DE4342132C1 - Verfahren zur Herstellung virusinaktivierte Vitamin K abhängige Plasmakomponenten sowie Protein C und Protein S enthaltender Mittel durch Membran-Chromatographie - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung virusinaktivierte Vitamin K abhängige Plasmakom­ ponenten sowie Protein C und Protein S enthaltender Mittel aus einer diese Komponenten enthaltenden Quelle.

Vitamin K abhängige Plasmakomponenten, wie Protein C, Protein S, die Faktoren II, VII, IX und X, sind im Blutplasma enthal­ tene Bestandteile, welche eine bedeutende Rolle in der Patho­ physiologie der Blutgerinnungskaskade spielen. Als Arzneimit­ tel werden diese Faktoren eingesetzt, um Patienten mit Symp­ tomen zu therapieren, die auf entsprechenden Mangel an diesen Faktoren zurückgehen.

Blutplasma als eine Quelle, aus der eine kommerzielle Gewin­ nung der Faktoren erfolgt, ist jedoch nicht in beliebiger Menge verfügbar. Aus ethischen und wirtschaftlichen Gründen muß es daher Ziel jeder Fraktionierung und Isolierung dieser Vitamin K abhängigen Plasmakomponenten sowie Protein C und Protein S sein, zum einen eine möglichst hohe Ausbeute jedes Faktors für sich allein zu gewährleisten und zum anderen gleichzeitig auch eine Isolierung der jeweils anderen Faktoren zu ermöglichen.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem ist es, ein solches Verfahren anzugeben.

Dieses Problem wird durch das erfindungsgemäße Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.

Der Einsatz der Membran-Chromatographie spielt bei dem erfin­ dungsgemäßen Verfahren eine bedeutende Rolle. Josi et al. beschreiben in Journal of Chromatography, 632 (1993) 1 bis 10 die Eignung der Heparin-Affinitätschromatographie zur Isolierung von Plasmaproteinen aus der Blutgerinnungskaskade. Die Isolierung von Antithrombin III und die Trennung von Faktor IX und Faktor X nach Vortrennung durch Anionen- Chromatographie wird beschrieben. Die Anionenaustauscher- Chromatographie zur Vortrennung von Faktor IX und X wird mit präparativer HPLC betrieben. Die Anreicherung von Faktor IX und Faktor X enthaltenden Proben erfolgt gemäß H. G. J. Brummelhuis in J.M. Curling (Editor), "Methods of Plasma Protein Fractionation", Academic Press, London, Orlando, 1980, p. 117.

Die high performance membrane chromatography von Serum und Plasmamembranproteinen ist bereits aus Josi et al. Journal of Chromatography, 590 (1992), 59 bis 76 bekannt. Dort wird die Trennung von Serum und Plasmamembranproteinen be­ schrieben. Es wurden beispielsweise Plasmamembranproteine aus Leber- und Nierengewebe getrennt.

Überraschenderweise hat sich gezeigt, daß wertvolle Vitamin K abhängige Plasmainhaltsstoffe, wie Protein C, Protein S, Faktoren II, VII, IX und X gemäß dem nachstehend beschriebe­ nen Verfahren in hoher Reinheit und Ausbeute hergestellt werden können.

In einem ersten Schritt werden die vorzugsweise aus Blut oder Blutplasma in frischer oder aufgetauter Form eingesetzten, die entsprechenden Vitamin K abhängigen Plasmakomponenten sowie Protein C und Protein S enthaltenden Quellen, einer Festphasenextraktion an Anionenaustauscher-Materialien unterworfen. Das Anionenaustauschermaterial kann dabei als partikuläres Material in loser Schüttung, in Membranen angeordnet oder in Form kompakter Disks vorliegen. Die Fest­ phasenextraktion an mit basischen Gruppen modifizierten gege­ benenfalls vernetzten Polysacchariden ist bevorzugt. Ins­ besondere können Materialien wie mit Diethylaminoethyl- Gruppen (DEAE) oder mit quartären Aminen modifizierte Poly­ saccharide eingesetzt werden. So können z. B. Materialien wie Sephadex® P 50 eingesetzt werden. DEAE modifizierte Trenn­ materialien werden insbesondere zur Trennung von Faktor IX eingesetzt. Bei der Festphasenextraktion wird die zu extra­ hierende Quelle mit dem Material, das in fester Form vor­ liegt, versetzt.

