EP0766697A1 - Verfahren zur isolierung von isolektinen aus der mistel - Google Patents

Verfahren zur isolierung von isolektinen aus der mistel

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EP0766697A1
EP0766697A1 EP95924317A EP95924317A EP0766697A1 EP 0766697 A1 EP0766697 A1 EP 0766697A1 EP 95924317 A EP95924317 A EP 95924317A EP 95924317 A EP95924317 A EP 95924317A EP 0766697 A1 EP0766697 A1 EP 0766697A1
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EP
European Patent Office
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mistletoe
lectins
lactosyl
type
isolectins
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Withdrawn
Application number
EP95924317A
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English (en)
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Inventor
Rudolf Private Universität Witten/Herdecke EIFLER
Uwe Private Universität Witten/Herdecke PFÜLLER
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Private Universitat Witten/herdecke GmbH
Original Assignee
Private Universitat Witten/herdecke GmbH
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • C07K14/42—Lectins, e.g. concanavalin, phytohaemagglutinin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/16—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from plants

Definitions

  • the present invention relates to a method for isolating isolates from mistletoe of type ML I, mistletoe isolectins of type ML I, their biologically active fragments obtainable by agents which break peptide bonds and a diagnostic agent which can be obtained by immunizing mammals with the isolectins according to the invention .
  • Mistletoe lectins are biologically active proteins which are described as immunostimulating / modulating and having a cytotoxic effect.
  • Mistletoe lectin I consists of an A and B chain, which can be obtained by reductive cleavage of the mistletoe lectin.
  • the B chain fraction is optionally subsequently determined by affinity chromatography on monoclonal anti-ML IA - 2nd
  • DE 42 21 836 relates to a biochemically purified mistletoe lectin (ML-I) as a therapeutically applicable immunomodulator.
  • ML-I mistletoe lectin
  • This substance is obtained from aqueous mistletoe extract and purified.
  • the ML I consists of a toxic A chain and a sugar-binding B chain. Structural data are also mentioned in the published specification. There are two different modifications to the A chain. The chains were partially sequenced starting from the N-terminus. , -
  • DE 42 29 876 describes a process for obtaining lectins from mistletoe plants, an extract being obtained from fresh or dried mistletoe plants which contains the mistletoe lectins I to III.
  • the method is based on a batch adsorption of the aqueous mistletoe extract followed by an affinity adsorption on lactosyl-Sepharose. The two fractions obtained are subsequently separated into individual lectin fractions by ion exchange chromatography.
  • the technical problem on which the invention is based consists first of all in specifying a method with which the disadvantages mentioned above can be avoided, in particular in a reproducible manner reducing the number of lectin compounds in the mixture.
  • the method is intended in particular to provide the isolectins ML I-1 and ML 1-2 but not their mixed aggregation products.
  • the method ML I-1 and ML 1-2 fractions are to be delivered in preparatively manageable quantities.
  • Claim 6 relates to isolectins from the mistletoe obtainable by the process according to the invention.
  • Claim 7 relates to biologically active fragments of the isolates of mistletoe according to the invention.
  • Claim 8 relates to a diagnostic agent obtainable by immunizing mammals by using the isolectins according to the invention.
  • birch or maple is used as the host plant.
  • the mistletoe plants cultivated on it are called Fresh plants are harvested and ground, then stirred with distilled water and the resulting filtered extract is acidified with acetic acid. After centrifugation, the supernatant is stirred with a suitable cation exchanger, preferably SP-Sephadex.
  • the cation exchanger adsorbs the lectin-containing protein fraction, which after washing with a buffer solution is eluted with a basic buffer of higher ionic strength.
  • the process according to the invention can also be carried out as a column chromatographic process.
  • the lectins are bound in a biospecific manner to suitable affinity carriers, preferably to lactosyl-Sepharose.
  • suitable affinity carriers preferably to lactosyl-Sepharose.
