DE69202049T2

DE69202049T2 - Verfahren zur reinigung von intaktem und korrekt gefaltetem igf-i.

Info

Publication number: DE69202049T2
Application number: DE69202049T
Authority: DE
Inventors: Russell A. Exton Penn 19341 Brierley; Gregory C. San Diego Ca 92111 Holtz
Original assignee: Salk Institute Biotechnology Industrial Associates Inc
Current assignee: SIBIA Neurosciences Inc
Priority date: 1991-01-16
Filing date: 1992-01-15
Publication date: 1995-08-24
Anticipated expiration: 2012-01-16
Also published as: EP0567554B1; EP0567554A1; CA2098183C; AU1194792A; CA2098183A1; WO1992012993A1; DE69202049D1; JPH06505010A; US5231178A; ES2071488T3; ATE121099T1

Description

Diese Erfindung betrifft Reinigungsverfahren. In einem besonderen Aspekt betrifft diese Erfindung die Reinigung von Insulin-like growth factor-1 Peptiden aus Fluidmedium das diese enthält. In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Reinigung von Insulin-like growth factor-1 Peptiden die durch rekombinante Techniken hergestellt wurden. In einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Reinigung von Insulin-like growth factor-1 Peptiden, die von Hefezellen, die mit mindestens einer Kopie einer für ein Insulin-like growth factor-1 Peptid codierenden DNA-Sequenz transformiert wurden, hergestellt wurden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) ist ein Polypeptid von 70 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 7648 Dalton. Dieses Einzelkettenprotein hat drei Intraketten-Disulfidbrücken. Diese Disulfidbrücken halten zusammen mit zahlreichen Wasserstoffbrücken und hydrophilen Wechselwirkungen die kompakte Tertiärstruktur dieses Moleküls aufrecht. Es wurde jedoch gezeigt, daß IGF-1 nach Reduktion und Reoxidation in mehreren Arten rückfalten kann, wobei soviele wie 15 monomere Konfigurationen gebildet werden [siehe Meng, et al., J. Chrom. 443:183 (1988)]. Demgemäß können Versuche große Mengen dieses Peptids herzustellen zur Bildung eines komplizierten Gemisches von Produktformen führen, das vor weiterer Verwendung gereinigt werden muß.
Insulin-like growth factor-1 gehört zu einer heterogenen Familie von Peptiden, die manche der biologischen und chemischen Eigenschaften von Insulin aufweisen aber die von Insulin antigenisch unterschiedlich sind. Derzeit verfügbare experimentelle Hinweise legen nahe, daß IGF-1 Wachstum fördert, indem er die Wirkungen von Wachstumshormon vermittelt. Somit werden derartige Prozesse wie Skelettwachstum, Zellreplikation und andere Wachstumsverwandte Prozesse von IGF-1 Gehalten beeinflußt. Es wurde gezeigt, daß physiologische Konzentrationen von IGF-1 durch derartige Bedingungen wie Schilddrüsenerkrankung, Diabetes und Mangelernäherung beeinflußt werden [siehe Preece, in Horm. Blood, 4: 108 (1983)].
Es wurde auch gezeigt, daß IGF-1 mit anderen Wachstumsfaktoren, beispielsweise beim Beschleunigen des Heilens von Weich- und Mesenchymgewebewunden [siehe Lynch et al., in J. Clin. Periodontol., 16: 545 (1989) und Lynch et al., in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7696 (1987)] und beim Verbessern des Wachstums von Säugerzellen in serumfreien Gewebekulturmedium [siehe Burleigh und Meng, in American Biotech. Lab., 4: 48 (1986)] synergistisch wirkt.
In Anbetracht der vielen klinischen Anwendungen und Forschungsanwendungen von IGF-1 ist eine einfache Versorgung mit IGF-1 für die Gebiete der Medizin und Biotechnologie von großem Wert. Da eine Isolierung aus natürlichen Quellen technisch schwierig, teuer und zeitraubend ist, haben sich in letzter Zeit die Bemühungen auf die Entwicklung effizienter rekombinanter Verfahren zur Herstellung von IGF-1 konzentriert.
Die methylotrophe Hefe Pichia pastoris wurde kürzlich als ein verbesserter Wirt für die Herstellung rekombinanter Produkte entwickelt. Es wurde gezeigt, daß rekombinante Pichia pastoris-Stämme fähig sind, bestimmte rekombinante Proteine in der Größenordnung von Gramm pro Liter zu sezernieren. Außerdem wurde gezeigt, daß derartige Stämme fähig sind, sich an chargenweise Nahrungszugabe oder kontinuierliche Kultivationsfermentationsbedingungen anzupassen. Darüber hinaus weisen derartige Stämme einen extrem stabilen rekombinanten Phenotyp auf und sind fähig hohe Ausbeuten des gewünschten rekombinanten Expressionsprodukts über mehrere Größenordnungen einer Fermentationsskala aufrechtzuerhalten. Tatsächlich haben Brierley et al., in der ebenfalls anhängigen Anmeldung United States Serial Nr. 578,728, eingereicht am 4. September 1990 kürzlich gezeigt, daß P. pastoris ein hervorragender Wirt für die rekombinante Herstellung von IGF-1 ist. Die Offenbarung dieser ebenfalls anhängigen Anmeldung wird durch Referenz in ihrer Gesamtheit hiermit aufgenommen. Angesichts der Verfügbarkeit eines Mediums, das hohe Gehalte von rekombinant produziertem IGF-1 enthält, ist ein effizientes Mittel zur Gewinnung und Reinigung von IGF-1 aus einem derartigen Medium erforderlich.
Rekombinant hergestellter IGF-1 besteht häufig aus einem Gemisch verschiedener IGF-1 Formen, d.h. aus intaktem monomeren, korrekt gefaltetem Material (hierin auch als authentischer IGF-1 bezeichnet), sowie verschiedenen aberranten Formen, wie etwa fehlgefaltetem Material (d.h. mit nicht korrekt gebildeten Disulfidbrücken), angespaltenem (nicked) Material (d.h. wobei eine oder mehrere der Peptidbindungen des Aminosäuregerüsts gespalten wurden aber das Molekulargewicht der entstehenden Spezies weitgehend das gleiche wie das des intakten Materials ist, da das angespaltene Material die gleiche Anzahl an Aminosäureresten wie das intakte Material hat und die Fragmente des angespaltenen Materials durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden), gespaltenem Material (d.h. wobei ein oder mehrere Peptidbindungen gespalten sind, so daß zwei Fragmente mit niedrigerem Molekulargewicht relativ zum intakten Material erzeugt werden oder Peptide, denen ein oder mehrere Aminosäurereste relativ zum intakten Material fehlen), multimeren Formen (d.h. Dimere, Trimere etc., wobei Disulfidbrücken zwischen zwei oder mehreren verschiedenen IGF- 1 Monomerketten gebildet werden) usw.. Aufgrund der weitgehenden Ähnlichkeit der verschiedenen IGF-1 Formen stellt die Reinigung rekombinant hergestellten Materials eine technisch schwierige Herausforderung dar. Eine derartige Reinigung erfordert nicht nur die Abtrennung der IGF-1 Peptide von den anderen Peptiden, die während der Fermentation hergestellt wurden, zusätzlich ist eine Abtrennung erforderlich, die selektiv genug ist, um zwischen den verschiedenen IGF-1 Formen die vorhanden sein können zu unterscheiden.
Brierley et al beschreiben auch in der internationalen Anmeldung Nr. PCT/US91/06452, die der Anmelderin mitgehört und die eine Continuation-in-Part der US-Serial Nr. 578,728 ist, eingereicht unter dem Patent Cooperation Treaty am 4. September 1991, die Herstellung von IGF-1 in P. pastoris Stämmen, die für proteolytische Aktivitäten, die das rekombinante Produkt abbauen können, wobei aberrante Formen wie etwa angespaltenes IGF-1 gebildet werden, defizient sind. Die Verwendung von proteasedefizienten Stämmen von P. pastoris als Wirte für die rekombinante Expression heterologer Proteine, die gegenüber einem Abbau von P. pastoris Proteasen anfällig sind, ist in US-Serial Nr. 07/678,916, eingereicht am 1. April 1991, beschrieben. Die Offenbarung dieser ebenfalls anhängigen Anmeldungen wird in ihrer Gesamtheit hierin durch Referenz aufgenommen. Fermentationen von IGF-1 produzierenden P. pastoris Stämmen, die für proteolytische Aktivität defizient sind, ergab 50 bis 100 % mehr authentischen IGF-1 und 30 % weniger angespaltenen IGF-1 als ähnliche Fermentationen IGF-1 produzierender P. pastoris Stämme, die für proteolytische Aktivität nicht defizient waren. Obwohl eine Reinigung von authentischem IGF-1 aus dem Nährmedium eines P. pastoris Stammes, der für proteolytische Aktivität defizient ist, durch die niedrigeren Mengen von angespaltenem IGF-1 im Nährmedium vereinfacht sein könnte, ist immer noch ein Trennverfahren, das fähig ist, zwischen den verschiedenen IGF-1 Formen zu unterscheiden, für eine derartige Reinigung erforderlich.
Die europäische Patentanmeldung, Veröffentlichungsnummer 0 360 411 offenbart die Expression eines O-glykosylierten Analogs von IGF-1 aus Mensch zusammen mit unglykosyliertem IGF-1 in Saccharomyces cerivisiae. Es wird berichtet, daß der exprimierte IGF-1 unter Verwendung nicht offenbarter "herkömmlicher biochemischer Trennungstechniken" isoliert wird, umfassend hydrophobe Interaktionschromatographie (HI- HPLC), das Protokoll des HI-HPLC-Schritts ist ebenfalls nicht offenbart.
D.G. Armstrong, et al., Domestic Animal Endocrinology 7:383- 393 (1990) offenbaren eine Reinigung von IGF-1 aus Huhn aus Hühnerserum durch Ammoniumsulfatpräzipitation und Extraktion, gefolgt von Kationenaustauschchromatographie, hydrophober Interaktionschromatographie unter Verwendung einer Acetonitrilgradientenelution und Reverse-Phase-HPLC unter Verwendung eines Acetonitrilgradienten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Gemäß vorliegender Erfindung haben wir ein effizientes Verfahren zur Gewinnung und Reinigung von IGF-1 Peptiden aus Fluidmedium, das diese enthält, entwickelt. Das erfindungsgemäße Verfahren umfaßt aufeinanderfolgende selektive Adsorptions-Desorptions-Schritte auf einer Kombination von Kationenaustausch- und hydrophoben Interaktionschromatographiematrixmaterialien und kann bevorzugt Gelfiltrationschromatographie umfassen. Auf diese Weise kann eine 30 bis 50 %-ige Gewinnung von weitgehend reinem, intaktem, korrekt gefaltetem, monomerem IGF-1 in der Gegenwart verschiedener anderer Formen von IGF-1, die anfänglich in dem IGF-1 enthaltenden Rohmedium vorhanden sind, bewerkstelligt werden.

KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN

Figur 1 ist ein Elutionsprofil für die Elution verschiedener IGF-1 Spezies aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix.
Figur 2 ist ein Elutionsprofil für die Elution verschiedener IGF-1 Spezies aus der zweiten Kationenaustauschmatrix.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

