DE3717209C2

DE3717209C2 -

Info

Publication number: DE3717209C2
Application number: DE3717209A
Authority: DE
Inventors: Metin Dr. 4006 Erkrath De Colpan; Ralf Dr. 4010 Hilden De Piotrowiak
Original assignee: Diagen Institut fur Molekularbiologische Diagnostik 4000 Duesseldorf De GmbH
Current assignee: Diagen Institut fur Molekularbiologische Diagnostik 4000 Duesseldorf De GmbH
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1987-05-22
Publication date: 1991-02-28
Also published as: DE3717209A1

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Mittel zur selektiven Adsorption von Biopolymeren aus einem Gemisch von Biopolymeren an ein trägergebundenes Ma terial, ein Verfahren zur Herstellung des erfin dungsgemäßen Mittels sowie seine Verwendung.

In der molekularbiologischen Laborpraxis, biotechnolo gischen Verfahrensanwendung und in der medizinischen Diagnostik stellt sich häufig das Problem, daß aus ei nem Gemisch unterschiedlichster Moleküle eine bestimmte Stoffklasse wie Nukleinsäuren oder Proteine isoliert werden soll. Bekannt sind Verfahren, die sich in ihrem methodischen Aufwand sowie in der erzielbaren Reinheit des isolierten Stoffes beträchtlich unterscheiden. So liefert zum Beispiel die Säulenchromatographie mit Io nenaustauschern in der Regel hochgereinigte Fraktionen. Diese Reinigungsverfahren bedürfen aber eines großen methodischen und apparativen Aufwands (zum Beispiel HPLC-Apparaturen). Ist die Reinigung einer Vielzahl separater Proben notwendig, wie beispielsweise bei der DNS-Analyse rekombinanter Bakterienklone, DNS-Analysen von Gewebeproben in der medizinischen Diagnostik und automatisierte Nukleinsäureisolierung, wird eine derar tige Methodik zu aufwendig. Hinzu kommt, daß die mehr malige Verwendung einer Säule für die Reinigung ver schiedener Präparate zu Kontaminationen führt, die ge rade im biologisch/medizinischen Bereich höchst uner wünscht sind.

Die DE-OS 24 29 196 betrifft mit Cyanogenbromid chemisch modifizierte anorganische Materialien. Dieses aktivierte Material bindet Peptide und Proteine vorzugsweise über Aminogruppen kovalent und irreversibel.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mittel bereitzustellen, das die einfache Vorbereitung und Wei terverarbeitung von Proben gewährleistet, wobei die Proben Biopolymere, insbesondere Nukleinsäure und/oder Proteine enthalten.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Mit tel, bestehend aus

a) einem flächenhaften festen Träger,
b) einer Klebstoffschicht und
c) einem Material, das die Biopolymeren reversibel ad sorbiert.

Der mit dem Material gemäß DE-OS 24 29 196 erzielte Zweck unterscheidet sich von dem erfindungsgemäßen gra vierend. Während gemäß der Erfindung Biopolymere selek tiv und reversibel adsorbiert werden, einmal um sie aus dem Gemisch zu entfernen, zum anderen um an ihnen Re aktionen durchzuführen, wird bei dem Material gemäß der DE-OS 24 29 196 bezweckt, Biopolymere, wie Enzyme, kova lent und irreversibel zu binden, um mit diesen Molekülen Reaktionen an Substraten, die in einer Lösung die immo bilisierten Biopolymeren passieren, auszuführen. Üb licherweise werden solche Materialien in Säulen oder Behälter gefüllt und dann entweder im Durchflußverfahren oder im "Batch"-Verfahren mit den umzusetzenden Sub straten in Verbindung gebracht.