  • the lectins of types II and III can be eluted with isotonic phosphate-buffered 0.8 to 1% saline solution, whereas the ML I is subsequently eluted specifically with solutions containing galactose.
  • the ML I is separated into the lectins ML II and ML 1-2 by rechromatography on the cation exchanger, preferably a mono-S chromatography material.
  • the isolectins of the mistletoe ML I-1 and ML 1-2 obtainable by the process according to the invention are obtained in preparatively manageable amounts, so that pharmacological and toxicological studies can be carried out.
  • protein structures can be broken down into subsections by peptide-cleaving agents, such as chemicals or enzymes. These fragments can have a biological activity similar to that of the parent compound.
  • the present invention also relates to fragments of the mistletoe isolectins which can be derived from the amino acid sequence as stated above, for example by means of specific peptide bond-cleaving reagents such as cyanogen bromide or by treatment with specific proteases such as endoproteases. According to the invention, such peptides are claimed which have a biological activity z. B. as an immunomodulator or have an antigenic structure.
  • diagnostic agents are e.g. mono- or polyclonal antibodies or anti-idiotype antibodies, which can be obtained by immunizing rabbits.
  • Mistletoe plant (Viscum album L. or other species) from various host trees; as a fresh plant, dried powder or mistletoe tea.
  • Acetate buffer 0.1 M, pH 4.0
  • Acetate buffer 0.015 M, pH 3.8
  • Citrate buffer 0.015 M, pH 3.8, NaCl gradient from 0 to 0.6 M
  • Tris buffer 0.1 M, 0.5 M NaCl, pH 8.0
  • Lactosyl-Sepharose 4B Lactosyl-Sepharose 4CL, Lactosyl-
  • Fresh mistletoe from birch or maple is harvested.
  • Fresh plant 250 g roughly chopped with 500 ml. Dest. Water homogenized material stirred for 1 hour.
  • the resulting suspension is filtered through a coarse-meshed cloth.
  • the strongly cloudy colored solution is adjusted to pH 4.0 with 2 M acetic acid.
  • the resulting precipitate is separated off by centrifugation at 5000 xg for 10 minutes.
  • 4 g of solid, swollen SP-Sephadex C-50 ® are added to the clear centrifugate and the mixture is stirred for 1 hour.
  • the ion exchanger is separated off via a glass suction filter and washed with 0.1 M acetate buffer, pH 4.0, until the washing buffer leaves the Nutsche colorless.
  • the adsorbed proteins are then eluted with 0.1 M Tris buffer (0.5 M NaCl, pH 8.0) using the column method.
  • the resulting crude lectin solution is passed through a lactosyl-Sepharose column with a bed volume of 100 ml.
  • the column is washed with three times the column volume of 0.9% saline.
  • the last 200 ml contain lectins II and III.
  • the ML I is then eluted with 1 column volume of 0.1 M galactose solution.
  • the ML II / III fraction is concentrated to 1/10 and then buffered over a Sephadex G 25 column in 0.015 M citrate buffer, pH 3.8. This solution is chromatographed on a Mono-S column (10/10 Mono-S, Pharmacia). The lectins II and III are eluted in succession with a saline gradient of 0 to 0.5 M in a 0.015 M citrate buffer, pH 3, 8 and a total volume of 160 ml. The two fractions thus obtained are re-chromatographed under these conditions. The ML II is eluted at 0.15 M and the ML III at 0.21 M NaCl.

