DE19735902A1 - Selektives Adsorbens für biologische Materialien - Google Patents

Selektives Adsorbens für biologische Materialien

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Falk Prof Dr Hiepe
Christian Dr Hentschel
Barbara Dr Pfueller
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/472—Complement proteins, e.g. anaphylatoxin, C3a, C5a
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Description

Die Erfindung betrifft ein selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen, Viren und anderen Erregern, Endotoxinen, C-reaktivem Protein, Amyloid, DNA, Cardiolipin, Fibronectin, Fibrinogen und anderen biologischen Verbindungen. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Medizin und die pharmazeutische Industrie.
Die Bildung zirkulierender Immunkomplexe (Antigen/Antikörper-Kom­ plexe) stellt einen physiologischen Abwehrmechanismus zur Eliminierung endogener oder exogener Antigene dar. Hierzu werden die zirkulierenden Immunkomplexe an die Subkomponente C1q der ersten Komplementkomponente gebunden und führen im folgenden zur Aktivierung des Komplementsystems und zur Auslösung der Komplementkaskade, wobei durch Freisetzung einer Vielzahl von biologisch aktiven Substanzen der Entzündungsprozeß initiiert wird.
Unter Nutzung dieser biospezifischen Wechselwirkung gelang es, zirkulierende Immunkomplexe aus Körperflüssigkeiten mit einem an einen Träger gebundenen Protein C1q selektiv und spezifisch zu binden. Damit können insbesondere Autoimmunerkrankungen, bei denen Immunkomplexe eine pathogenetische Rolle spielen, wirkungsvoll therapiert werden (DD 241 791).
Es ist ferner bekannt, daß Glykoproteine des HI-Virus, wie gp 41 oder gp 120, mit dem Protein C1q in Wechselwirkung treten können (Stoiber et. al., Molecular Immunology, Vol. 32 (1995), S. 371-374).
Ein Nachteil des an sich recht effektiven Verfahrens zur Entfernung verschiedener pathogener Stoffe aus Körperflüssigkeiten mit Hilfe von trägergebundenem C1q besteht in der aufwendigen und teuren Isolierung von C1q aus humanem oder tierischem Plasma/Serum sowie in der begrenzten Verfügbarkeit des Ausgangsmaterials. Hinzu kommt, daß das Protein C1q - wie viele Proteine - recht instabil ist und somit während seiner Isolierung und Reinigung an Aktivität verlieren kann. Des weiteren ist eine standardisierte Herstellung von C1q außerordentlich schwierig und in der Praxis häufig nicht gegeben. Schließlich birgt das Verfahren der Präparation aus humanen oder tierischen Seren die Gefahr der Übertragung von Infektionen in sich.
Ziel der Erfindung ist daher, ein selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen, Retroviren und analogen pathogenen Substanzen in Körperflüssigkeiten zu entwickeln, wobei das bindende Mittel im Adsorbens reproduzierbar herstellbar und damit leicht zugänglich sein soll.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß synthetische Peptide, die jeweils eines der aktiven Zentren des C1q simulieren, zur Realisierung dieser Zielstellung geeignet sind. Auf der Grundlage dieses Befundes wird die Aufgabe der Erfindung mittels eines Adsorbens gemäß den Ansprüchen 1 bis 16 realisiert. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung dieses Adsorbens gemäß Anspruch 17 und 18.
Es handelt sich bevorzugt um die folgenden Peptide:
Peptid 1: NH2-LEQGENVFLQATLLC-COOH
Peptid 2: NH2-LEQGENVFLQAT-COOH
Peptid 3: NH2-RFDHVITNMNNNYEPR-COOH
Peptid 4: NH2-QWEICLSIVSSSRGQVRRSLGF-COOH
Peptid 5: NH2-HTANLCVLLYRSGVKVVTF-COOH
Peptid 6: NH2-AGRPGRRGRPGLK-COOH
Peptid 7: NH2-GIKGTKGSPGNIKDQPR-COOH
Peptid 8: NH2-GAPGPKGESGDYKATQK-COOH
Peptid 9: NH2-GIPGEPGEEGRYKQKFQ-COOH.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß sich Immunkomplexe, Viren und andere Erreger, Endotoxine, C-reaktives Protein, Amyloid, DNA, Cardiolipin, Fibronectin, Fibrinogen und andere biologische Verbindungen in einer hohen Affinität und Selektivität an die immobilisierten Peptide binden.
Die Immobilisierung erfolgt an ein selektives Adsorbens, wobei die eingesetzten festen Träger bevorzugt aus sphärischen, flächenförmigen oder faserförmigen Formkörpern bestehen oder als dünne Schichten, Filme oder Lacke auf anderen Trägern aufgebracht sind. Die Formkörper sind durch Packung, Verweben, Sinterung oder durch Bindemittel zu vorzugsweise flächenförmigen Trägermaterialien oder Kolonnenpackungen zusammengestellt.
Als Trägermaterial werden verschiedene Stoffe eingesetzt
  • - organische Polymere, vorzugsweise sphärische Polyhydroxyethylmethacrylate, insbesondere Amino-Poly­ hydroxymethacrylate, deren Partikelgröße 10-1000 µm beträgt und deren Porosität < 10 nm ist
  • - natürliche Polymere, vorzugsweise Zelluloseträger, deren Partikelgröße 10-1000 µm beträgt und deren Porosität < 10 nm ist
    oder
  • - anorganische Polymere, vorzugsweise siliziumdioxidhaltige Materialien.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden homo- oder heterobifunktionelle Reagenzien und andere Verbindungen wie Epichlorhydrin, CNBr, Carbodiimide oder Glutardialdehyd mit und ohne Spacer als Brückenverbindungen zwischen Träger und Peptid eingesetzt.
Die Verwendung dem erfindungsgemäßen selektiven Adsorbens erfolgt in der Weise, daß das Adsorbens mit der Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Plasma oder Serum, in Kontakt gebracht wird und nach Bindung der Immunkomplexe, Retroviren, Endotoxine oder des C-reaktiven Proteins an das synthetische Peptid die feste Phase abgetrennt wird. Anschließend erfolgt eine Regenerierung der festen Phase durch Behandlung mit nicht denaturierenden Medien und Wiederverwendung derselben. Als nicht denaturierende Medien werden bevorzugt gepufferte Lösungen hoher Ionenstärke, chaotropische Reagenzien oder stark saure bzw. alkalische Lösungen eingesetzt.
Die Wirksamkeit der erfindungsgemäß eingesetzten Peptide wird anhand eines Vergleichs der Dissoziationskonstanten dieser Peptide mit dem Protein C1q belegt. Tabelle 1 zeigt die Hemmbarkeit der Bindung zwischen der mit C1q bzw. Peptid 4 beladenen festen Phase (Mikrotitrationsplatte) und aggregierten humanen Immunglobulin (Stimulierung zirkulierender Immunkomplexe) durch die Peptide P1 bis P5 im Enzymimmunoassay. Je kleiner dabei die Dissoziationskonstante kd ist, desto besser ist die Hemmung.
Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Peptid 3 und Peptid 4.

