach, ドイツ）で分析す
る。それぞれのトランスフェクションは、３回ずつ行
う。値は、平均相対光単位（ＲＬＵ）／mg細胞タンパク
質(BCA assay, Pierce)として示す。測定するルシフェ
ラーゼ活性を、市販ルシフェラーゼ(Promega)を用いて
得られる標準的尺度を用いてタンパク質の量に対して標
準化する。総タンパク質の量も、上清の一部を用いてビ
シンコニン酸（ＢＣＡ）比色定量法(Smith, Anal. Bioc
hem., 150 (1985),76-85)によって測定する。これによ
り、ルシフェラーゼ活性を細胞から抽出したタンパク質
１mg当たりのＲＬＵで表すことができる。
【００５８】結果を図１および２に示す。図１は、ポリ
ペプチドＣ１ｑＡを含んでなる複合体と比較したポリペ
プチドＫ８を含んでなる複合体のトランスフェクション
効率を示す。Ｋ８は、１０個のリシン残基を含んでなる
合成ポリリシン鎖（配列番号５）である。Ｃ１ｑＡは、
配列番号１からなる合成ポリペプチドである。Ｋ８−Ｄ
ＮＡおよびＣ１ｑＡ−ＤＮＡ複合体は、上記の方法によ
って形成される。ＤＮＡ単独を、対照物として用いる。
この実験では、Ｃ１ｑＡ−ＤＮＡ複合体は、上記ＤＮＡ
を２９３ＥＢＮＡ１細胞へ移行させるためのＫ８−ＤＮ
Ａ複合体と少なくとも同程度の効率であることを明らか
に示している。
ペプチドＣ１ｑＡを含んでなる複合体と比較したポリペ
プチドＫ８を含んでなる複合体のトランスフェクション
効率を示す。Ｋ８は、１０個のリシン残基を含んでなる
合成ポリリシン鎖（配列番号５）である。Ｃ１ｑＡは、
配列番号１からなる合成ポリペプチドである。Ｋ８−Ｄ
ＮＡおよびＣ１ｑＡ−ＤＮＡ複合体は、上記の方法によ
って形成される。ＤＮＡ単独を、対照物として用いる。
この実験では、Ｃ１ｑＡ−ＤＮＡ複合体は、上記ＤＮＡ
を２９３ＥＢＮＡ１細胞へ移行させるためのＫ８−ＤＮ
Ａ複合体と少なくとも同程度の効率であることを明らか
に示している。
【００５９】図２は、第一のポリペプチドＣ１ｑＡおよ
び第二のポリペプチドＰ３（配列番号６ Avrameas et
al., 1998, 上記）を含んでなる複合体のトランスフェ
クション効率を示す。ポリペプチドＣ１ｑＡ−Ｐ３は、
Altergen (Schiltigheim, フランス）から入手した。Ｃ
１ｑＡのＮ末端は、ペプチド結合によってＰ３のＣ末端
に会合している。ＤＮＡ−Ｃ１ｑＡ−Ｐ３複合体は、上
記と同様の方法によって形成され、その移行特性をＰ３
（配列番号６）のみを含んでなる複合体の特性と比較す
る。観察された結果は、ＤＮＡとの複合体における上記
の第一（Ｃ１ｑＡ）および第二（Ｐ３）のポリペプチド
の組合せは、この複合体のトランスフェクション特性を
著しく向上させることを明らかに示している。
び第二のポリペプチドＰ３（配列番号６ Avrameas et
al., 1998, 上記）を含んでなる複合体のトランスフェ
クション効率を示す。ポリペプチドＣ１ｑＡ−Ｐ３は、
Altergen (Schiltigheim, フランス）から入手した。Ｃ
１ｑＡのＮ末端は、ペプチド結合によってＰ３のＣ末端
に会合している。ＤＮＡ−Ｃ１ｑＡ−Ｐ３複合体は、上
記と同様の方法によって形成され、その移行特性をＰ３
（配列番号６）のみを含んでなる複合体の特性と比較す
る。観察された結果は、ＤＮＡとの複合体における上記
の第一（Ｃ１ｑＡ）および第二（Ｐ３）のポリペプチド
の組合せは、この複合体のトランスフェクション特性を
著しく向上させることを明らかに示している。
【００６０】更に、様々な電荷比を試験したところ、最
適トランスフェクションは、正／負電荷の比が４〜１０
の場合に得られることを示している。
適トランスフェクションは、正／負電荷の比が４〜１０
の場合に得られることを示している。
【００６１】実施例２： ペプチドＣ１ｑＡ（４〜２
６）（配列番号１）とプラスミドｐＴＧ１１０３３との
相互作用が、アガロースゲル上での電気泳動の後に示さ
れた。ゲルシフト分析法を、Ｃ１ｑＡ（４〜２６）（配
列番号１）を用いて、幾つかのＰＢＳ、ＴＢＳ、５％グ
ルコースまたは限外濾過した血清（YM10 Amicon膜）の
緩衝液で行った。ＤＮＡおよびペプチドを、［１：
４］、［１：１］および［１：０．２］の電荷比［−／
＋］で混合した。［１：４］の電荷比では、ゲル電気泳
動（０．８％アガロース，ＴＢＥ）の後に、いずれの場
合にも、臭化エチジウムの存在下での可視バンドの不在
を特徴とするＤＮＡのペプチドへの強力な会合が生じる
と思われた。［１：１］の電荷比については、ＤＮＡに
よる複合体形成しないプラスミドで有意な遅延が示され
た。
６）（配列番号１）とプラスミドｐＴＧ１１０３３との
相互作用が、アガロースゲル上での電気泳動の後に示さ
れた。ゲルシフト分析法を、Ｃ１ｑＡ（４〜２６）（配
列番号１）を用いて、幾つかのＰＢＳ、ＴＢＳ、５％グ
ルコースまたは限外濾過した血清（YM10 Amicon膜）の
緩衝液で行った。ＤＮＡおよびペプチドを、［１：
４］、［１：１］および［１：０．２］の電荷比［−／
＋］で混合した。［１：４］の電荷比では、ゲル電気泳
動（０．８％アガロース，ＴＢＥ）の後に、いずれの場