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Abstract

Verfahren zur Isolierung von Isolektinen aus der Mistel vom Typ ML I, wobei Mistelpflanzen von Birke oder Ahorn als Wirtspflanze als Frischpflanzen geerntet, zerkleinert, in wäßrigem Milieu suspendiert werden, die wäßrige Suspension wird gegebenenfalls filtriert und auf einen pH-Wert < 7 eingestellt, gegebenenfalls zentrifugiert, der erhaltene Überstand mit einem Kationenaustauscher behandelt, die eluierende Fraktion, enthaltend die Lektine aus der Mistel, aufgefangen, gefolgt von einer Chromatographie an Lactosyl-modifizierten Trägermaterialien und Desorption der Lektine des Typs ML I durch Behandlung des Lactosyl-modifizierten Trägermaterials, Trennung an Kationenaustauscher mit anschließendem Auffangen der Mistellektin-Fraktionen vom Typ ML I-1 und ML I-2. Mistellektine vom Typ ML I-1 und ML I-2, erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, sowie Fragmente, erhältlich durch reduktive Spaltung mit Disulfidbindungen spaltenden Reagenzien.

Description

Verfahren zur Isolierung von Isolektinen aus der Mistel
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Isolierung von Isolektinen aus der Mistel vom Typ ML I, Mi- stelisolektine des Typ ML I, deren biologisch aktiven Frag¬ mente erhältlich durch Peptidbindungen spaltende Mittel sowie ein Diagnostikmittel erhältlich durch Immunisierung von Säugern mit den erfindungsgemäßen Isolektinen.
Mistellektine sind biologisch aktive Proteine, welche als immunstimulierend/modulierend und cytotoxisch wirkend be¬ schrieben sind.
Man unterscheidet drei Gruppen von Isolektinen, die in der Mistel vorkommen, beispielsweise Mistellektin I, II, III. Das Mistellektin I besteht aus einer A- und B-Kette, die durch reduktive Spaltung des Mistellektins gewonnen werden können.
Zur Gewinnung einzelner Ketten des Mistellektins I wird dieses gemäß DD 296 703 in homogener Phase in Anwesenheit von 20 bis 40 Vol.-% Glycerol reduziert. Das entstandene Gemisch wird auf eine Immunglobulin-Sepharose- oder eine Asialofetuin-Säule aufgebracht und danach nacheinander mit einem Waschpuffer und einem Elutionspuffer, die jeweils 20 bis 40 Vol.-% Glycerol enthalten, eluiert.
Die B-Kettenfraktion wird gegebenenfalls nachfolgend durch Affinitats-Chromatographie an monoklonalen anti-ML I-A- - 2
Ketten-Antikörpern getrennt.
Die DE 42 21 836 betrifft ein biochemisch aufgereinigtes Mistellektin (ML-I) als therapeutisch anwendbarer Immun¬ modulator. Diese Substanz wird aus wäßrigem Mistelextrakt gewonnen und gereinigt. Das ML I besteht aus je einer toxischen A-Kette und einer zuckerbindenden B-Kette. Es sind in der Offenlegungsschrift auch Strukturdaten genannt. Dabei existieren zwei unterschiedliche Modifikationen der A-Kette. Die Ketten wurden jeweils vom N-Terminus beginnend partiell sequenziert. , -
Das in der DE 42 21 836 beschriebene Verfahren ist nach¬ teilig, da es bei der Reinigung keine reinen Isolektin- Fraktionen ergibt, sondern ein komplexes Gemisch von Iso¬ lektinen isoliert wird, das weiteren chromatographischen Reinigungen widersteht. Dies ist überwiegend auf Bildung von Dimeren oder anderen Aggregaten zurückzuführen, die nur unter denaturierenden Bedingungen, beispielsweise SDS-Gelelek- trophorese, aufgebrochen werden können. Solche Strukturen stellen jedoch keine nativen Lektine dar, die pharmakolo- gisch-toxikologischen Untersuchung zugeführt werden können. Eine Renaturierung des mittels denaturierender Verfahren gewonnenen Mistellektins ist bislang nicht gelungen.
Die DE 42 29 876 beschreibt ein Verfahren zur Gewinnung von Lektinen aus Mistelpflanzen, wobei aus frischen oder getrock¬ neten Mistelpflanzen ein Extrakt gewonnen wird, der die Mistellektine I bis III enthält. Das Verfahren geht aus von einer Batch-Adsorption des wäßrigen Mistelpflanzenextrakts gefolgt von einer Affinitätsadsorption an Lactosyl-Sepharose. Nachfolgend werden die zwei erhaltenen Fraktionen durch Ionenaustauscher-Chromatographie in einzelne Lektinfraktionen getrennt.