Die Festphasenextraktion wird vorzugsweise unter Bedingungen relativ geringer Ionenstärke durchgeführt. Nach gegebenen­ falls durchgeführten Waschschritten wird das Efluat gesammelt und kann dann anderen Aufarbeitungsschritten zugeführt werden.

So wird beispielsweise zur Trennung von Faktor IX die Probe vorzugsweise durch eine entsprechend modifizierte Membran filtriert. Das Filtrat kann dann gegebenenfalls weiter z. B. für die Albuminproduktion eingesetzt werden.

Die an der Membran oder dem entsprechenden Festphasenmaterial gebundenen Proteine Faktor II, insbesondere Faktor IX und Faktor X werden anschließend von der festen Phase unter Bedingungen höherer Ionenstärke eluiert. Vorteilhaft bei der Verwendung der DEAE oder mit quartären Aminen modifizierten Membranen ist insbesondere ihre mehrfache Einsetzbarkeit im Gegensatz zur Festphasenextraktion an oben genannten Fest­ phasenextraktionsmaterialien, insbesondere partikelförmiger Materialien.

Das an der festen Phase adsorbierte Material wird dann durch Einwirkung von Lösungen mit höherer Ionenstärke von dem Trä­ germaterial desorbiert. Die Ionenstärke der Fraktion wird dann durch geeignete Maßnahmen, wie Verdünnung oder Ultra­ filtration oder Diafiltration oder Zugabe Ionenstärke er­ höhender Mittel, an die zur Durchführung der nachfolgenden Trennschritte erforderlichen Bedingungen angepaßt.

Es kann sich daran eine Anionenaustauscher-Membranchroma­ tographie oder Affinitäts-Membranchromatographie mit immo­ bilisierten Substanzen mit hohem oder niedrigem Molekular­ gewicht, die eine hohe Affinität zu den zu isolierenden Vitamin K abhängigen Plasmakomponenten sowie Protein C und Protein S aufweisen, anschließen.

Auch an Materialien zur Durchführung der hydrophoben Wechsel­ wirkungs-Chromatographie (Hydrophobic Interaction Chromato­ graphy) kann dieser chromatographische Reinigungsschritt erfolgen.

Als Anionenaustauscher-Materialien kommen auch hier insbe­ sondere mit Diethylaminoethyl-Gruppen, bzw. mit quartären Aminen modifizierte Membranen in Betracht. Substanzen, die eine hohe Affinität zu den Vitamin K abhängigen Plasma­ komponenten sowie Protein C und Protein S aufweisen, können Immunaffinitätsliganden sein. Als Immunaffinitätsliganden kommen Antikörper, die gegen die zu isolierenden Faktoren gerichtet sind, in Frage. So können beispielsweise zur Isolierung von Faktor IX Membranen mit entsprechenden immo­ bilisierten Antikörpern gegen Faktor IX verwendet werden. Die nicht durch die Anionenaustauschermembran oder Immun­ affinitätsmembran zurückgehaltenen Substanzen werden aus­ gewaschen, gegebenenfalls aufgefangen und weiter verarbeitet.

Typische Liganden für die hydrophobe Chromatographie weisen eine abgestufte Hydrophobizität auf. Dazu gehören beispiels­ weise acyclische oder alicyclische aliphatische Verbindungen beispielsweise mit C₁ bis C₁₈ Alkylketten oder aromatische Verbindungen, die auch mit polar-protischen oder polar-a­ protischen Liganden wie Cyano-Gruppen modifiziert sein können. Als hydrophobe Liganden, die zur hydrophoben Wechselwirkungschromatographie befähigt sind, kommen insbe­ sondere Propyl-, Butyl-, Phenylgruppen, mit denen das Träger­ material modifiziert ist, und andere ähnliche Liganden mit abgestufter Hydrophobizität in Frage. Die Abstufung der Hydrophobizität kann auch durch polare Gruppen erfolgen. So sind insbesondere 2-Hydroxyaminoalkylgruppen, wie 2-Hydroxy­ aminopropylgruppen als hydrophobe Liganden zur Isolierung von Faktor IX geeignet.

Daran schließt sich eine weitere Fraktionierung der ad­ sorbierten Plasmakomponenten durch stufenweise Elution unter Änderung der Ionenstärke und/oder des pH-Wertes entweder mit Lösungsmittelsystemen höherer Ionenstärke, Lösungsmittel­ systeme mit anderer Polarität oder Lösungsmittelsystemen, die die Affinität zwischen Immunaffinitätsligand und Substrat aufheben, an. Zur Anpassung der Ionenstärke der aus der Mem­ bran austretenden Fraktion an die Bedingungen der weiteren Reinigung können dann die bereits weiter oben erwähnten Ver­ fahren Anwendung finden.