In einem Aspekt bringt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Reinigung von monomerem, intaktem, korrekt gefaltetem Insulin-like growth factor-1 Peptid (IGF-1) aus Medium, das IGF-1 Peptide enthält mit sich, welches Verfahren umfaßt:
(a) Inkonktaktbringen des Mediums mit einer ausreichenden Menge eines ersten Kationenaustauschmaterials unter geeigneten Bedingungen um mindestens etwa 95 % des gesamten IGF-1 aus dem Medium zu adsorbieren,
(b) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmaterial von Schritt (a) durch Inkontaktbringen des Kationenaustauschmaterials mit einer ausreichenden Menge eines Lösungsmittelsystems, das einen ausreichend hohen pH-Wert oder eine ausreichende Ionenstärke aufweist, um im wesentlichen den gesamten IGF-1 von dem Kationenaustauschmaterial zu verdrängen,
(c) Inkontaktbringen der IGF-1 enthaltenden Fraktionen des Eluats aus Schritt (b) in einem geeigneten Lösungsmittelsystem mit einer ausreichenden Menge einer ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren,
(d) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch zuerst Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems, relativ zum Matrixvolumen, mit einer ausreichend niedrigen Leitfähigkeit, um aberrante IGF-1 Peptide von der Matrix zu verdrängen, ohne wesentliche Mengen der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von adsorbiertem IGF-1 von der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix zu verdrängen, gefolgt von Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu etwa 10 Volumina eines Puffersystems mit einem hohen pH-Wert, relativ zum Matrixvolumen, wobei der hohe pH-Wert ausreichend hoch ist, um im wesentlichen die gesamten verbliebenen adsorbierten Formen von IGF-1 von der Matrix zu verdrängen.
Gemäß einem anderen ihrer Aspekte bringt die vorliegende Erfindung ein Verfahren mit sich zur Reinigung von monomerem, intaktem, korrekt gefaltetem Insulin-like growth factor-1 Peptid (IGF-1) aus Medium, das IGF-1 Peptide enthält, welches Verfahren umfaßt:
(a) Inkonktaktbringen des Mediums mit einer ausreichenden Menge eines ersten Kationenaustauschmaterials unter geeigneten Bedingungen um mindestens etwa 95 % des gesamten IGF-1 aus dem Medium zu adsorbieren,
(b) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmaterial von Schritt (a) durch Inkontaktbringen des Kationenaustauschmaterials mit einer ausreichenden Menge eines Lösungsmittelsystems, das einen ausreichend hohen pH-Wert oder eine ausreichende Ionenstärke aufweist, um im wesentlichen den gesamten IGF-1 von dem Kationenaustauschmaterial zu verdrängen,
(c) Inkontaktbringen der IGF-1 enthaltenden Fraktionen des Eluats aus Schritt (b) in einem geeigneten Lösungsmittelsystem mit einer ausreichenden Menge einer ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren,
(d) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch zuerst Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems, relativ zum Matrixvolumen, mit einer ausreichend niedrigen Leitfähigkeit, um aberrante IGF-1 Peptide von der Matrix zu verdrängen, ohne wesentliche Mengen der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von adsorbiertem IGF-1 von der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix zu verdrängen, gefolgt von Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu etwa 10 Volumina eines Puffersystems mit einem hohen pH-Wert, relativ zum Matrixvolumen, wobei der hohe pH-Wert ausreichend hoch ist, um im wesentlichen die gesamten verbliebenen adsorbierten Formen von IGF-1 von der Matrix zu verdrängen,
(e) Inkontaktbringen der Fraktionen des Eluats aus Schritt (d), die intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten in einem geeigneten Lösungsmittelsystem mit einer ausreichenden Menge einer Gelfiltrationschromatographiematrix, die eine geeignete Porengröße hat, um eine Auftrennung der intakten, monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF-1 von im wesentlichen allen multimeren Formen von IGF-1 zu bewirken und
(f) Eluieren der Gelfiltrationschromatographiematrix mit einer ausreichenden Menge eines Eluenten, um zu bewirken, daß die intakte, monomere, korrekt gefaltete Form von IGF-1 von den multimeren IGF-1 Formen aufgetrennt wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Reinigung von monomerem, intaktem, korrekt gefaltetem, Insulin-like growth factor-1 Peptid (IGF-1) aus Medium das IGF-1 Peptide enthält, welches Verfahren umfaßt:
(a) Inkonktaktbringen des Mediums mit einer ausreichenden Menge einer ersten Kationenaustauschmatrix unter geeigneten Bedingungen um mindestens etwa 95 % des gesamten IGF-1 aus dem Medium zu adsorbieren,
(b) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmatrix von Schritt (a) durch Inkontaktbringen der Kationenaustauschmatrix mit einer ausreichenden Menge eines Lösungsmittelsystems, das einen ausreichend hohen pH-Wert oder eine ausreichende Ionenstärke aufweist, um im wesentlichen den gesamten IGF-1 von dem Kationenaustauschmaterial zu verdrängen,
(c) Inkontaktbringen der IGF-1 enthaltenden Fraktionen des Eluats aus Schritt (b) in einem geeigneten Lösungsmittelsystem mit einer ausreichenden Menge einer ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren,
(d) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch zuerst Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems, relativ zum Volumen des Harzes, mit einer ausreichend niedrigen Leitfähigkeit, um manche der aberranten IGF-1 Peptide von der Matrix zu verdrängen, ohne wesentliche Mengen der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von adsorbiertem IGF-1 von der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix zu verdrängen, gefolgt von Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems mit einem hohen pH-Wert, relativ zum Matrixvolumen, wobei der hohe pH-Wert ausreichend hoch ist, um im wesentlichen die gesamten verbliebenen adsorbierten Formen von IGF-1 von der Matrix zu verdrängen,
(e) Inkontaktbringen der gemäß Schritt (d) unter Verwendung des Puffersystems mit einem hohen pH-Wert eluierten Fraktionen, die als die vorwiegende Form von IGF-1 intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, wobei das Inkontaktbringen mit einer ausreichenden Menge einer zweiten Kationenaustauschmatrix unter geeigneten Bedingungen durchgeführt wird, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des gesamten IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren,
(f) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der zweiten Kationenaustauschmatrix durch Inkontaktbringen der Matrix mit mindestens einem Volumen, relativ zum Matrixvolumen, eines Puffersystems mit einer ausreichenden Ionenstärke, um weitgehend die gesamten IGF-1 Peptide differentiell aus der Matrix zu verdrängen,
(g) Inkontaktbringen der Fraktionen des Eluats aus Schritt (f), die intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, in einem geeigneten Lösungsmittelsystem mit entweder
(1) einer ausreichenden Menge einer zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % aller IGF-1-Formen aus dem Eluat zu adsorbieren, oder
(2) einer ausreichenden Menge einer Gelfiltrationsmatrix mit einer geeigneten Porengröße, um eine Auftrennung der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF-1 von im wesentlichen allen multimeren Formen von IGF-1 zu bewirken, und
(h) (1) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix nach Schritt (g) (1) durch zuerst Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems, relativ zum Matrixvolumen, mit einer ausreichend geringen Leitfähigkeit um im wesentlichen alle anderen IGF-1 Formen als die intakte monomere, korrekt gefaltete Form von IGF-1 von der Matrix zu verdrängen, ohne wesentliche Mengen der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von adsorbiertem IGF-1 zu verdrängen, gefolgt von Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems, relativ zum Matrixvolumen, mit einem ausreichend hohen pH-Wert um im wesentlichen den gesamten verbliebenen adsorbierten IGF-1 von der Matrix zu verdrängen oder
(2) Eluieren der Gelfitrationschromatographiematrix nach Schritt (g) (2) mit einer ausreichenden Menge von Elutionspuffer, um zu bewirken, daß die intakte monomere, korrekt gefaltete Form von IGF-1 von den multimeren IGF-1 Formen aufgetrennt wird.
Gemäß einer spezifischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt zur Reinigung von monomerem, intaktem, korrekt gefaltetem Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) Peptid aus IGF-1 Peptide enthaltendem Medium, wobei das IGF-1 enthaltende Medium das weitgehend zellfreie Fermentationsmedium aus einem Hefefermentationsvorgang bei hoher Zelldichte ist und wobei die Hefe mit mindestens einem DNA-Fragment transformiert ist, umfassend in Transkriptionsrichtung die folgenden DNA-Sequenzen:
(i) eine Promotorregion eines Methanol responsiven Gens aus P. pastoris,
(ii) eine DNA-Sequenz, welche für ein Polypeptid codiert, bestehend aus:
(a) der S. cerevisiae alpha mating Faktor (AMF) Präpro-Sequenz, umfassend eine Prozessierungsstelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lys-Arg und Lys-Arg- (Glu-Ala)x, wobei x eine ganze Zahl zwischen 1 und etwa 3 ist und
(b) einem Insulin like growth factor-1 (IGF-1) Peptid und
(iii) einem Transkriptionsterminator, der in P. pastoris funktionell ist,
wobei die DNA-Sequenzen operativ miteinander verbunden sind zur Transkription der für das Polypeptid codierenden Sequenzen, wobei das Verfahren umfaßt:
(a) Inkontaktbringen des Mediums mit einer ausreichenden Menge eines sulfylpropylierten Kationenaustauschmediums unter geeigneten Bedingungen, um mindestens etwa 95 % des IGF-1 aus dem Medium zu adsorbieren, wobei mindestens 0,03 Liter des Kationenaustauschmaterials pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 2 bis zu 30ºC durchgeführt wird und wobei gegebenenfalls das IGF-1 enthaltende Medium vor Inkontaktbringen mit dem Kationenaustauschmaterial mit einem gepufferten Medium geringer Leitfähigkeit verdünnt werden kann, das den gleichen pH-Wert aufweist, wie das zum Äquilibrieren des Kationenaustauschmaterials verwendete Medium,
(b) Inkontaktbringen des IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmaterials mit mindestens etwa 2 Volumina pro Volumen des Kationenaustauschmaterials einer 0,02 M Essigsäurelösung, gefolgt von entweder (1) etwa vier Volumina einer 0,02 M Natriumacetatlösung mit einem pH-Wert von 5 und welche 0,2 M Natriumchlorid enthält oder (2) mindestens vier Volumina einer 0,05 M Natriumacetatlösung mit einem pH-Wert von 5 und dann mindestens vier Volumina einer 0,05 M Natriumacetatlösung mit einem pH-Wert von 5,5 oder (3) etwa vier Volumina einer 0,05 M Natriumacetatlösung, pH 5,5, dann etwa vier Volumina einer Lösung, die 0,05 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 enthält, und dann etwa vier Volumina einer Lösung, die 0,1 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 enthält,
(c) (1) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmatrixmaterial von Schritt (b) (1) durch Inkontaktbringen des Matrixmaterials aus Schritt (b) (1) mit einer ausreichenden Menge eines Lösungsmittelsystems, das eine 0,02 M Natriumacetatlösung mit einem pH von 5,5 umfaßt und 1,0 M Natriumchlorid enthält oder (2) Eluieren des adsorbierten IGF- 1 aus dem IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmatrixmaterial aus Schritt (b) (2) durch Inkontaktbringen des Matrixmaterials aus Schritt (b) (2) mit etwa 8 Volumina einer linearen Gradientenlösung pro Volumen der Kationenaustauschmatrix, umfassend 0 bis 0,05 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 oder (3) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmatrixmaterial aus Schritt (b) (3) durch Inkontaktbringen des Matrixmaterials aus Schritt (b) (3) mit etwa 8 Volumina einer Lösung, die 0,3 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 enthält,
(d) Inkontaktbringen des Eluats aus Schritt (c) (1) oder derjenigen Teile des Eluats aus Schritt (c) (2) oder (c) (3), die als die vorwiegende Form von IGF-1 intakten, monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, mit einem ausreichenden Volumen einer gepufferten Ammoniumsulfat enthaltenden Lösung mit einem pH-Wert zwischen etwa 4,0 und 7,0, um die Ammoniumsulfatkonzentration des Eluats im Bereich von etwa 0,2 bis zu 2 M und den pH des verdünnten Eluats auf etwa 4,5 einzustellen,
(e) Inkontaktbringen des Produkts aus Schritt (d) mit einer ausreichenden Menge einer ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren, wobei die erste hydrophobe Interaktionschromatographiematrix eine butylsubstituierte hydrophobe Poly(methacrylat) Träger-Interaktionschromatographiematrix ist, wobei mindestens etwa 0,05 Liter der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC durchgeführt wird,
(f) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch Inkontaktbringen der Matrix:
(1) zuerst mit einer ausreichenden Menge eines linearen Salzgradienten einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5 oder bevorzugt einem Anfangs-pH von etwa 5,0 und einem End-pH von etwa 4,0 um ein weitgehend Ammoniumsulfat-freies Eluat zu erzeugen und
(2) bevorzugt mit einer gepufferten Lösung mit einem pH- Wert von etwa 4,0, dann
(3) mit (i) einer ausreichenden Menge eines linearen Gradienten einer weitgehend Ammoniumsulfat-freien gepufferten Lösung mit einem Anfangs-pH von etwa 4,0 bis 4,5, um den pH-Wert des Eluats auf etwa 6,5 bis 7,5 zu erhöhen oder (ii) einer Menge einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5, wobei Schritt (f) (3) (ii) bevorzugt nach Schritt (f) (2) durchgeführt wird,
(g) gegebenenfalls Inkontaktbringen mindestens eines Teils der in Schritt (f) (3) (i) erhaltenen Eluatfraktionen mit einer ausreichenden zusätzlichen Menge der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % der restlichen IGF-1- Mengen aus dem Eluat zu adsorbieren, wobei die erste hydrophobe Interaktionschromatographiematrix eine Butylsubstituierte hydrophobe Interaktionschromatographiematrix ist, wobei mindestes etwa 0,05 Liter der ersten hydrophoben Interaktionschromtographiematrix pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC durchgeführt wird,
(h) falls der fakultative Schritt (g) durchgeführt wurde, Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch Inkontaktbringen der Matrix:
(1) zuerst mit einer ausreichenden Menge eines linearen Salzgradienten einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5 oder bevorzugt einem Anfangs-pH von etwa 5,0 und einem End-pH von etwa 4,0, um ein weitgehend Ammoniumsulfat-freies Eluat zu erzeugen und
(2) bevorzugt mit einer gepufferten Lösung mit einem pH- Wert von etwa 4,0, dann
(3) mit (i) einer ausreichenden Menge eines linearen Gradienten einer weitgehend Ammoniumsulfat-freien gepufferten Lösung mit einem Anfangs-pH von etwa 4,0 bis 4,5, um den pH-Wert des Eluats auf etwa 6,5 bis 7,5 zu erhöhen, oder (ii) einer Menge einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 6,5 bis 7,5,
(i) Inkontaktbringen derjenigen Teile des Eluats aus (f) (3) (i) oder Schritt (f) (3) (ii) oder gegebenenfalls der vereinten Eluate aus (f) (3) (i) und Schritt (h) (3) (i) oder (h) (3) (ii), die als die vorwiegende Form von IGF-1 intakten, monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, wobei das Intaktbringen mit einer ausreichenden Menge eines zweiten Kationenaustauschmatrixmaterials und unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren, durchgeführt wird, wobei die zweite Kationenaustauschmatrix eine sulfylmethylierte oder sulfylpropylierte Matrix ist, wobei mindestens etwa 0,05 Liter der Matrix pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bevorzugt bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC durchgeführt wird,
(j) Inkontaktbringen des IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmatrixmaterials mit mindestens einem bis zu etwa 5 Volumina einer 0,05 M Natriumacetatlösung, pH 4,5 pro Volumen des Kationenaustauschmatrixmaterials und bevorzugt mit 1 bis 5 Volumina einer 0,05 M Natriumacetatlösung, pH 5,5,
(k) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem zweiten Kationenaustauschmatrixmaterial durch Inkontaktbringen des Matrixmaterials mit mindestens 5 Volumina eines Natriumchloridgradienten, der durch das Kombinieren eines ersten Lösungsmittelsystems und eines zweiten Lösungsmittelsystems als ein linearer Gradient bereitgestellt wird, relativ zum Matrixvolumen,
wobei das erste Lösungsmittelsystem eine 0,05 M Natriumacetatlösung, pH 5,5 umfaßt und wobei das zweite Lösungsmittelsystem eine 0,05 M Natriumacetat/0,3 M Natriumchloridlösung, pH 5,5 umfaßt,
(1) nach Schritt (k) entweder (1) Verdünnen der Fraktionen des Eluats aus Schritt (k), die intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, mit mindestens einem Volumen einer gepufferten Ammoniumsulfat enthaltenden Lösung, pH 4,0 bis 7,0, um die Ammoniumsulfatkonzentration des Eluats im Bereich von etwa 0,2 bis zu 2,0 M und den pH des verdünnten Eluats auf etwa 4,5 einzustellen und Inkontaktbringen des verdünnten Eluats mit einer ausreichenden Menge einer zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren, wobei die zweite hydrophobe Interaktionschromatographiematrix eine butylsubstituierte hydrophobe Poly (methacrylat) Träger-Interaktionschromatographiematrix ist, wobei mindestens etwa 0,05 Liter der zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC durchgeführt wird oder
(2) Konzentrieren der Eluatfraktionen aus Schritt (k), die intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, und dann Inkontaktbringen des konzentrierten Materials mit einer ausreichenden Menge eines Größenausschlußmediums mit einer geeigneten Porengröße, um eine Auftrennung der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF-1 von weitgehend allen multimeren Formen von IGF- 1 zu bewirken und
(m) (1) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix nach Schritt (l) (1) durch Inkontaktbringen der Matrix:
(i) zuerst mit einer ausreichenden Menge eines linearen Salzgradienten einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5, oder bevorzugt mit einem Angangs-pH von etwa 5,0 und einem End-pH von etwa 4,0, um ein im wesentlichen ammoniumsulfatfreies Eluat zu erzeugen, dann
(ii) bevorzugt mit einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,0, dann
(iii) mit entweder (1) einer ausreichenden Menge eines linearen Gradienten einer im wesentlichen Ammoniumsulfat-freien gepufferten Lösung mit einem AnfangspH von etwa 4,0 bis 4,5 um den pH- Wert des Eluats auf etwa 6,5 bis 7,5 zu erhöhen oder (2) einer Menge einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5 oder
(m) (2) Eluieren der Größenausschlußmatrix nach Schritt (l) (2) mit 1 bis 2 Volumina von 0,05 bis 0,1 M Ammoniumacetat, pH 6 oder 0,2 M Essigsäure, um zu bewirken, daß die intakte monomere, korrekt gefaltete Form von IGF-1 von den multimeren IGF-Formen aufgetrennt wird.
Der Begriff "Insulin-like growth factor-1" oder "IGF-1 Peptid" oder einfach "IGF-1", wie durchwegs in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, bezeichnet die verschiedenen Formen von rekombinant hergestelltem IGF-1 (d.h. intakter, monomerer, korrekt gefalteter IGF-1 plus angespaltene, gespaltene, multimere und fehlgefaltete Formen). Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff "intakter, monomerer, korrekt gefalteter IGF-1" IGF-1-Formen mit im wesentlichen der gleichen, 70 Aminosäuren langen Sequenz und Tertiärstruktur wie nativer IGF-1 (siehe Rotwein et al., J.- Biol. Chem. 261:4828-4832 (1986)), sowie biologisch aktive Analoga und Derivate davon.
Der erste Schritt des erfindungsgemäßen Reinigungsverfahrens ist es, Medium, das Insulin-like growth factor-1 enthält, mit einer ausreichenden Menge einer ersten Kationenaustauschmatrix unter geeigneten Bedingungen um mindestens 95 % des gesamten IGF-1 aus dem Medium zu adsorbieren, in Kontakt zu bringen.
Das Inkontaktbringen des Insulin-like growth factor-1 enthaltenden Mediums mit der ersten Kationenaustauschmatrix kann auf mehrere Arten durchgeführt werden. Beispielsweise kann die erste Kationenaustauschmatrix in einer Säule enthalten sein, durch die das Insulin-like growth factor-1 enthaltende Medium durchsickern gelassen wird. Alternativ kann die erste Kationenaustauschmatrix in einem geschlossenen Gefäß enthalten sein, in das das Insulin-like growth factor-1 enthaltende Medium eingebracht wird, gefolgt von Rühren für einen ausreichenden Zeitraum, um zuzulassen, daß ein Kontakt der Matrix und des Fluidmediums stattfindet, gefolgt von Dekantieren des an IGF-1 abgereicherten Mediums von der IGF-1 enthaltenden ersten Kationenaustauschmatrix. Als weitere Alternative kann die erste Kationenaustauschmatrix zu dem Gefäß, das IGF-1 enthaltendes Medium enthält, zugegeben werden, gefolgt von Entfernen des an IGF-1 abgereicherten Mediums von der IGF-1 enthaltenden ersten Kationenaustauschmatrix.
Kationenaustauschmatrixmaterialien, die zur Verwendung im ersten Kontaktierungsschritt der vorliegenden Erfindung vorgesehen sind, sind in der Technik gut bekannt. Derartige Austauschmatrizes umfassen feste Kationenaustauschmatrizes, die fähig sind eine hohe Fließrate aufzuweisen, d.h. mit einem ausreichenden Festigkeitsgrad um hohen Drücken standzuhalten und die gegebenenfalls eine makroporöse Struktur besitzen und zusätzlich fähig sind, IGF-1 über einen weiten pH-Bereich zu binden. Beispiele für feste Kationenaustauschmatrizes umfassen carboxymethylierte und sulfonierte Kationenaustauschmatrizes. Matrixmaterialien, wie etwa Cellulose, Polystyrol, Dextrane, Agarose, quervernetzte Agarose u.dgl. können zur Herstellung der Kationenaustauschmatrizes verwendet werden. Derzeit sind bevorzugte Kationenaustauschmatrizes zur Verwendung in diesem ersten Kontaktierungsschritt sulfylpropylierte Matrizes.
Obwohl nicht essentiell, ist es häufig wünschenswert, Kationenaustauschmatrizes vor dem Inkontaktbringen mit IGF-1 enthaltendem Medium zu aktivieren. Eine derartige Aktivierung dient dazu, die Matrix für das folgende IGF-1 enthaltende Medium zu konditionieren und verbessert die Effizienz der Matrix zur Adsorption von IGF-1 Peptiden und die Abtrennung derartiger Peptide von anderen Komponenten im Medium. Ein typisches Aktivierungsverfahren umfaßt nacheinander den Kontakt der Kationenaustauschmatrix mit mehreren Säulenvolumina einer verdünnten schwachen Säure (z.B. 2 bis 5 Volumina 0,2 M Essigsäure), gefolgt von mehreren zusätzlichen Säulenvolumina einer stärker verdünnten schwachen Säurelösung (z.B. 2 bis 10 Volumina einer 0,02 M Essigsäurelösung).
Die Menge des in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendeten ersten Kationenaustauschmatrixmaterials kann über einen weiten Bereich variieren. Typischerweise werden mindestens etwa 0,03 Liter bis zu 1 Liter Matrix pro im Medium enthaltenen IGF-1 verwendet.
Das Inkontaktbringen des IGF-1 enthaltenden Mediums mit der ersten Kationenaustauschmatrix kann unter einer Vielzahl von Bedingungen durchgeführt werden. Typischerweise wird ein derartiges Inkontaktbringen für einen Zeitraum im Bereich von etwa 0,01 bis zu 1 Stunde oder länger und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 2 bis zu 30ºC durchgeführt, wobei eine Temperatur im Bereich von etwa 22 bis zu 25ºC bevorzugt ist. Sobald IGF-1 enthaltendes Nährmedium für einen ausreichenden Zeitraum mit der ersten Kationenaustauschmatrix in Kontakt gehalten wurde, um IGF-1 an das Matrixmaterial zu adsorbieren, ist es wünschenswert, das an IGF-1 abgereicherte Medium vom Kontakt mit der IGF-1 reichen ersten Kationenaustauschmatrix zu entfernen. Dies kann auf eine Vielzahl von Arten bewerkstelligt werden wie etwa z.B. Filtration, Dekantierung, Zentrifugation u.dgl.. Dieses Inkontaktbringen und Abtrennen kann einfach in einem Arbeitsschritt bewerkstelligt werden, durch Leiten des IGF-1 enthaltenden Mediums durch eine Säule der ersten Kationenaustauschmatrix, wobei die Säule mit einem Rückhaltemittel ausgestattet ist (z.B. einem Sieb einer Stützplatte mit Löchern o.dgl.) um die erste Kationenaustauschmatrix in der Säule zurückzuhalten und dennoch den Fluß eines Fluidmediums dadurch zuzulassen. Auf diese Weise wird zugelassen, daß das an IGF-1 abgereicherte Nährmedium lediglich durch die erste Kationenaustauschmatrix fließt. Beim Durchführen einer Säulenchromatographie gemäß der vorliegenden Erfindung ist eine Säulenbetthöhe von mehr als 10 cm wünschenswert, wobei eine Betthöhe von annähernd 20 cm besonders bevorzugt ist.
Sobald im wesentlichen der gesamte IGF-1 an der ersten Kationenaustauschmatrix adsorbiert worden ist und vor der Elution des IGF-1 davon ist es wünschenswert, die IGF-1 enthaltende Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina einer verdünnten schwachen Säure relativ zum Volumen der ersten Kationenaustauschmatrix in Kontakt zu bringen und danach wird die Matrix weiterhin mit zusätzlichen Volumina einer verdünnten schwachen Säure bei höherer Ionenstärke (oder bei höherer Ionenstärke und höherem pH-Wert) als im Anfangswaschschritt in Kontakt gebracht. Dieses fakultative Waschverfahren dient dazu, Verunreinigungen zu entfernen, die nicht so fest wie der IGF-1 an die erste Kationenaustauschmatrix gebunden sind. Beispiele für verdünnte schwache Säurelösungen umfassen annähernd 0,02 molare Essigsäurelösungen oder Phosphorsäurelösungen. Derzeit bevorzugte Waschsysteme umfassen 20 mM Essigsäure, gefolgt von 20 mM Natriumacetat, pH 5, enthaltend 0,2 M NaCl oder 20 mM Essgisäure, gefolgt von 50 mM Natriumacetat, pH 5, gefolgt von 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 oder ein Waschsystem, bestehend aus: 20 mM Essigsäure, gefolgt von 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, gefolgt von 0,1 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5.
Sobald im wesentlichen der gesamte IGF-1 an der ersten Kationenaustauschmatrix adsorbiert worden ist und gegebenenfalls wie oben beschrieben gewaschen worden ist, wird IGF-1 dann aus der IGF-1 enthaltenden Matrix eluiert durch Inkontaktbringen der Matrix mit einer ausreichenden Menge eines Lösungsmittelsystems, das einen ausreichend hohen pH- Wert oder eine ausreichene Ionenstärke hat, um im wesentlichen den gesamten IGF-1 aus der Matrix zu verdrängen. Ein Lösungsmittelsystem, das einen ausreichend hohen pH-Wert oder eine ausreichende Ionenstärke hat um die gewünschte Elution zu bewerkstelligen, ist ein Lösungsmittelsystem, das eine höhere Ionenstärke hat als das wäßrige Medium mit dem das Matrixmaterial äquilibriert wird, oder alternativ einen höheren pH-Wert hat als das wäßrige Medium mit dem das Matrixmaterial äquilibriert wird. Eine Elution wird bewerkstelligt durch Erhöhen des pH-Werts oder der Ionenstärke des Lösungsmittelsystems. Ein Lösungsmittelsystem das einen "ausreichend hohen pH-Wert oder eine ausreichende Ionenstärke" hat, um die erwünschte Elution zu bewerkstelligen ist eines bei dem der pH-Wert oder die Ionenstärke ausreichend verändert wurde, um die Verteilung der IGF-1 Peptide von der stationären Phase in die mobile Phase beträchtlich zu erhöhen.
Zur Verwendung in diesem Elutionsschritt vorgesehene Lösungsmittelsysteme umfassen verdünnte gepufferte Lösungen einer schwachen Säure bei einem pH von etwa 5,5 und welche etwa eine Konzentration von 0,2 bis 1 M eines ionischen Salzes z.B. Natriumchlorid u.dgl. enthalten. Derzeit bevorzugte Lösungsmittelsysteme zur Verwendung in diesem Elutionsschritt sind (1) eine 0,02 M Natriumacetatlösung mit einem pH von etwa 5,5, die weiterhin etwa 1 M Natriumchlorid enthält (2) eine Lösung eines linearen Gradienten, umfassend 0 bis 0,5 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, oder (3) eine 0,05 M Natriumacetatlösung, die 0,3 M NaCl, pH 5,5, enthält. Wenn der Elutionsschritt mit einer 0,3 M NaCl enthaltenden 0,05 M Natriumacetatlösung, pH 5,5 (d.h. Lösungsmittelsystem (3) oben), durchgeführt wird, ist es insbesondere bevorzugt, das Waschsystem, bestehend aus 20 mM Essigsäure, gefolgt von 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, gefolgt von 0,1 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, vor dem Elutionsschritt zu verwenden. Die Menge des verwendeten Lösungsmittelsystems zur Eluierung kann über einen weiten Bereich variieren. Typischerweise werden im Bereich von etwa 3 bis 10 Volumina des Lösungsmittelsystems pro Volumen der ersten Kationenaustauschmatrix verwendet.
Elution von IGF-1 aus der IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmatrix kann unter einer Reihe von Bedingungen durchgeführt werden. Typischerweise wird eine Temperatur im Bereich von etwa 2 bis zu 30ºC verwendet. Typischerweise ist die Elutionszeit relativ kurz und fällt in den Bereich von etwa 0,01 bis zu 1,0 Stunden, obwohl auch längere oder kürzere Zeiträume verwendet werden können.
Teilweise gereinigtes IGF-1 enthaltendes Medium, das aus der ersten Kationenaustauschmatrix eluiert wurde, wird dann mit einer ausreichenden Menge einer ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht, um in Bereich von 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltenden Mediums zu adsorbieren. 0bwohl ein derartiges Inkontaktbringen sowohl in einem Chargen- wie einem kontinuierlichen Modus durchgeführt werden kann, ist es derzeit bevorzugt das Matrixmaterial in einer Säule aufzunehmen und das IGF-1 enthaltende Medium hindurchzuleiten. Es ist bevorzugt, eine ausreichende Menge an Matrixmaterial zu verwenden, um eine Säulenbetthöhe von etwa 20 cm zu erreichen.
Vor dem Inkontaktbringen des Eluats der ersten Kationenaustauschmatrix mit der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix wird das anfängliche Eluat typischerweise mit einem ausreichenden Volumen einer gepufferten Salz enthaltenden Lösung, pH 4,0 bis 7,0, bevorzugt 4,5 bis 5,0 behandelt, um die Salzkonzentration des verdünnten Eluats im Bereich von etwa 0,4 bis zu 1,0 M, bevorzugt 0,6 M und den pH-Wert des verdünnten Eluats bei etwa 4,5 einzustellen. Durch Erhöhung des Salzgehaltes des Mediums wird die Bindungsaffinität von IGF-1 für die hydrophobe Interaktionschromatographiematrix verbessert. Für eine derartige Verwendung in Betracht gezogene Salze sind diejenigen Salze, die die hydrophobe Wechselwirkung von IGF-1 und der hydrophoben Interaktionschromatographiematrix verbessern, z.B. Natriumsulfat, Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat, Kaliumphosphat, Natriumacetat, Ammoniumacetat, Natriumchlorid, Natriumcitrat u.dgl.. Allgemein fällt der verwendete Salzgehalt in den Bereich von etwa 0,2 bis zu 2,0 M, wobei ein Salzgehalt von etwa 0,4 bis zu 1 M derzeit bevorzugt ist. Ein besonders bevorzugtes Salz ist Ammoniumsulfat bei einer Konzentration von etwa 0,4 bis 0,8 M.
Zur Verwendung in diesem nächsten Inkontaktbringen gemäß der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogene hydrophobe Interaktionschromatographiematrixmaterialien sind Alkyl- oder Aryl-substituierte hydrophobe Interaktionschromatographiematrizes. Hydrophobe Interaktionen bzw. Wechselwirkungen sind ein Phänomen von größter biologischer Bedeutung. Sie sind eine der Hauptkräfte die die dreidimensionale Struktur von Proteinen stabilisieren. Hydrophobizität ist die Abstoßung zwischen einer nicht polaren Verbindung und einer polaren Umgebung, wie etwa Wasser. Da die Struktur von Wasser um eine hydrophobe Verbindung hydrophobe Wechselwirkungen hervorruft, werden die hydrophoben Wechselwirkungen beeinflußt falls man die Struktur von Wasser durch Auflösen von Salzen darin verändert. Beispielsmatrizes umfassen Butyl-, Octyl- oder Phenyl-substituierte hydrophobe Interaktionschromatographiematrizes. Zur Verwendung als hydrophobe Interaktionschromatographiematrizes in der Praxis der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogene Träger umfassen synthetische Polymere, z.B. Polystyrol, Poly(methacrylate), etc.; Cellulose, Dextrane, Agarose, quervernetzte Agarose u.dgl. Eine derzeit bevorzugte hydrophobe Interaktionschromatographiematrix zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung ist eine Butylsubstituierte Poly(methacrylat) hydrophobe Interaktionschromatographiematrix, z B. TSK Butyl Toyopearl- 650M Matrix).
Vor Verwendung kann die hydrophobe Interaktionschromatographiematrix aktiviert werden oder nach Verwendung kann die hydrophobe Interaktionschromatographiematrix unter Anwendung des folgenden aufeinanderfolgenden Waschverfahrens regeneriert werden:
im Bereich von 1 bis 10 Säulenvolumina Wasser,
im Bereich von 3 bis 10 Säulenvolumina einer 0,5 M Natriumhydroxidlösung,
im Bereich von 1 bis 10 Säulenvolumina Wasser,
im Bereich von 3 bis 10 Säulenvolumina einer 50 %- igen wäßrigen Methanollösung und schließlich
im Bereich von 1 bis 10 Säulenvolumina Wasser,
und danach wird die Säule mit im Bereich von 5 bis 10 Säulenvolumina eines Salz enthaltenden Acetat/Phosphatpuffers mit einem pH-Wert von etwa 4,5, bevorzugt 5,0, äquilibriert.
Mengen der in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendeten ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix können über einen weiten Bereich variieren. Typischerweise werden im Bereich von etwa 0,05 bis zu 1 Liter Matrix pro Gramm IGF-1 in dem zu behandelnden Medium verwendet.
Das Inkontaktbringen von teilweise gereinigtem IGF-1 enthaltendem Nährmedium mit der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix kann unter einer Reihe von Bedingungen durchgeführt werden. Typischerweise wird ein derartiges Inkontaktbringen für einen Zeitraum im Bereich von etwa 0,1 bis zu 30 Minuten und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 15 bis 30ºC durchgeführt, wobei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC bevorzugt sind.
Sobald im wesentlichen der gesamte IGF-1 an der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix adsorbiert worden ist, wird der IGF-1 von der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix eluiert durch Inkontaktbringen der Matrix zuerst unter geeigneten Bedingungen, um manche der aberranten IGF-1 Peptide aus der Matrix zu entfernen ohne beträchtliche Mengen der intakten, monomeren, korrekt gefalteten Form von adsorbiertem IGF-1 aus der Matrix zu entfernen und danach wird die Matrix unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht, um im wesentlichen den gesamten verbliebenen adsorbierten IGF-1 aus der Matrix zu entfernen. Der IGF-1 Gehalt der Eluatfraktionen kann durch eine Vielzahl von Techniken, z.B. HPLC, bestimmt werden.
Die anfängliche Elution mancher der aberranten IGF-1 Peptide wird bewerkstelligt durch Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina relativ zum Matrixvolumen eines Puffersystems mit einer niedrigen Leitfähigkeit, d.h. einem Puffersystem mit weniger als etwa 100 mM Salz. Beispielspuffersysteme umfassen Acetatpuffer, Phosphatpuffer, Lactatpuffer, Succinatpuffer, Bis-Tris-Puffer u.dgl., sowie Gemische damit, mit einem pH von etwa 4,5. Es wird eine Menge eines derartigen Puffers verwendet, um ein im wesentlichen salzfreies Eluat zu erzeugen. Bevorzugt umfaßt diese anfängliche Elution der ersten HIC-Matrix, die Verwendung eines linearen Ammoniumsulfatsgradienten, beginnend bei 20 % gesättigtem Ammoniumsulfat, das mit 50 mM Natriumacetat/Phosphat bei pH 5,0 gepuffert ist und endend mit 0 % Ammoniumsulfat, das mit dem gleichen Puffer bei pH 4,0 gepuffert ist. Dies kann gefolgt werden durch weiteres Waschen unter Verwendung eines Puffers bei pH 4,0 ohne Ammoniumsulfat.
Elution des verbliebenen adsorbierten IGF-1 aus der Matrix wird bewerkstelligt durch Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems mit einem hohen pH, wobei der Puffer in einer ausreichenden Menge verwendet wird, um den pH des Eluats auf etwa 6,5 bis 7,5 zu erhöhen.
Elution von IGF-1 aus der IGF-1 enthaltenden hydrophoben Interaktionschromatographiematrix wird unter einer Reihe von Bedingungen bewerkstelligt. Typischerweise wird eine Temperatur im Bereich von etwa 15 bis zu 30ºC verwendet, wobei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC bevorzugt sind. Typischerweise variiert die Elutionszeit als eine Funktion der Säulendimensionen des Matrixmaterials u.dgl.. Fluß des Eluenten durch die Säule fällt typischerweise in den Bereich von etwa 10 bis zu 300 cm/h.
Gegebenenfalls kann ein Teil des Eluats aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix, das unter Verwendung eines Puffers mit einem hohen pH-Wert eluiert wird, auf die gleiche hydrophobe Interaktionschromatographiematrix (nach Regenerierung) aufgebracht werden und ein zweites Mal unter Verwendung des gleichen oben beschriebenen Zweistufen- oder Dreistufenelutionsprotokolls eluiert werden. Auf diese Weise werden zusätzliche Mengen des intakten, monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 erhalten. Diejenigen Eluatfraktionen, die beträchtliche Mengen des intakten, monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 plus beträchtliche Mengen anderer Formen von IGF-1 (z.B. einen Gehalt multimerer IGF-1 Form(en) von 20 % oder mehr) enthalten, sind naheliegende Kandidaten für eine derartige fakultative Wiederverwendung der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix.
Danach können die Eluatfraktionen aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix die intakten, monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, dann mit einer ausreichenden Menge einer zweiten Kationenaustauschmatrix unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht werden, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % der IGF-1 Peptide aus dem Eluat zu adsorbieren. Dies wird günstig bewerkstelligt durch Leiten des IGF-1 Peptide enthaltenden Mediums durch eine Säule, die das zweite Kationenaustauschmaterial enthält. Diese zweite Kationenaustauschchromatographiematrix wird wenn nötig verwendet, um "angespaltenen" IGF-1 aus IGF-1 enthaltenden Fraktionen zu entfernen, die "angespaltenen" IGF-1 zusätzlich zu authentischem IGF-1 und multimerem IGF-1 enthalten. In besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können proteasedefiziente Stämme methylotropher Hefe verwendet werden, um rekombinanten IGF-1 herzustellen, wobei die Gehalte von "angespaltenem" IGF-1 praktisch vernachlässigbar sein können, in welchem Fall dieser zweite Durchgang einer Kationenaustauschchromatographie fakultativ sein kann und das Reinigungsverfahren nach der hydrophoben Interaktionschromatographie sich fortsetzen kann mit einem Gelfiltrationschromatographieschritt wie hierin beschrieben, wenn es notwendig ist authentischen IGF-1 von multimerem IGF-1 abzutrennen.
Zur Verwendung in diesem Kontaktierungsschritt der vorliegenden Erfindung vorgesehene Kationenaustauschmatrizes sind feste Kationenaustauschmatrizes, die zu einer hohen Auflösung fähig sind, d.h. die fähig sind, angespaltenen IGF-1 von intaktem monomerem IGF-1 auf zutrennen. Beispielskationenaustauschmatrizes umfassen carboxymethylierte und sulfonierte Kationenaustauschmedien. Eine derzeit bevorzugte Kationenaustauschmatrix zur Verwendung in diesem Kontaktierungsschritt der vorliegenden Erfindung ist eine sulfonierte Agarose (z.B. Fast-Flow S-Sepharose oder Toyopearl SP550C).
Mengen der in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendeten zweiten Kationenaustauschmatrix können über einen weiten Bereich variieren. Typischerweise werden im Bereich von etwa 0,05 bis zu 1 Liter Matrix pro Gramm IGF-1 in dem zu behandelnden Medium verwendet.
Das Inkontaktbringen des IGF-1 enthaltenden Nährmediums mit der zweiten Kationenaustauschmatrix kann unter einer Reihe von Bedingungen durchgeführt werden. Typischerweise wird ein derartiges Inkontaktbringen für einen Zeitraum von mindestens etwa 0,1 Minuten und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 2 bis zu 30ºC durchgeführt, wobei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC bevorzugt sind.
Gegebenfalls kann, falls notwendig um Leitfähigkeit zu vermindern, das auf die zweite Kationenaustauschmatrix aufgebrachte Medium vor dem Inkontaktbringen mit der zweiten Kationenaustauschmatrix mit mindestens einem Volumen Wasser (oder einem Puffer niedriger Leitfähigkeit, wie etwa dem Säulenäquilibrierungspuffer) verdünnt werden. Der pH des verdünnten IGF-1 enthaltenden Mediums wird vor dem Aufbringen auf die zweite Kationenaustauschmatrix bevorzugt auf etwa 4,5 eingestellt.
Vor Verwendung kann die zweite Kationenaustauschmatrix aktiviert werden oder nach Verwendung kann die zweite Kationenaustauschmatrix regeneriert werden unter Verwendung des folgenden aufeinanderfolgenden Waschverfahrens:
im Bereich von 1 bis 10 Säulenvolumina Wasser,
im Bereich von 3 bis 10 Säulenvolumina einer 0,5 M Natriumhydroxidlösung,
im Bereich von 1 bis 10 Säulenvolumina Wasser,
im Bereich von 3 bis 10 Säulenvolumina einer 50 %- igen wäßrigen Methanollösung und schließlich
im Bereich von 1 bis 10 Säulenvolumina Wasser und danach wird die Säule äquilibriert mit
im Bereich von 3 bis 5 Säulenvolumina 0,5 M Natriumacetat, pH 4,5, und
im Bereich von 10 bis 20 Säulenvolumina 0,05 M Natriumacetat, pH 4,5.
Sobald im wesentlichen der gesamte IGF-1 an der zweiten Kationenaustauschmatrix adsorbiert worden ist und vor Elution des IGF-1 davon ist es wünschenswert, die IGF-1 enthaltende Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 5 Volumina eines verdünnten Puffers oder einer schwachen Säure relativ zum Matrixvolumen in Kontakt zu bringen. Für diesen Zweck in Betracht gezogene schwache Säuren umfassen Essigsäure und Phosphorsäure. Ein derzeit bevorzugter verdünnter Puffer oder eine derzeit bevorzugte schwache Säure umfaßt eine 0,05 M Natriumacetatlösung mit einem pH von etwa 4,5. Diese fakultative Waschung dient dazu, Verunreinigungen zu entfernen die nicht so fest an die zweite Kationenaustauschmatrix gebunden sind wie der IGF-1. Bevorzugt umfaßt dieser fakultative Waschschritt die Verwendung einer 0,05 M Natriumacetatlösung mit einem pH von etwa 4,5, gefolgt von einer 0,05 M Natriumacetatlösung mit einem pH von etwa 5,5.
Sobald im wesentlichen der gesamte IGF-1 an die zweite Kationenaustauschmatrix adsorbiert worden ist und gegebenfalls wie oben beschrieben gewaschen worden ist, wird IGF-1 dann aus der IGF-1 enthaltenden Matrix eluiert durch Inkontaktbringen der Matrix mit einer ausreichenden Menge eines Puffersystems mit einer ausreichenden Ionenstärke, um im wesentlichen alle IGF-1 Peptide differentiell aus der Matrix zu verdrängen. Typischerweise wird mindestens ein Volumen Eluent für diesen Zweck verwendet, wobei ein Bereich von etwa 3 bis zu 12 Volumina bevorzugt ist.
Ein günstiger Weg, um dieses differentielle Verdrängen zu bewerkstelligen ist es, einen Natriumchloridgradienten in einem gepufferten Lösungsmittelsystem zu verwenden. Beispielsweise kann ein Natriumacetatpuffer mit einem pH von 5,5 verwendet werden, wobei dem Puffer nach und nach steigende Mengen von Natriumchlorid zugegeben werden. Somit kann ein linearer Gradient bereitgestellt werden, beginnend mit einem ersten Lösungsmittelsystem, umfassend eine 0,05 M Natriumacetatlösung (pH 5,5) mit steigenden Mengen eines zweiten dazu zugegebenen Lösungsmittelsystems, wobei das zweite Lösungsmittelsystem eine 0,05 M Natriumacetat/0,3 M Natriumchloridlösung (pH 5,5) umfaßt.
Eine Elution von IGF-1 aus der IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmatrix kann unter einer Reihe von Bedingungen durchgeführt werden. Typischerweise wird eine Temperatur im Bereich von etwa 2 bis zu 30ºC verwendet, wobei Temperaturen im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC bevorzugt sind. Typischerweise variieren Elutionszeiträume als Funktion der Säulendimensionen des Matrixmaterials u.dgl.. Fluß des Eluenten durch die Säule wird typischerweise in einen Bereich von etwa 10 bis zu 300 cm/h fallen.
Das Eluat der zweiten Kationenaustauschmatrix kann entweder durch einen zweiten hydrophoben Interaktionschromatographieschritt behandelt werden oder bevorzugt durch ein Gelfiltrationsverfahren. Eine derartige Behandlung wird verwendet, um Restmengen an Multimeren aus dem Medium, das im wesentlichen gereinigten IGF-1 enthält, zu entfernen.
Wenn Gelfiltration verwendet wird, um Restmengen an Multimeren aus dem Medium, das im wesentlichen gereinigten IGF-1 enthält, zu entfernen, wird der Anteil des Eluats aus entweder der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix oder der zweiten Kationenaustauschchromatographiematrix, der als die vorwiegende Form von IGF-1 intakten, monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthielt, mit einer ausreichenden Menge eines Gelfiltrationsmediums unter geeigneten Bedingungen in Kontakt gebracht, um im wesentlichen den gesamten monomeren IGF-1 von multimeren Formen aufzutrennen. Dies wird bewerkstelligt durch Leiten des IGF-1 enthaltenden Mediums durch eine Säule, die Gelfiltrationsmedium enthält. Zur Verwendung in der Praxis der vorliegenden Erfindung in Betracht gezogene Gelfiltrationsmedien umfassen Größenausschlußmedien mit einer geeigneten Porengröße um eine Differenzierung zwischen der gewünschten intakten, monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF-1 und multimeren Formen davon zu unterscheiden. Beispielsgelfiltrationsmedien umfassen Sephadex, Sephacryl, Superdex, Harze auf Polymerbasis u.dgl.
Die Mengen des in der Praxis der vorliegenden Erfindung verwendeten Gelfiltrationsmediums liegen typischerweise im Bereich von 1 bis 10 l Gelfiltrationsmedium pro Gramm IGF-1 in dem zu behandelnden Medium.
Das Inkontaktbringen der IGF-1 enthaltenden Medien mit dem Gelfiltrationsmedium kann unter einer Reihe von Bedingungen durchgeführt werden. Typischerweise wird ein derartiges Inkontaktbringen für einen Zeitraum von mindestens etwa 120 Minuten und bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 25ºC durchgeführt.
Nach Verwendung kann das Gelfiltrationsmedium regeneriert werden unter Verwendung des folgenden aufeinanderfolgenden Waschverfahrens:
Im Bereich von 0,5 bis 2,0 Säulenvolumina Wasser, im Bereich von 0,5 bis 2,0 Säulenvolumina 0,5 M NaOH, im Bereich von 0,5 bis 2,0 Säulenvolumina 50 % Methanol und schließlich im Bereich von 0,5 bis 2,0 Säulenvolumina Wasser und danach wird die Säule mit im Bereich von 1 bis 5 Säulenvolumina 0,05 M Ammoniumacetat, pH 6, oder 0,2 M Essigsäure äquilibriert.
Sobald das IGF-1 enthaltende Medium auf das Gelfiltrationsmedium aufgebracht worden ist, wird IGF-1 dann aus den Gelfiltrationsmedium eluiert durch Inkontaktbringen des Gelfiltrationsmediums mit einer ausreichenden Menge eines Eluenten um eine differentielle Bewegung von multimerem und monomerem IGF-1 durch das Gelfiltrationsmedium, ohne wesentliche irreversible Adsorption von Protein an die Matrix, zu erleichtern. Typischerweise wird mindestens ein Volumen Eluent für diesen Zweck verwendet, wobei ein Bereich von etwa 1 bis zu 1,5 Volumina bevorzugt ist. Beispielseluenten zur Verwendung beim Eluieren von IGF-1 aus dem Gelfiltrationsmedium umfassen Salz enthaltende Puffer, wie etwa 50 mM Ammoniumacetat, pH 6,0 oder Puffer geringer Leitfähigkeit, wie etwa 0,2 M Essigsäure. Obwohl im wesentlichen jedes Gelfiltrationsmaterial mit einer geeigneten Porengröße wie hierin beschrieben mit einem Salz enthaltenden Puffer chromatographiert werden kann, ist es besonders bevorzugt, die Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung einer Gelfiltrationsmatrix durchzuführen, die ein Harz auf Polymerbasis verwendet, am meisten bevorzugt Toyopearl HW50F (TosoHaas, Philadelphia, PA), und mit einer Essigsäurelösung wie etwa 0,2 M Essigsäure zu eluieren.
Eine Elution von IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltenden Gelfiltrationsmedium kann unter Verwendung verschiedener Bedingungen durchgeführt werden. Typischerweise wird eine Temperatur im Bereich von etwa 20 bis 25ºC verwendet. Typischerweise variieren Elutionszeiträume als Funktion von Säulendimensionen, Gelfiltrationsmedium u.dgl.. Eluentenfluß durch die Säule fällt typischerweise in den Bereich von 5 bis zu 50 cm/h.
Wenn eine zweite hydrophobe Interaktionschromatographiematrix anstelle von Gelfiltration verwendet wird, wird vor dem Inkontaktbringen des Anteils des Eluats aus der zweiten Kationenaustauschmatrix mit einer zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix das Eluat aus der zweiten Kationenaustauschmatrix, das wesentliche Mengen von intaktem monomerem, korrekt gefaltetem IGF-1 enthält, gegebenenfalls mit einem ausreichenden Volumen einer gepufferten Salz enthaltenden Lösung mit einem pH von etwa 4,0 bis etwa 7,0, bevorzugt etwa pH 4,5 bis 5,0 verdünnt, um die Salzkonzentration des verdünnten Eluats im Bereich von 0,4 bis zu 1,0, bevorzugt 0,6 M, einzustellen.
Der Anteil des Eluats der zweiten Kationenaustauschmatrix, der wesentliche Mengen von intaktem monomerem, korrekt gefaltetem IGF-1 enthält, wird dann mit einer zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix, die die gleiche sein kann wie die erste, früher verwendete hydrophobe Interaktionschromatographiematrix oder davon verschieden sein kann, in Kontakt gebracht.
Mengen der zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix und Bedingungen des Inkontaktbringens für diesen Schritt sind ähnlich wie diejenigen, die im vorhergehenden Inkontaktbringen des IGF-1 enthaltenden Mediums mit der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix verwendet wurden.
Sobald im wesentlichen alle IGF-1 Formen (d.h. diejenigen Formen, die bei dieser Stufe des Reinigungsverfahrens noch vorhanden sind) an die zweite hydrophobe Interaktionschromatographiematrix adsorbiert worden sind, wird der IGF-1 aus der Matrix eluiert durch erneutes Inkontaktbringen der Matrix, wie vorstehend für die erste hydrophobe Interaktionschromatographiematrix beschrieben.
Somit wird die Matrix zuerst unter geeigneten Bedingungen behandelt, um im wesentlichen alle anderen verbliebenen Formen von IGF-1 als die intakte, monomere, korrekt gefaltete Form von IGF-1 aus der Matrix zu entfernen, ohne wesentliche Mengen der intakten, monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF-1 zu verdrängen und danach wird die Matrix unter geeigneten Bedingungen behandelt, um im wesentlichen den gesamten verbliebenen adsorbierten IGF-1 aus der Matrix zu entfernen.
Eine Elution von anderen IGF-1 Formen als der intakten, monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF-1 (vorwiegend multimere IGF-1 Formen) wird unter Verwendung eines Puffersystems mit einer geringen Leitfähigkeit bewerkstelligt. Ein derartiger Puffer fördert vorwiegend die Elution multimerer IGF-1 Formen. Ein für einen derartigen Zweck geeignetes Beispielpuffersystem ist ein linearer Salzgradient einer gepufferten Lösung mit einem pH von etwa 4,5 in einer ausreichenden Menge um ein im wesentlichen salzfreies Eluat zu erzeugen. Bevorzugt wird für diesen Zweck ein linearer Ammoniumsulfatgradient verwendet, beginnend bei 20 % gesättigtem Ammoniumsulfat mit 0,05 M Natriumacetat/Phosphat bei pH 5,0 gepuffert und endend mit 0 % Ammoniumsulfat mit den gleichen Puffer bei pH 4,0 gepuffert. Dies kann gefolgt werden von weiterem Waschen unter Verwendung eines Puffers ohne Ammoniumsulfat, pH 4,0.
Eine Elution des verbliebenen adsorbierten IGF-1 aus der Matrix wird bewerkstelligt unter Verwendung eines Puffersystems mit einem höheren pH-Wert als dem pH-Wert des zum Äquilibrieren der HIC-Matrix verwendeten wäßrigen Mediums. Ein günstiges Mittel, um ein derartiges Medium bereitzustellen ist ein linearer Gradient einer im wesentlichen salzfreien gepufferten Lösung mit einem Anfangs-pH von etwa 4,0, wobei der pH dieser Pufferlösung allmählich auf etwa 6,5 bis 7,5 erhöht wird. Alternativ dazu kann das Medium eine gepufferte Lösung mit einem pH-Wert von etwa 6,5 bis etwa 7,5 sein.
Wie vorstehend mit Bezug auf die erste hydrophobe Interaktionschromatographiematrix beschrieben, kann ein Teil des Eluats aus der zweiten HIC-Matrix, das unter Verwendung eines Puffers mit hohem pH-Wert eluiert wird und vorwiegend multimere IGF-1 Formen plus geringe Mengen an intaktem, monomerem, korrekt gefaltetem IGF-1 enthält, erneut auf die zweite hydrophobe Interaktionschromatographiematrix aufgebracht werden, dann unter Verwendung des gleichen oben beschriebenen Elutionsprotokolls erneut eluiert werden.
Das aus dem obig beschrieben Vielschrittverfahren erhaltene, im wesentlichen gereinigte Produkt kann gegebenenfalls behandelt werden, um restliche Salze aus dem gereinigten Produkt zu entfernen, und um das Medium, das das gereinigte Produkt enthält, zu konzentrieren. Salzentfernung kann z.B. durch Gelfiltration, Diafiltration u.dgl. bewerkstelligt werden, während eine Konzentrierung des Mediums, das gereinigtes Produkt enthält, durch Lyophilisierung, Diafiltration u.dgl. bewerkstelligt werden kann.
Das Medium aus dem IGF-1 gemäß dem erfindungsgemäßen IGF-1 Reinigungsverfahren gewonnen wird, kann stark variieren. Derzeit ist die Gewinnung von natürlichen, synthetischen und/oder rekombinanten Materialien vorgesehen. Bevorzugt wird für die Praxis der vorliegenden Erfindung Medium, das mindestens etwa 0,01 Gramm IGF-1 Peptide pro Liter Medium enthält, verwendet.
Synthetische Quellen für IGF-1, aus denen intakter IGF-1 gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnen und gereinigt werden kann, umfassen rekombinant modifizierte Hefe, Bakterien und/oder Säugerzellen, die eine oder mehrere DNA-Sequenzen, welche operabel für IGF-1 Peptide codieren, enthalten. Derzeit bevorzugt sind Hefespezies, ausgewählt aus der Gattung Pichia, wobei die Hefe mit mindestens einem DNA-Fragment, das fähig ist, IGF-1 zu exprimieren, transformiert ist; insbesondere wobei IGF-1 von einem Konstrukt exprimiert wird, umfassend in Transkriptionsrichtung die folgenden DNA-Sequenzen:
(i) eine Promotorregion eines methanolresponsiven Gens von P. pastoris, z.B. den AOX1 Promotor,
(ii) eine für ein Polypeptid codierende DNA-Sequenz, bestehend aus:
(a) der S. cerevisiae alpha mating factor (AMF) Präpro-Sequenz, umfassend eine Prozessierungsstelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lys-Arg und Lys-Arg-(Glu-Ala)x, wobei x eine ganze Zahl zwischen 1 und etwa 3 ist und
(b) einem Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) Peptid und
(iii) einen in P. pastoris funktionellen Transkriptionsterminator,
wobei die DNA-Sequenzen zur Transkription der für das Polypeptid codierenden Sequenzen operativ miteinander verbunden sind.
Die spezifischen Pichia pastoris Stämme G+IGF201S1, G+IGF201S2, G+IGF201S6, G+IGF201S10, G+IGF202S3, G+IGF202S5, G+IGF204S2, G+IGF204S8, G+IGF206S2, G+IGF206S5, G+IGF206S8, G+IGF206S9, G+IMB202S2, G+IMB204S14, G+IMB206S1, G+IMB206S3, G-IMB202S1, G-IMB206S2, oder G-IMB206S3 sind derzeit bevorzugt, weil sich herausgestellt hat, daß sie bei Fermentation hohe IGF-1 Gehalte erzeugen. Diese spezifischen, derzeit am meisten bevorzugten Stämme werden hergestellt und veranlaßt IGF-1 zu exprimieren, wie in der ebenfalls anhängigen Anmeldung Serial Nr. 578,728 beschrieben, auf welche Anmeldung der Leser bezüglich zusätzlicher Einzelheiten, wie der Herstellung der Stämme und der Expression von IGF-1 daraus, verwiesen wird. P. pastoris Stämme, die für proteolytische Aktivität defizient sind und die bei Fermentation hohe IGF-1 Gehalte und verringerte Gehalte von angespaltenem IGF-1 produzieren, sind in der United States Anmeldung Serial Nr. 678,916, eingereicht am 1. April 1991, die der Anmelderin mitgehört und der internationalen PCT-Anmeldung Nr. US91/06452, eingereicht am 4. September 1991, die der Anmelderin mitgehört, beschrieben, wobei die Offenbarungen dieser Anmeldungen durch Referenz hierin aufgenommen werden. Ein besonders bevorzugter P. pastoris Stamm, der hohe Gehalte an authentischem IGF-1 und verminderte Gehalte von angespaltenem IGF-1 produziert, ist M+TMB206S1.
Wenn der zu reinigende IGF-1 im Fermentationsnährmedium aus Fermentationsbetrieb enthalten ist, ist es bevorzugt vor dem anfänglichen Inkontaktbringen des IGF-1 enthaltenden Mediums mit der ersten Kationenaustauschmatrix zelluläres und teilchenförmiges Material aus dem Fermentationsnährmedium abzutrennen. Bevorzugt ist der zu reinigende TGF-1 in einem weitgehend zellfreien Fermentationsnährmedium aus einem Fermentationsvorgang bei hoher Zelldichte enthalten. In diesem Fall wird das Nährmedium gegebenenfalls vor dem Tnkontaktbringen des Nährmediums mit der ersten Kationenaustauschmatrix mit einem gepufferten Medium verdünnt. Der für diesen Zweck verwendete Puffer sollte eine geringe Leitfähigkeit haben und sollte etwa den gleichen pH-Wert wie die zum Äguilibrieren der ersten Kationenaustauschmatrix verwendeten Medien aufweisen.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden nicht beschränkenden Beispiele ausführlicher beschrieben.