Der Klebstoff fixiert das die Biopolymeren adsorbierende Material (Adsorbentien) auf flächigen Trägermateriali en. Die Fixierung der Adsorbentien erfolgt durch einen Klebstoff, vorzugsweise einen Schmelzkleber auf der Basis von Polypropylen und Polybutylen, welcher vorher auf die entsprechende Oberfläche aufgebracht wird. Als besonders geeignet haben sich thermoplastische Klebstof fe, zum Beispiel ein amorphes alpha-Olefin-Copolymer (Vestoplast®-508), erwiesen, da sie technisch leicht zu verarbeiten sind, die Fixierung in chemischer Hinsicht unterschiedlichster Partikel gestatten und aufgrund der Unlöslichkeit in wäßrigen Lösungen nicht zu Kontami nationen der Probe führen. Die erfindungsgemäß einge setzten Klebstoffe können durch Erhitzen verflüssigt werden und entwickeln erst dann ihre klebenden Eigen schaften. Die Temperatur der Thermobehandlung des Kleb stoffes liegt zwischen 60 und 180°C, vorzugsweise bei 70 bis 120°C. Der Klebstoff wird zum Auftragen auf den festen flächenhaften Träger in Form eines einseitig oder zweiseitig offenen Behälters (Reaktionsgefäß, Schlauch und ähnliches) zunächst in Chloroform oder Methylenchlorid gelöst oder suspendiert (0,05 bis 0,5 g/ml, vorzugsweise 0,1 bis 0,3 g/ml Chloroform oder Methylenchlorid). Danach gibt man diese Suspension in das Gefäß. Aufgrund der Wechselwirkungen zwischen Kleb stoff und Gefäßwand wird die Gefäßwandung mit Klebstoff beschichtet. Dann dekantiert man die überschüssige Sus pension ab.

Die jeweiligen Adsorbentien werden aufgetragen, im ein fachsten Fall durch Bestreuen der Gefäßwand, und bei einer Temperatur von 60 bis 180°C, vorzugsweise 70 bis 120°C prozessiert, so daß die Adsorbentien vermittels Klebstoff an der Gefäßwand haften. Dabei ist es gleich gültig, aus welchem Material das Adsorbens besteht. Es können sowohl oberflächenmodifizierte Materialien auf der Basis von Kieselgel, Aluminiumoxid, Titanoxid, Aga rose, Cellulose, Hydroxylapatit, Acrylamid und andere unlösliche Adsorbentien eingesetzt werden. Die Art der Oberflächenmodifizierung spielt dabei ebenfalls keine Rolle; Ionenaustauschergruppen enthaltende Adsorbentien können ebenso verwendet werden wie beispielsweise Affi nitätsadsorbentien oder Chelatbildner.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren fixierten Ad sorbentien stellen eine grundsätzlich neue Anwendungs form dar und bieten die Möglichkeit neuer und im Ver gleich zur üblichen Methodik einfacherer Verfahren. Das fixierte adsorbierende Material wird lediglich mit ei ner die zu trennenden Substanzen enthaltenden Lösung überschichtet und eine bestimmte Zeit inkubiert. In Abhängigkeit von den Lösungsbedingungen binden bestimm te Moleküle aufgrund unterschiedlicher Wechselwirkungen reversibel an chemische Gruppen des Adsorbens. Nach der Bindung wird die verbliebene Lösung dekantiert. In ei nem Waschvorgang wird durch erneutes überschichten und Dekantieren das Adsorbens von unspezifisch gebundenen und abzutrennenden Substanzen gereinigt. In einem ab schließenden Elutionsschritt wird eine Lösung zugesetzt, die zur Freisetzung der gebundenen Moleküle führt.

Als Adsorbentien kommen Materialien wie synthetische, organische und anorganische Polymere, Kieselgel, Alumi niumoxid, Titanoxid, Cellulose, Agarose, Hydroxylapa tit, Acrylamid und andere unlösliche Adsorbentien in Betracht, wobei diese Materialien meist oberflächlich modifiziert sind. Vorzugsweise kann die Modifikation aus chemischen Gruppen bestehen, die Ionenaustauscher gruppen aufweisen oder die Möglichkeit zur Immobilisie rung von Affinitätsliganden besitzen oder bereits mit Affinitätsliganden beladene Adsorbentien sind. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Oberfläche des Trägermaterials mit Chelatbildnern modifiziert.