Der optionale Schritt f) des Anspruchs 1 beinhaltet eine Affinitätsmembranchromatographie. Als Affinitätsmembranchro­ matographie im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens wird auch die hydrophobe Chromatographie verstanden. Entsprechende Liganden wurden weiter oben bereits charakterisiert.

Die Affinitätschromatographie im Sinne des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft auch chromatographische Verfahren, bei dem mit Immunaffinitätsliganden modifizierte Membranen eingesetzt werden. Dabei werden insbesondere an der Membran immobilisierte monoklonale Antikörper gegen die zu iso­ lierenden oder abzutrennenden Vitamin K abhängigen Plasmakom­ ponenten sowie Protein C und Protein S verwendet.

Die chromatographischen Trennoperationen zur Reinigung der Vitamin K abhängigen Plasmakonzentrate sowie Protein C und Protein S in der Probe können zum einen an mit Ionenaustau­ schergruppen modifizierten Grundmaterialien, insbesondere Anionenaustauschern, oder mit Immunaffinitätsliganden modifi­ zierten Materialien erfolgen.

In sehr vorteilhafter Weise sind die genannten chromato­ graphischen Materialien in Membranen angeordnet. Vorzugsweise bestehen die Membranen aus einem Grundmaterial wie modi­ fizierter Zellulose oder Kunststoffaser. Insbesondere sind Membranen sowie kompakte Disks aus porösen Polyglycidylmetha­ crylaten und/oder aus anderen porösen hydrophilen Polymeren mit ähnlicher Struktur, wie auch hydrophilisiertem Polystyrol, geeignet.

Im ersten Fall besteht eine zur Trennung geeignete Membran entweder aus aufeinander gestapelten dünnen porösen Folien aus Cellulose oder Kunststoffasern oder im zweiten Fall aus kompakten Scheiben aus Silicagel oder Polymerträgern. Die Grundmaterialien der Membranen oder Disks sind mit ent­ sprechenden Anionenaustauschergruppen oder Immunaffinitäts­ liganden versehen. Als Ionenaustauschergruppen kommen ins­ besondere Anionenaustauschergruppen wie quartäre Ammonium­ verbindungen oder Diethylaminoethyl-Gruppen (DEAE) in Frage. Als Kationenaustauscher kommen grundsätzlich schwach und stark saure Kationenaustauscher in Betracht, wie Materialien, die mit Sulfonsäure- oder Phosphorsäuregruppen modifiziert sind.

Die Ionenaustauschergruppen können ohne oder mit einem soge­ nannten Spacer an die Faser des Grundmaterials gebunden sein. Mit Spacer versehene Materialen werden auch als Tentakelmate­ rialien bezeichnet. In der DE 42 04 694 sind entsprechende Spacer und Liganden genannt. Als Spacer kann auch beispiels­ weise ein Glucosaminrest dienen. Auch an den Membranen aus porösem Polyglycidylmethacrylat oder den anderen genannten Materialien können Anionenaustauschergruppen wie DEAE oder quartäre Ammoniumverbindungen gebunden sein. Die Bindung der Anionenaustauschergruppen erfolgt dabei entweder direkt an das die Membran bildende Material oder ebenfalls über einen Spacer, z. B. einen Glucosaminrest.

In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Affinitätsmembran-Chromatographie mit immobilisierten nieder- oder hochmolekularen Substanzen, die eine hohe Affinität für die zu gewinnenden Vitamin K ab­ hängigen Plasmakomponenten sowie Protein C und Protein S aufweisen, verwendet, die vorzugsweise humanen oder murinen Ursprungs sind.

Die Substanzen mit Affinität für die Vitamin K abhängigen Plasmakomponenten, Faktoren II, VII, IX oder X sowie Protein C, Protein S, werden an den Träger mittels chemisch aktiver Gruppen immobilisiert. Vorzugsweise wird die aktive Gruppe nicht direkt am Trägermaterial angreifen, sondern am Ende eines Spacers. Die Immobilisierung der Substanzen für mit Affinität zu den Faktoren erfolgt durch Bindung an aktive Gruppen wie Tosyl, Tresyl, Hydrazid und andere. Entsprechende Verfahren sind bekannt aus T.M. Phillips "Affinity chromato­ graphy" in "Chromatography" (E. Heftmann, ed.), 5th ed. Else­ vier, Amsterdam 1992.