合にも、臭化エチジウムの存在下での可視バンドの不在
を特徴とするＤＮＡのペプチドへの強力な会合が生じる
と思われた。［１：１］の電荷比については、ＤＮＡに
よる複合体形成しないプラスミドで有意な遅延が示され
た。
【００６２】実施例３： 複合体の大きさを光散乱によ
って評価した。プラスミドＤＮＡ（ＰＴＧ１１０３３；
ＥＰ−Ａ−８９０３２号明細書参照，９．６ｋｂ）およ
びＣ１ｑＡ（４〜２６）ペプチド（配列番号１，表１参
照）を用いて調製した複合体の大きさを評価した。複合
体は、５％グルコースまたは限外濾過したウシ胎児血清
（YM10 Amicon膜）中で処方した。処方物を、６μｇの
ＤＮＡおよび［１：４］の［−／＋］複合体を形成する
のに必要なペプチドの量を用いて５００μl緩衝液とし
た。対照物として、ポリリシンＳＶ４０ ＮＬＳペプチ
ドを用いた。（配列： Ｈ２Ｎ−ｂｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ）。大きさの測定（表１参照）
では、５％グルコースと比較して限外濾過した血清中で
Ｃ１ｑＡペプチドの使用に有利であることが示された。
酸化すると、二量体化したＣ１ｑＡペプチドは、この処
方物緩衝液を用いる限り更に小さな複合体を形成するこ
ともできた。限外濾過した血清中でＣ１ｑＡペプチドを
用いて得られる合理的な大きさは、ポリリシン誘導体よ
りもこのペプチドを用いるのに有利である。
って評価した。プラスミドＤＮＡ（ＰＴＧ１１０３３；
ＥＰ−Ａ−８９０３２号明細書参照，９．６ｋｂ）およ
びＣ１ｑＡ（４〜２６）ペプチド（配列番号１，表１参
照）を用いて調製した複合体の大きさを評価した。複合
体は、５％グルコースまたは限外濾過したウシ胎児血清
（YM10 Amicon膜）中で処方した。処方物を、６μｇの
ＤＮＡおよび［１：４］の［−／＋］複合体を形成する
のに必要なペプチドの量を用いて５００μl緩衝液とし
た。対照物として、ポリリシンＳＶ４０ ＮＬＳペプチ
ドを用いた。（配列： Ｈ２Ｎ−ｂｉｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙ
ｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−
Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｌ
ｙｓ−Ｖａｌ−ＣＯＯＨ）。大きさの測定（表１参照）
では、５％グルコースと比較して限外濾過した血清中で
Ｃ１ｑＡペプチドの使用に有利であることが示された。
酸化すると、二量体化したＣ１ｑＡペプチドは、この処
方物緩衝液を用いる限り更に小さな複合体を形成するこ
ともできた。限外濾過した血清中でＣ１ｑＡペプチドを
用いて得られる合理的な大きさは、ポリリシン誘導体よ
りもこのペプチドを用いるのに有利である。
【００６３】
【表１】
【００６４】実施例４： ペプチド配列番号１、配列番
号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号
９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列
番号１３とプラスミドｐＴＧ１１２３６との相互作用
を、アガロースゲル上での電気泳 動の後に示した。ゲル
シフト分析を、ペプチド配列番号１、配列番号２、配列
番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番
号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号
１３を用いて、５％グルコース、６％Elohes (Freseniu
m Kabi)および限外濾過した血清（YM10 Amicon膜）の各
種培地中で行った。技術的条件は、実施例２と同様であ
る。ＤＮＡおよびペプチドを、下記の電荷比Ｎ／Ｐに相
当するＤＮＡ１μｇ当たりペプチド０．３６、１．４
４、および１．８ナノモルで混合した。
号２、配列番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号
９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列
番号１３とプラスミドｐＴＧ１１２３６との相互作用
を、アガロースゲル上での電気泳 動の後に示した。ゲル
シフト分析を、ペプチド配列番号１、配列番号２、配列
番号３、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番
号１０、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号
１３を用いて、５％グルコース、６％Elohes (Freseniu
m Kabi)および限外濾過した血清（YM10 Amicon膜）の各
種培地中で行った。技術的条件は、実施例２と同様であ
る。ＤＮＡおよびペプチドを、下記の電荷比Ｎ／Ｐに相
当するＤＮＡ１μｇ当たりペプチド０．３６、１．４
４、および１．８ナノモルで混合した。
【００６５】
