JPH10504287A

JPH10504287A - ヤドリギからイソレクチンを単離する方法

Info

Publication number: JPH10504287A
Application number: JP8502798A
Authority: JP
Inventors: ルドルフアイフラー; ウーベフューラー
Original assignee: プリバーテユニベルジテートヴィッテン／ヘルデッケゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング
Priority date: 1994-06-23
Filing date: 1995-06-23
Publication date: 1998-04-28
Also published as: AU2887595A; EP0766697A1; WO1996000239A1; DE4421895A1

Abstract

(57)【要約】ヤドリギからMLＩ型イソレクチンを単離する方法であって；樺又は楓をホスト植物とするヤドリギ類植物を新鮮な植物として採取し、これを粉砕して水性媒体中に懸濁し、この水性懸濁液を任意に濾過し、pHを７未満に調節し、任意に遠心分離し、得られた上澄液を陽イオン交換剤で処理し、ヤドリギ由来のレクチンを含む溶出画分を収集し、ラクトシルで改質した支持材料上でクロマトグラフィーを行い、前記ラクトシル改質支持材料を処理することによってMLＩ型レクチンを脱着し、陽イオン交換体上で分離し、MLＩ-1型及びMLＩ-2型ヤドリギレクチン画分を収集する各工程を含む方法。請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載される方法によって得ることができるMLＩ-1型及びMLＩ-2型ヤドリギレクチン、及び、ジスルフィド結合開裂剤を用いた還元的開裂によって得ることができるフラグメント。

