DE4421895A1 - Verfahren zur Isolierung von Isolektinen aus der Mistel - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Isolektinen aus der Mistel vom Typ ML I, Mistel­ isolektine des Typ ML I, deren biologisch aktiven Fragmente erhältlich durch Peptidbindungen spaltende Mittel sowie ein Diagnostikmittel erhältlich durch Immunisierung von Säugern mit den erfindungsgemäßen Isolektinen.

Mistellektine sind biologisch aktive Proteine, welche als immun­ stimulierend/modulierend und cytotoxisch wirkend beschrieben sind.

Man unterscheidet drei Gruppen von Isolektinen, die in der Mistel vorkommen, beispielsweise Mistellektin I, II, III. Das Mistellektin I besteht aus einer A- und B-Kette, die durch reduktive Spaltung des Mistellektins gewonnen werden können.

Zur Gewinnung einzelner Ketten des Mistellektins I wird dieses gemäß DD 2 96 703 in homogener Phase in Anwesenheit von 20 bis 40 Vol.-% Glycerol reduziert. Das entstandene Gemisch wird auf eine Immunglobulin-Sepharose- oder eine Asialofetuin-Säule aufgebracht und danach nacheinander mit einem Waschpuffer und einem Elutionspuffer, die jeweils 20 bis 40 Vol.-% Glycerol enthalten, eluiert.

Die B-Kettenfraktion wird gegebenenfalls nachfolgend durch Affinitäts-Chromatographie an monoklonalen anti-ML I-A-Ketten- Antikörpern getrennt.

Die DE 42 21 836 betrifft ein biochemisch aufgereinigtes Mistel­ lektin (ML-I) als therapeutisch anwendbarer Immunmodulator. Die­ se Substanz wird aus wäßrigem Mistelextrakt gewonnen und gerei­ nigt. Das ML I besteht aus je einer toxischen A-Kette und einer zuckerbindenden B-Kette. Es sind in der Offenlegungsschrift auch Strukturdaten genannt. Dabei existieren zwei unterschiedliche Modifikationen der A-Kette. Die Ketten wurden jeweils vom N- Terminus beginnend partiell sequenziert.

Das in der DE 42 21 836 beschriebene Verfahren ist nachteilig, da es bei der Reinigung keine reinen Isolektin-Fraktionen ergibt, sondern ein komplexes von Gemisch von Isolektinen isoliert wird, das weiteren chromatographischen Reinigungen widersteht. Dies ist überwiegend auf Bildung von Dimeren oder anderen Aggregaten zurückzuführen, die nur unter denaturierenden Bedingungen, beispielsweise SDS-Gelelektrophorese, aufgebrochen werden können. Solche Strukturen stellen jedoch keine nativen Lektine dar, die pharmakologisch-toxikologischen Untersuchung zugeführt werden können. Eine Renaturierung des mittels denatu­ rierender Verfahren gewonnenen Mistellektins ist bislang nicht gelungen.

Die DE 42 29 876 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von Lektinen aus Mistelpflanzen, wobei aus frischen oder getrock­ neten Mistelpflanzen ein Extrakt gewonnen wird, der die Mistel­ lektine I bis III enthält. Das Verfahren geht aus von einer Batch-Adsorption des wäßrigen Mistelpflanzenextraks gefolgt von einer Affinitätsadsorption an Lactosyl-Sepharose. Nachfolgend werden die zwei erhaltenen Fraktionen durch Ionenaustauscher- Chromatographie in einzelne Lektinfraktionen getrennt.

Durch Chromatographie der ML I-Fraktion an einer Kationenaustau­ schersäule mit steigendem Kochsalzgradienten werden zwei Sub­ fraktionen der Lektine ML I, nämlich ML I-1 und ML I-2 erhalten. Auch dieses Verfahren liefert die angesprochenen Isolektine lediglich in analytischen Mengen, die eine präparative Gewinnung nicht zuläßt. Mit diesem Gewinnungsverfahren lassen sich Isolek­ tine nicht in hinreichender Menge herstellen, um zuverlässige biochemische, pharmakologische und toxikologische Daten über die Isolektine zu ermitteln. Das beschriebene Verfahren liefert auch Isolektine, die nicht mehr trennbar sind, möglicherweise aufgrund von Dimerisierungen, die unter nicht denaturierenden Bedingungen nicht aufgehoben werden können.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht zunächst darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt, die oben genannten Nachteile zu vermeiden, insbesondere in reproduzierbarer Weise die Anzahl der Lektinverbindungen im Gemisch zu reduzieren. Das Verfahren soll insbesondere die Isolektine ML I-1 und ML I-2 aber nicht deren gemischte Ag­ gregationsprodukte liefert. Weiterhin soll das Verfahren ML I-1 sowie ML I-2 Fraktionen in präparativ handhabbaren Mengen liefern.

Überraschenderweise wurde das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Die sich daran anschließenden Unteransprüche 2 bis 5 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsge­ mäßen Verfahrens.