Auch sogenannte "reversed phase"-Materialien können für bestimmte Applikationen wie Entfernung von hydrophoben Bestandteilen eines Gemisches verwendet werden. Beson ders bevorzugt sind Adsorbentien, die bekannt sind aus DE-OS 32 11 309 sowie in der deutschen Patentanmeldung der Anmelderin P 36 27 063 vorgeschlagen werden. Die Partikelgröße beträgt 1 µm bis 2 mm. Die Porengröße beträgt 5,0 bis 2500 nm, vorzugsweise 150 nm. Das in Form von Partikeln vorliegende, oberflächlich modifi zierte Adsorbens wird, wie oben beschrieben, mittels eines thermoplastischen Klebstoffs an den flächenhaften festen Träger gebunden, der aus organischem und/ oder anorganischem Material besteht. Der flächenhafte Träger kann in bevorzugten Ausführungsformen bestehen aus Foli en, Filtern, Schläuchen, Gefäßen oder Platten aus Kunst stoffen, Glas, Keramik etc. Weitere bevorzugte Ausfüh rungsformen des erfindungsgemäßen Mittels sind Arbeits gerätschaften wie Reaktionsgefäße aus Kunststoff, z. B. Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Reaktionsgefäße) Pi pettenspitzen, Objektträger, Mikrotiterplatten, Kanülen, Nylonfilter und ähnliches.

Der Anwendungsbereich des erfindungsgemäßen Verfahrens ist außerordentlich breit. Beispielhaft seien genannt: Plasmidpräparationen, Isolierung langkettiger, chromo somaler DNS aus unterschiedlichsten Quellen, Isolierung und Reinigung von Nukleinsäuren unterschiedlichster Provenienz sowie Immobilisierung von Proteinen, insbe sondere Immunoglobulinen sowie Reinigung von spezifi schen Antigenen durch Affinitätsadsorption. Außerdem ist es möglich, das erfindungsgemäße Mittel zur adsorp tiven Immobilisierung von Biopolymeren zu verwenden, um diese einer chemischen Modifizierungsreaktion zu unter ziehen. So können beispielsweise Nukleinsäuren in ad sorbiertem Zustand mit Enzymen, beispielsweise Restrik tionsenzymen behandelt werden. Auch eine Behandlung mit Polymerasen sowie radioaktive Markierung mittels Nick translationen, Endmarkierungen mit Klenow-Polymerasen, Methylierungen, Phosphatasebehandlungen und ähnlichen Reaktionen der Nukleinsäurebiochemie sind mit dem er findungsgemäßen Mittel in überraschend einfacher Weise möglich. Mit dem erfindungsgemäßen Mittel gelingt es, einen partiellen Nukleinsäureabbau reproduzierbar zu erreichen, ohne zunächst eine aufwendige Enzymkinetik erstellen zu müssen um die Abbaureaktion zu einem be stimmten Zeitpunkt zu stoppen. Überraschenderweise stoppt nämlich der Nukleinsäureabbau in reproduzier barer Weise nach einer gewissen Anzahl von Restriktions schnitten. Damit entfällt die mühsame Vorgehensweise, die bei Anwendung herkömmlicher Methoden zwingend er forderlich ist. Das Verfahren ist Gegenstand einer gleichzeitig mit dieser Patentanmeldung eingereichten Patentanmeldung.

Es ist auch möglich, zuerst ein Biopolymer, das eine gewisse Affinität zu anderen Biopolymeren aufweist, an dem betreffenden Adsorbens zu immobilisieren, wonach dann das eigentlich zu untersuchende oder gewinnende Biopolymere in Form eines Sekundärkomplexes an den pri mären Komplex gebunden wird. So weist zum Beispiel Pro tein A eine starke Affinität zu Immunglobulinen (IgG) auf. Immobilisiert man also Protein A an dem Biopolyme re adsorbierenden Material, wird man in die Lage ver setzt, die IgG-Fraktion aus einer Probe selektiv zu adsorbieren.

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Die Kopplung der Partikel an den festen flächenhaften Träger erfolgt mit einm amorphen Olefin-Copolymer zur Herstellung von Schmelzklebern (Vestoplast®-508).