Description

【発明の詳細な説明】ヤドリギからイソレクチンを単離する方法本発明は、ヤドリギからMLＩ型イソレクチンを単離する方法、MLＩ型ヤドリギイソレクチン、ペプチド結合開裂剤を作用させることによって得ることができる MLＩ型ヤドリギイソレクチンの生物学的活性フラグメント、及び本発明のイソレクチンで動物を免疫することによって得ることができる診断剤に関する。ヤドリギレクチンは、免疫刺激作用／免疫活性調節作用を有し、細胞毒性を示すものと記載されている生物学的活性蛋白質である。ヤドリギ中に存在するイソレクチンは３つのグループ、例えばＩ型、II型、II I型ヤドリギレクチンに分類される。Ｉ型ヤドリギイフレクチンは、ヤドリギレクチンを還元分解することによって得られるＡ鎖及びＢ鎖からなる。Ｉ型ヤドリギレクチンのＡ鎖及びＢ鎖は、ＤＤ296,703号公報にしたかってＩ型ヤドリギレクチンを２０〜４０体積％のグリセロールを含む均一相で還元し、得られた混合物を免疫グロブリンセファロース又はアシアロフェチュインカラムにチャージして、２０〜４０体積％のグリセロールをそれぞれ含む洗浄用緩衝剤と溶出用緩衝剤で連続的に溶出することによって得ることができる。あるいは、その後さらに、モノクローナル抗MLＩ−Ａ鎖抗体上でアフィニティクロマトグラフィーを行うことによってＢ鎖画分を分離することもできる。ドイツ特許公開第4,221,836号公報には、治療用に供し得る免疫活性調節剤として生化学的に単離精製したヤドリギレクチン（MLＩ）を使用することが記載されている。このヤドリギレクチンは、水性ヤドリギ抽出物から単離精製している。MLＩ型ヤドリギレクチンは毒性Ａ鎖と糖結合Ｂ鎖を含んでおり、この公開公報にはその構造に関するデータも記載されている。Ａ鎖には２種類の変形があり、各鎖の配列はそれぞれＮ末端から部分的に決定されている。しかしながら、ドイツ特許公開第4,221,836号公報に記載される方法には、精製によって純粋なイソレクチン画分を単離できないという欠点がある。精製を行ってもイソレクチンの複雑な混合物が得られるだけであり、この混合物をさらにクロマトグラフィーで精製することはできない。これは、主としてＳＤＳゲル電気泳動のような変性条件下でのみ破壊され得る二量体やその他の会合体が生成するからである。その生成物の構造は、薬理／毒性試験に供し得る天然のレクチンとは異なっている。このような変性法によって得られたヤドリギレクチンの再生法は、いまだ開発されていない。ドイツ特許公開第4,229,876号公報には、ヤドリギ類植物からレクチンを単離する方法が記載されている。この公報では、新鮮な(fresh)乾燥ヤドリギ類植物からＩ〜III型ヤドリギレクチンを含む抽出物を得ている。この方法は、水性ヤドリギ抽出物をバッチ吸着させ、ラクトシルセファロース上にアフィニティ吸着させるものである。得られる２つのレクチン画分は、イオン交換クロマトグラフィ一法によって各レクチン画分に分離している。 MLＩ画分に対して、陽イオン交換カラムを用いて塩化ナトリウム傾斜濃度でクロマトグラフィーを行うことにより、MLＩ型レクチンの２つのサブ画分、すなわちMLＩ-1型及びMLＩ-2型レクチンを得ることができる。この方法による場合も、分析量の該イソレクチンが得られるだけであり、単離回収できる程の量は得られない。また、この分離法による場合、イソレクチンに関する信頼性が高い生化学的、薬理学的及び毒性データを取得することができるほど十分な量のイソレクチンを得ることはできない。さらに、この方法による場合も、非変性条件下では回避できない二量化が起こってしまうと考えられるため、得られるイソレクチンを分離することはできない。本発明は、上記欠点を回避すること、特に再生しうるように混合物中の多くのレクチン化合物を還元することができる方法を提供することを第１の目的とする。特に、本発明が目的とする方法は、MLＩ-1型及びMLＩ-2型イソレクチンを得るものであって、これらの混合会合生成物を得るものではない。また、この方法は単離できる量のMLＩ-1及びMLＩ-2画分を得るものである。驚くべきことに、これらの目的は、請求の範囲第１項に記載される特徴を有する方法によって達成された。従属する第２〜５項は、本発明の方法の好ましい実施態様に関するものである。請求の範囲第６項は、本発明の方法によってヤドリギから得ることができるイソレクチンに関する。第７項は、本発明のヤドリギレクチンの生物学的活性フラグメントに関する。第８項は、本発明のイソレクチンを用いて哺乳類を免疫することによって得ることができる診断剤に関する。本発明では、樺又は楓をホスト植物として用い、これらの植物上で生長したヤドリギ類植物を新鮮な植物として採取する。採取したヤドリギ類植物を蒸留水とともに攪拌し、抽出物を濾過した後、酢酸を用いて酸性にする。遠心分離をした後に、上澄液を適当な陽イオン交換体、好ましくはSPセファデックスとともに攪拌する。この陽イオン交換体は蛋白質画分を含むレクチンを吸着する。緩衝剤で洗浄した後、イオン強度がより高い塩基性の緩衝剤を用いて溶出する。バッチ工程に加えて、本発明の方法をカラムクロマトグラフィー法によって行うこともできる。得られた未精製レクチン溶液中のレクチンを、適当なアフィニティー材料、好ましくはラクトシルセファロースに生物学的特異的に結合させる。II型及び III型レクチンは、等張リン酸塩で緩衝液にした０．８〜１％塩化ナトリウム溶液で溶出することができる。MLＩは、その後ガラクトース含有溶液で特異的に溶出する。MLＩは、陽イオン交換体、好ましくはモノ−Ｓクロマトグラフィー材料上でさらにクロマトグラフィーを行うことによって、MLＩ-1型レクチンとMLＩ-2 型レクチンに分離する。本発明の方法によれば、薬理及び毒性試験を行うことができる程度の十分な量のMLＩ-1型及びMLＩ-2型ヤドリギレクチンを得ることができる。蛋白質は、化合物や酵素などのペプチド開裂剤によってサブフラグメントに開裂しうることが、当業者に知られている。これらのフラグメントは、開裂前の化合物と同様な生物学的活性を有しうる。本発明は、上述のアミノ酸配列に由来し得るヤドリギイソレクチンのフラグメントにも関する。このフラグメントは、例えば、臭化シアンなどの特異的なペプチド結合開裂剤や、エンドプロテアーゼなどの特異的なプロテアーゼで処理することによって得ることができる。例えば免疫活性調節剤として利用しうるような生物学的活性又は抗原構造を有する本発明のペプチドについて特許を請求している。ヤドリギ由来のイソレクチンまたはそのフラグメントで哺乳類を免疫することによって、価値ある診断剤を得ることができる。これらの診断剤は、例えば免疫ウサギから得ることができるモノクローナル又はポリクローナル抗体又はアンチイディオタイプの抗体である。以下に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明する。１．試薬と出発物質種々のホスト樹木から得られるヤドリギ類植物（Viscum album L．などの植物種）：新鮮な植物、乾燥粉末又はヤドリギティー（tea）酢酸：２Ｍ酢酸塩緩衝剤：0.1M，pH4.0 酢酸塩緩衝剤：0.015M，pH3.8 クエン酸塩緩衝剤：0.015Ｍ，pH3.8，塩化ナトリウム勾配０〜０.６Ｍトリス緩衝剤：0.1Ｍ，0.5Ｍ塩化ナトリウム，pH8.0 塩化ナトリウム溶液：0.9％蒸留水溶液ガラクトース溶液：0.1Ｍ，0.9％塩化ナトリウム硫酸アンモニウム溶液：３Ｍ硫酸アンモニウム SP−セファデックスＣ−50^TM，ファルマシアラクトシルセファロース４Ｂ，ラクトシルセファロース４CL，ラクトシルセファクリル400 モノ−Ｓカラム^TM，ファルマシア２．MLＩ、MLII、MLIII、MLＩ-1及びMLＩ-2型レクチンの単離と分離樺又は楓由来の新鮮なヤドリギ250ｇを採取して、粗粉砕した。これを均質化して、500mlの蒸留水とともに１時間攪拌した。得られた懸濁液を目の粗い布で濾過して、かなり濁った着色液を得た。２Ｍ酢酸を用いてpHを4.0に調節し、生成した沈殿物を5000xgで１０分間遠心分離して除去した。残った透明液に固体状の膨潤SP−セファデックスＣ−50^TMを４ｇ添加して１時間攪拌した。イオン交換体をガラス吸引フィルターを用いて分離し、pH4.0の0.1Ｍ酢酸塩緩衝剤を用いて洗浄した。この洗浄は、吸引フィルターを通過する洗浄緩衝剤が透明になるまで行った。吸着したタンパク質を0.1Ｍトリス緩衝剤(0.5Ｍ塩化ナトリウム，pH8.0 )を用いてカラム法により溶出した。得られた未精製のレシチン溶液を、ベッド容積100mlのラクトシルセファロースカラムに通した。カラムをカラム容積の３倍量の0.9％塩化ナトリウム溶液で再洗浄したところ、最後の200mlにはII型レクチン及びIII型レクチンが含まれていた。MLＩは、その後にカラムと同体積の0.1Ｍガラクトース溶液で溶出された。 MLII／III画分の体積を1/10にして、セファデックスＧ25カラム中にてpH3.8の 0.015Ｍクエン酸塩緩衝剤を用いて再度緩衝液にした。この溶液に対して、塩化ナトリウム勾配0〜0.5の0.015Ｍクエン酸塩緩衝剤（pH3.8）を合計160ml用いてモノ−Ｓカラム（10/10モノ−Ｓ，ファルマシア）によるクロマトグラフィーを行うことによって、II型レクチン及びIII型レクチンを連続的に溶出した。得られた２つの画分に対して、この条件下で再度クロマトグラフィーを行った。MLII は塩化ナトリウム濃度0.15Ｍ、MLIIIは塩化ナトリウム濃度0.21Ｍでそれぞれ溶出した。単離したMLＩ画分を0.015Ｍクエン酸塩緩衝剤（pH3.8）で再度緩衝液にし、モノ−Ｓ(10/10)中にて塩化ナトリウム勾配0.2〜0.6Ｍで再度クロマトグラフィーを行った。MLＩ-1は塩化ナトリウム濃度0.36Ｍ、MLＩ-2は塩化ナトリウム濃度0. 42Ｍでそれぞれ溶出した。これら３種のレクチンを３Ｍ硫酸アンモニウム溶液中に懸濁したところ、すべて活性や溶解度を低下させることなく５年以上安定に存在した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者アイフラールドルフドイツ連邦共和国、ヴィッテンＤ− 58453、ストックマーシュトラーセ 10、インスティチュートフュアフィトケミエ、プリバーテユニベルジテートヴィッテン／ヘルデッケゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング (72)発明者フューラーウーベドイツ連邦共和国、ヴィッテンＤ− 58453、ストックマーシュトラーセ 10、インスティチュートフュアフィトケミエ、プリバーテユニベルジテートヴィッテン／ヘルデッケゲゼルシャフトミットベシュレンクテルハフツング