Die Antikörper können auch an Membranen mit Protein A- oder Protein G-Liganden voradsorbiert werden. Durch anschließende kovalente Vernetzung kann die Elution der Antikörper (Ausblu­ ten der Säule) verhindert werden. Für die Vernetzung der Antikörper an Protein A- oder Protein G-Membranen kann ein ähnliches Verfahren wie bei losen Trägern angewendet werden. Der Vorteil der Immobilisierung an das Protein A oder an das Protein G besteht darin, daß die Antikörper ausschließlich am konstanten Segment des Moleküls (F_c) immobilisiert werden. So bleibt der antigen-bindende Teil (F_ab) frei und ist in seiner Wechselwirkung mit den jeweiligen Faktoren nicht behindert.

Die Virusinaktivierung erfolgt durch Behandlung der nach einer chromatographischen Reinigung erhaltenen Fraktion mit Detergenzien wie ionischen und/oder nicht-ionischen Tensiden, z. B. in Gegenwart di- oder trialkylierter Phosphatver­ bindungen, wie beispielsweise Tri-n-Butylphosphat ent­ sprechend der in der EP 131 740 A1 beschriebenen Methode. Dabei kann grundsätzlich die Virusinaktivierung auch vor dem ersten chromatographischen Schritt erfolgen. Vorzugsweise werden Triton® X - 100 Tween/TNBP (Tri-n-butylphosphat) zur Virusinaktivierung verwendet. Gute Ergebnisse werden auch mit Natriumcholat/TNBP erzielt. Vorzugsweise werden Mengen von bis zu 15 Gew.-% an Detergenz eingesetzt.

Die Virusinaktivierung kann auch durch eine Hitzebehandlung erfolgen. Vorzugsweise wird dabei nach einer ersten Membran­ chromatographie die Vitamin K abhängige Plasmakonzentrate sowie Protein C und Protein S eluierte Probe einem Pasteuri­ sierungsschritt unterzogen. Ein entsprechendes Verfahren wird in der P 43 18 435.9 vorgeschlagen. Dabei werden Fraktionen, die Faktor VIII angereichert sind, in Gegenwart von Stabili­ satoren wie Zucker, Aminosäuren, bivalenten Kationen und/oder Heparin, mit Di- oder Trialkylphosphaten und gegebenenfalls Benetzungsmitteln in Kontakt gebracht und gleichzeitig oder aufeinanderfolgend bei erhöhter Temperatur im Bereich von 55°C bis 70°C für eine Zeitdauer von 5 Stunden bis 30 Stunden behandelt. Gegebenenfalls kann auch eine Filtration zur Entfernung von Viren durchgeführt werden.

Es kann vorteilhaft sein die beiden Methoden der Virusinakti­ vierung, der Behandlung mit Detergenzien und Hitze sowie der Filtration zu kombinieren.

Bei der Isolierung von Faktor IX wird der Pasteurisierungs­ schritt vorzugsweise nach Schritt f) des Anspruchs 1 durch­ geführt. Zur Entfernung der bei diesem Schritt eingesetzten Chemikalien kann eine weitere Membran-Chromatographie ange­ schlossen werden. Vorzugsweise erfolgt die Abtrennung der zugegebenen Stabilisatoren mit einer DEAE oder quartären Ammonium-Verbindungen, die über einen Spacer an der Ober­ fläche des chromatographischen Trägermaterials angeordnet sind, modifizierten Membran. Es ist ebenfalls möglich, die entsprechenden Liganden ohne Spacer an der Oberfläche des Trägermaterials anzuordnen.

Die Stabilisatoren werden von diesem Anionenaustauschermate­ rial unter den gewählten Bedingungen nicht retardiert, während die Faktoren an dem Chromatographie-Material adsor­ biert werden.

Die im allgemeinen aus niedermolekularen Stoffen bestehenden Stabilisatoren können aber auch durch Ultra- oder Diafiltra­ tion entfernt werden. Die erhaltenen an Vitamin K abhängigen Plasmakonzentrate, wie Protein C und Protein S angereicherten Fraktionen werden dann gegebenenfalls konzentriert. Als Kon­ zentrierungsmethoden bieten sich schonende Verfahren zum Ent­ zug des Lösungsmittels, überlicherweise Wasser, an. Dazu gehören insbesondere Verfahren, mit denen unter reduziertem Druck das Lösungsmittel entzogen wird, wie beispielsweise Lyophilisation (Gefriertrocknung) oder Sprühtrocknung.