Um das Reaktionsgefäß mit einer einheitlich dicken Schicht von etwa 20 µm mit dem Klebstoff zu beschich ten, wird zunächst das amorphe Olefin-Copolymer zur Herstellung von Schmelzklebern (Vestoplast®-508) in Choroform suspendiert (0,15 g/ml), so daß eine kolloida le Suspension entsteht. Diese Klebstoffsuspension wird in das Reaktionsgefäß gegeben und sofort wieder dekan tiert. Aufgrund der Wechselwirkungen zwischen dem Mate rial des entsprechenden festen flächenhaften Trägers und dem Klebstoff verbleibt ein dünner Film an der Innenwandung des Gefäßes. Durch Unterdruck (5 Minuten im Exsikkator) wird anschließend das Chloroform ent fernt. Die zu fixierenden Partikel, zum Beispiel An ionenaustauscher wie Fractogel TSK DEAE-650, Ionenaus tauscher, vorgeschlagen in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3 und bekannt aus DE-OS 32 11 309, mit Par tikelgrößen von 50 bis 1000 µm und Durchmesser der Poren mit dem 1- bis 20-fachen des Durchmessers des zu trennenden Moleküls, werden in das Gefäß gefüllt, welches anschließend auf ca. 74°C erhitzt wird und dabei seine klebenden Eigenschaften entwickelt. Nach dem Ab kühlen werden nicht fixierte Partikel mittels Druckluft durch Wegblasen entfernt.

Beispiel 2

Mit dem amorphen Olefin-Copolymer zur Herstellung von Schmelzklebern (Vestoplast®-508) kompatible Folien können direkt beschichtet werden, indem der thermisch verflüssigte Klebstoff aufgetragen wird und mittels einer Roll- oder Schlitzrakel ein homogener Film der jeweils gewünschten Schichtdicke aufgezogen wird. Die Fixierung erfolgt auch in diesem Fall durch Erwärmung des Klebers in Gegenwart der Partikel.

Beispiel 3

Kanülen und Pipettierspitzen werden beschichtet, indem die Klebstoffsuspension eingezogen, sofort wieder her ausgedrückt und nach Einfüllen der jeweiligen Partikel, zum Beispiel gemäß der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3, DE-OS 32 11 309 oder anderer Ionenaustauscher erhitzt wird. Ungebundene Partikel werden mittels Druckluft durch Wegblasen entfernt.

Gemäß den Beispielen 1 bis 3 können die folgenden Mate rialien zur Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels eingesetzt werden: Ionenaustauscher auf Silicagel-/Aga rose-/Acrylamid-/Cellulose-Basis, wie DE-52 und TSK DEAE-650. Das Material muß mit Wasser und Aceton vorher gewaschen und im Vakuum getrocknet werden. Auch handelsübliche Reversed-phase-Materialien Lich roprep® RP-18) sowie aktivierte Affinitätsadsorbentien, wie zum Beispiel hydrophile Acryl-Copolymerisate (Euper git®-C) können eingesetzt werden.

Beispiel 4

Plasmidpräparation aus Escherichia coli mit Hilfe von mit Ionenaustauscher beschichteten Mikrozentrifugen röhrchen (Eppendorf-Reaktionsgefäßen) nach Beispiel 1, wobei das in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3 vorgeschlagene Ionenaustauschermaterial verwendet wird:
Der Bakterienaufschluß erfolgt nach der "Alkaline Lysis Method" (siehe Maniatis et al. 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87 969-136-0, New York). Anstelle der Phenolisierung wird jedoch der Überstand auf 1 M Natri umchlorid und 50 mM Natriumacetat pH 7 eingestellt und in ein Reaktionsgefäß gegeben, wobei das Reaktionsgefäß gemäß Beispielen 1 bis 3 mit dem Ionenaustauscher be kannt aus der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3 beschichtet wurde.

Nach 15 Minuten wird die Lösung dekantiert, das Reak tionsgefäß mit 2 × je 1 ml der angegebenen Pufferlösung gewaschen und dann 15 Minuten bei Raumtemperatur mit 2 × 100 µl Elutionspuffer (1,5 M Natriumchlorid, 50 mM Natrium-Acetat pH 7, 15% Ethanol) eluiert. Das Eluat wird mit 25 µl Wasser und 80 µl Isopropanol versetzt, 20 Minuten bei -70°C inkubiert und anschließend abzen trifugiert. Die so isolierte Plasmid-DNS ist in der Reinheit mit durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie gereinigten DNS-Proben vergleichbar. Sie kann erfolg reich enzymatischen Behandlungen unterworfen werden.

