DD292262A5 - Verwendung von modifizierten nylonfolien fuer die reinigung von proteinen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer kommerziell zur kovalenten Fixierung von Proteinen hergestellten Nylonfolie fuer die Anreicherung von Proteinen aus Zellhomogenaten oder anderen Quellen, indem die nicht vorhersehbare Eigenschaft der Folie zur selektiven und nicht-kovalenten Bindung von Proteinen und deren selektive Abloesung ausgenutzt wird. Dadurch lassen sich Enzyme und andere Proteine aus Homogenaten in einem einzigen Schritt 10-100fach anreichern, bzw. bereits teilgereinigte Proteine bis zur Homogenitaet reinigen oder unerwuenschte Enzymaktivitaeten aus Proteinpraeparaten entfernen. So aufbereitete Proteine finden u. a. in der medizinischen Diagnostik und Forschung und in der Lebensmittelindustrie Anwendung.{Affinitaetschromatographie; Enzyme; Kinase; Proteine; Affinitaetselution; Serumproteine; Nukleotide; Proteinreinigung; Membranen; Nylonfolien}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft die Verwendung modifizierter Nylonfolien für die Reinigung von Proteinen.

Charakterisierung des Standes der Technik

Zur Reinigung von Proteinen finden eine Reihe von allgemeinen und spezifischen Techniken Anwendung. So sind Fällungsreaktionen durch Salze, organische Lösungsmittel u.a. Substanzen, Ionenaustausch-, Affinitäts- u.a.

chromatographische Verfahren, die Unterschiede in Ladung, Molekülgröße und spezifischen Bindungseigenschaften ausnutzen, gebräuchlich. Zum Beispiel, wird bei der Affinitätschromatographie ein mehr oder weniger spezifischer Ligand an eine unlösliche Matrix gebunden. Durch Bindung der Proteine aus Zellhomogenaten oder anderen biologischen Flüssigkeiten, durch Waschen der Matrix zur Entfernung ungebundener Eiweiße und Fremdsubstanzen und durch nachfolgende spezifische Ablösung lassen sich in der praktischen Anwendung mit einer solchen Technik Reinigungsfaktoren bis etwa 100 erreichen. Derartige Affinitätssorptionen sind in Batch- oder säulenchrcmatographischen methodischen Anwendungen gebräuchlich. Die Wahl der Liganden und Matrizen sowie die Kopplungsmethoden der Liganden an die Träger variieren und erfordern oftmals einen beträchtlichen Aufwand

Zusammenfassende Darstellungen dieser Methodik finden sich bei

Lowe, C. R. und Dean, P. D. G. Affinity chromatography, John Wiley & Sons, London, 1974

Eckstein, F. und Sundaram, P.V. (Hrsg.), Theory and practice in affinity chromatography. Academic Press, New York, 1978. Die Nachteile dieser Techniken liegen in der teilweise instabilen Matrix, die durch chemische Agentien oder mikrobiologische Zersetzung Veränderungen unterliegen können oder in der zu starken Hydrophobizität von chemisch inerten Trägern, was in der Regel zu einer unspezifischen Bindung führt. Im allgemeinen müssen partikelfreie Lösungen als Quelle der zu reinigenden Enzyme eingesetzt werden, um Verstopfungen oder unerwünschte Verunreinigungen der Affinitätsgele zu vermeiden, was zusätzliche Aufarbeitungen (Filtrationen, Zentrifugationen) von Zellhomogenaten erfordert.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, ein Affinitätssorbens aufzufinden, das frei ist von den Nachteilen bekannter Sorbentien. Es soll leicht zugänglich ssin, hinreichende Selektivität aufweisen und regenerierbar sein. Eine Vorbehandlung zu Beginn des Einsatzes soll sich cuf einfache Schritte beschränken, um die Adsorption von Proteinen und deren nachfolgende Desorption kostengünstig zu gestalten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Erfindung hat die Aufgabe, ein stabiles Affinitätssorbens vorzuschlagen, das zur affinitätschromatographischen Proteinbindung geeignet ist und in technisch einfacher Weise die Adsorption von Proteinen aus partikelhaltigen Lösungen zu deren Gewinnung bewirkt oder zur Reinigung entsprechender Lösungen von speziellen Proteinen geeignet ist.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß Nylonmembranen mit der Bezeichnung IMMUNODYNE® der Firma PALL Filtralionstechnii' diese Anforderungen erfüllt. Die genannte Folie wird produziert zum Zwecke der irreversiblen Fixierung von Proteinen, z. B. von Antikörpern, was durch eine reaktive Gruppe bewirkt wird, die auf die Folienoberfläche aufgebracht ist. Nach dar Proteinfixierung wird die Folie für entsprechende Zwecke eingesetzt. Unerwartet läßt sich die Proteinbindung reversibel gestallen, wenn auf die Ligandierung verzichtet wird und die Folien durch Behandlung mit alkalischer Lösung zunächst inaktiviert werden und anschließend ohne weitere Veränderung in technisch sehr einfacher Weise als Äff initätssorbens eingesetzt werden. Es zeigte sich, daß aus einem Zellhomogenat die Bindung von Proteinen hinreichend selektiv ist und daß mit der Desorption durch Zusatz eines biospezifischen Liganden zum VWschpuffer eine noch höhere Selektivität in bezug auf die Art der abgelösten Proteine erreicht wird. Nach der Verwendung der Folien lassen diese sich durch Behandlung mit alkalischen Lösungen oder mit Detergentien regenerieren und beliebig oft wiederverwenden