【表２】
【００６６】これらの結果は、試験したペプチドが、ゲ
ル電気泳動の後にＤＮＡに穴個う゛することができ、プ
ラスミドＤＮＡの部分的または完全な遅延を生じること
を明らかに示している。更に具体的には、配列番号１お
よび配列番号３は、ＤＮＡ１μｇ当たりペプチド１．４
４ナノモル〜１．８ナノモルで、プラスミドＤＮＡ複合
体は完全に遅延する。
ル電気泳動の後にＤＮＡに穴個う゛することができ、プ
ラスミドＤＮＡの部分的または完全な遅延を生じること
を明らかに示している。更に具体的には、配列番号１お
よび配列番号３は、ＤＮＡ１μｇ当たりペプチド１．４
４ナノモル〜１．８ナノモルで、プラスミドＤＮＡ複合
体は完全に遅延する。
【００６７】実施例５： 核局在化ペプチド（配列番号
１４）の付加によって改質された配列番号１を含んでな
る複合体（生成するペプチドを配列番号１−配列番号１
４と命名する）とＪＴＳ１フソゲニックペプチド（配列
番号４）のトランスフェクショ ン効率をHeLaおよび２９
３ＥＢＮＡ−１細胞で評価した。
１４）の付加によって改質された配列番号１を含んでな
る複合体（生成するペプチドを配列番号１−配列番号１
４と命名する）とＪＴＳ１フソゲニックペプチド（配列
番号４）のトランスフェクショ ン効率をHeLaおよび２９
３ＥＢＮＡ−１細胞で評価した。
【００６８】本発明による特殊なペプチドを、Ｃ１ｑＡ
ペプチドのＤＮＡ複合体形成特性とＮＬＳペプチドの核
局在化特性を組合わせることによって合成した。配列番
号１−配列番号１４と命名された生成するペプチドは、
配列番号１のＣ末端を配列番号１４のＮ末端にペプチド
結合によって会合することによってAltergen (Schiltig
eim, フランス）から入手する。
ペプチドのＤＮＡ複合体形成特性とＮＬＳペプチドの核
局在化特性を組合わせることによって合成した。配列番
号１−配列番号１４と命名された生成するペプチドは、
配列番号１のＣ末端を配列番号１４のＮ末端にペプチド
結合によって会合することによってAltergen (Schiltig
eim, フランス）から入手する。
【００６９】特殊なペプチドを、下記の方法でＤＮＡと
複合体形成した。１０μｇのプラスミドＤＮＡと試験ペ
プチド（Ｎ／Ｐ＝４／１）の所望量を、１ｍｌの５％グ
ルコース中で混合し、攪拌する。
複合体形成した。１０μｇのプラスミドＤＮＡと試験ペ
プチド（Ｎ／Ｐ＝４／１）の所望量を、１ｍｌの５％グ
ルコース中で混合し、攪拌する。
【００７０】トランスフェクション分析には、この特殊
なペプチドを、膜溶解性ペプチド(membranolytic pepti
de)、すなわちＪＴＳ１（配列番号４）と組合わせるこ
とによって試験した。これに関して、攪拌調製物を室温
で３０分間インキュベーションした後、所望量の配列番
号４を加えて、最終的にＮ／Ｐ＝２／１とする。
なペプチドを、膜溶解性ペプチド(membranolytic pepti
de)、すなわちＪＴＳ１（配列番号４）と組合わせるこ
とによって試験した。これに関して、攪拌調製物を室温
で３０分間インキュベーションした後、所望量の配列番
号４を加えて、最終的にＮ／Ｐ＝２／１とする。
【００７１】最後に、複合体を室温で３０分間インキュ
ベーションした後、実施例１で開示した方法で細胞上で
試験する。トランスフェクションは、６ウェルプレート
または２４ウェルプレートで行った。
ベーションした後、実施例１で開示した方法で細胞上で
試験する。トランスフェクションは、６ウェルプレート
または２４ウェルプレートで行った。
【００７２】結果は、ＮＬＳペプチドをＣ１ｑＡペプチ
ドに付加することによって、トランスフェクション効率
が向上することを示している。更に、ゲルシフト分析お
よび光散乱分析により、ＤＮＡがＮＬＳおよびＣ１ｑＡ
特性を併せ持つ上記ペプチドと効率的に複合体形成する
ことができることが確認された。
ドに付加することによって、トランスフェクション効率
が向上することを示している。更に、ゲルシフト分析お
よび光散乱分析により、ＤＮＡがＮＬＳおよびＣ１ｑＡ
特性を併せ持つ上記ペプチドと効率的に複合体形成する
ことができることが確認された。
【００７３】実施例６： ＪＴＳ１フソゲニックペプチ
ド（配列番号４）の付加によって改質したペプチド配列
番号１に相当する特殊ペプチドの分析（生成するペプチ
ドは配列番号４−配列番号１と命名される）。本発明の
特殊ペプチドを、Ｃ１ｑＡペプチドのＤＮＡ複合体形成
特性をＪＴＳ１ペプチドのフソゲニック特性と組合わせ
ることによって合成した。上記の配列番号４−配列番号
１ポリペプチドは、配列番号４のＣ末端を配列番号１の
Ｎ末端にペプチド結合によって会合させることによって
Altergen (Schiltigheim, フランス）から入手した。ゲ
ルシフト分析は、ペプチド配列番号４−配列番号１を用
いて５％グルコース中で行った。プラスミドｐＴＧ１１
０３３ ４００ngを、ペプチド配列番号４−配列番号１
の増加量と混合した。ゲルの遅延は、ペプチド０．９μ
ｇの添加で観察され、ペプチド３．３μｇの添加の後に
は完全となる。
ド（配列番号４）の付加によって改質したペプチド配列