BEISPIELE

BEISPIEL 1: CHARAKTERISIERUNG VON REKOMBINANTEN PROTEINEN IN NÄHRMEDIUM VON IGF-1 SEZERNIERENDEN PICHIA PASTORIS STÄMMEN

Rekombinanter IGF-1 wurde produziert durch Anzucht von IGF-1 sezernierenden P. pastoris Stämmen G+IMB204S14 und N+IMB206S1 (beschrieben in US-Patentanmeldung Serial Nr. 578,728, eingereicht am 4. September 1990 und US-Serial No. 678,916, eingereicht am 1. April 1991 und Internationale Anmeldung Nr. PCT/US91/06452, eingereicht am 4. September 1991) in einer 10- Liter Fermentation, die durchgeführt wurde gemäß des folgenden dreistufigen chargenweisen Fermentationsverfahrens bei hoher Zelldichte:
1) Wachstum auf überschüssigem Glycerin,
2) Wachstum auf begrenztem Glycerin und
3) Wachstum auf begrenztem Methanol.
Anfangs werden Zellen in einem Chargenmodus auf Glycerin angezogen. Da Glycerol den AOX1 Promotor stark reprimiert, wird das IGF-1 Gen, das durch diesen Promotor reguliert wird, während dieser Phase nicht exprimiert. Nach Glycerinverarmung wird eine begrenzte Glycerinzufuhr begonnen. Während dieser Phase akkumuliert Glycerin nicht, aber die Zellmasse nimmt zu und der AOX1 Promotor wird dereprimiert. Schließlich wird in der dritten Phase eine Methanolzufuhr begonnen, die den AOX1 Promotor zur Herstellung von IGF-1 vollständig induziert.
Korrekt gefalteter, intakter monomerer IGF-1 wurde aus dem Nährmedium von 10 Liter Fermentationen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Kombination von Kationenaustauschchromatographie, hydropher Interaktionschromatographie (HIC) und Gelfiltrationschromatographie gereinigt.

A. Zehn-Liter Fermentationen der P. pastoris Stämme G+IMB204S14 und M+IMB206S1

Ein 15-Liter Fermenter (Biolafitte; Princeton, NJ), der 3,5 Liter 10x Basissalze (42 ml 85 % Phosphorsäure/l, 1,8 g Calciumsulfat 2H&sub2;O/l, 28,6 g Kaliumsulfat/l, 23,4 g Magnesiumsulfat 7H&sub2;O/l, 6,5 g Kaliumhydroxid/l) und 220 g Glycerin in einem Gesamtvolumen von 5,5 Litern enthielt, wurde sterilisiert. Nachdem der Fermenter abgekühlt war, wurden 24 ml PTM1 Spurensalze (6,0 g Kupfersulfat 5H&sub2;O/l, 0,08 g Natriumjodid/l, 3,0 g Mangansulfat H&sub2;O/l, 0,2 g Natriummolybdat 2H&sub2;O/l, 0,02 g Borsäureil, 0,5 g Kobaltchlorid/l, 20,0 g Zinkchlorid/l, 65,0 g Eisen(II)sulfat 7H&sub2;O/l, 0,20 g Biotin/l, 5,0 ml Schwefelsäure/l) zugegeben und der pH wurde mittels der Zugabe von 28 % (konzentriertem) Ammoniumhydroxid auf 5,0 eingestellt. Der pH-Wert wurde mittels der Zugabe der gleichen Lösung geregelt. Schäumen wurde mittels der Zugabe einer 5 % Lösung Struktol J673 geregelt. Die Temperatur wurde bei 30ºC gehalten und gelöster Sauerstoff wurde über 20 % Sättigung gehalten durch Erhöhen der Bewegung, der Belüftung, des Reaktordrucks oder durch Ergänzen der Luftzufuhr mit Sauerstoff. Animpfungen wurden hergestellt aus Übernachtkulturen von Zellen der P. pastoris Stämme G+IMB204S14 oder M+IMB206S1 in gepufferter Hefestickstoffbasis (YNB) (11,5 g/l KH&sub2;PO&sub4;, 2,66 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 6,7 g/l Hefestickstoffbasis, pH 6), die 2 % Glycerin enthielt. Der Fermenter wurde mit 500 bis 700 ml der Zellkulturen, die auf eine OD&sub6;&sub0;&sub0; von 2 bis 8 gewachsen waren, angeimpft und der Chargenwachstumsablauf wurde 18 bis 24 Stunden fortgesetzt. Zum Zeitpunkt der Glycerinerschöpfung, angezeigt durch eine Erhöhung der Konzentration an gelöstem Sauerstoff, wurde eine Glycerinzufuhr (50 % w/v Clycerin plus 12 ml/l PTM&sub1;) bei 100 ml/Stunde begonnen. Zu diesem Zeitpunkt wurde bei der Fermentation von Stamm G+IMB204S14 der Vorgabewert des pH- Reglers auf 2,7 bis 2,8 eingestellt. Nach 4 Stunden nahm der pH-Wert als eine Folge des Zellmetabolismus auf den Vorgabewert ab. Die Glycerolzufuhr wurde dann beendet und eine Methanolzufuhr (100 % Methanol plus 12 ml/l PTM&sub1;) wurde bei 20 ml/Stunde begonnen. Zu diesem Zeitpunkt wurde bei der Fermentation von Stamm M+IMB206S1 der Vorgabewert des pH- Reglers auf 2,8 bis 3,0 eingestellt. Nach 4 Stunden Methanolzufuhr wurde die Methanolzufuhrrate auf 60 ml/Stunde erhöht und bei dieser Rate für eine Gesamtzeit von annähernd 72 Stunden gehalten, zu welchem Zeitpunkt der Gefäßinhalt geerntet wurde.

B. Charakterisierung von rekombinanten Proteinen in Fermentationsnährmedium

von Pichia hergestellter IGF-1 liegt im Fermentationsnährmedium IGF-1 exprimierender P. pastoris Stämme in verschiedenen Formen vor, einschließlich intaktem, monomerem, korrekt gefaltetem IGF-1, wie durch Immunblot und HPLC-Analysen von zellfreiem Nährmedium gezeigt. Da die HPLC- Analyse (unter Verwendung des in Beispiel 3A1 beschriebenen Protokolls) des rohen zellfreien Mediums aus der Fermentation der P. pastoris Stämme G+IMB204S14 und M+IMB206S1 die verschiedenen IGF-1 Spezies nicht angemessen auftrennt, wurden die nativen P. pastoris Proteine durch Vorbehandeln des Nährmediums mittels Kationenaustauschchromatographie in Kleinmaßstab abgetrennt, um die IGF-1 Spezies durch HPLC zu unterscheiden.