Anspruch 6 betrifft Isolektine aus der Mistel erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Anspruch 7 betrifft biologisch aktive Fragmente der erfindungsgemäßen Isolektine der Mistel. Anspruch 8 betrifft ein Diagnostikmittel erhältlich durch Immunisierung von Säugetieren durch Verwendung der erfindungs­ gemäßen Isolektine.

Erfindungsgemäß wird Birke oder Ahorn als Wirtspflanze verwen­ det. Die darauf kultivierten Mistelpflanzen werden als Frisch­ pflanzen geerntet und zerkleinert, danach mit destilliertem Wasser gerührt und der resultierende filtrierte Extrakt wird mit Essigsäure angesäuert. Nach Zentrifugation wird der Über­ stand mit einem geeigneten Kationenaustauscher, bevorzugt SP- Sephadex, gerührt. Der Kationenaustauscher adsorbiert die lektinhaltige Proteinfraktion, die nach Waschen mit einer Pufferlösung mit einem basischen Puffer höherer Ionenstärke eluiert wird. Neben dem Batch-Verfahren kann das erfindungsge­ mäße Verfahren auch als säulen-chromatographisches Verfahren durchgeführt werden. Aus der Rohlektinlösung werden die Lektine biospezifisch an geeigneten Affinitätsträgern, vorzugsweise an Lactosyl-Sepharose, gebunden. Dabei können die Lektine der Typen II und III mit isotonischer phosphatgepufferter 0,8 bis 1%iger Kochsalzlösung eluiert werden, wohingegen das ML I nachfolgend spezifisch mit galactosehaltigen Lösungen eluiert wird. Durch Rechromatographie am Kationenaustauscher, vorzugsweise einem Mono-S-Chromatographiematerial, wird das ML I in die Lektine ML I-1 und ML I-2 getrennt.

Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Isolektine der Mistel ML I-1 und ML I-2 fallen in präparativ handhabbaren Mengen an, so daß pharmakologische und toxikologische Unter­ suchungen durchgeführt werden können.

Es ist dem Fachmann bekannt, daß Proteinstrukturen durch pep­ tidspaltende Agenzien, wie Chemikalien oder Enzyme in Unterab­ schnitte zerlegt werden können. Diese Bruchstücke können eine ähnliche biologische Aktivität wie die der Stammverbindung aufweisen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Bruchstücke der Mistelisolektine, die sich aus der Aminosäuresequenz, wie sie oben angegeben ist, ableiten lassen z. B. durch spezifische, peptidbindung- spaltende Reagenzien wie Cyanogenbromid oder durch Behandlung mit spezifischen Proteasen wie Endoproteasen.

Erfindungsgemäß beansprucht werden solche Peptide, die eine biologische Aktivität z. B. als Immunmodulator oder eine antige­ ne Struktur aufweisen.

Durch Immunisierung von Säugern mit den Isolektinen aus der Mistel oder deren Bruchstücken lassen sich wertvolle diagno­ stische Mittel erhalten. Diese Diagnostikmittel sind z. B. mono- oder polyklonale Antikörper oder antiidiotype Antikörper, die durch Immunisierung von Kaninchen erhalten werden können.

Die Erfindung wird anhand des folgenden Ausführungsbeispiels näher erläutert.

1. Reagenzien und Ausgangsstoffe

Mistelpflanze (Viscum album L. oder andere Spezies) von ver­ schiedenen Wirtsbäumen; als Frischpflanze, getrocknetes Pulver oder Misteltee.

Essigsäure: 2 M
Acetatpuffer: 0,1 M, pH 4,0
Acetatpuffer: 0,015 M, pH 3,8
Citratpuffer: 0,015 M, pH 3,8, NaCl-Gradient von 0 bis 0,6 M
Trispuffer: 0,1 M, 0,5 M NaCl, pH 8,0
Kochsalzlösung: 0,9% in dest. Wasser
Galaktose-Lösung: 0,1 M, 0,9% NaCl
Ammoniumsulfatlösung: 3 M
Ammoniumsulfat
SP-Sephadex C-50®, Pharmacia
Lactosyl-Sepharose 4B, Lactosyl-Sepharose 4CL, Lactosyl-Sepha­ cryl 400
Mono-S-Säule®, Pharmacia