番号１に相当する特殊ペプチドの分析（生成するペプチ
ドは配列番号４−配列番号１と命名される）。本発明の
特殊ペプチドを、Ｃ１ｑＡペプチドのＤＮＡ複合体形成
特性をＪＴＳ１ペプチドのフソゲニック特性と組合わせ
ることによって合成した。上記の配列番号４−配列番号
１ポリペプチドは、配列番号４のＣ末端を配列番号１の
Ｎ末端にペプチド結合によって会合させることによって
Altergen (Schiltigheim, フランス）から入手した。ゲ
ルシフト分析は、ペプチド配列番号４−配列番号１を用
いて５％グルコース中で行った。プラスミドｐＴＧ１１
０３３ ４００ngを、ペプチド配列番号４−配列番号１
の増加量と混合した。ゲルの遅延は、ペプチド０．９μ
ｇの添加で観察され、ペプチド３．３μｇの添加の後に
は完全となる。
【００７４】実施例７： 配列番号４−配列番号１のフ
ソゲニック活性をリポソーム開裂分析によって測定し
た。リポソーム開裂分析は、配列番号４−配列番号１ペ
プチドを用いて、Planck et al. (1994, J. Biol. Che
m., 269, 12918-12924)に前記した方法で行う。Triton
X-100でリーシスを行うと、カルセイン放出が正の制御
を受けるが、水を加えると負の制御を受ける。リポソー
ムに水またはTriton X-100を加えることによって測定し
た蛍光値は、１０倍だけ異なる。本発明のペプチドを２
×１０５〜０．１pgペプチド／μlの濃度範囲で試験し
た。結果は、ペプチド配列番号４−配列番号１は、４・
１０４〜８・１０３pgペプチド／μlの範囲のペプチド
濃度でｐＨ５およびｐＨ７では５０％リーシスを生じる
ことを示している。この結果は、ペプチド配列番号４−
配列番号１はＪＴＳ１フソゲニック活性を示すことを示
唆している。
ソゲニック活性をリポソーム開裂分析によって測定し
た。リポソーム開裂分析は、配列番号４−配列番号１ペ
プチドを用いて、Planck et al. (1994, J. Biol. Che
m., 269, 12918-12924)に前記した方法で行う。Triton
X-100でリーシスを行うと、カルセイン放出が正の制御
を受けるが、水を加えると負の制御を受ける。リポソー
ムに水またはTriton X-100を加えることによって測定し
た蛍光値は、１０倍だけ異なる。本発明のペプチドを２
×１０５〜０．１pgペプチド／μlの濃度範囲で試験し
た。結果は、ペプチド配列番号４−配列番号１は、４・
１０４〜８・１０３pgペプチド／μlの範囲のペプチド
濃度でｐＨ５およびｐＨ７では５０％リーシスを生じる
ことを示している。この結果は、ペプチド配列番号４−
配列番号１はＪＴＳ１フソゲニック活性を示すことを示
唆している。
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> TRANSGENE SA <120> Antitumoral complexes <130> Antitumoral complexes <140> <141> <160> 15 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 23 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys Lys Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys 20 <210> 2 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Gly Arg Pro Gly Arg Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys 1 5 10 <210> 3 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Ile Lys Gly Thr Lys Gly Ser Pro Gly Asn Ile Lys Asp Gln Pro 1 5 10 15 Arg <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Leu Phe Glu Ala Leu Leu Glu Leu Leu Glu Ser Leu Trp Glu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Glu Ala 20 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Tyr Lys Ala Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Lys Trp Lys 1 5 10 <210> 6 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Ala Tyr Ile Ser Arg Gly Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ser Asp