Die Verwendung der Membran-Chromatographie im erfindungsgemä­ ßen Verfahren weist insbesondere den Vorteil auf, daß sich die chromatographische Trennung erheblich schneller durch­ führen läßt. Desweiteren können die zu verwendenden Membranen vielfach wiederverwendet werden. Demgegenüber kann bei Verwendung der Festphasenmaterialien des Standes der Technik dieses nicht wiederverwendet werden, sondern muß bereits nach einmaliger Verwendung entsorgt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der Isolierung von Faktor IX näher erläutert.

Beispiel 1

Aufgetautes Blutplasma wird mit Sephadex® P 50 einer Fest­ phasenextraktion unterzogen. Nach Elution der an der festen Phase adsorbierten Substanz wird diese Fraktion auf eine Ionenstärke entsprechend 10 bis 20 mM Natriumcitrat bei pH 7,4 eingestellt und einer Membranchromatographie an einer DEAE-QuickDisk (Durchmesser 25 mm; Dicke 3 mm) unterzogen. Der Druck beträgt ca. 3 bar. Dann wird mit einer Durchfluß­ rate von 5 mm pro Minute chromatographiert. Ein typisches Chromatogramm ist in Fig. 1 abgebildet. Die Fraktionen 2 und 4 werden gesammelt. Die Fraktion 2 enthält ein Gemisch von Faktor II und Faktor VII und kann einer weiteren Auf­ arbeitung zugeführt werden. Der Peak, der anschließend von der Säule eluiert, enthält eine Mischung von Faktor IX und Faktor X. Die Membranchromatographie wird mittels eines Gradienten durchgeführt, der ausgehend von der genannten Anfangspufferlösung zu einer Pufferlösung aus 1 M NaCl sowie 10 bis 20 mM Natriumcitrat pH 7,4 als Puffer B. Wird ein starker Anionenaustauscher mit hoher oberflächlicher Be­ setzung der Liganden verwendet, wird eine höhere Kapazität erreicht. Ein begrenzender Faktor ist dabei die Selektivität des Materials. Der Verlauf des Elutionsgradienten ist von der Stärke der Oberflächenbesetzung des Liganden auf dem Träger abhängig.

Die Mischung von Faktor IX und Faktor X wird dann einer weiteren Chromatographie unterzogen. Die Beladungskapazität des eingesetzten membranchromatographischen Materials ist bezogen auf die Menge des Materials gleich oder höher als diejenige des Materials in Partikelform.

Beispiel 2

Die gemäß Beispiel 1 gewonnene Faktor IX/X enthaltende Fraktion wird wie in Journal of Chromatography 632 (1993) 1-10 durchgeführt. Die gemäß Beispiel 1 erhaltene Faktor IX/X haltige Fraktion wird einer Heparinaffinitäts­ membranchromatographie an einer kompakten Disk unterzogen. Nach Auftrag aus einem Puffer mit relativ geringer Ionen­ stärke wird das Material mit einem Puffer einer Ionenstärke von etwa 500 mOsm gespült. Danach wird der Faktor IX mit einem Gradienten, beginnend bei ca. 500 mOsm auf etwa 1000 mOsm steigend, eluiert. Der dabei eluierende Faktor IX weist eine hohe Reinheit auf. Die Wiederverwendungsrate an Faktor IX ausgehend vom ersten Aufarbeitungsschritt beträgt ca. 87%.

Claims (13)

1. Verfahren zur Herstellung virusinaktivierte Vitamin K abhängige Plasmakomponenten sowie Protein C, Protein S, Faktoren II, VII, IX und/oder X sowie Kombinationen davon, wie beispielsweise PPSB Präparate enthaltender Mittel, wobei eine diese Komponenten enthaltende Quelle den folgenden Verfahrenschritten unterworfen wird