1. Vorbehandlung von rohem Fermentationsnährmedium

Eine direkte Injektion von rohem P. pastoris Nährmedium in HPLC führte üblicherweise nicht zu einem Chromatogramm mit unterscheidbaren Peaks. Um die Komponenten von rohem Nährmedium durch HPLC (unter Verwendung des in Beispiel 3 beschriebenen Protokolls) direkt analysieren zu können, wurde ein Vorreinigungsverfahren entwickelt, um endogene P. pastoris Kontaminationen zu entfernen, unter Verwendung eines Kationenaustauschchromatographieschritts im Kleinmaßstab. Verschiedene Kationenaustauschsysteme wurden für diesen Zweck getestet: Sulfylpropylkationenaustauschkapseln (FMC (Pinebrook, NJ) und Cuno (Meriden, CT)) und die Verwendung eines Massenkationenaustauschers (z.B. Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Uppsala, Schweden), SP-Spherodex (IBF, Columbia, MD) oder Toyopearl SP650M und SP550C (TosoHaas, Philadelphia, PA)) in einer 2 ml Polypropylen-Wegwerfsäule (0,8 x 2,4 cm BioRad, Richmond, CA) mit einem integrierten 10 ml Reservoir. Jedes dieser Systeme ergab zufriedenstellende Ergebnisse. Die zwei routinemäßig verwendeten Systeme um rohes Nährmedium für die quantitative HPLC-Analyse der IGF-1 Gehalte vorzubehandeln umfaßten die Cuno Kationenaustauschkapsel oder die SP- Spherodex oder SP550C Kationenaustauscher in einem Säulenformat. Das rohe Nährmedium wurde durch Kationenaustauschchromatographie vorgereinigt und direkt in eine HPLC-Säule injiziert. Das entstehende Chromatogramm trennte die unterschiedlichen IGF-1 Spezies in Nährmedium klar auf.

a. Vorbehandlung unter Verwendung von Kationenaustauschkapseln

Die Cuno-Kapsel ist eine 25 mm Scheibe. Die Scheibe wurde zuerst mit 4 ml 0,2 M Essigsäure gewaschen dann mit 4 ml 0,02 M Essigsäure äquilibriert. Ein Volumen des rohen zellfreien Nährmediums (1 bis 10 ml) wurde 1:2 mit 0,02 M Essigsäure verdünnt und auf die Scheibe geladen. Nach dem Beladen wurde die Scheibe mit 1,5 ml 0,02 M Essigsäure gewaschen und der IGF-1 mit 4 ml 0,02 M Natriumacetat, pH 5,5, plus 1 M NaCl eluiert. Die ersten 1,5 ml des Eluats enthielten 75 bis 80 % des gesamten IGF-1 und waren üblicherweise das einzige gesammelte Elutionsvolumen. Die Kapsel konnte danach durch Waschen mit 4 ml 100 % Methanol regeneriert werden.

b. Vorbehandlung unter Verwendung von Massenkationenaustauscher in einem Säulenformat

Zu der Wegwerfsäule wurden 0,25 ml vorgequollener Kationenaustauscher zugegeben. Das Adsorbens wurde zuerst mit 2 ml 0,2 M Essigsäure gewaschen, dann mit 2 ml 0,02 M Essigsäure äquilibriert. Ein Volumen des Nährmediums (1 ml) wurde auf die Säule geladen, die dann mit 1 ml 0,02 M Essigsäure gewaschen wurde. Alle Puffer und das Nährmedium wurden sorgfältig auf die Säule geladen, um eine Störung des Säulenbetts zu vermeiden. Obwohl in geringem Umfang während der Zugabe von Flüssigkeit zu der Säule üblicherweise eine Suspendierung des Adsorbens auf trat, war es für das Binden oder Eluieren der Probe nicht nachteilig. Proben des Nährmediums und Puffer wurden mittels Schwerkraft durch die Säule laufengelassen. Der IGF-1 wurde mit 2 ml eines 0,05 M Natriumacetatpuffers, pH 5,5, der 1 M NaCl enthielt eluiert. Der erste Milliliter des Eluats enthielt 80 bis 90 % des gesamten durch 2 ml Elutionspuffer eluierten IGF-1. Die Säule wurde nach der Salzelution regelmäßig (annähernd alle 5 bis 10 Proben) mit einer 50 % Methanolwaschung regeneriert. Weniger häufig wurde die Säule auch mit 0,5 M NaOH regeneriert. Diese Säulen behalten ihre selektiven Bindungseigenschaften über viele aufeinanderfolgende Benutzungen.

2. Charakterisierung

Das nach Kationenaustauschchromatographie im Kleinmaßstab eines zellfreien Nährmediums von einer Fermentation der Stämme G+IMB204S14 oder M+IMB206S1 erhaltene Eluat enthält alle IGF-1 Spezies (d.h. angespaltene, mißgefaltete, multimere und intaktes, korrekt gefaltetes Monomer), die durch das in Beispiel 3 beschriebene HPLC-Protokoll aufgetrennt werden können. Die verschiedenen im Chromatogramm der HPLC-Analyse nachgewiesenen Peaks von Nährmedium, das Kationenaustauschchromatographie unterzogen worden war, entsprechen verschiedenen Formen von IGF-1 die in Fermentationen von rekombinanten P. pastoris produziert werden. Die Identität der diesen Peaks entsprechenden Proteine wurde durch HPLC, Immunblot und SDS-PAGE Analysen von Nährmedium und Nährmediumkomponenten (isoliert durch HPLC, Gelfiltration, Kationenaustausch- und hydrophobe Interaktionschromatographie) nachgewiesen.
Ein Chromatogramm einer HPLC-Analyse (durchgeführt wie in Beispiel 3A1 beschrieben) von Nährmedium aus einer Fermentation eines IGF produzierenden P. pastoris Stamms enthält einen Peak der einem Protein entspricht, das nach annähernd 10 Minuten aus der HPLC-Säule eluierte, welches korrekt gefaltetes intaktes IGF-1 Monomer darstellt. Die Identität dieses Proteins wurde anfangs auf Basis seiner Elutionszeit in HPLC, die identisch ist zu der von rekombinanten Standard-IGF-1 (Amgen, Thousand Oaks, CA) bestätigt. Weiterhin wurde das Protein mit einer HPLC- Elutionszeit von annähernd 10 Minuten gereinigt, wie in Beispiel 2 beschrieben und weiteren Analysen unterworfen. SDS- PAGE Analyse von reduzierten und nicht reduzierten Proben des gereinigten Proteins ergab identische Ergebnisse, welche auf zeigten, daß es ein intaktes 7,7 kDa Protein ist, das mit IGF-1 Standard comigrierte. Immunblotanalyse des gereinigten Proteins zeigte, daß es mit einem Antikörper, der gegen die letzten 14 Aminosäuren von IGF-1 gerichtet ist, reaktiv ist. Gelfiltrationschromatographie des gereinigten Proteins zeigte auf, daß es eluiert, wie für ein IGF-1 Monomer der korrekten Größe erwartet. Schließlich bestätigte Aminosäureanalyse, daß die Aminosäureverhältnisse des gereinigten Proteins denen von Standard-IGF-1 entsprechen. Proteinsequenzanalyse zeigte, daß die vollständige Aininosäuresequenz des gereinigten Proteins zu der von authentischem IGF-1 identisch ist.
Das Protein, das bei annähernd 8,6 Minuten aus einer HPLC- Säule eluiert, wurde versuchsweise als fehlgefalteter IGF-1 identifiziert. Dieses Protein wurde durch HPLC und hydrophobe Interaktionschromatographie isoliert und durch SDS-PAGE, Immunblot und Proteinsequenzanalyse (siehe Beispiele 3C und 3F für Protokolle) charakterisiert. SDS-PAGE-Analyse von reduzierten und nicht reduzierten Proben dieses Proteins zeigte, daß diese Form mit authentischem monomeren IGF-1 migrierte und daß es nicht eine angespaltente Form von IGF-1 war (d.h., daß es ein intaktes Protein war, bei dem die Primärstruktur ausschließlich durch Peptidbindungen zusammengehalten wurde, im Gegensatz zu einem gespaltenen IGF- 1 Molekül das aus zwei oder mehreren Peptidfragmenten, die durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden, besteht). Western Blot-Analyse dieses Proteins unter Verwendung eines gegen den C-Terminus von IGF-1 gerichteten Antikörpers zeigte, daß es immunreaktiv war. Amino-terminale Proteinsequenzierung dieses Proteins bestätigte auch, daß das Molekül intakt war da nur eine Amino-terminale Sequenz, diejenige von authentischem IGF-1, identifiziert werden konnte. Weiterhin koeluieren reduzierte Proben dieser vermutlich fehlgefalteten Form von IGF-1, die mit Dithiotreitol behandelt waren, mit reduzierten Proben von authentischem IGF-1 wenn sie Reverse Phase HPLC unterworfen werden. Diese Ergebnisse legen nahe, daß diese Form eine fehlgefaltete Spezies von IGF-1 ist.
Die Proteine, die aus einer HPLC-Säule bei annähernd 10,5 bis 11,5 Minuten eluieren, wurden als angespaltene oder abgebaute Formen von IGF-1 identifiziert (d.h. IGF-1 Moleküle die zwei oder mehrere durch die Spaltung einer oder mehrerer Peptid- Bindungen erzeugte Fragmente enthalten und durch Disulfidbrücken zusammengehalten werden). Anscheinend treten in der chromatographischen HPLC Analyse von vorgereinigtem Nährmedium mindestens zwei Peaks auf, die angespaltenen Formen von IGF-1 entsprechen. Das Protein, das durch den größeren Peak (der bei 10,7 Minuten eluiert) dargestellt wird, wurde während des S-Sepharose Kationenaustauschschritts des IGF-1 Reinigungsverfahrens (siehe Beispiel 2C) isoliert.
In silbergefärbten SDS-PAGE Gelen nicht reduzierter Proben dieser isolierten IGF-1 Spezies komigrierte das Molekül mit IGF-1 Standard und lag als Einzelbande vor. In silbergefärbten Gelen reduzierter Proben des isolierten Materials wurde eine Doppelbande, die zwei Peptide von jeweils annähernd 3 bis 4 kDa darstellt (annähernd die halbe Größe von intaktem IGF-1), nachgewiesen. Die Position dieser Doppelbande im Gel entsprach der der kleineren der zwei Banden, die unterhalb der Bande nachgewiesen wurden, welche intakten IGF-1 in Gelen, die reduzierte Proben von rohem zellfreiem Medium enthielten, darstellt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß dieses Molekül gespalten oder angespalten ist und durch Disulfidbrücken zusammengehalten wird. Amino-terminale Proteinsequenzanalyse des Proteins bestätigte, daß das Molekül vor dem Rest 40 gespalten war, da zwei Amino-Termini nachgewiesen wurden: einer beginnt mit Rest 1 von IGF-1 und einer beginnt mit Rest 40 von IGF-1. Immunblot-Analyse der reduzierten und nicht reduzierten Proben dieses isolierten angespaltenen IGF-1 Moleküls zeigten auf, daß es mit dem gegen den C-Terminus von IGF-1 gerichteten Antikörper weniger reaktiv ist als intakter IGF-1.
In der Proteinsequenzanalyse von aus dem ersten Kationenaustauschchromatographieschritt des Reinigungsverfahrens (siehe Beispiel 2A) gewonnenem IGF-1 wurden zwei zusätzliche angespaltene Spezies identifiziert. Jede oder beide dieser Spezies könnten dem kleineren Peak im HPLC-Chromatogramm des vorgereinigten zellfreien Nährmediums entsprechen (Protein eluiert bei 11 Minuten). Der Amino- Terminus des C-terminalen Fragments eines dieser angespaltenen Moleküle beginnt bei Rest 25 von IGF-1. Der Amino-Terminus des C-terminalen Fragments der anderen angespaltenen Spezies, die im Nährmedium von Stamm G+IMB204S14 nachgewiesen wurde, beginnt bei Rest 14 von IGF-1.
Der letzte durch HPLC vom zellfreien Nährmedium nachgewiesene Satz von Proteinen, die nach 11,5 bis 16 Minuten aus der HPLC- Säule eluieren, scheint Disulfid-verbrückte multimere IGF-1 Formen zu sein. Die Anwesenheit von Disulfid-verbrückten IGF-1 Multimeren in P. pastoris Nährmedium wurde in SDS-PAGE Gelen von Nährmedium und in Immunblots der Gele angedeutet. Die mutmaßlichen Multimere migrierten als IGF-1 Dimere und Trimere auf nicht reduzierenden SDS-PAGE Gelen und waren in Immunblots mit gegen den C-Terminus von IGF-1 gerichteten Antikörpern reaktiv. Wenn diese Multimere reduziert wurden, komigrierten sie in SDS-PAGE Gelen mit monomerem Standard IGF-1 und koeluierten mit monomerem IGF-1 in HPLC, was anzeigt, daß sie Disulfid-verbrückte IGF-1 Monomere enthalten. Darüber hinaus wurden multimere IGF-1 Spezies (anscheinend Dimere und Trimere) auf einer Gelfiltrationssäule isoliert und durch HPLC analysiert (siehe Beispiel 3B). Das isolierte Multimer eluierte bei 12 bis 14 Minuten aus der Säule, was den Elutionszeiten der Proteine in Nährmedium, die als IGF-1 Multimere angenommen wurden, entspricht.

BEISPIEL 2: REINIGUNG VON KORREKT GEFALTETEM, INTAKTEM IGF-1 MONOMER AUS P. PASTORIS FERMENTATIONSNÄHRMEDIUM

Das Verfahren zur Reinigung von korrekt gefaltetem, intaktem monomerem IGF-1 aus P. pastoris Nährmedium basierte auf einer Kombination von Kationenaustausch-, hydrophober Interaktions- und Gelfiltrationschromatographie. Dieses Verfahren wurde zur Reinigung von korrekt gefaltetem intaktem monomerem IGF-1 aus dem Nährmedium von 10 Liter Fermentationen der Stämme G+IMB204S14 und M+IMB206S1 angewendet. Das in der Reinigung von IGF-1 nach jedem Schritt erhaltene Material wurde qualitativ und quantitativ analysiert (durch HPLC, siehe Beispiel 3A für eine Beschreibung des Protokolls), um die IGF- 1 Ausbeute und Reinheit des Produkts zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Analysen sind in den Tabellen I und II aufgelistet. TABELLE I ERGEBNISSE DER REINIGUNG VON IGF-1 AUS ZELLFREIEM FERMENTATIONSNÄHRMEDIUM DES P. PASTORIS STAMMS G+IMB204S14 Reinigungsschritt Intaktes IGF-1 Monomer durch HPLC Volumen Liter Prozent Reinheit Prozent Gewinnung zellfreies Nährmedium Gewinnung aus SP-250 Kapsel Butyl HIC S-Sepharose End-HIC ND = nicht ermittelt TABELLE II Reinigung von IGF-1 aus zellfreiem Nährmedium des P. pastoris Stamms M+IMB206S1 Schritt PROTEIN Gramm (BCA) Gesamt IGF-1 Gramm (HPLC) Authentischer IGF-1 Gramm (HPLC) Gesamtausbeute zellfreies Nährmedium SP-Gewinnung Butyl HIC S-Sepharose Gelfiltration Konzentration/Diafiltration a Die Endprobe wurde durch Aminosäureanalyse analysiert.

A. Gewinnung von IGF-1 aus Fermentationsnährmedium

Von Pichia hergestellter IGF-1 wurde aus rohem Fermentationsmedium gewonnen, entweder unter Verwendung einer CUNO radial flow Zeta Prep SP-250 (Sulfylpropyl) Kationenaustauschkapsel oder einer mit Toyopearl SP550C Ionenaustauscher (TosoHaas, Philadelphia, PA) beladenen 5 cm Säule.

1. Herstellung von zellfreiem Nährmedium

Annähernd 10 Liter einer Fermenterkultur der P. pastoris Stämme G+IMB204S14 oder M+IMB206S1 wurde bei 6500 x g 20 Minuten zentrifugiert, um Nährmedium von den Zellen abzutrennen. Annähernd 5 bis 6 Liter zellfreier Überstand aus dem Nährmedium von G+IMB204S14, der 400 bis 600 mg intaktes IGF-1 Monomer, wie durch HPLC bestimmt (siehe Beispiel 3A), enthielt, wurde erhalten. Zusätzliche 40 bis 60 mg intaktes IGF-1 Monomer wurden aus dem Zellpellet gewonnen durch Waschen des Pellets mit annähernd 4 bis 6 Litern 20 mM Essigsäure und erneutes Entfernen der Zellen durch Zentrifugation. Der Überstand der ersten Zentrifugation wurde 1:1 mit 20 mM Essigsäure verdünnt und mit der Zellpellet-Waschlösung vereint. Annähernd 7,3 Liter zellfreies Nährmedium wurde aus dem rohen Nährmedium von M+IMB206S1 gewonnen und es enthielt annähernd 976 mg authentischen IGF-1. Die gesamten Präparationen des zellfreien Nährmediums wurden dann durch ein Whatman GF Filter (Glasfaser) filtriert.

2. Kationenaustauscherpräparation

a. Kationenaustauschkapsel

Eine radial flow ZetaPrep SP-250 (Sulfylpropyl) Kationenaustauschkapsel (CUNO, Meriden, CT) wurde äquilibriert indem durch die Kapsel drei Säulenvolumina (750 ml) 0,2 M Essigsäure, gefolgt von vier Säulenvolumina 20 mM Essigsäure bei einer Fließrate von 50 ml/Minute gepumpt wurden. Alle Schritte bei diesem ersten Kationenaustausch-Kontaktieren wurden bei annähernd 4ºC durchgeführt.

b. Tovopearl SP550C Kationenaustauschchromatographiesäule

Alternativ dazu wurde eine Säule mit 5 cm Durchmesser mit 250 ml Toyopearl SP550C Ionenaustauscher in 0,5 M NaCl bei einer Fließrate von 100 ml/Minute (300 cm/h) bepackt. Nach dem Packen wurde eine Betthöhe von 12 cm für ein Bettvolumen von 235 ml gemessen. Die Säule wurde mit sechs getrennten Waschungen regeneriert: 1 l 1 M NaCl, gefolgt von 250 ml Wasser, jeweils mit einer Fließrate von 50 bis 75 ml/min, 1 Liter 0,5 M NaOH bei 10 bis 20 ml/min, 250 ml Wasser bei 25 bis 50 ml/min, 1 l 50 % Methanol bei 10 bis 20 ml/min, 250 ml Wasser bei 25 bis 50 ml/Minute. Zur Aufbewahrung wurde die Säule bei Raumtemperatur in 20 % Ethanol gehalten. Um die Säule zum Beladen vorzubereiten, wurden auf die Säule 500 ml 200 mM Essigsäure bei 50 bis 75 ml/min aufgebracht, gefolgt von Äquilibrierung mit 1,5 bis 2,0 l 20 mM Essigsäure bei 50 bis 75 ml/min. Alle Arbeitsschritte bezüglich dieser Säule wurden bei Raumtemperatur ausgeführt.

3. Probenauftrag und Waschung

a. Kationenaustauschkapsel

Das verdünnte, filtrierte zellfreie Nährmedium aus einer G+IMB204S14 Fermentation (annähernd 17 Liter) wurde mit einer Fließrate von 50 ml/Minute auf die ZetaPrep Kapsel gepumpt. Analyse des Durchflusses der erhalten wurde während des Ladens des zellfreien Nährmediums auf die Kationenaustauschkapsel ergab, daß der Großteil des gefärbten Materials und der nativen P. pastoris Proteine im Nährmedium durch die Kapsel floß, wie durch SDS-PAGE und visuelle Betrachtung bestimmt, während der Großteil des gesamten IGF-1 (> 95 %) im Nährmedium durch die Kapsel rückgehalten wurde, wie durch HPLC-Analyse des Durchflusses bestimmt.
Nachdem das verdünnte Nährmedium auf die Kapsel aufgetragen worden war, wurde die Kapsel bei einer Fließrate von 50 ml/Minute mit zwei Säulenvolumina einer gepufferten Lösung gewaschen, die 20 mM Essigsäure umfaßte, gefolgt von vier Säulenvolumina 20 mM Natriumacetat, pH 5 (20 mM Acetat plus 10 M NaOH), enthaltend 0,2 M NaCl.

b. Tovopearl SP550C Kationenaustauschchromatographiesäule

Das zellfreie Nährmedium aus einer M+IMB206S1 Fermentation wurde mit einer Fließrate von 50 bis 75 ml/Minute auf die SP550C Säule aufgebracht. Die Säule wurde dann mit 1 l 20 mM Essigsäure bei 50 ml/min gewaschen, gefolgt von zwei 1 l Waschungen mit 50 mM Natriumacetat, pH 5,0 bzw. 50 mM Natriumacetat, pH 5,5. Alternativ dazu wurde die Säule mit vier getrennten 1 l Waschungen jeweils bei einer Fließrate von 50 ml/min gewaschen: 20 mM Essigsäure, 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, 0,05 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, 0,1 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5.

4. Elution von IGF-1

a. Kationenaustauschkapsel

Der gesamte IGF-1 wurde eluiert durch Waschen der Kapsel mit 6 Säulenvolumina eines Puffers, umfassend 20 mM Natriumacetat, pH 5,5 und 1 M NaCl (bei einer Fließrate von 50 ml/Minute). Fraktionen, die einem Säulenvolumen (250 ml) entsprachen, wurden während dieser Waschungen unter Verwendung von 0,2 und 1,0 M NaCl enthaltenden Puffern gesammelt und durch HPLC untersucht, um die IGF-1 enthaltenden Fraktionen zu identifizieren.

b. Tovopearl SP550C

Kationenaustauschchromatographiesäule

IGF-1 wurde aus der Säule eluiert mit 2 Litern einer Lösung eines linearen Gradienten, bestehend aus 0 bis 0,5 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5. Eluatfraktionen (jeweils 25 bis 30 ml) wurden während der Waschung und Elution der Säule gesammelt. Alternativ dazu wurde IGF-1 mit einer Lösung, bestehend aus 0,3 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 eluiert.

5. Charakterisierung des gewonnenen Materials

a. Kationenaustauschkapsel

Die ersten Fraktionen, die während der 0,2 M NaCl Waschung der SP-250 ZetaPrep Kapsel, die mit dem zellfreien Nährmedium beladen worden war, eluierten, enthielten sehr wenig intakten monomeren IGF-1 aber eine beträchtliche Menge von angespaltenem und multimerem IGF-1. Intakter, momonerer IGF-1 begann in der letzten Fraktion der 0,2 M NaCl Waschung und den ersten drei bis vier Fraktionen der 1 M NaCl Waschung zu eluieren. Die Eluatfraktionen der 1 M NaCl Elution wurden gepoolt. Der Pool enthielt annähernd 425 mg teilweise gereinigten intakten monomeren IGF-1 in einem Volumen von 840 ml. Daher wurde in dem anfänglichen Kationenaustauschschritt des IGF-1 Reinigungsverfahrens das durchgeführt wurde, um IGF- 1 aus rohem Nährmedium zu gewinnen, eine beträchtliche Menge der unerwünschten angespalteten und multimeren IGF-1 Formen aus der IGF-1 Präparation entfernt. Annähernd 81 % des intakten monomeren IGF-1 wurden in diesem Schritt rückgewonnen.

b. Toyopearl SP550C

Kationenaustauschchromatographiesäule

Immunblot- und HPLC-Analyse des Durchflusses, der während des Ladens des Nährmedius auf die Säule erhalten wurde, ergab vernachlässigbare Mengen an authentischem IGF-1 aber beträchtliche Mengen von nativen Pichia Proteinkontaminationen und multimerem IGF-1. Daher band ein großer Teil der kontaminierenden Pichia Proteine nicht an die Matrix und wurde aus dem Nährmedium durch Fließen durch die Säule in den Durchfluß entfernt. Im Gegensatz dazu band der Großteil des IGF-1 an die Matrix.
Quantitative HPLC-Analyse von Eluatfraktionen ergab, daß eine beträchtliche Menge von angespaltenem IGF-1 während der pH 5,5 Waschung (Fraktionen 41 bis 80) und dem ersten Teil der Salzgradientenelution (Fraktionen 81 bis 119) aus der Präparation entfernt wurde. Wie durch HPLC-Analyse eines Pools, der die Fraktionen 101 bis 119 enthielt, die während des Mittelteils der Salzgradientenelution gesammelt worden waren, gezeigt, begann authentischer IGF-1 in diesen Fraktionen, die auch fehlgefalteten und multimeren IGF-1 enthielten, aus der Säule zu eluieren.
Die folgenden Kriterien wurden zur Auswahl der Fraktionen, die für weitere Reinigung gepoolt wurden, angewendet: (1) ein Gehalt von weniger als 10 % angespaltener IGF-1 in der Fraktion und (2) eine Konzentration von mehr als 100 mg/l für den authentischen IGF-1 in der Fraktion. Auf Basis dieser Kritieren und von HPLC-Analysen der restlichen Eluatfraktionen wurden die Fraktionen 120 bis 155 gepoolt und der Pool wurde für weitere Reinigung im nächsten Schritt des Verfahrens vorbereitet. HPLC-Analyse dieses Pools ergab, daß IGF-1 die vorwiegende in dem Pool enthaltene IGF-1 Spezies war. Annähernd 730 mg der ursprünglichen 976 mg von im Nährmedium enthaltenen authentischem IGF-1 wurden in einem Volumen von 1 Liter bei einer Ausbeute von 75 % für diesen Schritt rückgewonnen. Dieser Pool enthielt 21 % fehlgefalteten IGF-1 (347 mg), 30 % multimeren IGF-1 (488 mg), sowie 45 % authentischen IGF-1 (730 mg). Obwohl im Chromatogramm dieses Pools nicht aufgelöst, war angespaltener IGF-1 ebenfalls zu einem Gehalt von annähernd 40 bis 50 mg (2 bis 3 %) im Pool vorhanden. Mindestens 300 mg angespaltener IGF-1 wurden bei diesem Schritt aus der Präparation entfernt, sowie 400 mg multimerer IGF-1.
Ein Vergleich der Gesamtproteingehalte des gewonnen Pools (Fraktionen 120 bis 155) mit dem Ausgangsnährmedium, wie durch BCA-Untersuchungen (Pierce, Rockford, IL) bestimmt, ergab daß 94 % des gesamten Proteins, das im zellfreien Nährmedium vorhanden war, während des anfänglichen Gewinnungsschritts aus der Präparation entfernt worden waren.

B. Erster hydrophober

Interaktionschromatographieschritt

Nach Gewinnung von IGF-1 aus zellfreiem P. pastoris Nährmedium unter Verwendung von Kationenaustauschchromatographie wurde der IGF-1 weiter gereinigt durch hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) unter Verwendung von TSK Butyl Toyopearl-650M Matrix (TosoHaas, Philadelphia, PA). Alle Schritte bei diesem ersten HIC-Kontaktieren wurden bei 20 bis 25ºC durchgeführt.