Thr 1 5 10 15 Val Lys Gly Arg Phe Thr Arg Gln Lys Tyr Asn Lys Arg Ala 20 25 30 <210> 7 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Asp Leu Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys Lys Gly Glu Ala Gly Arg 1 5 10 15 Pro Gly Arg Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys 20 25 <210> 8 <211> 24 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Leu Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys Lys Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly 1 5 10 15 Arg Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys 20 <210> 9 <211> 26 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys Lys Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys Gly Glu Gln 20 25 <210> 10 <211> 29 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys Lys Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys Gly Glu Gln Gly Glu Pro 20 25 <210> 11 <211> 32 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys Lys Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys Gly Glu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Pro 20 25 30 <210> 12 <211> 35 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys Lys Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys Gly Glu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Pro 20 25 30 Gly Ile Arg 35 <210> 13 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Cys Arg Ala Pro Asp Gly Lys Lys Gly Glu Ala Gly Arg Pro Gly Arg 1 5 10 15 Arg Gly Arg Pro Gly Leu Lys Gly Glu Gln Gly Glu Pro Gly Ala Pro 20 25 30 Gly Ile Arg Thr Gly Ile 35 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Pro Lys Lys Lys Arg Lys Glu Val Asp 1 5 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Gly Ala Leu Phe Leu Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly 1 5 10 15
【図１】ルシフェラーゼコード遺伝子の発現レベル（Ｒ
ＬＵ／mgタンパク質）： ２９３ＥＢＮＡ１細胞中にＣ
１ｑＡまたはＫ８およびプラスミドｐＴＧ１１０３３を
含んでなる複合体のトランスフェクション効率の比較。
ＬＵ／mgタンパク質）： ２９３ＥＢＮＡ１細胞中にＣ
１ｑＡまたはＫ８およびプラスミドｐＴＧ１１０３３を
含んでなる複合体のトランスフェクション効率の比較。
【図２】ルシフェラーゼコード遺伝子の発現レベル（Ｒ
ＬＵ／mgタンパク質）： ２９３ＥＢＮＡ１細胞中にプ
ラスミドｐＴＧ１１０３３およびＣ１ｑＡ−Ｐ３を含ん
でなる複合体のトランスフェクション効率。
ＬＵ／mgタンパク質）： ２９３ＥＢＮＡ１細胞中にプ
ラスミドｐＴＧ１１０３３およびＣ１ｑＡ−Ｐ３を含ん
でなる複合体のトランスフェクション効率。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ０７Ｋ 14/46 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ドミニク、ボーティエ フランス国ストラスブール、リュ、デ、シ ャノワーヌ、リックス、11