• a) Festphasenextraktion, der die zu trennenden Kom­ ponenten enthaltenden Quellen, an Anionenaus­ tauscher-Materialien in loser Schüttung, Membranen und/oder kompakten Disks unter Bedingungen relativ niedriger Ionenstärke, Abtrennung des austretenden Efluats und gegebenenfalls Zuführung des Efluats in weitere Aufarbeitungsverfahren zur Gewinnung anderer Stoffe,
• b) Elution des an der festen Phase adsorbierten Mate­ rials,
• c) gegebenenfalls Anpassung der Ionenstärke und/oder des pH-Wertes der das Eluat enthaltenden Fraktion an die Bedingungen des folgenden Reinigungs­ schrittes,
• d) Anionenaustauscher-Membranchromatographie, Affinitäts-Membranchromatographie mit immobili­ sierten hoch oder niedrig molekularen Substanzen mit hoher Affinität zu Vitamin K abhängigen Plasmakomponenten sowie Protein C und Protein S oder hydrophobe Wechselwirkungschromatographie,
• e) Fraktionierung einzelner Komponenten durch stufen­ weise Elution unter Änderung der Ionenstärke, der Polarität und/ oder des pH-Wertes gegebenenfalls,
• f) Membranaffinitätschromatographie,
• g) gegebenenfalls Auffangen des Eluats enthaltend die nicht bereits abgetrennten Proteine und gegebenen­ falls deren weitere Fraktionierung unter Wiederho­ lung des Schrittes f), wobei entsprechende Affini­ tätsmaterialien eingesetzt werden,
• h) Elution der an dem Affinitätsmaterial gebundenen Substanzen, unter die Affinitätsbindung auf­ hebenden Bedingungen, gefolgt von einer Kon­ zentrierung des Eluats, gegebenenfalls unter Verringerung des zur Elution von dem Affini­ tätsmaterial verwendeten Agens,

und die Virusinaktivierung mittels ionischer und/oder nicht ionischer Detergenzien vor jeweils einem chroma­ tographischen Reinigungsschritt stattfindet und/oder durch eine Wärmebehandlung und/oder an geeigneter Stelle eine Filtration zur Virusentfernung erfolgt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Vitamin K ab­ hängigen Plasmakomponenten, wie Protein C und Protein S enthaltende Quelle Blutplasma in frischer oder auf­ getauter Form ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und/oder 2, wobei die Fest­ phasenextraktion an mit basischen Gruppen modifizier­ tem, vernetztem Polysaccharid wie Sephadex® oder mit entsprechend modifizierten Anionenaustauscher-Membranen erfolgt.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Membran-Chromatographie an mit DEAE oder mit quartären Aminen modifizierten Membranen oder mit Mem­ branen durchgeführt wird, die mit niedrig oder hoch molekularen Affinitätsliganden, die die gewünschten Plasmakomponenten spezifisch binden können, modifiziert sind (Membranaffinitätschromatographie).

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Affinitätschromatographie eine Heparin-Mem­ branaffinitätschromatographie, Membranimmun­ affinitätschromatographie mit immobilisierten Anti­ körpern gegen die zu isolierende Substanz oder Membran­ affinitätschromatographie mit hydrophoben Liganden modifizierten Membranen ist.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die hydrophoben Liganden zur Modifizierung des chromatographischen Trägers, 2-Hydroxyaminoalkyl-Gruppen wie 2-Hydroxy­ aminopropyl und/oder hydrophobe Liganden wie Propyl-, Butyl-, Phenylgruppen und andere ähnliche Liganden mit abgestufter Hydrophobizität sind.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Anpassung der Ionenstärke nach den chromato­ graphischen Schritten durch Verdünnung- oder Ent­ salzungsverfahren, wie Dia- oder Ultrafiltration er­ folgt oder durch Zusatz die Ionenstärke erhöhender Mittel.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei der Virusinaktivierungsschritt durch Behandlung einer nach einer chromatographischen Reinigung er­ haltenen Fraktion mit Detergenzien, wie ionischen und/oder nicht-ionischen Tensiden in Gegenwart von Di- oder Trialkylphosphatverbindungen, wie Tri-n-Butyl­ phosphat erfolgt.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Virusinaktivierung durch Erwärmung der Fraktion auf 55 bis 70°C für eine Dauer von 5 bis 30 Stunden in Gegenwart von Stabilisatoren wie Zucker, Aminosäuren, bivalenten Kationen und/oder Heparin erfolgt.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Stabilisatoren durch Entsalzungsverfahren, wie Diafiltration oder Ul­ trafiltration durch Heparin-Affinitätschromatographie oder Anionenaustauscher-Chromatographie oder an mit DEAE oder quartären Ammoniumverbindungen modifizierten Trägern oder mit hydrophoben Liganden modifizierten Trägern erfolgt.

11. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei das Chromatographiematerial in loser Schüttung angeordnetes partikuläres Material ist, in Membranen eingebettetes Material ist und/oder kompakte Disks aus den entsprechenden Materialien ist.

12. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die erhaltenen Fraktionen durch Lyophilisation oder Sprühtrocknung konzentriert werden.