Durch Chromatographie der ML I-Fraktion an einer Kationenaus¬ tauschersäule mit steigendem Kochsalzgradienten werden zwei - 3
Subtraktionen der Lektine ML I, nämlich ML I-l und ML 1-2 erhalten. Auch dieses Verfahren liefert die angesprochenen" Isolektine lediglich in analytischen Mengen, die eine prä- parative Gewinnung nicht zuläßt. Mit diesem Gewinnungsver¬ fahren lassen sich Isolektine nicht in hinreichender Menge herstellen, um zuverlässige biochemische, pharmakologische und toxikologische Daten über die Isolektine zu ermitteln. Das beschriebene Verfahren liefert auch Isolektine, die nicht mehr trennbar sind, möglicherweise aufgrund von Dimerisierun- gen, die unter nicht denaturierenden Bedingungen nicht aufgehoben werden können.
Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht zunächst darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt, die oben genannten Nachteile zu vermeiden, insbesondere in reproduzierbarer Weise die Anzahl der Lektinverbindungen im Gemisch zu reduzieren. Das Verfahren soll insbesondere die Isolektine ML I-l und ML 1-2 aber nicht deren gemischte Ag¬ gregationsprodukte liefern. Weiterhin soll das Verfahren ML I-l sowie ML 1-2 Fraktionen in präparativ handhabbaren Mengen liefern.
Überraschenderweise wurde das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem gelöst durch ein Verfahren mit den Merk¬ malen des Anspruchs 1. Die sich daran anschließenden Unter¬ ansprüche 2 bis 5 betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Anspruch 6 betrifft Isolektine aus der Mistel erhältlich nach dem erfindungsgemäßen Verfahren. Anspruch 7 betrifft bio¬ logisch aktive Fragmente der erfindungsgemäßen Isolektine der Mistel. Anspruch 8 betrifft ein Diagnostikmittel erhält¬ lich durch Immunisierung von Säugetieren durch Verwendung der erfindungsgemäßen Isolektine.
Erfindungsgemäß wird Birke oder Ahorn als Wirtspflanze verwendet. Die darauf kultivierten Mistelpflanzen werden als Frischpflanzen geerntet und zerkleinert, danach mit de¬ stilliertem Wasser gerührt und der resultierende filtrierte Extrakt wird mit Essigsäure angesäuert. Nach Zentrifugation wird der Überstand mit einem geeigneten Kationenaustauscher, bevorzugt SP-Sephadex, gerührt. Der Kationenaustauscher adsorbiert die lektinhaltige Proteinfraktion, die nach Waschen mit einer Pufferlösung mit einem basischen Puffer höherer Ionenstärke eluiert wird. Neben dem Batch-Verfahren kann das erfindungsgemäße Verfahren auch als säulen-chromato- graphisches Verfahren durchgeführt werden. Aus der Rohlektin- lösung werden die Lektine biospezifisch an geeigneten Äffini- tätsträgern, vorzugsweise an Lactosyl-Sepharose, gebunden. Dabei können die Lektine der Typen II und III mit iso¬ tonischer phosphatgepufferter 0,8 bis 1 %iger Kochsalzlösung eluiert werden, wohingegen das ML I nachfolgend spezifisch mit galactosehaltigen Lösungen eluiert wird. Durch Rechroma- tographie am Kationenaustauscher, vorzugsweise einem Mono-S- Chromatographiematerial, wird das ML I in die Lektine ML I-l und ML 1-2 getrennt.
Die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhältlichen Iso¬ lektine der Mistel ML I-l und ML 1-2 fallen in präparativ handhabbaren Mengen an, so daß pharmakologische und toxiko¬ logische Untersuchungen durchgeführt werden können.