Claims

【特許請求の範囲】１．ヤドリギからMLＩ型イソレクチンを単離する方法であって、樺又は楓をホスト植物とするヤドリギ類植物を新鮮な植物として採取し、これを粉砕して水性媒体中に懸濁し、この水性懸濁液を任意に濾過し、pHを７未満に調節し、任意に遠心分離し、得られた上澄液を陽イオン交換剤で処理し、ヤドリギ由来のレクチンを含む溶出画分を収集し、ラクトシルで改質した支持材料上でクロマトグラフィーを行い、前記ラクトシル改質支持材料を処理することによってMLＩ型レクチンを脱着し、陽イオン交換体上で分離し、MLＩ-1型及びMLＩ-2型ヤドリギレクチン画分を収集する各工程を含む方法。２．陽イオン交換体がSPセファデックスであり、ラクトシル改質支持材料がラクトシルセファロースである請求の範囲第１項に記載される方法。３．水性抽出液の陽イオン交換体による処理を、バッチ工程及び／又はカラムクロマトグラフィーによって行う、請求の範囲第１項又は第２項に記載される方法。４．ラクトシル改質支持材料による処理を、バッチ工程及び／又はカラムクロマトグラフィーによって行う請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載される方法。５． MLＩ画分を0.2〜0.6Ｍの塩化ナトリウム濃度勾配を用いて陽イオン交換体から溶出し、MLＩ-1を低イオン強度で溶出し、MLＩ-2が高イオン強度で溶出する、請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載される方法。６．請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載される方法によって得ることができるMLＩ-1型及びMLＩ-2型ヤドリギレクチン、及び、ジスルフィド結合開裂剤を用いた還元的開裂によって得ることができるフラグメント。７．請求の範囲第６項に記載されるヤドリギレクチンを特定のペプチド結合開裂化学試薬又はペプチド結合開裂酵素によって処理し、免疫活性調節作用を有するフラグメントを単離することによって得ることができるヤドリギレクチン。８．請求の範囲第６項又は第７項に記載されるヤドリギレクチンで哺乳類を免疫することによって得ることができる、モノクローナル又はポリクローナル抗体又はアンチイディオタイプを含む診断剤。