Beispiel 5

Isolierung langkettiger, chromosomaler DNS aus Gewebe mit Hilfe von mit Ionenaustauschern Mikrozentrifugen röhrchen beschichteten (Eppendorf-Reaktionsgefäßen) nach Beispiel 1, wobei der Ionenaustauscher in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3 vorgeschlagen wird:
Für den Zellaufschluß eukaryotischer Zellen existieren verschiedene Methoden (vgl. Maniatis et al. 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87 969-136-0, New York).

Sobald die Zellen lysiert sind, wird das von störenden Bestandteilen befreite Lysat (cleared lysate) auf 1 M Natriumchlorid und 50 mM Natriumacetat pH 7 eingestellt und anschließend, wie in Beispiel 4 beschrieben, behan delt. Es können auf diese Weise extrem große DNS-Frag mente (50 bis 1000 kb) isoliert werden. Bei allen ande ren Methoden, die zur Reinigung und Isolierung von DNS bekannt sind, wie Säulenchromatographie und phenoli scher Aufschluß, kommt es aufgrund starker Scherkräfte zur Fragmentierung der Nukleinsäuren. Werden die nach Beispiel 1 hergestellten erfindungsgemäßen Mittel einge setzt, unterliegen die Moleküle nur schwachen Diffu sionskräften und nur geringfügigen Scherkräften.

Darüber hinaus bewirkt die rein oberflächliche Adsorp tion eine zusätzliche Stabilisierung der langen Mole küle, deren Länge 1 µm bis 3000 µm betragen kann.

Beispiel 6

Isolierung von Nukleinsäuren (BNYV-Virus) aus stark verschmutzten Quellen, zum Beispiel Erde, mit Hilfe von mit Ionenaustauscher beschichteten 50 ml-Falcon-Reak tionsgefäßen (Reaktionsgefäße nach Beispiel 1 mit Ionenaustauscher versehen), die wie folgt durchgeführt wird:
Etwa 10 g Erde werden mit 10 ml 40 mM TRIS-Puffer, pH 7,5, 20 mM Natrium-Acetat und 1 mM EDTA sowie mit 10 ml wasser-gesättigtem Phenol versetzt und 2 Minuten mit Ultraschall behandelt. Anschließend werden 800 µl 25% iges Triton® X-100 und 10 ml Chloroform zugesetzt und nach Mischen 10 Minuten bei 3500 g zentrifugiert. Der wäßrige Überstand wird mit 10 ml Chloroform versetzt und erneut 10 Minuten bei 3500 g zentrifugiert. Die wäßrige Phase wird nun auf 300 mM Natriumchlorid einge stellt und die beschichteten Reaktionsgefäße gegeben.

Die Bindung von Nukleinsäuren erfolgt während 40 Minu ten bei 40°C. Anschließend wird der Überstand dekan tiert und verworfen und das Reaktionsgefäß 2 × mit was sergesättigtem Phenol und 2 × mit 50 ml 0,3 M Natrium chlorid gewaschen. Die Elution erfolgt 10 Minuten bei 1,5 M Natriumchlorid, 50 mM Natrium-Acetat pH 7 und 15% Ethanol. Das Eluat wird durch 1 Vol. Wasser und 20 ml Isopropanol 30 Minuten bei -20°C gefällt und abzentri fugiert. Darauf folgende Gelelektrophorese und DOT- BLOT-Analysen belegen eine wesentlich höhere Probenrein heit als es mit anderen Verfahren, wie zum Beispiel der Säulenchromatographie, erreichbar ist.