2. Isolierung und Trennung der Lektine ML I, ML II, ML III, ML I-1 und ML I-2

Frischmistel von Birke oder Ahorn werden geerntet. Frischpflan­ ze: 250 g grob zerkleinert mit 500 ml. dest. Wasser homogeni­ siertes Material 1 Stunde gerührt. Die entstandene Suspension wird über ein grobmaschiges Tuch filtriert. Die stark getrübte gefärbte Lösung wird mit 2 M Essigsäure auf pH 4,0 eingestellt. Der resultierende Niederschlag wird durch 10minütiges Zentrifu­ gieren bei 5000 × g abgetrennt. Dem klaren Zentrifugat werden 4 g festes, gequollenes SP-Sephadex C-50® zugesetzt, und es wird 1 Stunde gerührt. Der Ionenaustauscher wird über eine Glasfil­ ternutsche abgetrennt und mit 0,1 M Acetatpuffer, pH 4,0 solange gewaschen, bis der Waschpuffer farblos die Nutsche verläßt. Die adsorbierten Proteine werden anschließend mit 0,1 M Trispuffer (0,5 M NaCl, pH 8,0) nach dem Säulenverfahren eluiert. Die re­ sultierende Rohlektinlösung wird über eine Lactosyl-Sepharose- Säule mit 100 ml Bettvolumen gegeben. Nachgewaschen wird wird die Säule mit dem dreifachen Säulenvolumen 0,9%iger Kochsalzlö­ sung. Die letzten 200 ml enthalten die Lektine II und III. Das ML I wird anschließend mit 1 Säulenvolumen 0,1 M Galaktoselösung eluiert.

Die ML II/III-Fraktion wird auf 1/10 eingeengt und darauf über einer Sephadex-G 25-Säule in 0,015 M Citratpuffer, pH 3,8 umge­ puffert. Diese Lösung wird an einer Mono-S-Säule (10/10 Mono-S, Pharmacia) chromatographiert. Mit einem Kochsalzgradienten von 0 bis 0,5 M in einem 0,015 M Citratpuffer, pH 3,8 und einem Ge­ samtvolumen von 160 ml werden die Lektine II und III nachein­ ander eluiert. Die beiden so erhaltenen Fraktionen werden unter diesen Bedingungen rechromatographiert. Das ML II wird bei 0,15 M und das ML III bei 0,21 M Nacl eluiert.

Die Rechromatographie der isolierten ML I-Fraktion, umgepuffert in 0,015 M Citratpuffer, pH 3,8 and Mono-S (10/10) mit einem NaCL-Grandienten von 0,2 bis 0,6 M in Citratpuffer (0,015 M, pH 3,8) ergibt die Lektine ML I-1 bei einer NaCl-Konzentration von 0,36 M und das ML I-2 bei 0,42 M.

Alle drei Lektine sind suspendiert in 3 M Ammoniumsulfatlösung mindestens 5 Jahre ohne Aktivitätsverlust und Beeinträchtigung der Löslichkeiten haltbar.

Claims (8)

1. Verfahren zur Isolierung von Isolektinen aus der Mistel vom Typ ML I, wobei

• - Mistelpflanzen von Birke oder Ahorn als Wirtspflanze als Frischpflanzen geerntet, zerkleinert, in wäßrigem Milieu suspendiert werden,
• - die wäßrige Suspension wird gegebenenfalls filtriert und auf einen pH-Wert < 7 eingestellt,
• - gegebenenfalls zentrifugiert, der erhaltene Überstand mit einem Kationenaustauscher behandelt, die eluie­ rende Fraktion, enthaltend die Lektine aus der Mi­ stel, aufgefangen,
• - gefolgt von einer Chromatographie an Lactosyl-modifi­ zierten Trägermaterialien und
• - Desorption der Lektine des Typs ML I durch Behandlung des Lactosyl-modifizierten Trägermaterials, Trennung an Kationenaustauscher mit anschließendem Auffangen der Mistellektin-Fraktionen vom Typ ML I-1 und ML I-2.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kationenaustauscher SP-Sephadex und das Lactosyl-modifizierte Trägermaterial Lactosyl-Sepharose ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und/oder 2, wobei die Behandlung der wäßrigen Aufschlußlösung mit Kationenaus­ tauscher im Batch-Verfahren und/oder Säulenchromatographie erfolgt.

4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Behandlung mit Lactosyl-modifizierten Träger­ materialien im Batch-Verfahren und/oder durch Säulenchroma­ tographie erfolgt.

5. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wo­ bei die ML I-Fraktionen vom Kationenaustauscher mit einer 0,2 bis 0,6 M Kochsalzgradientenlösung eluiert werden, wo­ bei bei niedriger Ionenstärke ML I-1 und bei höheren Ionen­ stärke ML I-2 eluiert.

6. Mistellektine vom Typ ML I-1 und ML I-2 erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 sowie Fragmente erhältlich durch reduktive Spaltung mit Disulfid­ bindungen spaltenden Reagenzien.

7. Mistellektine, wobei die Lektine erhältlich sind durch Behandlung der Mistellektine nach Anspruch 6 mit spezifi­ schen Peptidbindungen spaltenden chemischen Reagenzien oder Peptidbindungen spaltenden Enzymen und Isolierung der Bruchstücke mit immunmodulatorischer Wirkung.

8. Diagnostikmittel mit mono- oder polyklonalen Antikörpern oder Antiidiotypen, erhältlich durch Immunisierung von Säugern mit den Mistellektinen gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 und/oder 7.