1. Säulenpräparation

Eine Reihe unterschiedlicher Bedingungen wurde hinsichtlich der Bindung von IGF-1 an die HIC-Matrix untersucht, wobei besonderes Augenmerk auf die Konzentration von Ammoniumsulfat im Medium und den pH-Wert des Mediums gerichtet wurde. Es wurde festgestellt, daß IGF-1, typisch für mit HIC verwendeten Bedingungen, bei hohen Ammoniumsulfatkonzentrationen (d. h. mehr als 15 % Sättigung oder etwa 0,6 M (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;) an die HIC- Matrix band. Daher umfaßte eine Äquilibrierung der HIC-Matrix die Zugabe von Ammoniumsulfat.
Eine Säule von 2,5 cm Durchmesser, wurde mit 5 bis 24 ml/min mit annähernd 37 ml oder 123 ml TosoHaas Butyl Toyopearl-650M Matrix in Wasser gepackt. Die mit 37 ml Matrix gepackte Säule hatte eine Betthöhe von 7,5 cm, während die mit 123 ml Matrix gepackte Säule eine Betthöhe von 25 cm hatte. Die Säule wurde regeneriert durch Waschen mit vier oder fünf getrennten Waschungen bei einer Fließrate von 800 bis 1000 cm/h: 200 bis 250 ml Wasser, 200 bis 800 ml 0,5 N NaOH, 100 bis 800 ml 50 % Methanol und 100 bis 250 ml Wasser. Wenn die Säule mit fünf Waschungen regeneriert wurde, wurde eine Wasserwaschung (250 ml) zwischen den NaOH- und Methanolwaschungen aufgenommen. Die Matrix wurde dann mit 200 bis 750 ml Puffer (15 bis 20 % gesättigtes Ammoniumsulfat, 50 mM Natriumacetat, 50 mM Natriumphosphat, pH 4,0 bis 5,0) äquilibriert. (Ein Liter 100 % gesättigtes Ammoniumsulfat ist definiert als 533 Gramm des festen Salzes enthaltend). Diese Ammoniumsulfatkonzentration des Puffers ist derzeit hinsichtlich einer optimalen Bindung von IGF-1 an die Matrix bevorzugt. Wie es für alle zur Verwendung bei der Reinigung von IGF-1 durch HIC beschriebenen gepufferten Lösungen zutreffend ist, wurde der HIC- Bindungspuffer hergestellt aus einer 10x konzentrierten Lösung von 0,5 M Essigsäure und 0,5 M monobasischen Natriumphosphat, die mit Natriumhydroxid auf den entsprechenden pH-Wert titriert wurde.

2. Probenpräparation und Auftragung

a. Probe eines aus dem Nährmedium von G+IMB204S14 gereinigten IGF-1

Annähernd 425 mg eines partiell gereinigten intakten, monomeren, korrekt gefalteten IGF-1, die erhalten worden waren aus dem zellfreien Fermentationsnährmedium des Stammes G+IMB204S14, das durch eine Zeta-Prep Kationenaustauschkapsel geleitet worden war, wurden durch Zugabe eines Puffers enthaltend 5 M Natriumchlorid, 0,5 M Natriumacetat und 0,5 M Natriumphosphat, pH 4,0, auf ein Gesamtvolumen von drei Litern verdünnt. Ein Liter einer 80 % gesättigten Ammoniumsulfatlösung wurde dann langsam zu den drei Litern des verdünnten Materials zugegeben. Dies führte zu einer trüben Lösung, die präzipitierten IGF-1 enthielt. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren der Lösung während 20 Minuten bei 10.000 UPM in einem GSA-Rotor entfernt. Das Präzipitat wurde in einem Liter eines Acetat/Phosphatpuffers bei pH 4,5 aufgelöst. Die vier Liter lösliches Material (nach Zentrifugation erhaltener Überstand) wurden auf pH 4,5 eingestellt und mit dem resuspendierten Präzipitat vereint, wobei eine Gesamtmenge von fünf Litern erhalten wurde. Diese 5-Liter-Lösung enthielt IGF-1 (425 mg), Ammoniumsulfat (16 % Sättigung), 40 mM Natriumacetat, 40 mM Natriumphosphat, pH 4,5 und 0,4 M NaCl und wurde auf die HIC-Matrix geladen. Alle Lösungen wurden auf die die HIC-Matrix enthaltende Säule bei einer Fließrate von etwa 80 bis 300 cm/h gemäß den Empfehlungen des Herstellers aufgebracht. Um eine Präzipitation von IGF-1 in den nachfolgenden Schritten des Reinigungsverfahrens zu vermeiden, wurde der pH-Wert des IGF-1 enthaltenden Materials bei einem pH von 4,5 oder höher gehalten.

b. Probe eines aus dem Nährmedium von M+IMB206S1 aereinigten IGF-1

Eluatfraktionen aus dem anfänglichen SP550C Kationenaustauschchromatographieschritt, die authentischen IGF-1 zu einem bezeichneten Reinheitsgehalt enthielten (Fraktionen 120 bis 155), wurden gepoolt. Dieser Pool, der annähernd 730 mg teilweise gereinigten authentischen IGF-1 in einem Volumen von 1 Liter enthielt, wurde durch Zugabe von 200 ml 10X Vorratslösung von Natriumacetat/Phosphatpuffer, pH 5,0 und 800 ml Wasser, das 160 g Ammoniumsulfat enthielt, um die Konzentration von Ammoniumsulfat in der Probe auf 15 % Sättigung einzustellen, auf 2 Liter verdünnt. Der pH-Wert wurde mit NaOH oder HCl auf pH 5,0 eingestellt, bevor langsam die Ammoniumsulfatlösung zugegeben wurde. Die IGF-1 enthaltende Lösung wurde dann bei 15 ml/Minute (180 cm/h) auf die Säule geladen.

3. Elution von IGF-1

Während des Verlaufs dieser Arbeit, die auf die Entwicklung eines Reinigungsverfahrens für IGF-1 abzielt, entdeckten wir überraschend, daß der pH-Wert des in diesem HIC- Reinigungsschritt verwendeten Elutionspuffers das IGF-1 Elutionsprofil dramatisch veränderte. Bei pH 7,5 beginnt intaktes IGF-1 Monomer in einem Salzelutionsgradienten bei 0,6 M Ammoniumsulfat zu eluieren, und ist vollständig eluiert, wenn die Ammoniumsulfatkonzentration des Gradienten auf 0,2 M verringert wird. Bei niedrigeren pH-Werten begann intakter IGF-1 nicht zu eluieren, bevor die Ammoniumsulfatkonzentration des Gradienten nicht auf niedrigere Werte verringert worden waren. Wenn der pH-Wert des Puffers weniger als 5, bevorzugt 4,5 betrug, konnte die Ammoniumsulfatkonzentration auf 0 % vermindert werden, ohne daß sehr wenig intaktes IGF-1 Monomer von der Säule eluierte, obwohl unter derartigen Bedingungen fehlgefalteter und multimerer IGF-1 aus der Matrix entfernt werden. Somit führte ein Verringern der Ammoniumsulfatkonzentration der Säule bei niedrigem pH-Wert zu einer Abtrennung von fehlgefaltetem und multimerem IGF-1 von authentischem IGF-1. Danach wurde der authentische IGF-1 durch Erhöhen des pH-Werts aus der Matrix eluiert.
Auf Basis dieser Erkenntnisse werden Proteine aus der HIC- Säule typischerweise in zwei oder drei Schritten eluiert. Zuerst wird die Ammoniumsulfatkonzentration der Säule unter Verwendung von 500 ml einer bei pH 4,5 bis 5,0 gepufferten Ammoniumsulfatgradientenlösung, die 50 mM Natriumacetat, 50 mM Natriumphosphat enthält, bei einer Fließrate von 80 bis 300 cm/h von 20 % Sättigung auf kein Ammoniumsulfat verringert. Es ist derzeit bevorzugt, daß die Ammoniumsulfatgradientenlösung ein linearer Gradient ist, beginnend bei 20 % gesättigtem Ammoniumsulfat mit 50 mM Acetat/Phosphat bei pH 5,0 gepuffert und endend ohne Ammoniumsulfat, gepuffert bei pH 4,0 mit dem gleichen Puffer. Dies wird gefolgt von 400 ml eines Puffers mit pH 4,0 ohne Ammoniumsulfat. Da eine Erhöhung des pH-Werts der Säule überraschenderweise die hydrophoben Wechselwirkungen in diesem System verringerte, wurde der pH-Wert im nächsten Elutionsschritt unter Verwendung von 0,5 bis 2 Liter eines Puffergradienten (50 mM Natriumacetat, 50 mM Natriumphosphat), der kein Ammoniumsulfat enthielt, von etwa 4,0 bis 4,5 auf etwa 6,5 bis 7,5 erhöht.

4. Charakterisierung von gewonnenem Material

a. Gewinnung aus dem ersten HIC-Schritt bei der Reinigung von IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14

Eluatfraktionen (annähernd 7,5 ml) wurden während jedes Schritts des Elutionsverfahrens gesammelt und durch HPLC analysiert, um IGF-1 enthaltende Fraktionen zu identifizieren. Die Daten wurden zusammengetragen und die Elutionsprofile für jede IGF-1 Form sind in Figur 1 graphisch gezeigt. Alle fehlgefalteten IGF-1 eluierten aus der HIC-Matrix während Elution der Säule mit der Ammoniumsulfatgradientenlösung (Fraktionen 0 bis 60). Annähernd 75 % Multimer wurden während der Ammoniumsulfatgradientenelution (Fraktionen 0 bis 60) und während des ersten Teils der pH-Gradientenelution (Fraktionen 60 bis 84) aus der Matrix entfernt. Die korrekt gefalteten, intakten und angespaltenen monomeren IGF-1 Formen blieben jedoch an die Matrix gebunden. Während des zweiten Teil des Elutionsschritts unter Verwendung einer pH-Gradientenlösung (Fraktionen 85 bis 125) eluierten die intakten monomeren und angespaltenen Formen von IGF-1 aus der Säule.
Die in Figur 1 in die Gruppen 1 und 2 getrennten Fraktionen wurden zur weiteren Reinigung in die Pools 1 bzw. 2 gepoolt. Der erste Pool bestand aus Fraktionen, die während des Zeitraums gesammelt wurden, der beginnt, als die Ammoniumsulfatkonzentration der Säule 0 % betrug (Fraktion 60) und sich bis zu dem Zeitraum erstreckt, zu dem der Großteil des Multimers von der Matrix entfernt worden war (Fraktion 84). Der zweite Pool bestand aus den Fraktionen 85 bis 125, die während des pH-Gradientenelutionsschritts gesammelt worden waren. Die Chromatogramme der HPLC-Analyse dieser zwei Pools deuten darauf hin, daß sehr wenig Multimer und praktisch kein fehlgefalteter IGF-1 im zweiten Pool vorhanden waren, der vorwiegend aus IGF-1 Monomer und angespaltenem IGF-1 bestand. Obwohl dies aus den HPLC-Analysen verdünnter Pool-2-Proben nicht hervorgeht, war im zweiten Pool etwas restliches Multimer vorhanden, wie durch SDS-PAGE und Immunblotanalysen dieser Proben bestimmt (siehe Beispiel 3C).

b. Gewinnung aus dem ersten HIC-Schritt bei der Reinigung von IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1

Fraktionen (25 bis 30 ml) wurden während jedes Schritts des Elutionsverfahrens gesammelt und durch HPLC (20 41 Injektionen) und SDS-PAGE und Immunblot analysiert, um IGF-1 enthaltende Fraktionen zu identifizieren, die für Weiterverarbeitung gepoolt werden könnten. Fehlgefalteter IGF- 1 wurde im Ammoniumsulfatgradienten in den Fraktionen 1 bis 18 entfernt. Der fehlgefaltete IGF-1 eluierte mit einer Reinheit von annähernd 90 % aus der Säule.
Das angefärbte Gel einer nicht reduzierten Probe des Pools der Fraktionen 1 bis 20 zeigte eine breite Bande, die ein Protein mit hohem Molekulargewicht darstellte, eine Bande die einem Protein, das mit authentischem IGF-1 Monomer komigrierte entsprach, und eine schwache Bande zwischen den anderen zwei Banden, das eine dimere IGF-1 Form sein konnte.
Die Waschung bei pH 4 (kein Ammoniumsulfat enthaltend) entfernte den Großteil von multimerem IGF-1, der an das Harz gebunden war. Diese Waschung mit 50 mM Natriumacetat/Phosphat pH 4 wurde auf die Säule während der Sammlung der Fraktionen 19 bis 30 angewendet. Nachdem die einzelnen Fraktionen charakterisiert worden waren, wurden die Fraktionen 21 bis 29 gepoolt und durch analytische HPLC charakterisiert. Im entstandenen Chromatogramm stellte der Peak, der multimerem IGF-1 entsprach, 75 % der Peakfläche im Chromatogramm dar. Das Chromatogramm zeigte auch die Anwesenheit einer geringen Menge von authentischem (48 mg) und angespaltenem (13 mg) IGF-1 in diesem Pool. Die Menge von in diesem Schritt verlorenem authentischem IGF-1 ist höchstwahrscheinlich eine Funktion der Säulenkapaz ität.
Wenn Proben des Pools der pH 4 Waschung (Fraktionen 21 bis 29) durch Analysen angefärbter Gele aus SDS-PAGE und Western Blots untersucht wurden, war das Vorherrschen multimerer Formen offensichtlich. Im nicht reduzierten Zustand gab es viele Formen mit hohem Molekulargewicht in der Probe, die in reduzierten Proben des Pools nicht nachgewiesen wurden. Reduzierte Proben des Pools bestanden vorwiegend aus Material, das mit monomerem IGF-1 komigrierte.
Die Kriterien, die verwendet wurden zur Auswahl derjenigen Eluatfraktionen, die authentischen IGF-1 enthielten, zur weiteren Reinigung im nächsten Schritt des Protokolls waren wie folgt erstens ein Gehalt von weniger als 60 % von in der Fraktion vorhandenem multimerem IGF-1 und zweitens eine Konzentration von mehr als 100 mg/l für den authentischen IGF- 1. Fraktionen 30 bis 80, die während der pH-Gradientenelution gesammelt worden waren wurden ausgewählt und gepoolt, um im nächsten Schritt des Reinigungsverfahrens verwendet zu werden. Eine Gesamtmenge von 613 mg der 730 mg von authentischem IGF- 1, die auf HIC-Säule geladen worden waren, wurde in diesem Pool rückgewonnen. Diese Ausbeute entspricht einer Rückgewinnung von 84 % für diesen Verfahrensschritt und einer kumulativen Rückgewinnung von 63 % aus zellfreiem Nährmedium des Stammes M+IMB206S1. HPLC-Analyse dieses Pools zeigte auch einen Gehalt von 3 mg (0,5 %) fehlgefaltetem und 27 mg (4 %) multimerem IGF-1. Obwohl angespaltener IGF-1 im Chromatogramm nicht aufgetrennt war, wurde geschätzt, daß 21 mg (3 %) angespaltener IGF-1 im Pool vorhanden waren. Die Reinheit des authentischen IGF-1 in diesem Pool wurde daher auf 92 % geschätzt. Der Gesamtproteingehalt im rückgewonnen Eluatpool aus dem HIC-Schritt wurde mit 1 Gramm (Tabelle II) oder 20 % des gesamten Proteins, das auf die Säule geladen worden war, bestimmt.
Da alle der während der pH-Gradientenelution gesammelten Fraktionen für eine weitere Reinigung gepoolt wurden, kann die Gradientenelution durch eine einzige Elutionsstufe mit 50 mM Natriumacetat/Phosphat, pH 7,5, ersetzt werden. Eine pH- Elutionsstufe vermindert das Volumen des rückgewonnen IGF-1 auf annähernd einen Liter und vereinfacht das Elutionsverfahren beträchtlich. Daher wird der Großteil des authentischen IGF-1 während der pH-Elutionsstufe im Eluat gesammelt bis die Konzentration des authentischen IGF-1 des Eluats weniger als 100 mg/l beträgt. Dieser Pool kann mit den Endfraktionen der Waschung bei pH 4, die authentischen IGF-1 enthalten, vereint werden.

5. Erneuter Probenauftrag auf die Säule und Charakterisierung der Gewinnung

Lediglich annähernd 40 % (170 mg) des nach SP-250 Kapsel gereinigten, intakten, korrekt gefalteten monomeren IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14, die auf die HIC-Säule geladen worden waren, wurden im zweiten Pool der Eluatfraktionen aus der HIC-Säule rückgewonnen. Figur 1 zeigt, daß eine große Menge von intaktem IGF-1 Monomer (87 mg) zusammen mit angespaltenem und multimerem IGF-1 im ersten Pool vorhanden war. Um zusätzlichen intakten monomeren IGF-1 rückzugewinnen, wurden die Eluatfraktionen des ersten Pools erneut auf die HIC-Säule geladen und gemäß dem gleichen, wie in der anfänglichen HIC-Reinigung verwendeten Verfahren eluiert. Zusätzliche 65 mg intakter monomerer IGF-1 wurden aus der HIC-Säule gewonnen. Dieses Pool 2 Material wurde mit dem ersten Pool 2 Material vereint, wobei ein Endpool erhalten wurde, der 235 mg intakten, korrekt gefalteten monomeren IGF-1 in einem Volumen von 590 ml bei einer Reinheit von 74 % (Tabelle I) enthielt. Daher wurden annähernd 55 % des durch SP-250 Kapsel gereinigten, intakten monomeren IGF-1, der auf die Butyl-HIC-Säule geladen worden war, zurückgewonnen, wodurch sich die Gesamtausbeute bei diesem Schritt im Reinigungsverfahren auf 45 % verringert. Dieser HIC-Schritt des Reinigungsverfahrens entfernte somit wirksam die meisten der multimeren und fehlgefalteten IGF-1 Formen aus der Präparation.

C. Kationenaustauschchromatographie

Die angespaltenen und intakten monomeren IGF-1 Spezies in dem aus HIC erhaltenen Material von IGF-1, der in Pichia produziert worden war, wurden durch Kationenaustauschchromatographie unter Verwendung von Fast Flow S-Sepharose Matrix (Pharmacia, Piscataway, NJ) abgetrennt. Diese Matrix wurde für die Chromatographie vorbereitet, durch Regenerierung in einer Säule unter Verwendung des gleichen Protokolls wie dem das zur Regenerierung der HIC-Matrix beschrieben ist (Beispiel 2B). Alle Schritte in diesem zweiten Kationenaustauschchromatographieverfahren wurden bei 20 bis 25ºC durchgeführt.

1. Säulenpräparation

Eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm wurde bei 2 bis 20 ml/min mit annähernd 35 bis 80 ml Pharmacia Fast Flow S- Sepharose in Wasser gepackt. Die Säule wurde äquilibriert durch Leiten von 100 bis 250 ml 0,5 M Natriumacetat, pH 4,5, gefolgt von 300 bis 750 ml 50 mM Natriumacetat, pH 4,5 durch die Säule. Diese Niedersalzlösung, die bei einem pH-Wert gepuffert war, der niedrig genug ist, um eine positive Nettoladung am Protein bereitzustellen, wurde verwendet, um ein Binden von IGF-1 an die negativ geladene Matrix zu erleichtern.

2. Probenpräparation und -beladung

Der Pool der IGF-1 enthaltenden Eluatfraktionen, der durch HIC-Reinigung eines teilweise gereinigten IGF-1 aus zellfreiem Nährmedium des Stammes G+IMB204S14 erhalten worden war, hatte eine Leitfähigkeit von 7 mmho und enthielt annähernd 235 mg intaktes IGF-1 Monomer. Die zum Eluieren des IGF-1 aus der HIC-Säule verwendeten Niedersalzbedingungen minimierten Manipulationen des Eluats vor Ionenaustauschchromatographie. Der pH-Wert des Pools der IGF-1 enthaltenden Eluatfraktionen aus der HIC-Reinigung der IGF-1 Probe aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14 oder des Stammes M+IMB206S1 wurde auf 4,5 eingestellt und das Volumen des Pools wurde durch Zugabe von 50 mM Natriumacetat, pH 4,5 auf einen Liter eingestellt. Der HIC-gereinigte IGF-1 wurde direkt ohne weitere Manipulation auf die Kationenaustauschmatrix Fast Flow S-Sepharose geladen. Nachdem das Protein bei 2 bis 15 ml/min auf die Säule geladen worden war, wurde die Säule mit annähernd 100 ml 50 mM Natriumacetat, pH 4,5 gewaschen. Die Säule wurde dann zusatzlich mit 330 ml 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 gewaschen, wobei diese zusätzliche Waschung bevorzugt ist.

3. Elution von IGF-1

Der IGF-1 wurde von der Säule eluiert unter Verwendung von 500 oder 1000 ml eines mit 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 gepufferten 0 bis 0,3 M Natriumchloridgradienten. Der höhere pH-Wert verminderte die ionische Wechselwirkung zwischen den Proteinen und der Matrix und die Eluatfraktionen, die intakten, korrekt gefalteten monomeren IGF-1 wie durch HPLC bestimmt enthielten, wurden gepoolt. Die Matrix wurde in 20 % Ethanol aufbewahrt.

4. Charakterisierung der Gewinnung

a. Gewinnung aus der zweiten Kationenaustauschchromatographie bei der Reinigung von IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14

Das Elutionsprofil für jede der IGF-1 Spezies, das aus HPLC- Analyse der während der Gradientenelution gesammelten Eluatfraktionen (annähernd jeweils 8 ml) erzeugt wurde, ist in Figur 2 gezeigt. Dieser Kationenaustauschchromatographieschritt trennte die angespaltenen und intakten Monomerformen, die in der Präparation vorhanden waren, vollständig auf. Die Eluatfraktionen 28 bis 50, die bei einer NaCl-Konzentration der Gradientenwaschlösung in der Säule im Bereich von 0,15 bis 0,25 M erhalten wurden, wurden gepoolt. Die Ergebnisse von SDS-PAGE-, Immunblot-, HPLC- und Gelfiltrationsanalyse (siehe Beispiele 3A, 3B und 3C für Protokolle) des Pools der Eluatfraktionen zeigen alle die Anwesenheit von restlichem Multimer (HPLC- und Gelfiltrationsquantifizierung deuteten auf einen Multimergehalt von 9 % hin). Nichtsdestoweniger wurden 86 % (203 mg) des intakten, korrekt gefalteten IGF-1 Monomers, das auf die Fast Flow S-Sepharose Säule geladen worden war, im Eluatpool rückgewonnen und die Gesamtrückgewinnung bei diesem Schritt des Reinigungsverfahrens betrug 39 % (Tabelle I).

b. Gewinnung aus dem zweiten Kationenaustauschschritt bei der Reinigung von IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1

Fraktionen (25 bis 30 ml) wurden während des Elutionsverfahrens gesammelt und durch HPLC analysiert, um IGF-1 enthaltende Fraktionen, die für den nächsten Schritt im Reinigungsverfahren, gepoolt werden könnten, zu identifizieren. Bei der Waschung mit pH 5,5 (Fraktionen 6 bis 17) wurden annähernd 10 mg angespaltener IGF-1 aus der Präparation entfernt. Die Anwesenheit von Peptiden mit niedrigem Molekulargewicht, die in einem SDS-PAGE Gel und einem entsprechenden Immunblot einer reduzierten Probe dieses Pools schneller wandern als IGF-1 Standard und in einer nicht reduzierten Probe des Pools nicht vorhanden sind, weist auf die Anwesenheit von angespaltenem IGF-1 hin. Angespaltener IGF-1 hat im nicht reduzierten Zustand die Größe von intaktem Monomer aber dissoziiert bei Reduktion in zwei Peptide, wobei jedes Peptid kleiner ist als das intakte Molekül. Die Fraktionen 21 bis 29 wurden während des ersten Teils der Salzgradientenelution gesammelt. Wie im Fall der frühen Stufen der Elution der SP550C Säule mit dem linearen Salzgradienten im Rückgewinnungsschritt schien etwas authentischer IGF-1 zusammen mit zusätzlichem angespaltenem IGF-1 im ersten Bereich der Salzgradientenelution der S-Sepharosesäule zu eluieren. SDS-PAGE Analyse dieses Pools zeigte IGF-1 Formen, die sowohl unter nicht reduzierten wie reduzierten Bedingungen langsamer als IGF-1 Standard wanderten. Es ist möglich, daß diese glykosylierte oder anderweitig modifizierte IGF-1 Formen darstellen, die in sehr geringen Gehalten anwesend sind.
Die Kriterien die angelegt wurden, um Eluatfraktionen zum Poolen für eine weitere Reinigung auszuwählen waren wie folgt ein Gehalt von weniger als 5 % in der Fraktion anwesender angespaltener IGF-1 und eine Konzentration von mehr als 150 mg/l für den authentischen IGF-1. Die Fraktionen 30 bis 45, die während der zweiten Hälfte der Salzgradientenelution gesammelt worden waren, wurden auf Basis dieser Kriterien ausgewählt und gepoolt, um im nächsten Schritt des Reinigungsverfahrens verwendet zu werden. Eine Gesamtmenge von 531 mg authentischem IGF-1 wurde aus den 613 mg authentischer IGF-1 die auf die Säule geladen worden waren, rückgewonnen, entsprechend einer Rückgewinnungsausbeute von 87 % für dieses Verfahren und einer kumulativen Rückgewinnung von 54 % aus zellfreiem Nährmedium des Stammes M+IMB206S1. HPLC-Analyse dieses Pools zeigte, daß er auch 3 mg (0,5 %) fehlgefalteten, 3 mg angespaltenen (0,5 %) und 43 mg (7,5 %) multimeren IGF-1 enthielt.
Der Gesamtproteingehalt im rückgewonnen Pool aus dem S- Sepharose Kationenaustauschchromatographieschritt wurde zu 0,86 Gramm bestimmt (Tabelle II). Der Pool wurde ebenfalls durch SDS-PAGE und Immunblot analysiert. Die geringe Menge von multimerem IGF-1, die im Pool enthalten war, war im nicht reduzierten gefärbten SDS-PAGE Gel sichtbar.