Beispiel 7

Immobilisierung von Protein A und Reinigung von Human Immunglobulinen (IgG) mit Protein A-Affinitätsadsorp tion:
Ein mit aktiviertem Silicagel beschichtetes Mikrozentri fugenröhrchen (Eppendorf-Reaktionsgefäß) wird mit 500 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gefüllt und 1 mg Protein A (aus Staphylococcus aureus oder rekombi nantes Protein A) gelöst in 100 µl 0,1 M Natrium phosphat-Puffer, pH 8,0, zugegeben. Die Suspension wird 4 Stunden bei 4°C geschüttelt, um eine hohe Immobili sierung von Protein A zu gewährleisten. Nach der Re aktion wird das nicht immobilisierte Protein A pi pettiert und das Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf- Reaktionsgefäß) 2 × mit je 500 µl 0,1 molar Natrium phosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen. Die nicht reagierten aktiven Gruppen werden blockiert durch zweistündiges Schütteln mit 250 µl 0,05 M Mercaptoethanol in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0. Nach der Blockierungs reaktion wird das Produkt 5 × mit 500 µl 0,1 molar Natriumphosphatpuffer pH 7,0 gewaschen. Das mit Protein A beschichtete Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf- Reaktionsgefäß) wird mit 1 ml 0,1 M Natriumphosphat puffer, pH 7,0, und 1 ml 0,05 M Natriumcitratpuffer, pH 3,0, gewaschen und 2 × mit 1 ml 0,1 M Natriumphosphat puffer, pH 7,0, äquilibriert. Die IgG-Probe, bestehend aus 1 mg rohem human IgG, wird in 500 µl 0,1 M Natrium phosphatpuffer, pH 7,0, gelöst, in das mit Protein A beschichtete Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Reaktionsgefäß) pipettiert und 30 Minuten bei 10°C ge schüttelt und adsorbiert. Verunreinigungen mit anderen Proteinen und unspezifisch gebundenes IgG werden durch dreimaliges Waschen mit 500 µl 0,1 M Natriumphosphat puffer, pH 7,0, ausgewaschen und das spezifisch gebun dene human IgG mit 2 × 100 µl 0,05 M Citratpuffer, pH 3,0, eluiert.

Die Bindekapazität von mit Protein A beschichteten Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Reaktionsgefäßen) wurde zu je 200 µg IgG bestimmt.

Beispiel 8

Immobilisierung von Maus anti-human IgG und Reinigung von Human Immunglobulinen (IgG) mit Maus anti-human IgG-Affinitätsadsorption:
Ein mit aktiviertem Silicagel beschichtetes Mikrozentri fugenröhrchen (Eppendorf-Reaktionsgefäß) wird mit 500 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gefüllt und 1 mg Maus anti-human IgG gelöst in 100 µl 0,1 M Natrium phosphatpuffer, pH 8,0, zugegeben. Die Suspension wird 4 Stunden bei 4°C geschüttelt, um einen hohen Immobili sierungsgrad von Maus anti-human IgG zu gewährleisten.

Nach der Reaktion wird das nicht immobilisierte Maus anti-human IgG pipettiert und das Mikrozentrifugen röhrchen (Eppendorf-Reaktionsgefäß) 2 × mit je 500 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0, gewaschen. Die nicht abreagierten, aktiven Gruppen werden blockiert durch zweistündiges Schütteln mit 250 µl 0,05 M Mercaptoethanol in 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 8,0.

Nach der Blockierungsreaktion wird das Produkt 5 × mit 500 µl 0,1 M Natriumphospatpuffer, pH 7,0, gewaschen.

Das mit Maus anti-human IgG beschichtete Mikrozentri fugenröhrchen (Eppendorf-Reaktionsgefäß) wird mit 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0 und 1 ml 0,05 M Natriumcitratpuffer, pH 3,0, gewaschen und 2 × mit je 1 ml 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, äquilibriert.

Die IgG-Probe, bestehend aus 1 mg rohem human IgG, wurde in 500 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, gelöst, in das mit Maus anti-human IgG eschichtete Mikrozentri fugenröhrchen (Eppendorf-Reaktionsgefäß) pipettiert und 30 Minuten bei 4°C geschüttelt und adsorbiert.