Claims (18)

1. Selektives Adsorbens zur Bindung von Immunkomplexen, Viren und anderen Erregern, Endotoxinen, C-reaktivem Protein, Amyloid, DNA, Cardiolipin, Fibronectin, Fibrinogen und anderen biologischen Verbindungen, enthaltend an feste Träger gebundene synthetische Peptide, die eines der aktiven Zentren des Proteins C1q simulieren.
2. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1, enthaltend das Peptid NH2-LEQGENVFLQATLLC-COOH
3. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1, enthaltend das Peptid NH2-LEQGENVFLQAT-COOH
4. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1, enthaltend das Peptid NH2-RFDHVITNMNNNYEPR-COOH
5. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1, enthaltend das Peptid NH2-QWEICLSIVSSSRGQVRRSLGF-COOH
6. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1, enthaltend das Peptid NH2-HTANLCVLLYRSGVKVVTF-COOH
7. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1, enthaltend das Peptid NH2-AGRPGRRGRPGLK-COOH
8. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1, enthaltend das Peptid NH2-GIKGTKGSPGNIKDQPR-COOH
9. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1, enthaltend das Peptid NH2-GAPGPKGESGDYKATQK-COOH
10. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1, enthaltend das Peptid NH2-GIPGEPGEEGRYKQKFQ-COOH
11. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten festen Träger aus sphärischen, flächenförmigen oder faserförmigen Formkörpern bestehen oder als dünne Schichten, Filme oder Lacke auf anderen Trägern aufgebracht sind.
12. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Formkörper durch Packung, Verweben, Sinterung oder durch Bindemittel zu vorzugsweise flächenförmigen Trägermaterialien oder Kolonnenpackungen zusammengestellt sind.
13. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger organische Polymere, vorzugsweise sphärische Polyhydroxyethylmethacrylate, insbesondere Amino-Polyhydroxymethacrylate, zum Einsatz gelangen, deren Partikelgröße 10-1000 µm beträgt und deren Porosität < 10 nm ist.
14. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger natürliche Polymere zum Einsatz gelangen, vorzugsweise Zelluloseträger, deren Partikelgröße 10-1000 µm beträgt und deren Porosität < 10 nm ist.
15. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß als Träger anorganische Polymere zum Einsatz gelangen, vorzugsweise siliziumdioxidhaltige Materialien.
16. Selektives Adsorbens nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß homo- oder heterobifunktionelle Reagenzien und andere Verbindungen wie Epichlorhydrin, CNBr, Carbodiimide oder Glutardialdehyd mit und ohne Spacer als Brückenverbindungen zwischen Träger und Peptid eingesetzt werden.
17. Verwendung des selektiven Adsorbens nach Anspruch 1-16, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorbens mit der Körperflüssigkeit, insbesondere Blut, Plasma oder Serum, in Kontakt gebracht wird und nach Bindung der Immunkomplexe, Retroviren, Endotoxine oder des C-reaktiven Proteins an das synthetische Peptid die feste Phase abgetrennt wird und anschließend eine Regenerierung der festen Phase durch Behandlung mit nicht denaturierenden Medien und Wiederverwendung derselben erfolgt.
18. Verwendung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht denaturierenden Medien gepufferte Lösungen hoher Ionenstärke, chaotropische Reagenzien oder stark saure bzw. alkalische Lösungen sind.
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