Es ist dem Fachmann bekannt, daß Proteinstrukturen durch pep- tidspaltende Agenzien, wie Chemikalien oder Enzyme in Unter¬ abschnitte zerlegt werden können. Diese Bruchstücke können eine ähnliche biologische Aktivität wie die der Stammver¬ bindung aufweisen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Bruchstücke der Mistelisolektine, die sich aus der Aminosäuresequenz, wie sie oben angegeben ist, ableiten lassen z.B. durch spezifische, peptidbindung-spaltende Reagenzien wie Cyanogen- bromid oder durch Behandlung mit spezifischen Proteasen wie Endoproteasen. Erfindungsgemäß beansprucht werden solche Peptide, die eine biologische Aktivität z. B. als Immunmodulator oder eine antigene Struktur aufweisen.
Durch Immunisierung von Säugern mit den Isolektinen aus der Mistel oder deren Bruchstücken lassen sich wertvolle diagno¬ stische Mittel erhalten. Diese Diagnostikmittel sind z.B. mono- oder polyklonale Antikörper oder antiidiotype Anti¬ körper, die durch Immunisierung von Kaninchen erhalten werden können.
Die Erfindung wird anhand des folgenden Ausführungsbeispiels näher erläutert.
1. Reagenzien und Ausgangsstoffe
Mistelpflanze (Viscum album L. oder andere Spezies) von ver¬ schiedenen Wirtsbäumen; als Frischpflanze, getrocknetes Pulver oder Misteltee.
Essigsäure: 2 M
Acetatpuffer: 0,1 M, pH 4,0
Acetatpuffer: 0,015 M, pH 3, 8
Citratpuffer: 0,015 M, pH 3,8, NaCl-Gradient von 0 bis 0,6 M
Trispuffer: 0,1 M, 0,5 M NaCl, pH 8,0
Kochsalzlösung: 0,9 % in dest. Wasser
Galaktose-Lösung: 0,1 M, 0,9 % NaCl
Ammoniumsulfatlösung: 3 M
Ammoniumsulfat
SP-Sephadex C-50®, Pharmacia
Lactosyl-Sepharose 4B, Lactosyl-Sepharose 4CL, Lactosyl-
Sephacryl 400
Mono-S-Säule®, Pharmacia 2. Isolierung und Trennung der Lektine ML I, ML II, ML III, ML I-l und ML 1-2
Frischmistel von Birke oder Ahorn werden geerntet. Frisch¬ pflanze: 250 g grob zerkleinert mit 500 ml. dest. Wasser homogenisiertes Material 1 Stunde gerührt. Die entstandene Suspension wird über ein grobmaschiges Tuch filtriert. Die stark getrübte gefärbte Lösung wird mit 2 M Essigsäure auf pH 4, 0 eingestellt. Der resultierende Niederschlag wird durch lOminütiges Zentrifugieren bei 5000 x g abgetrennt. Dem klaren Zentrifugat werden 4 g festes, gequollenes SP-Sephadex C-50® zugesetzt, und es wird 1 Stunde gerührt. Der Ionenaus¬ tauscher wird über eine Glasfilternutsche abgetrennt und mit 0,1 M Acetatpuffer, pH 4, 0 solange gewaschen, bis der Wasch¬ puffer farblos die Nutsche verläßt. Die adsorbierten Proteine werden anschließend mit 0,1 M Trispuffer (0,5 M NaCl, pH 8,0) nach dem Säulenverfahren eluiert. Die resultierende Roh- lektinlösung wird über eine Lactosyl-Sepharose-Säule mit 100 ml Bettvolumen gegeben. Nachgewaschen wird die Säule mit dem dreifachen Säulenvolumen 0,9 %iger Kochsalzlösung. Die letzten 200 ml enthalten die Lektine II und III. Das ML I wird anschließend mit 1 Säulenvolumen 0,1 M Galaktoselösung eluiert.