Claims (18)
- 【請求項１】(i) アニオン性物質に結合することがで
きる少なくとも１種類の第一のポリペプチド、および
（ii）目的とするアニオン性物質、を含んでなる、目的
とするアニオン性物質を細胞中に送達するための複合体
であって、 前記の第一のポリペプチドがＣ１補体因子のサブユニッ
トアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列
の全部または一部を含んでなる、前記複合体。 - 【請求項２】前記アミノ酸配列が、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒおよ
びＣ１ｓアミノ酸配列サブユニットからなる群から選択
される、請求項１に記載の複合体。 - 【請求項３】前記アミノ酸配列が、Ｃ１ｑサブユニット
のＣ１ｑＡ、Ｃ１ｑＢおよびＣ１ｑＣアミノ酸配列から
なる群から選択される、請求項２に記載の複合体。 - 【請求項４】前記アミノ酸配列が、配列番号１〜配列番
号１３に記載のアミノ酸配列からなる群から選択され
る、請求項３に記載の複合体。 - 【請求項５】複合体が、 (i) 細胞特異的ターゲッティングおよび／または膜不
安定化に関与し、および／または、目的とするアニオン
性物質の細胞中への送達を促進する、少なくとも１種類
の第二のポリペプチド、および／または（ii）カチオン
性脂質およびカチオン性ポリマーからなる群から選択さ
れる少なくとも１種類のカチオン性化合物、および／ま
たは（iii） 少なくとも１種類の負に帯電した、中性
のまたは双性イオン性の脂質、をさらに含んでなる、請
求項１〜４のいずれか一項に記載の複合体。 - 【請求項６】前記の第二のポリペプチドが、配列番号
４、配列番号５または配列番号６、配列番号１４または
配列番号１５に記載のアミノ酸配列の全部または一部を
含んでなる、請求項５に記載の複合体。 - 【請求項７】目的とする前記アニオン性物質が核酸また
はタンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記
載の複合体。 - 【請求項８】目的とする前記アニオン性物質が、ｃＤＮ
Ａ、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、メッセンジャー
ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、トランスフ
ァーＲＮＡ、リボソームＲＮＡおよびこれらの種類のＲ
ＮＡをコードするＤＮＡからなる群から選択される核酸
である、請求項７に記載の複合体。 - 【請求項９】前記核酸が、少なくとも１種類の治療上有
用な遺伝子配列およびそれを発現させることができる要
素を包含する、請求項８に記載の複合体。 - 【請求項１０】複合体の大きさが５００nm未満である、
請求項１〜９のいずれか一項に記載の複合体。 - 【請求項１１】複合体の大きさが２０〜１００nmであ
る、請求項１０に記載の複合体。 - 【請求項１２】正電荷の数と負電荷の数との比が、０．
０５〜２０であり、好ましくは２．５〜１５であり、最
も好ましくは約４〜１０．０である、請求項１〜１１の
いずれか一項に記載の複合体。 - 【請求項１３】アニオン性物質に結合することができ、
かつＣ１補体因子のサブユニットアミノ酸配列からなる
群から選択されるアミノ酸配列の全部または一部を含ん
でなる少なくとも１種類の第一のポリペプチドを、目的
とする少なくとも１種類のアニオン性物質と接触させ、 必要に応じて、精製工程の後に、前記複合体を回収する
工程を含んでなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記
載の複合体の製造法。 - 【請求項１４】最初に前記の第一のポリペプチドを、前
記追加要素(i)および／または（ii）および／または（i
ii）と混合した後、目的とするアニオン性物質と複合体
を形成させる工程、または最初に前記の第一のポリペプ
チドを、目的とするアニオン性物質と複合体を形成させ
た後、この複合体を前記追加要素(i)および／または（i
i）および／または（iii）と混合する工程、を含んでな
る、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の複合体の製
造法。 - 【請求項１５】請求項１〜１２のいずれか一項に記載の
複合体を少なくとも１個含んでなる、目的とするアニオ
ン性物質を細胞に送達するための医薬組成物。 - 【請求項１６】少なくとも１種類のアジュバントをさら
に含んでなる、請求項１５に記載の医薬組成物。 - 【請求項１７】ヒトまたは動物の治療、予防またはワク
チン治療用の医薬組成物を製造するための、請求項１〜
１２のいずれか一項に記載の複合体の使用。 - 【請求項１８】目的とするアニオン性物質を細胞中に送
達するための複合体を製造するための、Ｃ１補体因子の
サブユニットに相当する少なくとも１種類のアミノ酸配