Die Erfindung soll an nachstehenden Durchführungsbeispielen erläutert werden:

Ausführungsbeispiele

Vorbeugung der Immup.odyne-Membran

Die Membran wird auf eine Größe von 1Ox 15cm geschnitten und an die Innenseite einer Kunststoffflasche angelegt. In waagerechter Lage wird die Flasche an eine drehbare Achse angelegt. In dieser Anordnung läßt sich die Folie mit den angegebenen Lösungen behandeln. Das Volumen der eingesetzten Lösungen muß so groß sein, daß die Folie über ihre gesamte Breite etwa 1 cm (abhängig vom Durchmesser der verwendeten Flasche) benetzt wird.

Vor jedem Einsatz wird die Folie mit 0,01 N Natronlauge behandelt und danach mit Wasser gewaschen. War die Folie bereits benutzt, wird sie durch mehrfache Behandlung mit 0,01 N NaOH oder mit 0,1 % Natriumdodecylsulfat regeneriert. Vor der unmittelbaren Verwendung wird sie mit dem angegebenen Puffersystem äquilibriert.

Beispiel I

3g Hefemasse werden in 3ml Phosphatpuffer (5OmM Na-Phosphat, 5mM Mercaptoethanol, pH7,2) suspendiert und mit 5g Glasperlen (Durchmesser 0,5 mm) vermischt. Der Ansatz wird in mehreren Zyklen intensiv geschüttelt, was zum Aufschluß der Hefezellen führt. Die Glasperlen setzen sich innerhalb von Sekunden am Boden ab. Der Überstand wird abgetrennt und als Zellhomogenat verwendet.

4 ml des Zellhomogenates werden auf die Folie gegeben und der Ansatz zwei Stunden bei Raumtemperatur oder unter Kühlraumbedingungen unter Drehen inkubiert. Das Zellhomogenat wird anschließend verworfen und die Folie mit dem Aufschlußpuffer gewaschen. Anschließend wird die Folie mit 3ml Aufschlußpuffer, der 1OmM ATP enthält, 20 min behandelt. Im Ablösepuffer befinden sich dann Proteine in vom Homogenat abweichenden qualitativen und quantitativen Verhältnis. So ergeben sich für das Enzym Phosphofruktokinase spezifische Aktivitäten von 15p/mg und für das enzym Phosphoglyceratkinase von 200p/mg. Vergleicht man die erhaltenen spezifischen Aktivitäten mit denen im Überstand des hochtourig zentrifugieren Homogenates ergeben sich Reinigungsfaktoren von 40 für Phosphofruktokinase bzw. von 100 für Phosphoglyceratkinase. Im Ablösepuffer ist ATP durch AMP und NADP substituierbar. Die Bindungskapazität der Membran beträgt etwa 10pg/cm² für beide Enzyme.