D. Zweiter hydrophober Interaktionschromatographieschritt oder Gelfiltrationschromatographieschritt

Um den Multimergehalt in der anderweitig reinen Präparation von intaktem monomerem IGF-1 zu vermindern, wurde der Pool der Eluatfraktionen aus der Fast Flow S-Sepharose Kationenaustauschchromatographie von teilweise gereinigtem IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14 auf eine regenerierte TSK Butyl Toyopearl-650 M Matrix (siehe Beispiel 2B für eine Beschreibung der Matrixregenerierung) für den zweiten und letzten HIC-Schritt bei der Reinigung von IGF-1 geladen, wie in Beispiel 2.D.1. unten beschrieben. Alle Schritte dieses zweiten HIC-Verfahrens wurden bei 20 bis 25ºC durchgeführt.
Es ist derzeit bevorzugt restliches Multimer von dem gereinigten IGF-1 unter Verwendung von Gelfiltrationschromatographie zu entfernen. Wie in Beispiel 3B ebenfalls beschrieben, werden durch Gelfiltrationschromatographie multimere und monomere IGF-1 Formen gut aufgetrennt. Der Pool der Eluatfraktionen aus der Fast Flow S-Sepharose Kationenaustauschchromatographie von teilweise gereinigtem IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1 wurde wie in Beispiel 2.D.2. nachstehend beschrieben auf eine Gelfiltrationschromatographiesäule geladen.

1. Zweiter HIC-Schritt um Multimer aus gepooltem Eluat vom zweiten Kationenaustauschschritt bei der Reinigung von IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14 zu entfernen

a. Probenpräparation

Bevor der Pool der Eluatfraktionen auf die HIC-Säule geladen wurde, wurde der Pool durch Zugeben von 50 ml einer 0,5 M Natriumacetat und 0,5 M Natriumphosphat, pH 4,5 enthaltenden Pufferlösung auf 500 ml verdünnt. Um den pH-Wert der Lösung auf 4,5 einzustellen, wurde eine ausreichende Menge 1 N HCl zugegeben. Dann wurde Wasser zugegeben, um das Gesamtvolumen auf 438 ml zu erhöhen und Ammoniumsulfat (63 ml einer Lösung mit 80 % Sättigung) wurde langsam zugegeben, wobei 500 ml einer Lösung erhalten wurden, die IGF-1 (203 mg), Ammoniumsulfat (10 % Sättigung), 50 mM Natriumacetat und 50 mM Natriumphosphat, pH 4,5 enthielt. Bei Zugabe von Ammoniumsulfat zum Eluat bildete sich kein Präzipitat.

b. IGF-1 Elution und erneute Beladung

Das in Beispiel 2B beschriebene Zweischritt-Elutionsverfahren wurde verwendet, um den IGF-1 aus der HIC-Säule zu eluieren.
Die Eluatfraktionen wurden in zwei Pools vereint und wie für den ersten HIC-Schritt beschrieben (siehe Beispiel 2B) wurde Pool 1 erneut auf die HIC-Säule geladen und eluiert, um in dem Pool enthaltenes intaktes IGF-1 Monomer rückzugewinnen. Die Pool 2 Eluate der zwei HIC-Matrix Elutionen wurden vereint, wobei ein einziger Pool von gereinigtem IGF-1 Monomer erhalten wurde.

c. Charakterisierung der Gewinnung

HPLC-Analyse des endgültigen Eluatpools ergab, daß diese Präparation von intaktem IGF-1 Monomer zu mehr als 97 % rein war und 147 mg intaktes IGF-1 Monomer in einem Volumen von 320 ml entsprechend einer Endausbeute von 28 % des intakten IGF-1 Monomers, das im zellfreien Nährmedium vorhanden war (Tabelle I), enthielt.

2. Gelfiltrationschromatographie von gepooltem Eluat aus dem zweiten Kationenaustauschschritt bei der Reinigung von IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1

a. Säulenpräparation

Eine vorgepackte 60 cm x 1,6 cm Durchmesser Superdex 75 16/60 Gelfiltrationssäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) wurde regeneriert unter Verwendung von 60 ml Wasser bei 1,4 ml/Minute, 120 ml 0,5 M NaOH bei einer Fließrate von 0,5 ml/Minute, 60 ml Wasser bei 0,5 ml/Minute, 120 ml 50 % Isopropylalkohol bei 0,5 ml/Minute und 60 ml Wasser bei 0,5 ml/Minute. Die Säule wurde dann mit mindestens zwei Säulenvolumina (250 bis 350 ml) 50 mM Ammoniumacetat nach Regenerierung oder Lagerung äquilibriert. (Die Säule wurde in 20 % Ethanol aufbewahrt.) Alle Arbeitsgänge bei Verwendung dieser Säule wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Alternativ dazu wurde eine Säule mit einem Durchmesser von 2,5 cm mit Toyopearl HW50F Größenausschlußmedien (TosoHaas, Philadelphia, PA) in 50 mM Ammoniumacetat, pH 6,0 bei einer Fließrate von 6 ml/min (73 cm/h) auf eine Betthöhe von 92 cm (450 ml Bettvolumen) gepackt. Die Säule wurde regeneriert durch Waschen der Säule mit 150 ml Wasser, 300 ml 0,5 M NaOH, 150 ml Wasser, 300 ml 50 % Methanol, gefolgt von 150 ml Wasser. Die Fließrate wurde während der Regenerierung aufgrund des hohen Staudrucks während der Hydroxidwaschung auf 2 ml/min vermindert. Die Säule wurde in 20 % Ethanol aufbewahrt und der Betrieb der Säule wurde bei Raumtemperatur durchgeführt.

b. Probenpräparation und Auftragung

Wie in Beispiel 2.C.4.b beschrieben, wurden während der Salzgradientenelution der S-Sepharose Säule erhaltene Fraktionen die authentischen IGF-1 zu einem bezeichneten Reinheitsgrad enthielten, gepoolt. Der Pool (enthaltend annähernd 530 mg authentischen IGF-1) wurde dann in einer 400 ml Amicon Druckzelle unter Verwendung einer YM2 Membran, die Proteine mit einem Molekulargewicht von mehr als 2000 Da zurückhält (d.h. ein Cut Off bei einem Molekulargewicht von 2000), von einem Volumen von 420 ml auf 60 ml konzentriert. Das 60 ml Poolkonzentrat wurde in 20 Aliquots, die jeweils annähernd 30 mg authentischen IGF-1 enthielten, aufgeteilt. Die Aliquots wurden einzeln auf die Säule aufgebracht, was eine Gesamtmenge von 20 Chromatographiedurchgängen für die Charge erfordert. Während des Probenauftrags für jeden der 20 Zyklen betrug die Fließrate des Puffers (50 mM Ammoniumacetat, pH 6,0) 0,7 ml/Minute. Fünfzehn Minuten nach dem Beladen wurde die Fließrate auf 1,4 ml/Minute eingestellt. Nachdem das Monomer und Multimer von der Säule eluiert waren, wurde das nächste Aliquot auf die Säule geladen und der Zyklus wurde wiederholt. Eine größere Säule mit einer höheren Kapazität hätte die Anzahl der erforderlichen Zyklen vermindert.
Alternativ kann, wenn die Toyopearl HW50F Säule für Gelfiltrationschromatographie verwendet wird, um restliches Multimer von teilweise gereinigtem IGF-1 zu entfernen, 0,2 M Essigsäure als der Elutionspuffer verwendet werden. Interessanterweise eluierte IGF-1 Monomer langsamer, wenn der Essigsäurepuffer verwendet wurde als wenn der 50 mM Ammoniumacetatpuffer verwendet wurde. Anscheinend besteht bezüglich dieser Matrix und monomerem IGF-1 irgendeine Wechselwirkung, welche die Elution von monomerem IGF-1 verzögert und die Auftrennung von monomerem und multimerem IGF-1 verbessert.

c. Elution von IGF-1

Das Säuleneluat wurde mit einem on-line UV- Absorptionsdetektor, der bei einer Wellenlänge von 280 nm eingestellt war, überwacht. Wenn Protein von der Säule zu eluieren begann, wie durch den UV-Absorptionsdetektor angezeigt, wurden alle 5 Minuten Fraktionen (jeweils 7 ml) des Eluats gesammelt, bis authentisches IGF-1 Monomer aus der Säule zu eluieren begann, wie durch einen scharfen Anstieg der Uv-Absorption angezeigt. Zu diesem Zeitpunkt wurden kontinuierlich 0,5 Minuten-Fraktionen (0,7 ml) annähernd 3 Minuten gesammelt, so daß die Übergangsfraktionen (d.h. Fraktionen die an der Grenze zwischen Mulitmer- und Monomerelution gesammelt wurden) analysiert werden konnten. Am Ende des 3-minütigen Zeitraums wurden 5 Minuten-Fraktionen (jeweils 7 ml) für den Rest der Monomerelution gesammelt. Sobald das Monomer vollständig eluiert war, wurde ein weiteres Aliquot, das 30 mg IGF-1 enthielt, auf die Säule geladen und das Elutionsverfahren wurde wiederholt.

d. Charakterisierung der Gewinnung

Die Fraktionen, die aus der Gelfiltrationssäule für alle 20 Zyklen gesammelt worden waren, wurden durch HPLC analysiert. Das IGF-1 Material, das als erstes aus der Säule eluierte, wurde gesammelt, während des Zeitraums beginnend unmittelbar nachdem 64 ml Puffer aus der Säule eluiert waren und endend unmittelbar nachdem 100 ml Eluat aus der Säule eluiert waren (d.h. Material im 65. bis 100. Milliliter des Eluats). HPLC- Analyse dieses Materials, das als der erste Peak aus der Gelfiltrationssäule eluierte, wies kein Protein nach (d.h. das HPLC-Chromatogramm enthielt keine Peaks). Daher wurde die Konzentration dieses Materials mit hohem Molekulargewicht, vermutlich multimere IGF-1 Spezies, bestimmt durch Vergleichen der Absorption dieses Materials bei 280 nm mit der des später eluierenden dimeren IGF-1, der durch HPLC-Analyse quantifizierbar war. SDS-PAGE-Analyse dieses Eluatpools zeigte ein Protein mit sehr hohem Molekulargewicht mit einer Position am oberen Ende des Gels unter nicht reduzierenden Bedingungen. Unter reduzierenden Bedingungen wies die Bande die diesem Protein mit hohem Molekulargewicht entsprach, eine stark verminderte Intensität auf und eine der monomeren Form von IGF-1 entsprechende Band war im Gel vorhanden. In den Western Blots dieser Gele konnte im oberen Bereich des Blots der die nicht reduzierte Probe enthielt eine sehr schwache Bande erkannt werden, und die Monomerbande konnte im Blot der reduzierten Probe erkannt werden.
Der zweite Peak auf dem Gelfiltrations on-line Detektorchromatogramm entsprach Material, das zwischen dem 100. bis 125. Milliliter des Eluats eluierte. Die Hauptmenge dieses Materials hatte ein scheinbares Molekulargewicht, das mit dem eines IGF-1 Trimers konsistent war, wie auf SDS-PAGE Gelen unter nicht reduzierenden Bedingungen und entsprechenden Western Blots gezeigt. Zusätzlich enthielt dieses Material eine Spezies mit höherem Molekulargewicht wie in diesen Analysen nachgewiesen. Unter reduzierenden Bedingungen entsprach die einzige im Gel und im Immunblot beobachtete Bande dieses Eluatpools einem Protein, das mit Standard IGF-1 komigrierte. Das HPLC-Chromatogramm für diesen Pool ergab, daß IGF-1 Trimer eine relativ lange Retentionszeit aufwies (d.h. die Elution fand von 14 bis nach 16 Minuten statt).
Der dritte Peak des Gelfiltrationschromatogramms entsprach Material, das vom 125. bis 135. Milliliter des Eluats eluierte. HPLC-Analyse und SDS-PAGE- und Western-Analyse zeigten, daß dieser Eluatpool vorwiegend aus IGF-1 Dimer mit geringen Mengen von monomerem sowie trimerem IGF-1 bestand. Auf einer HPLC-Säule eluierte dieser Pool zwischen 11 und 14 Minuten.
Authentischer IGF-1 begann im 126. Milliliter des Eluats zu eluieren, der auch einen recht hohen Gehalt von dimerem IGF-1 enthielt. Die ersten 2,1 ml (1,5 Minuten) der Elution nachdem das Monomer zu eluieren begann, enthielten jedoch lediglich 0,2 mg Monomer. Während der anschließenden 2,1 ml der Elution eluierten 3 mg monomerer IGF-1, der annähernd 10 % dimeren IGF-1 enthielt. Dieser Pool wurde in den IGF-1 Pool, der auf die Säule geladen wurde, rückgeführt, um die Rückgewinnungsausbeute dieses Verfahrens zu verbessern. Wenn dieser Pool nicht durch erneutes Laden auf die Säule rückgeführt worden wäre, wären 10 % des gesamten monomeren IGF-1 verloren worden (3 mg für jede 30 mg Charge). Zu diesem Zeitpunkt, nachdem ein Gesamtvolumen von 130 ml Eluat eluiert war, hatte die Konzentration von multimerem IGF-1 auf weniger als 3 % abgenommen und das restliche Eluat wurde bis zum Ende der Monomerelution gewonnen, die beim 150. Milliliter des Eluats eintrat. Die Monomerpools, die nach jedem der 20 getrennten Gelfiltrationen der 20 Aliquots des Eluats aus dem S-Sepharose Schritt erhalten worden waren, wurden gepoolt, wobei eine Gesamtmenge von 481 mg authentischer IGF-1 in einem Volumen von 600 ml erhalten wurde. Die Ausbeute für diesen Schritt betrug 91 % und die Gesamtausbeute für das Reinigungsverfahren bis zu diesem Punkt betrug 49 % (Tabelle II). HPLC-Analyse des Monomerpools deutete auf eine Reinheit von 98 % und einen Multimergehalt von 0,9 % hin. SDS-PAGE und Western Blot-Analyse des Monomerpools, wobei lediglich monomerer IGF-1 sowohl unter reduzierenden wie nicht reduzierenden Bedingungen nachgewiesen wurde, war mit den Ergebnissen der HPLC-Analyse des Pools konsistent.

E. Diafiltration und Konzentration von gereinigtem IGF-1

1. Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14

Das als gepooltes Eluat (320 ml) aus dem zweiten HIC-Schritt endgültig erhaltene gereinigte IGF-1 Produkt wurde durch Filtration durch ein Filter, das größere Proteine als 2000 Da (YM2 Filter, Amicon, Darvers, MD) zurückhält, in einer 400 ml Amicondruckzelle auf ein Volumen von etwa 20 ml konzentriert. Der Puffer der konzentrierten IGF-1 Präparation wurde mit 0,1 M Essigsäure ausgetauscht, durch Verdünnen des konzentrierten IGF-1 auf 400 ml mit 0,1 M Essigsäure und dann erneutes Konzentrieren des Proteins durch Filtration auf ein Gesamtvolumen von annähernd 20 ml. Das Verfahren wurde zweimal wiederholt, um einen nahezu vollständigen Pufferaustausch zu bewerkstelligen. Diafiltration wurde bei einer Temperatur von 2 bis 10ºC durchgeführt.

2. Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1

Alle der Eluatfraktionen aus dem Gelfiltrationschromatographieschritt, die monomeren IGF-1 enthielten, wurden gepoolt, wobei ein Gesamtvolumen von 600ml, worin 481 mg authentischer IGF-1 enthalten waren, erhalten wurde. Dieser Pool wurde dann auf ein Volumen von 50 ml in einer Amicon Druckzelle unter Verwendung einer YM2 Membran (Cut Off bei einem Molekulargewicht von 2000) konzentriert. Um das Ammoniumsalz zu entfernen wurde der konzentrierte, gereinigte Monomerpool 10-fach mit 0,1 M Essigsäure verdünnt und erneut konzentriert. Dieser Verdünnungs- und Konzentrationsschritt wurde zweimal wiederholt. Ein Endvolumen von 45 ml wurde aus der Druckzelle entfernt und der Filter wurde mit zwei Waschungen einer 0,1 M Essigsäure mit einem Gesamtvolumen von 5 ml gewaschen. Die ersten 45 ml wurden durch ein Corning 0,22 Mikrometer Filter geleitet und dann wurden die aus der Filterwaschung gesammelten 5 ml ebenfalls durch den gleichen Filter filtriert und mit den 45 ml vereint, wobei das Gesamtvolumen des endgültigen, gereinigten authentischen IGF-1 auf 50 ml gebracht wurde. Die Menge von konzentriertem IGF-1 (Tabelle II) wurde durch HPLC zu 453 mg bestimmt, entsprechend einer Ausbeute von 94 % für den Konzentrationsschritt und einer Gesamtausbeute von 46 % für das gesamte Reinigungsverfahren.
Um sicherzustellen, daß durch dieses Verfahren Ammoniak entfernt wurde, wurde der Ammoniakgehalt in jedem während der Konzentrations- und Verdünnungsreihe gesammelten Filtrat unter Verwendung einer Ammoniakkombinationselektrode (Corning, Medford, MA) bestimmt. Mit bekannten Ammoniakkonzentrationen wurde eine Standardkurve erstellt. Die Ammoniakkonzentrationen wurden berechnet zu 53 mM für den Gelfiltrationspuffer und zu 42 mM für das aus dem anfänglichen Konzentrationsschritt erhaltene erste Filtrat. Nachfolgende Filtrate aus der Reihe 10-facher Verdünnungen und Konzentrierungen wurden berechnet zu 4,6, 0,016 und 0,001 mM Ammoniak.

BEISPIEL 3: CHARAKTERISIERUNG VON IN PICHIA PRODUZIERTEM IGF-1 DER AUS FERMENTATIONSNÄHRMEDIUM GEREINIGT WURDE

Die Eluatpools von gereinigtem IGF-1 der nach dem zweiten HIC- Schritt bei mehrfachen Wiederholungen des oben beschriebenen Verfahrens erhalten wurden, wurden durch Diafiltration in 0,1 M Essigsäure, wie in Beispiel 2E beschrieben, konzentriert. Typische Proben von intaktem, monomerem, korrekt gefaltetem IGF-1, wie oben beschrieben aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14 und des Stammes M+IMB206S1 gereinigt, wurden durch HPLC, Gelfiltrationschromatographie, SDS-PAGE, Immunblot, Aminosäurezusammensetzung und Aminosäuresequenzanalysen charaktisiert und quantifiziert.

A. HPLC Analyse

1. Protokoll

Ein Waters (Medford, MA) 600 Lösungsmittelzuführsystem, ein Waters Modell 481 Lambda Max variabler Wellenlängendetektor, ein Wisp 710B Autoinjektor und ein Schimadzu Crom-Pac (Cole Scientific, Moorepark, CA) Integrator bildeten das HPLC- System. Eine Vydac C4 Säule (0,46 x 5 cm) mit einer Schutzsäule wurde verwendet, um Komponenten der in Pichia astoris produzierten IGF-1 Präparationen auf zutrennen. Während des Reinigungsverfahrens erhaltene Proben und Proben der endgültigen gereinigten Präparation von IGF-1 wurden bei einer Fließrate von 1 ml/min auf die Säule geladen und wurden in einem Trifluoressigsäure (TFA) /Acetonitrilgradienten eluiert. Das Elutionsmittel wurde hergestellt durch Verwenden von mobiler Phase A (0,1 % TFA) zu verdünnter mobiler Phase B (95 % Acetonitril, 5 % Wasser, 0,1 % TFA). Ein Gradient von 1 %/Minute von 25 % bis 42 % mobiler Phase B wurde während eines Zeitraums von 17 Minuten bei einer Fließrate von 1 ml/Minute durch die Säule geleitet, um das Material das auf die Säule geladen worden war, zu eluieren. Die Säule wurde dann mit 100 % mobiler Phase B bei einer Fließrate von 2 ml/Minute während 4 Minuten, gefolgt von 25 % mobiler Phase B während 4 Minuten bei 2 ml/Minute regeneriert. Die Fließrate wurde dann aufl ml/Minute vermindert und die Säule wurde vor erneuter Injektion einer anderen zu analysierenden Probe 2 Minuten äquilibriert. Der Detektor wurde auf 0,05 Absorptionseinheiten-Vollausschlag (absorbance units full scale, AUFS) eingestellt und eine Wellenlänge von 215 nm wurde für maximale Sensitivität verwendet.
Um die Gehalte von in Pichia produziertem IGF-1 durch HPLC zu guantifizieren, wurden bekannte Mengen von Standard-IGF-1 (Amgen) (0,5 bis 5,0 ug) in die HPLC-Säule injiziert und die Fläche unter den entsprechenden Peaks in den Chromatogrammen wurde gemessen. Eine Standardkurve wurde erstellt durch Auftragen der Fläche gegen ug des auf die HPLC-Säule geladenen TGF-1. Ein Umrechnungsfaktor zur Verwendung beim Umrechnen der Fläche unter HPLC-Chromatogrammpeaks in IGF-1 wurde aus der Standardkurve berechnet. Wenn der Detektor auf 0,05 AUFS und eine Wellenlänge von 215 nm eingestellt wurde, variierte der Umrechnungsfaktor von 350 Einheiten/ug bis 405 Einheiten/ug von in die Säule injiziertem IGF-1. Unter Verwendung dieser Information war es möglich, die Konzentration an korrekt gefaltetem, intaktem, monomerem IGF-1, der in einem Nährmedium oder einer Reinigungsprobe vorhanden war, zu bestimmen, durch Messen der Fläche des entsprechenden Peaks auf dem Chromatogramm aus der HPLC-Analyse der Probe. Dieser Umrechnungsfaktor wurde ebenfalls verwendet, um auch die annäherende Konzentration anderer IGF-1 Spezies abzuschätzen. Die absoluten Konzentrationen jeder dieser anderen Spezies können jedoch in Abhängigkeit der Unterschiede ihrer spezifischen Umrechungsfaktoren variieren.

2. Analyse gereinigter Proben

Verschiedene Verdünnungen von gereinigtem IGF-1 wurden durch HPLC analysiert. Die Äquivalente von 5, 2, 1, 0,5, 0,2 und 0,1 ul des konzentrierten, gereinigten IGF-1 wurden in die C4- Säule injiziert. Die Peakfläche, die intaktem, korrekt gefaltetem, monomerem IGF-1 entspricht, war in Chromatogrammen aus der Analyse der 0,1 bis 1 - 2 ul Aliquots direkt zum Volumen der Probe proportional. Unter Verwendung eines von Amgen erhaltenen IGF-1 Standards wurde eine Standardkurve erstellt und verwendet, wobei eine Konzentration von 8,2 ± 1,4 mg/ml für die IGF-1 Konzentration der gereinigten Präparation aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14 und von 9,0 ± 0,3 mg/ml für die IGF-1 Konzentration der gereinigten Präparation aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1 berechnet wurde.
Reinheitsabschätzungen für die IGF-1 Präparation nahmen zu mit abnehmendem Volumen des in die HPLC-Säule injizierten gereinigten Materials. Das Chromatogramm eines 2 ul Aliquots einer aus Nährmedium von G+IMB204S14 gereinigten Probe deutete darauf hin, daß die Präparation zu 97,3 % reines, intaktes, korrekt gefaltetes IGF-1 Monomer war, mit drei geringen Kontaminationen, verkörpert durch eine vordere Peakschulter (vermutlich fehlgefalteter IGF), eine rückwärtige Peakschulter (angespaltener IGF) und die Peaks im Multimerbereich, umfassend 0,9 %, 0,4 % bzw. 1,4 % der Präparation. Eine Reinigungsbestimmung auf Basis einer HPLC-Analyse eines 1 ul Aliquots deutete darauf hin, daß die Präparation zu 89,7 % reines, korrekt gefaltetes, intaktes IGF-1 Monomer war, wobei kein Multimer vorhanden war, während eine HPLC-Analyse eines 0,2 ul Aliquots darauf hindeutete, daß die Präparation zu 99,4 % reines, korrekt gefaltetes, intaktes IGF-1 Monomer war. Da das Multimer aus der HPLC-Säule als ein breiter heterogener Peak eluiert, ist es schwierig seine Anwesenheit durch HPLC zu bestimmen. 2 ul des konzentrierten gereinigten IGF-1 entsprechen jedoch beinahe 15 ug IGF-1. Es würde daher erwartet werden, daß Kontaminationen mit einem niedrigen Gehalt in einer HPLC-Analyse eines 2 ul Aliquots von gereinigtem IGF-1 nachgewiesen werden würden.
Das Chromatogramm eines 2 ul Aliquots einer aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1 gereinigten Probe deutete darauf hin, daß die Präparation zu 97,3 % reiner authentischer IGF-1 mit 1,1 % Multimer, 0,73 % angespaltenem und 0,9 % mutmaßlich mißgefaltetem IGF-1 war. Die geschätzte Reinheit der 0,1 bis 0,5 ul Aliquots betrug mehr als 99 %.

B. Gelfiltrationschromatographieanalyse

1. Protokoll

Eine Superdex 75 HR 10/30 Gelfiltrationssäule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) mit einem Bettvolumen von 24 ml (10 x 300 mm) wurde verwendet, um den endgültig gereinigten IGF-1 zu charakterisieren. Das oben beschriebene HPLC-System (siehe Beispiel 3A) wurde zur Verwendung mit dieser Säule modifiziert. Der Detektor wurde auf eine Wellenlänge von 280 nm und eine Sensitivität von 0,05 AUFS eingestellt. IGF-1 enthaltende Proben, die während der Reinigung von IGF-1 aus Nährmedium erhalten worden waren, wurden auf die Säule geladen und ein 0,1 bis 0,3 M Ammoniumacetat, pH 6, enthaltender Puffer wurde bei einer Fließrate von 0,5 ml/Minute verwendet, um die IGF-1 Spezies nach Größe zu trennen.