列の全部または一部の使用。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP99401155A EP1052288A1 (en) | 1999-05-10 | 1999-05-10 | Complex for transferring an anionic substance of interest into a cell |
| US18721700P | 2000-03-03 | 2000-03-03 | |
| US99401155.9 | 2000-03-03 | ||
| US60/187217 | 2000-03-03 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001029087A true JP2001029087A (ja) | 2001-02-06 |
Family
ID=26153660
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000137647A Pending JP2001029087A (ja) | 1999-05-10 | 2000-05-10 | 細胞内へ有用なアニオン性物質を送達するための複合体 |
Country Status (4)
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|---|---|
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| JP (1) | JP2001029087A (ja) |
| AU (1) | AU770607B2 (ja) |
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| AU2006257664B2 (en) | 2005-06-14 | 2013-01-10 | Protox Therapeutics Incorporated | Method of treating or preventing benign prostatic hyperplasia using modified pore-forming proteins |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0832269A1 (en) * | 1995-06-07 | 1998-04-01 | Baylor College Of Medicine | Nucleic acid transporters for delivery of nucleic acids into a cell |
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| FR2759382A1 (fr) * | 1997-02-10 | 1998-08-14 | Transgene Sa | Nouveaux composes et compositions les contenant utilisables pour le transfert d'au moins une substance therapeutiquement active, notamment un polynucleotide, dans une cellule cible et utilisation en therapie genique |
| AU7173698A (en) * | 1997-05-02 | 1998-11-27 | Baylor College Of Medicine | Lipophilic and/or lytic peptides for specific delivery of nucleic acids to ce lls |
| FR2766826B1 (fr) * | 1997-08-04 | 2001-05-18 | Pasteur Institut | Vecteurs derives d'anticorps pour le transfert de substances dans les cellules |
| DE19735902A1 (de) * | 1997-08-19 | 1999-02-25 | Imtec Immundiagnostika Gmbh | Selektives Adsorbens für biologische Materialien |
-
2000
- 2000-05-08 EP EP20000401284 patent/EP1052287A3/en not_active Withdrawn
- 2000-05-09 AU AU32610/00A patent/AU770607B2/en not_active Ceased
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- 2000-05-10 JP JP2000137647A patent/JP2001029087A/ja active Pending
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