Beispiel Il

Hefezellen werden wie in Beispiel I behandelt und 4 ml des Zellhomogenates auf die Folie gegeben. Nach Inkubation über zwei Stunden wird die Folie von ungebundenem Material mit Aufschlußpuffer frei gewaschen und anschließend 30min mit 3ml Aufschlußpuffer, der 5 mM NAD⁺ enthält, behandelt. Die Lösung wird erneuert und die Folie für weitere 30 min gewaschen. Nach zweimaligem Waschen mit Aufschlußpuffer werden Phosphofruktokinase und Phosphoglyceratkinase durch 1OmMATP, 1OmM AMP oder 1OmM NADP selektiv wie in Beispiel I abgelöst. Die spezifischen Aktivitäten liegen dann für Phosphofruktokinase bei 25U/mg und für Phosphoglyceratkinase bei 320U/mg.

Beispiel Hf

Glycerolphosphatdehydrogenase, die nach SCOPES und STOTER (Meth.Enzymol.90,479 [19821) aus Kaninchenmuskel gereinigt worden war, enthält als Fremdaktivität bis zu 15% Phosphofruktokinase.

Zur Entfernung dieser Fremdaktivität werden 600U Glycerolphosphatdehydrogenase in einem Volumen von 4ml 20min wie in Beispiel I mit der Immunodyne-Folie behandelt. Die Folie war mit 0,02 M Trirnethylamin behandelt worden. Das Enzvmpräparat war gegen 5OmM Natriumphosphatpuffer dialysiert worden. Nach 20 min wird die Behandlung mit einer neuen Folie fortgesetzt.

590 U der Glycerolphosphatdehydrogenase werden danach wiedergefunden. Die Aktivität von Phosphofruktokinase liegt dann

Die an die Folie gebundene Kaninchenmuskel-Phosphofruktokinase läßt sich mit 10mM ATP spezifisch ablösen (siehe Beispiel I).

Beispiel IV

Die Folie wird mit 2OmM r atriumphosphatpu'.er, pH7,0, äquilibriert. 0,5ml frisches Human-Plasma, dialysiert gegen den Äqulibrierungspuffer, werden 30 min mit der Folie wie in Beispiel I behandelt. Das Plasma ist anschließend frei von ß-Lipoprotein. Die Kontrolle des an die Folie gebundenen Proteins nach dessen Ablösung mit 0,01 M Natronlauge zeigt die Anwesenheit von ß-Lipoprotein neben einem im Makroglobulinbereich lokalisierten Protein.

Claims (6)

1. Verwendung von modifizierten Nylonfolien für die Reinigung von Proteinen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Folie mit der Bezeichnung IMMUNODYNE® der Firma PALL Filtrationstechnik eingesetzt wird.

2. Verwendung von modifizierten Nylonfolien für die Reinigung von Proteinen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Folie mit anorganischen oder organischen alkalischen Lösungen behandelt wird, z.3. durch Benetzen mit verdünnter NaOH, Na₂COa, Trimethylamin o.dgl.

3. Verwendung von modifizierten Nylonfolien für die Reinigung von Proteinen nach Anspruch 1,

dadurch gekennzeichnet, daß die Folie nach Regenerierung mit alkalischen Lösungen oder Detergentien erneut verwendet werden kann.

4. Verwendung von modifizierten Nylonfolien für die Reinigung von Proteinen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Enzyme aus biologischen Flüssigkeiten adsorptiv gebunden werden und im weiteren desorbiert und rein gewonnen werden.

5. Verwendung von modifizierten Nylonfolien für die Reinigung von Proteinen nach Anspruch 1 bis 4,

dadurch gekennzeichnet, daß ATP-abhängige Enzyme, insbesondere Kinasen, selektiv adsorbiert werden.

6. Verwendung von modifizierten Nylonfolien für die Reinigung von Proteinen nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß nicht ATP-abhängige Proteine wie ß-Lipoproteine, Subklassen von Immunglobulinen wie IgM, IgE selektiv adsorbiert werden.