2. IGF-1 Analysen

a. Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14

Um den tatsächlichen Gehalt von IGF-1 Multimer, das in der Präparation von gereinigtem IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14 vorhanden war, abzuschätzen, wurden 50 ul des konzentrierten gereinigten IGF-1 (annähernd 250 ug), die mit 0,3 M Ammoniumacetat, pH 6, auf ein Volumen von 200 ul verdünnt worden waren, durch Gelfiltrationschromatographie analysiert. Die Integration der zwei Peaks, die den zwei schneller eluierenden Kontaminationen (multimerer IGF-1) entsprachen, deutete darauf hin, daß der erste Peak (Material eluierte bei 22,67 Minuten, das vermutlich ein Trimer war) 1,0 % der gesamten Fläche ausmachte und der zweite Peak (Material eluierte bei 24,75 Minuten, das vermutlich ein Dimer war) 2,6 % der gesamten Fläche ausmachte. Der Gesamtprozentsatz von Multimer in der gereinigten Präparation wurde zu 3,6 % berechnet und der Prozentsatz an Monomer (drittschnellste eluierende Spezies im Chromatogramm) wurde zu 94,9 % berechnet. Das diesen drei Peaks entsprechende Material wurde gesammelt und getrennt durch HPLC analysiert (siehe das in Beispiel 3A beschriebene Protokoll).
Aus dem HPLC-Chromatogramm von Material, das dem Monomerpeak im Gelfiltrationschromatogramm entsprach, wurde berechnet, daß mehr als 95 % des IGF-1 Monomers, das auf die Gelfiltrationssäule geladen worden war, im Eluat rückgewonnen wurde. Annähernd 19 ug intakter, monomerer IGF-1 aus der Gelfiltrationssäule wurde auf die C4-Säule geladen und kein Multimer wurde im HPLC-Chromatogramm nachgewiesen.
Die multimeren IGF-1 Formen, die aus der Gelfiltrationssäule als die zwei schnellsten eluierenden Spezies eluierten, wurden ebenfalls durch HPLC analysiert aber die Multimerkonzentration war für einen Nachweis über HPLC zu gering.
Um manche der multimeren Formen, die in niedrigen Mengen im gereinigten TGF-1 vorhanden sein könnten zu analysieren, wurden 200 ul Material aus dem ersten Pool der Eluatfraktionen aus dem ersten HIC-Schritt der Reinigung (siehe Beispiel 2D) einer Gelfiltrationschromatographie (wie oben beschrieben) unterworfen, da es einen relativ hohen Multimergehalt enthielt. Das den einzelnen Peaks entsprechende Material wurde gesammelt und getrennt durch HPLC analysiert. HPLC- Chromatogramme der Komponenten des ersten Pools der Eluatfraktionen aus dem ersten HIC-Schritt eluierten aus der Gelfiltrationssäule bei 22,7 Minuten (Trimer) bzw. 24,8 Minuten (Dimer). Material das bei annähernd 35,5 Minuten aus der Gelfiltrationssäule eluierte, wurde ebenfalls durch HPLC analysiert aber im HPLC-Chromatogramm wurden keine Peaks nachgewiesen. Vermutlich ist dies ein kleines IGF-1 Peptid, das entweder zu fest an die C4-Säule bindet, so daß es im Elutionsgradienten nicht entfernt wurde oder an C4 überhaupt nicht bindet.

b. Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1

Das Chromatogramm der Gelfiltrationschromatographieanalyse von 450 ug der endgültigen aus Nährmedium des Stammes M+IMB20S1 gereinigten Präparation zeigte, daß sie 99,2 % monomeren und 0,8 % multimeren IGF-1 enthielten. Das Chromatogramm von 200 ug dieser Präparation deutete darauf hin, daß sie aus 100 % Monomer besteht.

c. SDS-PAGE und Immunblotanalyse

1. Protokolle

a. SDS-PAGE

1. Elektrophoresebedingungen

Das Tricinnatriumdodecylsulfatpolyacrylamid- Gelelektrophoresesystem (Tricin SDS-PAGE) [Schagger, H. und von Jagow, G. (1987) Anal. Biochem 166:368], ein System das fur die Trennung von Proteinen im Bereich von 5 bis 20 kDa optimiert ist, wurde zur elektrophoretischen Analyse IGF-1 enthaltender Proben verwendet. Kurz zusammengefaßt wurde Elektrophorese im Mini-PROTEAN 11 (BioRad, Richmond, CA) Vertikalgelsystem durchgeführt. Trenngele hatten 13 % T, 3 % C und die Stapelgele hatten 4 % T, 3 % C. Wie von Schagger und von Jagow (oben) definiert, bezeichnet T den Gesamtprozentsatz der Konzentration beider Monomere (Acrylamid und Bisacrylamid) und C bezeichnet den Prozentsatz der Konzentration des Vernetzungsmittels relativ zur Gesamtkonzentration T.
Elektrophoreseproben wurden vorbereitet, indem sie 2 bis 3 Minuten in ein kochendes Wasserbad eingebracht wurden nach Zugabe der Probenpufferkomponenten auf die folgenden Konzentrationen: 2 % SDS, 12 % Glycerin, 50 mM Tris HCl, pH 6,8, 0,0025 % Coomassie Brilliantblau G und 0,001 % Pyronin Y. Zusätzlich wurden in manchen Proben die Disulfidbrücken durch Aufnahme von 100 mM Dithiotreitol (DTT) in den Probenpuffer reduziert. Ein konstantes Probenpuffervolumen wurde zu jeder Bahn der Gele zugegeben, einschließlich der "leeren" Bahnen. Elektrophorese wurde bei maximal 100 Volt durchgeführt, bis die Indikatorfarbstoffe das Ende der Gele erreicht hatten. Die Gele wurden dann entweder für Western Blot-Analyse oder für Proteinfärbung weiterverarbeitet.

ii. Fixieren und Coomassie-Färben von Tricingelen

Proteinvisualisierung durch Coomassie-Färbung wurde durchgeführt durch Inkubieren der Gele in 50 % Ethanol, 10 % Essigsäure, 5 % TCA und 200 mg/l Coomassie Brilliantblau R-250 für 30 Minuten. Aufgrund des in dieser Lösung enthaltenen Ethanols dehydratisierten die Gele zum Teil nach der Coomassie-Färbung. Daher wurden die Gele nach dem Färben in 10 % Ethanol, 7 % Essigsäure, 1 % TCA und 50 mg/l Coomassie Brilliantblau R-250 rehydratisiert. Um die Proteine kovalent in den Gelen zu fixieren, wurden die Gele 30 Minuten in 10 % Glutaraldehyd inkubiert. Nach der letzten Inkubation wurden die Gele gründlich mit destilliertem Wasser gewaschen, um den Glutaraldehyd zu entfernen. Das Waschverfahren umfaßte typischerweise das Einweichen der Gele in destilliertem Wasser während 2 Stunden, während welcher Zeit mindestens zweimal frisches Wasser zugegeben wurde, gefolgt von einer Übernacht- Inkubation der Gele in mehreren Volumina destilliertem Wasser.

b. Immumblot

Gereinigtes Protein und Proteinproben von zellfreiem Nährmedium, die durch Immunblot analysiert wurden, wurden zuerst durch Tricingelelektrophorese (siehe Beispiel 3.C.1.a) aufgetrennt und dann auf 0,1 um Nitrocellulose in einer Towbin Pufferlösung (25 mM Tris HCl, pH 8,3, 190 mM Glycin, 20 % Methanol) elektrogeblottet. Vor dem Elektrotransfer wurden Proteingele 30 Minuten in Towbin Transferpuffer äquilibriert. Nicht-reduzierte Gele wurden in Towbin Puffer, der 1 % β- Mercaptoethanol enthielt, äquilibriert.
Nachdem die Proteine auf Nitrocellulose transferiert worden waren, wurde der Filter eine Stunde in Blockingpuffer (0,25 % Gelatine, phosphatgepufferte Salzlösung, 0,05 % Tween 20, 0,02 % Natriumazid) inkubiert. Anti-IGF-1-Antiseren 10A aus Kaninchen, die gegen ein C-terminales IGF-1 Peptid erzeugt worden waren, wurden 1:2000 mit Blockingpuffer verdünnt und mit dem Filter über Nacht inkubiert. Der Filter wurde 1 Stunde mit Blockingpuffer gewaschen und 45 Minuten mit ¹²&sup5;I-Protein A (0,02 uCi/ml) inkubiert. Nach einer Stunde Waschen mit Blockingpuffer wurde der Filter luftgetrocknet und mit einem Verstärkerschirm bei -75ºC auf Röntgenfilm exponiert.

2. Analysen

a. SDS-PAGE

1. gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14

Nicht reduzierte und reduzierte Proben des gereinigten IGF-1, die 5, 2, 1, 0,5, 0,2 und 0,1 ug IGF-1, wie durch Analyse der Aminosäurezusammensetzung bestimmt, enthielten, wurden Elektrophorese und Coomassie-Färbung unterworfen. Die Minimalmenge von reduziertem oder nicht reduziertem IGF-1, die in Coomassie gefärbten SDS-PAGE-Gelen nachgewiesen werden konnte, betrug 0,2 ug. Eine Einzelbande, die einem Protein entsprach, welches mit Standard IGF-1 komigrierte, war in Gelen, die nicht reduzierte und reduzierte Proben (0,2, 0,5, 1 oder 2 ug) von gereinigtem IGF-1 enthielten, sichtbar. Zwei Banden von denen eine einem Protein entsprach, das mit Standard IGF-1 komigrierte, und eine einem Protein entsprach, das langsamer als Standard IGF-1 migrierte, waren jedoch in den Gelen der nicht reduzierten und reduzierten 5 ug Proben von IGF-1 sichtbar. Das langsamer migrierende Protein in der nicht reduzierten 5 ug Probe wurde als ein Multimer disulfidverbrückter IGF-1 Monomere identifiziert. Die Menge von in der gereinigten IGF-1 Präparation vorhandenem Multimer wurde auf 4 bis 10 % des gesamten IGF-1 geschätzt auf Basis eines visuellen Vergleichs der Intensitäten der Banden, die IGF-1 Multimer entsprachen, und bekannten Mengen von gereinigtem IGF-1.
Die schwache Bande, die überhalb der monomerem IGF-1 entsprechenden Bande in Gelen von reduzierten 5 ug Proben von gereinigtem IGF-1 nachgewiesen wurde, migrierte zu der gleichen Position wie multimerer IGF-1. Zusätzliche SDS-PAGE Analysen reduzierter Proben von gereinigtem IGF-1 wurden unter stärker stringenten, reduzierenden Bedingungen durchgeführt und diese Bande wurde nicht nachgewiesen. Weiterhin war diese Bande auf dem entsprechenden Western Blot (siehe Beispiel 3C2c) reduzierter Proben von gereinigtem IGF-1 vorhanden, was darauf hinweist, daß dies eine multimere IGF-1 Form ist. Daher ist diese obere Bande höchstwahrscheinlich das Ergebnis einer unvollständigen Reduktion des IGF-1 vor Elektrophorese.
Banden, die schneller migrierenden Proteinen als monomerem IGF-1 entsprechen, welche die Anwesenheit von angespaltenem oder abgebautem IGF-1 andeuten würden, wurden im Gel der reduzierten Proben nicht entdeckt. Da auf dem reduzierten Gel keine anderen Banden erkannt wurden, beträgt der Reinheitsgrad für den gereinigten IGF-1 höchstwahrscheinlich mehr als 95 %.

ii. Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1

Aliquots der aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1 gereinigten Präparation, die 200, 500, 1000 und 2000 ng authentischen IGF- 1 enthielten, wurden in Bahnen eines SDS-PAGE Gels geladen. Die nicht reduzierten Proben zeigten auf dem silbergefärbten Gel eine schwache, multimerem IGF-1 entsprechende Bande, diese Spezies war jedoch in Western Blots von weniger als 2000 ng der gereinigten Präparation kaum sichtbar. Der Multimergehalt konnte aus einem silbergefärbten Gel nicht bestimmt werden, da die Färbungsintensität zum Proteingehalt nicht proportional war, insbesondere für Kontaminationen niedrigen Gehalts. Eine andere Bande wurde gerade überhalb der Monomerbande in den Spuren des silbergefärbten Gels, das 1000 und 2000 ng nicht reduzierten IGF-1 enthielt, erkannt. Diese Spezies war zu einem geringeren Gehalt als dem der Multimerkontamination vorhanden. Das SDS-PAGE Gel der reduzierten Proben zeigte keine Kontaminationen außer einer sehr schwachen Bande an der Position von Multimer in der 2000 ng IGF-1 enthaltenden Spur.

b. Densitometrie-Scannen

Um die Multimerkonzentration aus den Ergebnissen von SDS-PAGE Analysen von gereinigtem IGF-1 genau zu bestimmen, wurden die Gele reduzierter und nicht reduzierter Proben von gereinigtem IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14 einem Densitometrie-Scannen unter Verwendung eines Hoefer (San Francisco, CA) Scanning-Densitometers bei einer festen Wellenlänge von 580 nm unterworfen. Densitometeraufzeichnungen wurden erzeugt durch Scannen der Gele nicht reduzierter 5 ug und 2 ug Proben und reduzierter 5 ug und 2 ug Proben. Die zwei Peaks in der Aufzeichnung, die durch Scannen der Gele der nicht reduzierten Proben erzeugt wurden, entsprechen multimerem, bzw. monomerem IGF-1. Die kleinen Peaks in den Densitometeraufzeichnungen, die durch Scannen der Gele reduzierten Proben von gereinigtem IGF-1 erzeugt wurden, entsprechen unvollständig reduziertem IGF-1 Multimer, während die großen Peaks in den gleichen Aufzeichnungen reduziertem Multimer plus monomerem IGF-1 entsprechen. Die berechneten Flächen für die Monomerpeaks, die 0,2 bis zu 5 ug gereinigtem, nicht reduziertem IGF-1 entsprechen, wurden gegen die Menge von IGF-1 aufgetragen, um eine Standardkurve aufzustellen. Die Kurve war zwischen 0,2 bis 2,0 ug IGF-1 linear. Der der Multimerbande entsprechende Peak im Gel, das 5 ug nicht reduzierten IGF-1 enthielt, konnte jedoch immer noch verwendet werden, um die Menge an vorhandenem Multimer zu berechnen, da das Multimer in dieser Bahn weniger als 2 ug darstellte. Die Fläche für den 5 ug Multimerpeak wurde verwendet, um eine Menge von 0,63 ug zu berechnen, was einer Multimerkonzentration von 12,7 % entspricht. Eine Multimermenge von 0,07 ug wurde auf Basis der einem Multimer entsprechenden Peakfläche in 2 ug von nicht reduziertem IGF-1 berechnet, was einer Multimerkonzentration von 3,4 % entspricht. Aufzeichnungen die erzeugt wurden durch Scannen der Gele nicht reduzierter Proben der gereinigten Präparation, welche weniger als 2 ug IGF-1 enthielten, deuteten darauf hin, daß das Material 100 % reiner monomerer IGF-1 war. Es sollte angemerkt werden, daß in den Aufzeichnungen die erzeugt wurden durch Scannen der Gele von nicht reduziertem, gereinigtem IGF- 1 eine hohe Menge an Hintergrund vorhanden war, und dieser Hintergrund in die Flächenberechnungen für die Multimerpeaks eingeschlossen wurde. Somit sind die berechneten Werte für die Multimerkonzentration von gereinigtem IGF-1 auf Basis von Densitometrie-Scannen zu hohe Schätzungen der tatsächlichen Konzentration.

c. Immunblot-Analyse von gereinigtem IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14

Tricin-SDS-PAGE Gele reduzierter und nicht reduzierter Proben von gereinigtem IGF-1 (0,1, 0,2, 0,5, 1, 2 und 5 ug intaktes IGF-1 Monomer auf Basis von HPLC-Analysen von gereinigtem IGF- 1) wurden auch Immunblotting unterworfen. Abschätzungen für Konzentration von IGF-1 Multimer und Monomer auf Basis von Immunblot-Analysen hängen von der relativen Bindung von Multimer und Monomer an die in diesen Analysen verwendeten polyklonalen Antiseren ab und es gibt Hinweise für eine stärkere Bindung von Antiseren durch Multimer verglichen mit monomerem IGF-1. Daher ist Immunblotanalyse von gereinigtem IGF-1 ein sensitiveres Verfahren zur Bestimmung von IGF-1 Multimer als SDS-PAGE. Beim Abschätzen der Menge von Multimer im gereinigten IGF-1 durch Immunblot-Analyse ist es jedoch notwendig, die möglichen Effekte relativer Antikörperbindung zu berücksichtigen.
Im Immunblot nicht reduzierter Proben von gereinigtem IGF-1 wurden Banden, die multimerem IGF-1 entsprechen, sowohl in Bahnen, die Amgen IGF-1 Standard enthielten, als auch in den 5-, 2- und 1-ug Proben von gereinigtem IGF-1 nachgewiesen. Die Multimerbande in der 2 ug gereinigten IGF-1 enthaltenden Bahn, schien eine ähnliche Intensität aufzuweisen, wie die Monomerbande in der 0,1 ug gereinigten IGF-1 enthaltenden Bahn (was einem Multimergehalt von 5 % entspräche) und eine viel geringere Intensität als die Monomerbande in der 0,2 ug gereinigten IGF-1 enthaltenden Bahn (Multimergehalt < 10 %). Visuelle Abschätzungen des IGF-1 Multimergehalts des gereinigten IGF-1 durch Western Blot-Analyse nicht reduzierter Proben (5 bis 10 %) stimmen gut überein mit den Werten, die durch visuelle Abschätzung Coomassie gefärbter SDS-PAGE Gele der nicht reduzierten Proben erhalten wurden.
Ähnlich zu den Coomassie gefärbten SDS-PAGE Gelen reduzierter Proben von gereinigtem IGF-1 zeigte auch der Immunblot der reduzierten Proben die unvollständige Reduktion in der 5 ug Probe. Von höchster Bedeutung waren alle der Banden, die in den Coomassie-gefärbten SDS-PAGE Gelen von gereinigtem IGF-1 auftraten, in den Immunblots der Proben vorhanden. Dies weist darauf hin, daß in der gereinigten Präparation keine nicht IGF-1 Kontaminationen vorhanden sind und daß die einzige leicht nachweisbare Kontamination die im gereinigten IGF-1 vorhanden ist, multimerer IGF-1 ist.

D. Zusammenfassung der HPLC-, Gelfiltrationschromatographie-, SDS-PAGE- und Immunblot-Analysen von gereinigtem IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14

Die Prozentsätze von IGF-1 Multimer in der gereinigten IGF-1 Präparation, bestimmt durch HPLC (1,4 %), Gelfiltrationschromatographie (3,6 %), SDS-PAGE (4 bis 10 %), Immunblot (5 bis 10 %) und Densitometrie Coomassie-gefärbter SDS-PAGE Gele (3,4 bis 12,7 %) scheinen alle in Anbetracht der in der Präparation vorhandenen niedrigen Multimergehalte in relativ guter Übereinstimmung zu liegen. Da 250 ug IGF-1 auf die Gelfiltrationssäule geladen worden waren, war dieses Verfahren vermutlich das genaueste zum Bestimmen der Multimergehalte des gereinigten IGF-1. Weiterhin besteht die Möglichkeit, daß die Probenpräparation für die SDS-PAGE Analyse in gewissem Umfang eine Aggregation von monomerem IGF- 1 in der gereinigten Präparation bewirkte, was zu höheren Abschätzungen des Multimergehalts führt. Für die Gelfiltrationschromatographie wurde keine derartige Probenpräparation durchgeführt. Wenn die gefärbten Gele und Immunblots von Proben des gereinigten IGF-1 verglichen wurden, wurden keine nicht-IGF-1 Proteinkontaminationen nachgewiesen.
Obwohl multimerer IGF-1 durch eine Reihe von Techniken identifiziert werden konnte, die verwendet wurden um die Reinheit der IGF-1 Präparation zu bestimmen, wurden die angespaltenen und fehlgefalteten Formen von IGF-1 nur durch HPLC differenziert und nachgewiesen. Der Prozentsatz von angespaltenem IGF-1 wurde durch HPLC zu etwa 0,4 % und durch SDS-PAGE und Immunblot-Analyse von reduziertem gereinigtem IGF-1 zu 0 % gemessen. HPLC Analyse zeigte auch eine Kontamination die als vordere Schulter des Peaks erschien, welcher intaktem korrekt gefaltetem monomerem IGF-1 entspricht. Diese Kontamination war zu einem Gehalt von 0,9 % vorhanden und es wird angenommen, daß sie eine fehlgefaltete Form bzw. fehlgefaltete Formen von IGF-1 ist.

E. Aminosäureanalyse

1. Protokoll

Gereinigter IGF-1 wurde säurehydrolysiert und die entstandenen Aminosäuren auf einem Beckman (Palo Alto, CA) 6300 Aminosäureanalysator charakterisiert. Um IGF-1 Protein sauer zu hydrolysieren wurden sorgfältig abgemessene Volumina gereinigter IGF-1 Lösung in 6 x 50 mm Glasröhrchen gegeben und in einem Savant (Farmingdale, NY) Speed Vac getrocknet. Diese Röhrchen wurden in einen 6 N HCl enthaltenden Reaktionskolben gegeben. Oxidation wurde durch Anlegen eines Vakuums und Abdichten des Kolbens minimiert. Der Kolben wurde über Nacht in einen 110ºC Ofen gegeben und das Protein wurde durch die heißen HCl Dämpfe hydrolysiert.
Nach Hydrolyse wurde der Reaktionskolben auf Raumtemperatur abkühlen gelassen und die Hydrolyseröhrchen wurden entfernt. Alle HCl, die in den Röhrchen kondensiert haben könnte, wurde durch Trocknen in einem Speed Vac entfernt. Die freien Aminosäuren wurden in einer Minimalmenge von 100 41 Beckman Aminosäureproben-Verdünnungspuffer Na-S zum Beladen in die 50 ul Schleife des Analysators aufgelöst. Ein Nelson (Cupertino, CA) 3000 Series Chromatographie Datensystem wurde zur Quantifizierung verwendet, mittels Vergleichen der integrierten Chromatogramme von Aminosäurestandardlösungen und den resuspendierten hydrolysierten Proben.

2. Analysen

a. Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14

Eine Proteinkonzentration von 5,15 mg/ml wurde aus acht getrennten Analysen von gereinigtem IGF-1 unter Verwendung von Norleucin als einem internen Standard bestimmt. Eine Standardabweichung von 0,26 mg/ml wurde ebenfalls berechnet. Daher waren 186 bis 206 mg Protein in dem Gesamtvolumen von 38 ml gereinigtem IGF-1 enthalten. Tabelle III zeigt die ermittelten und tatsächlichen Aminosäureverhältnisse. Die berechneten Werte für die Anzahl von Cys-, Met- und Tyr-Resten waren aufgrund oxidativer Zerstörung dieser Aminosäuren unter Hydrolysebedingungen alle niedriger als die tatsächlichen Werte. Der höhere berechnete Wert für die Anzahl von Threoninresten beruht höchstwahrscheinlich auf Peakintegrationsfehlern als Folge unvollständiger Auflösung dieses Restes und des angrenzenden Serinrestes. Diese Abweichungen liegen innerhalb der erwarteten Grenzen für dieses Verfahren. TABELLE III ANALSYSE DER AMINOSÄUREZUSAMMENSETZUNG VON GEREINIGTEM IGF-1 AUS NÄHRMEDIUM DES STAMMES G+IMB204S14 Aminosäuren Veröffentliche Zusammensetzungena Injektionen Geschätzter Durchschnitt der Tests 1 - 8 a abgeleitet von der von Rotwein, et al. oben veröffentlichten Nukleotidsequenz

b. Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1

Eine Analyse der Aminosäurezusammensetzung wurde mit dem endgültigen aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1 gereinigten IGF-1 durchgeführt und eine Konzentration von 8,4 mg/ml wurde berechnet. Tabelle IV zeigt die ermittelten Aminosäureverhältnisse für den gereinigten IGF-1 und die tatsächlichen veröffentlichten Aminosäureverhältnisse für IGF- 1 aus Mensch. Die ermittelten und veröffentlichten Verhältnisse stimmen gut überein und leichte Abweichungen in den ermittelten und veröffentlichten Zusammensetzungen liegen innerhalb der erwarteten Grenzen dieser Analyse. TABELLE IV Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1 Analysedaten zur Aminosäurezusammensetzung Aminosäure veröffentlichte Zusammensetzunga Experimentell a abgeleitet aus der von Rotwein et al., (oben) veröffentlichten Nukleotidsequenz.

F. Proteinsequenzanalyse

1. Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes G+IMB204S14

Um die vollständige Aminosäuresequenz des gereinigten IGF-1 zu bestimmen, wurden Proben dieses Materials direkt auf einen Applied Biosystems (Foster City, CA) 470/120 Gasphasenproteinsequenzer geladen. Sequenzieren wurde gemäß dem von Hunkapiller und Hood [Science 219:650 (1983)] beschriebenen Verfahren durchgeführt. Das Material wurde von der N-terminalen Aminosäure an durch soviel des Restes der Proteinsequenz wie möglich sequenziert. Diese Analyse erzeugte die Sequenz der ersten 59 Reste des gereinigten Proteins.
Da die Aminosäure bei Position 59 ein Methioninrest ist und Bromcyan Proteine nach Methionenresten spaltet, war es möglich das Peptid, das die 11 C-terminalen Aminosäuren (Reste 60 bis 70) von gereinigtem IGF-1 ausmacht, zu isolieren um es für eine Vervollständigung der Proteinsequenzanalyse des gereinigten Materials zu verwenden. Die 11 C-terminalen Aminosäuren des gereinigten IGF-1 wurden erhalten als ein Peptidfragment, das aus mit Bromcyan behandeltem IGF-1 durch HPLC isoliert wurde, unter Verwendung der gleichen C4-Säule wie in Beispiel 3A1 beschrieben. Dieses Fragment wurde auf den Proteinsequenzer geladen, um die Sequenz der C-terminalen Aminosäuren (Aminosäuren 60 bis 70) zu erzeugen.
Jeder Rest des gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren gereinigten Materials wurde positiv identifiziert außer den Cysteinen. Diese Reste werden identifiziert durch die vollständige Abwesenheit überhaupt eines Restes in diesem Zyklus. Die gesamte Sequenz entsprach authentischem IGF-1 aus Mensch.

b. Gereinigter IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1

Amino-terminale Sequenzanalyse von gereinigtem IGF-1 aus Nährmedium des Stammes M+IMB206S1 ergab, daß die ersten 30 Aminosäuren zur N-terminalen Sequenz von IGF-1 aus Mensch identisch waren.
Die Erfindung wurde im einzelnen in Bezug auf bestimmte besondere Ausführungsformen davon beschrieben, aber vernünftige Variationen und Modifikationen innerhalb der Idee und des Umfangs der vorliegenden Offenbarung werden von der vorliegenden Offenbarung und den beigefügten Ansprüchen in Betracht gezogen.