Verunreinigungen mit anderen Proteinen und unspezifisch gebundenes IgG werden durch dreimaliges Waschen mit je 500 µl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, ausgewa schen und das spezifisch gebundene human IgG mit 2 × je 100 µl 0,05 M Citratpuffer, pH 3,0, eluiert. Die Bin dekapazität von einem mit Maus anti-human IgG beschich teten Mikrozentrifugenröhrchen (Eppendorf-Reaktionsge fäß) wurde zu 50 µg IgG bestimmt.

Beispiel 9

Nukleinsäuren können in adsorbiertem Zustand, insbeson dere gebunden an Ionenaustauscher, vorgeschlagen in der deutschen Patentanmeldung P 36 39 949.3 der Anmelderin, Fractogel TSK DEAE-650 und DE-52 Cellulose, nach den bekannten Verfahrensweisen (siehe Maniatis et al. 1982, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN-0-87 969-136-0, New York) enzymatisch behandelt werden. Vor Zugabe des En zyms empfiehlt sich die Zugabe von Rinderserumalbumin (BSA). 3 µg Plasmid, zum Beispiel pBR 322, die nach der oben beschriebenen Plasmidpräparationsmethodik isoliert worden sind und an einen Anionenaustauscher wie DE-52 Cellulose gebunden sind, werden mit Eco R 1 endonukleo lytisch gespalten. Hierzu wird zunächst eine Rinderse rumalbumin-Lösung (2 mg/ml Eco RI Puffer) in das Reak tionsgefäß gegeben. Nach 10 Minuten wird diese Lösung dekantiert und verworfen. Mit 3 Einheiten Eco R 1 wird nun 30 Minuten in 100 mM Natriumchlorid, 50 mM TRIS, pH 7,5, 10 mM Magnesiumchlorid und 1 mM Dithiothreitol verdaut. Etwa 90 bis 95% der gesamten Plasmid-Spaltstel len ist umgesetzt, wie sich nach Elution mit anschlie ßender Gelelektrophorese nachweisen läßt.

Claims

1. Mittel zur selektiven Adsorption von Biopolymeren aus einem Gemisch von Biopolymeren an ein trägergebundenes Material, bestehend aus

a) einem flächenhaften festen Träger,
b) einer Klebstoffschicht und
c) einem Material, das die Biopolymeren reversibel adsorbiert.

2. Mittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der die Klebstoffschicht bildende Klebstoff ein thermopla stischer Klebstoff ist.

3. Mittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der flächenhafte feste Träger aus organischem und/ oder anorganischem Material besteht.

4. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß die Oberfläche des die Biopolymeren adsorbierenden Materials durch Ionenaustauschergruppen oder Affinitätsliganden modifiziert ist.

5. Mittel nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß die Oberfläche des die Biopolymeren adsorbierenden Materials mit Chelatbildnern modifiziert ist.

6. Verfahren zur Herstellung eines Mittels nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß auf einen festen Träger eine Schicht aus thermoplastischem Kleb stoff aufgebracht wird, wonach das Material, das die Biopolymeren adsorbiert, auf die Klebstoffschicht aufgetragen und bei erhöhter Temperatur behandelt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der feste flächenhafte Träger ein einseitig oder zwei seitig offener Behälter ist und

a) der Klebstoff in organischen Lösungsmitteln suspen diert aufgebracht,
b) das Lösungsmittel abdekantiert und nach Verdampfen des restlichen Lösungsmittels,
c) das Adsorbens eingefüllt und dann bei 60 bis 180°C, vorzugsweise 70 bis 120°C behandelt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der flächenhafte Träger eine Folie ist und

a) der Klebstoff mit einer Roll- oder Schlitzrakel aufgebracht,
b) mit dem Adsorbens beschichtet und dann
c) bei 60 bis 180°C, vorzugsweise 70 bis 120°C behan delt wird.

9. Verwendung des Mittels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur Adsorption, Trennung, Reinigung und/oder Isolierung von Biopolymeren.

10. Verwendung des Mittels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 zur chemischen Modifizierung von Biopolymeren.

11. Verwendung des Mittels gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das die Biopolymeren adsorbierende Material seinerseits ein am festen flächenhaften Träger immobi lisiertes Biopolymeres ist, welches zu einem weiteren Biopolymeren eine Affinität besitzt.