Die ML II/III-Fraktion wird auf 1/10 eingeengt und darauf über einer Sephadex-G 25-Säule in 0,015 M Citratpuffer, pH 3,8 umgepuffert. Diese Lösung wird an einer Mono-S-Säule (10/10 Mono-S, Pharmacia) chromatographiert. Mit einem Kochsalzgradienten von 0 bis 0,5 M in einem 0,015 M Citrat¬ puffer, pH 3, 8 und einem Gesamtvolumen von 160 ml werden die Lektine II und III nacheinander eluiert. Die beiden so erhaltenen Fraktionen werden unter diesen Bedingungen re- chromatographiert. Das ML II wird bei 0,15 M und das ML III bei 0,21 M NaCl eluiert.
Die ReChromatographie der isolierten ML I-Fraktion, umge¬ puffert in 0,015 M Citratpuffer, pH 3, 8 and Mono-S (10/10) mit einem NaCL-Gradienten von 0,2 bis 0,6 M in Citratpuffer (0,015 M, pH 3,8) ergibt die Lektine ML I-l bei einer NaCl-' Konzentration von 0,36 M und das ML 1-2 bei 0,42 M.
Alle drei Lektine sind suspendiert in 3 M Ammoniumsulfat- lösung mindestens 5 Jahre ohne Aktivitätsverlust und Beein¬ trächtigung der Löslichkeiten haltbar.

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Verfahren zur Isolierung von Isolektinen aus der Mistel vom Typ ML I, wobei
Mistelpflanzen von Birke oder Ahorn als Wirts¬ pflanze als Frischpflanzen geerntet, zerkleinert, in wäßrigem Milieu suspendiert werden, die wäßrige Suspension wird gegebenenfalls filtriert und auf einen pH-Wert < 7 eingestellt, gegebenenfalls zentrifugiert, der erhaltene Über¬ stand mit einem Kationenaustauscher behandelt, die eluierende Fraktion, enthaltend die Lektine aus der Mistel, aufgefangen, gefolgt von einer Chromatographie an Lactosyl- modifizierten Trägermaterialien und Desorption der Lektine des Typs ML I durch Be¬ handlung des Lactosyl-modifizierten Träger¬ materials, Trennung an Kationenaustauscher mit an¬ schließendem Auffangen der Mistellektin-Fraktionen vom Typ ML I-l und ML 1-2.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Kationenaus¬ tauscher SP-Sephadex und das Lactosyl-modifizierte Trägermaterial Lactosyl-Sepharose ist.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und/oder 2, wobei die Behandlung der wäßrigen AufSchlußlösung mit Kationenaustauscher im Batch-Verfahren und/oder Säulen¬ chromatographie erfolgt.
4. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Behandlung mit Lactosyl-modifizierten Träger¬ materialien im Batch-Verfahren und/oder durch Säulen¬ chromatographie erfolgt. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die ML I-Fraktionen vom Kationenaustauscher mit einer 0,2 bis 0,6 M Kochsalzgradientenlösung eluiert werden, wobei bei niedriger Ionenstärke ML I-l und bei höheren Ionenstärke ML 1-2 eluiert.
Mistellektine vom Typ ML I-l und ML 1-2 erhältlich durch ein Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 sowie Fragmente erhältlich durch reduktive Spaltung mit Disulfidbindungen spaltenden Reagenzien.
Mistellektine, wobei die Lektine erhältlich sind durch Behandlung der Mistellektine nach Anspruch 6 mit spe¬ zifischen Peptidbindungen spaltenden chemischen Reagenzien oder Peptidbindungen spaltenden Enzymen und Isolierung der Bruchstücke mit immunmodulatorischer Wirkung.
Diagnostikmittel mit mono- oder polyklonalen Anti¬ körpern oder Antiidiotypen, erhältlich durch Immuni¬ sierung von Säugern mit den Mistellektinen gemäß mindestens einem der Ansprüche 6 und/oder 7.
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