Claims

1. Verfahren zur Reinigung von monomerem, intaktem, korrekt gefalteten Insulin-like growth factor-1 Peptid (IGF-1) aus Medium, das IGF-1-Peptide enthält, welches Verfahren umfaßt:

(a) Inkonktaktbringen des Mediums mit einer ausreichenden Menge eines ersten Kationenaustauschmaterials unter geeigneten Bedingungen um mindestens etwa 95 % des gesamten IGF-1 aus dem Medium zu adsorbieren,

(b) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmaterial von Schritt (a) durch Inkontaktbringen des Kationenaustauschmaterials mit einer ausreichenden Menge eines Lösungsmittelsystems, das einen ausreichend hohen pH-Wert oder eine ausreichend hohe Ionenstärke aufweist, um im wesentlichen den gesamten IGF-1 von dem Kationenaustauschmaterial zu verdrängen,

(c) Inkontaktbringen der IGF-1 enthaltenden Fraktionen des Eluats aus Schritt (b) in einem geeigneten Lösungsmittelsystem mit einer ausreichenden Menge einer ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren,

(d) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch zuerst Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis 10 Volumina eines Puffersystems, relativ zum Matrixvolumen, mit einer ausreichend niedrigen Leitfähigkeit, um aberrante IGF-1 Peptide von der Matrix zu verdrängen, ohne wesentliche Mengen der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von adsorbiertem IGF-1 von der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix zu verdrängen, gefolgt von Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu etwa 10 Volumina eines Puffersystems mit einem hohen pH-Wert, relativ zum Matrixvolumen, wobei der hohe pH-Wert ausreichend hoch ist, um weitgehend die gesamten verbliebenen adsorbierten Formen von IGF-1 von der Matrix zu verdrängen,

(e) Inkontaktbringen der gemäß Schritt (d) unter Verwendung des Puffersystems mit einem hohen pH-Wert eluierten Fraktionen, die als vorwiegende Form von IGF-1 intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, wobei das Inkontaktbringen mit einer ausreichenden Menge einer zweiten Kationenaustauschmatrix und unter geeigneten Bedingungen durchgeführt wird, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des gesamten IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren,

(f) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der zweiten Kationenaustauschmatrix durch Inkontaktbringen der Matrix mit mindestens einem Volumen, relativ zum Matrixvolumen, eines Puffersystems mit einer ausreichenden Ionenstärke, um weitgehend die gesamten IGF-1 Peptide differentiell aus der Matrix zu verdrängen,

(g) Inkontaktbringen der Fraktionen des Eluats aus Schritt (f), die intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, in einem geeigneten Lösungsmittelsystem mit entweder

(1) einer ausreichenden Menge einer zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % aller IGF-1-Formen aus dem Eluat zu adsorbieren, oder

(2) einer ausreichenden Menge einer Gelfiltrationschromatographiematrix mit einer geeigneten Porengröße, um eine Auftrennung der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF-1 von im wesentlichen allen multimeren Formen von IGF-1 zu bewirken, und

(h) (1) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix nach Schritt (g) (1) durch Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems, relativ zum Matrixvolumen, mit einer ausreichend geringen Leitfähigkeit um weitgehend alle anderen IGF-1 Formen als die intakte monomere, korrekt gefaltete Form von IGF-1 von der Matrix zu verdrängen, ohne wesentlichen Mengen der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von adsorbiertem IGF-1 von der zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix zu verdrängen, gefolgt von Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von 1 bis 10 Volumina eines Puffersystems, relativ zum Matrixvolumen, mit einem ausreichend hohen pH-Wert um weitgehend den gesamten verbliebenen absorbierten IGF-1 von der Matrix zu verdrängen oder

(2) Eluieren der Gelfitrationschromatographiematrix nach Schritt (g) (2) mit einer ausreichenden Menge von Elutionspuffer, um zu bewirken, daß die intakte monomere, korrekt gefaltete Form von IGF-1 von den multimeren IGF-1 Formen aufgetrennt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die erste Kationenaustauschmatrix und/oder die zweite Kationenaustauschmatrix ausgewählt wird aus carboxymethylierten oder sulfonierten Kationenaustauschmedien.

3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei geeignete Lösungsmittelsysteme für die Elution in Schritt (b) gepufferte Lösungen einer schwachen verdünnten Säure mit einem pH-Wert von etwa 5,5 sind und etwa 1,0 M Natriumchlorid enthalten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das geeignete Lösungsmittelsystem für die Elution in Schritt (b) eine 0,02 M Natriumacetatlösung mit einem pH-Wert von 5,5 ist und 1,0 M Natriumchlorid enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das in Schritt (c) vorgesehene Inkontaktbringen durchgeführt wird durch Leiten der IGF-1 enthaltenden Fraktionen des Eluats aus Schritt (b) durch eine Säule, welche die erste hydrophobe Interaktionschromatographiematrix enthält, wobei das in Schritt (g) (1) vorgesehene Inkontaktbringen durchgeführt wird durch Leiten der IGF-1 enthaltenden Fraktionen aus dem Eluat von Schritt (f) durch eine Säule, welche die zweite hydrophobe Interaktionschromatographiematrix enthält, und wobei die ersten und die zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrizes jeweils unabhängig ausgewählt werden aus einer alkyl- oder arylsubstituierten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die ersten und zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrizes ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus butyl-, octyl- und phenylsubstituierter hydrophober Interaktionschromatographiematrix.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei die ersten und zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrizes butylsubstituierte Poly(methacrylat) Träger-HIC-Matrizes sind.

8. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das in den Schritten (c) und (g) (1) vorgesehene Inkontaktbringen unabhängig jeweils bei einer Temperatur im Bereich von etwa 15 bis zu 30ºC durchgeführt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Elution von adsorbiertem IGF-1 aus der IGF-1 enthaltenden Matrix gemäß der Schritte (d) und (h) (1) in jedem Schritt umfaßt das Inkontaktbringen der Matrix

(i) zuerst mit einem linearen Salzgradienten einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5 in einer ausreichenden Menge, um ein weitgehend salzfreies Eluat zu erzeugen, dann

(ii) mit einem linearen Gradienten einer weitgehend salzfreien gepufferten Lösung mit einem Anfangs-pH- Wert von etwa 4,5 in einer ausreichenden Menge, um den pH-Wert des Eluats auf etwa 6,5 zu erhöhen.

10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Teil des bei hohem pH eluierten Eluats erneut den Schritten (c) und (d) unterworfen wird und Fraktionen der Eluate aus beiden Elutionen nach Schritt (d), die als die vorwiegende Form von IGF-1 intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, vereinigt werden, bevor mit Schritt (e) fortgefahren wird.

11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der pH-Wert des Eluats aus Schritt (d) mit hohem pH auf etwa pH 4,5 eingestellt wird und das Eluat mit mindestens einem Volumen Wasser oder Puffer mit geringer Leitfähigkeit vor dem in Schritt (e) vorgesehenen Inkontaktbringen verdünnt wird.

12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei vor Schritt (f) die zweite Kationenaustauschmatrix gewaschen wird, indem sie mit im Bereich von etwa 1 bis zu 5 Volumina mindestens einer Lösung, relativ zum Matrixvolumen, die ein verdünnter Puffer oder eine schwache Säure ist, in Kontakt gebracht wird.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die erste und/oder zweite Kationenaustauschmatrix gewaschen wird, indem sie mit einer Lösung bzw. mit Lösungen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (1) einer Pufferlösung, welche eine 0,05 M Natriumacetatlösung umfaßt und einen pH-Wert von 4,5 aufweist, und (2) einer Pufferlösung, welche eine 0,05 M Natriumacetatlösung umfaßt und einen pH-Wert von etwa 4,5 aufweist, gefolgt von einer Pufferlösung, welche eine 0,05 M Natriumacetatlösung umfaßt und einen pH-Wert von etwa 5,5 aufweist, in Kontakt gebracht wird.

14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei geeignete Lösungsmittelsysteme für die Elution in Schritt (f) einen Natriumchloridgradienten in einem Natriumacetatpuffer, pH 5,5 umfassen.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei der Natriumchloridgradient bereitgestellt wird durch das Kombinieren eines ersten Lösungsmittelsystems und eines zweiten Lösungsmittelsystems als ein linearer Gradient, wobei das erste Lösungsmittelsystem eine 0,05 M Natriumacetatlösung, pH 5,5, umfaßt und wobei das zweite Lösungsmittelsystem eine 0,05 M Natriumacetat/0,3 M Natriumchloridlösung, pH 5,5 umfaßt.

16. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, worin das IGF-1 enthaltende Eluat aus Schritt (b) und/oder (f) vor Schritt (c) und/oder (g) (1) durch Verdünnen des Eluats mit einem ausreichenden Volumen einer gepufferten Salz -enthaltenden Lösung, pH 4,5 behandelt wird, um die Salzkonzentration des verdünnten Eluats im Bereich von etwa 0,2 bis 2 M und den pH des verdünnten Eluats auf etwa 4,5 einzustellen.

17. Verfahren nach Anspruch 1, worin ein Teil des bei hohem pH eluierten Eluats aus Schritt (h) (1) erneut den Schritten (g) (1) und (h) (1) unterworfen wird, und Fraktionen der Eluate aus beiden Elutionen nach Schritt (h) (1), die als die vorwiegende Form von IGF-1 intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, vereinigt und aufbewahrt werden.

18. Verfahren zur Reinigung von monomerem, intaktem, korrekt gefaltetem Insulin-like growth factor-1 (IGF-1) Peptid aus IGF-1 Peptide enthaltendem Medium, wobei das IGF-1 enthaltende Medium das weitgehend zellfreie Fermentationsmedium aus einem Hefefermentationsvorgang bei hoher Zelldichte ist und wobei die Hefe mit mindestens einem DNA-Fragment transformiert ist, umfassend in Transkriptionsrichtung die folgenden DNA- Sequenzen:

(i) eine Promotorregion eines Methanol responsiven Gens aus Pichia pastoris,

(ii) eine DNA-Sequenz, welche für ein Polypeptid codiert, bestehend aus:

(a) die S. cerevisiae alpha mating Faktor Präpro-Sequenz, umfassend eine Prozessierungsstelle, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lys-Arg und Lys-Arg- (Glu-Ala)x, wobei x eine ganze Zahl zwischen 1 und etwa 3 ist und

(b) ein Insulin like growth factor-1 (IGF-1) Peptid und

(iii) einen Transkriptionsterminator, der in P. pastoris funktionell ist,

wobei die DNA-Sequenzen operativ miteinander verbunden sind zur Transkription der für das Polypeptid codierenden Sequenzen, wobei das Verfahren umfaßt:

(a) gegebenenfalls das Verdünnen des IGF-1 enthaltenden Mediums mit einem gepufferten Medium geringer Leitfähigkeit, mit dem gleichen pH-Wert wie das zur Äquilibrierung der Kationenaustauschmatrix im folgenden Schritt (b) verwendete Medium,

(b) Inkontaktbringen des Mediums mit einer ausreichenden Menge eines sulfylpropylierten Kationenaustauschmediums unter geeigneten Bedingungen, um mindestens etwa 95 % des IGF-1 aus dem Medium zu adsorbieren, worin mindestens 0,05 Liter des Kationenaustauschmaterials pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 2 bis 30ºC durchgeführt wird,

(c) Inkontaktbringen des IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmaterials mit mindestens etwa 2 Volumina pro Volumen des Kationenaustauschmaterials einer 0,02 M Essigsäurelösung, gefolgt von etwa vier Volumina einer 0,02 M Natriumacetatlösung mit einem pH-Wert von 5 und welche 0,2 M Natriumchlorid enthält,

(d) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmatrixmaterial von Schritt (c) durch Inkontaktbringen des Matrixmaterials mit einer ausreichenden Menge eines Lösungsmittelsystems, umfassend eine 0,02 M Natriumacetatlösung mit einem pH von 5,5 und 1,0 M Natriumchlorid enthaltend,

(e) Inkontaktbringen des IGF-1 enthaltenden Eluats aus Schritt (d) mit einem ausreichenden Volumen einer gepufferten Ammoniumsulfat-enthaltenden Lösung, pH 4,5, um die Ammoniumsulfatkonzentration des Eluats im Bereich von etwa 0,4 bis zu 0,8 M und den pH des verdünnten Eluats auf etwa 4,5 einzustellen,

(f) Inkontaktbringen des Produkts aus Schritt (e) mit einer ausreichenden Menge einer ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren, wobei die erste hydrophobe Interaktionschromatographiematrix eine butylsubstituierte hydrophobe Poly (methacrylat) Träger-Interaktionschromatographiematrix ist, wobei mindestens etwa 0,05 Liter der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC durchgeführt wird,

(g) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch Inkontaktbringen der Matrix:

(1) zuerst mit einer ausreichenden Menge eines linearen Salzgradienten einer gepuffertem Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5, um ein weitgehend ammoniumsulfatfreies Eluat zu erzeugen, dann

(2) mit einer ausreichenden Menge eines linearen Gradienten einer weitgehend ammoniumsulfatfreien gepufferten Lösung mit einem Anfangs-pH von etwa 4,5, um den pH-Wert des Eluats auf etwa 6,5 zu erhöhen,

(h) Inkontaktbringen mindestens eines Teils der in Schritt (g) (2) erhaltenen Eluatfraktionen mit einer ausreichenden zusätzlichen Menge der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % der restlichen IGF-1-Mengen aus dem Eluat zu adsorbieren, wobei mindestens etwa 0,05 Liter des ersten hydrophoben Interaktionschromatographieharzes pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC durchgeführt wird,

(i) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch Inkontaktbringen der Matrix:

(1) zuerst mit einer ausreichenden Menge eines linearen Salzgradienten einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5, um ein weitgehend ammoniumsulfatfreies Eluat zu erzeugen, dann

(2) mit einer ausreichenden Menge eines linearen Gradienten einer weitgehend ammoniumsulfatfreien gepufferten Lösung mit einem Anfangs-pH von etwa 4,5, um den pH des Eluats auf etwa 6,5 zu erhöhen,

(j) Inkontaktbringen derjenigen Anteile des vereinigten Eluats der Schritte (g) (2) und (i) (2), die als die vorwiegende Form von IGF-1 intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, wobei das Inkontaktbringen mit einer ausreichenden Menge eines zweiten Kationenaustauschmatrixmaterials und unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren, durchgeführt wird, wobei mindestens 0,05 Liter des Kationenaustauschmaterials pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 2 bis zu 30ºC durchgeführt wird.

(k) Inkontaktbringen des IGF-1 enthaltenden zweiten Kationenaustauschmatrixmaterials mit mindestens einem bis zu etwa 5 Volumina einer 0,05 M Natriumacetatlösung, pH 4,5, pro Volumen des Kationenaustauschmaterials

(l) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem zweiten Kationenaustauschmatrixmaterial durch Inkontaktbringen des Matrixmaterials mit mindestens 5 Volumina eines Natriumchloridgradienten, der durch das Kombinieren eines ersten Lösungsmittelsystems und eines zweiten Lösungsmittelsystems als ein linearer Gradient bereitgestellt wird, relativ zum Matrixvolumen,

wobei das erste Lösungsmittelsystem eine 0,05 M Natriumacetatlösung, pH 5,5 umfaßt und wobei das zweite Lösungsmittelsystem eine 0,05 M Natriumacetat/0, 3 M Natriumchloridlösung, pH 5,5 umfaßt,

(m) entweder

(1) Verdünnen der Fraktionen des Eluats aus Schritt (l), die intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, mit mindestens einem Volumen einer gepufferten Ammoniumsulfat-enthaltenden Lösung, pH 4,5, um die Ammoniumsulfatkonzentration des Eluats im Bereich von etwa 0,2 bis zu 2,0 M und den pH des verdünnten Eluats auf etwa 4,5 einzustellen und Inkontaktbringen des verdünnten Eluats mit einer ausreichenden Menge einer zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren, wobei die zweite hydrophobe Interaktionschromatographiematrix eine butylsubstituierte hydrophobe Interaktionschromatographiematrix ist, wobei mindestens etwa 0,05 Liter der zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix pro Gramm IGF-1 in dem Medium verwendet werden und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur im Bereich von etwa 20 bis zu 25ºC durchgeführt wird oder

(2) Inkontaktbringen der Fraktionen des Eluats aus Schritt (l), die intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, mit einer ausreichenden Menge einer Gelfiltrationschromatographiematrix mit einer geeigneten Porengröße, um eine Auftrennung der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF-1 von weitgehend allen multiineren Formen von IGF-1 zu bewirken und

(n) (1) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der zweiten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix nach Schritt (m) (1) durch Inkontaktbringen der Matrix mit:

(i) zuerst einer ausreichenden Menge eines linearen Salzgradienten einer gepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 4,5, um ein weitgehend ammoniumsulfatfreies Eluat zu erzeugen, dann

(ii) mit einer ausreichenden Menge eines linearen Gradienten einer weitgehend ammoniumsulfatfreien gepufferten Lösung mit einem Anfgangs-pH von etwa 4,5, um den pH des Eluats auf etwa 6,5 zu erhöhen oder

(2) Eluieren der Gelfiltrationschromatographiematrix nach Schritt (m) (2) mit einer ausreichenden Menge Elutionspuffer, um zu bewirken, daß die intakte monomere, korrekt gefaltete Form von IGF-1 von den multimeren IGF-Formen aufgetrennt wird.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei ein Teil des bei hohem pH eluierten Eluats aus Schritt (n) (1) erneut mit der hydrophoben Interaktionschromatographiematrix in Kontakt gebracht wird und gemäß Schritt (n) (1) eluiert wird und Fraktionen der Eluate beider Elutionen nach Schritt (n) (1), die als die vorwiegende Form von IGF-1 intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, vereinigt und aufbewahrt werden.

20. Verfahren zur Reinigung von monomerem, intaktem, korrekt gefaltetein Insulin-like growth Faktor-1 Peptid (IGF-1) aus IGF-1 Peptide enthaltendem Medium, welches Verfahren umfaßt:

(a) Inkontaktbringen des Mediums mit einer ausreichenden Menge eines ersten Kationenaustauschmaterials unter geeigneten Bedingungen, um mindestens 95 % des gesamten IGF-1 aus dem Medium zu adsorbieren,

(b) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltenden Kationenaustauschmaterial aus Schritt (a) durch Inkontaktbringen des Kationenaustauschinaterials mit einer ausreichenden Menge eines Lösungsmittelsystems, das einen ausreichend hohen pH oder eine ausreichend hohe Ionenstärke hat, um weitgehend den gesamten IGF-1 aus dem Kationenaustauschmaterial zu verdrängen,

(d) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch Inkontaktbringen der Matrix zuerst mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems, relativ zum Matrixvolumen, mit einer ausreichend niedrigen Leitfähigkeit, um aberrante IGF-1 Peptide von der Matrix zu verdrängen, ohne wesentliche Mengen der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von adsorbiertem IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix zu verdrängen, gefolgt von Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems mit einem hohen pH-Wert, relativ zum Matrixvolumen, wobei der hohe pH ausreichend hoch ist, um im wesentlichen alle verbliebenen adsorbierten IGF-1 Formen von der Matrix zu verdrängen.

21. Verfahren nach Anspruch 1 oder 20, wobei vor der Elution in Schritt (b), die IGF-1 enthaltende Kationenaustauschchromatographiematrix einem schrittweisen Waschsystem unterworfen wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) (i) einer verdünnten Essigsäurelösung, gefolgt von (ii) einer Acetatpufferlösung mit einem pH von etwa 5 und mit einer Konzentration von etwa 0,2 M Salz und (2) (i) einer verdünnten Essigsäurelösung, gefolgt von (ii) einer acetatgepufferten Lösung mit einem pH-Wert von etwa 5, gefolgt von (iii) einer acetatgepufferten Lösung mit einem pH von etwa 5,5.

22. Verfahren nach Anspruch 1 oder 20, wobei vor der Elution in Schritt (b) die IGF-1 enthaltende Kationenaustauschchromatographieinatrix einem schrittweisen Waschsystem unterworfen wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: (1) 20 mM Essigsäure, gefolgt von 0,2 M NaCl enthaltendem 20 mM Natriumacetat, pH 5 und (2) 20 mM Essigsäure, gefolgt von 50 inM Natriumacetat pH 5, gefolgt von 50 mM Natriumacetat, pH 5,5.

23. Verfahren nach Anspruch 1 oder 20, wobei vor der Elution in Schritt (b) die IGF-1 enthaltende Kationenaustauschchromatographiematrix einem schrittweisen Waschsystem unterworfen wird, bestehend aus: (1) einer verdünnten Essigsäurelösung, (2) einer salzfreien Acetatpufferlösung mit einem pH von etwa 5,5, (3) einer Acetatpufferlösung mit einem pH von etwa 5,5 und mit etwa 0,05 M Salz und (4) einer Acetatpufferlösung mit einem pH von etwa 5,5 und mit etwa 0,1 M Salz.

24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das schrittweise Waschsystem aus 20 mM Essigsäure, gefolgt von 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, gefolgt von 0,05 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, gefolgt von 0,1 M NaCl in 50 mM Natriumacetat, pH 5,5, besteht.

25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Lösungsinittelsystem aus Schritt (b) eine Acetatpufferlösung mit einem pH von etwa 5,5 und mit etwa 0,3 M Salz ist.

26. Verfahren nach Anspruch 24, wobei das Lösungsmittelsystem aus Schritt (b) 0,3 M NaCl, 50 mM Natriumacetat, pH 5,5 ist.

27. Verfahren nach Anspruch 1 oder 20, wobei das Lösungsmittelsystem in Schritt (b) ein linearer Salzgradient ist, beginnend mit einer weitgehend salzfreien Pufferlösung mit einem pH von etwa 5,5 und endend mit einer Pufferlösung im wesentlichen mit dem gleichen pH-Wert und mit einer Salzkonzentration von etwa 0,5 M.

28. Verfahren nach Anspruch 27, wobei das Salz Natriumchlorid ist.

29. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 20, 21, 23 oder 27, wobei das Puffersystem mit einer ausreichend niedrigen Leitfähigkeit ein linearer Gradient ist, beginnend mit 20 % gesättigtem Ammoniumsulfat mit 50 mM Natriumacetat/Phosphat bei pH 4,5 gepuffert, und endend mit 0 % Ammoniumsulfat mit dem gleichen Puffer bei pH 4,5 gepuffert.

30. Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Puffersystem mit einem hohen pH ein zunehmender pH-Gradient ist, beginnend bei einem pH von etwa 4,5 und endend bei einem pH von etwa 6,5.

31. Verfahren nach einem der Ansprüche 1, 20, 21, 23 oder 27, wobei das Puffersystem mit einer ausreichend geringen Leitfähigkeit ein linearer Gradient ist, beginnend bei 20 % gesättigtem Ammoniumsulfat, das mit 50 mM Natriumacetat/Phosphat bei pH 5,0 gepuffert ist, und endend mit 0 % Ammoniumsulfat, das mit dem gleichen Puffer bei pH 4,0 gepuffert ist.

32. Verfahren nach Anspruch 31, wobei die hydrophobe Interaktionschromatographiematrix nach dem linearen Gradienten weiter mit einer bei pH 4,0 gepufferten ammoniumsulfatfreien Lösung in Kontakt gebracht wird.

33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei das Puffersystem mit einem hohem pH eine Lösung mit einem pH im Bereich von 6,5 bis 7,5 ist.

34. Verfahren nach Anspruch 1 oder 20, wobei das Verfahren weiter umfaßt:

(e) nach Schritt (d) das Inkontaktbringen der Fraktionen des Eluats aus Schritt (d), welche intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, und nach dem Inkontaktbringen der Matrix mit einem Puffersystem, das einen hohen pH hat, erhalten wurden, in einem geeigneten Lösungsmittelsystem, mit einer ausreichenden Menge einer Gelfiltrationschromatographiematrix, die eine geeignete Porengröße hat, um eine Auftrennung der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF- 1 im wesentlichen von allen multiineren IGF-1 Formen zu bewirken und

(f) Eluieren der Gelfiltrationschromatographiematrix mit einer ausreichenden Menge eines Eluenten um zu bewirken, daß die intakte monomere, korrekt gefaltete Form von IGF-1 von den multimeren IGF-1 Formen aufgetrennt werden.

35. Verfahren nach Anspruch 34, wobei der Eluent eine Lösung mit einer Konzentration von etwa 50 mM Ammoniumacetat und einem pH von etwa 6,0 ist.

36. Verfahren nach Anspruch 34, wobei die Gelfiltrationschromatographiematrix ein Harz auf Polymerbasis ist, und der Eluent in Schritt (f) eine Essigsäurelösung ist.

37. Verfahren nach Anspruch 36, wobei die Gelfiltrationschromatographiematrix Toyopearl HW50F ist und der Eluent eine Essigsäurelösung mit einer Konzentration von etwa 0,2 M ist.

38. Verfahren zur Reinigung von monomerem, intaktem, korrekt gefaltetem Insulin-like growth factor-1 Peptid (IGF-1) aus IGF-1 Peptide enthaltendem Medium, welches Verfahren umfaßt:

(a) Inkontaktbringen des Mediums mit einer ausreichenden Menge eines ersten Kationenaustauschmaterials unter geeigneten Bedingungen, um mindestens etwa 95 % des gesamten IGF-1 aus dem Medium zu adsorbieren,

(b) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus dem IGF-1 enthaltendem Kationenaustauschmaterial aus Schritt (a) durch Inkontaktbringen des Kationenaustauschmaterials mit einer ausreichenden Menge einer gepufferten, 0,3 M NaCl-Lösung mit einem pH von etwa 5,5, um weitgehend den gesamten IGF-1 aus dein Kationenaustauschmaterial zu verdrängen, wobei vor der Elution die IGF-1 enthaltende Kationenaustauschchromatographiematrix einem schrittweisen Waschsystem unterworfen wird, bestehend aus: (1) einer verdünnten Essigsäurelösung, (2) einer salzfreien Pufferlösung mit einem pH von etwa 5,5 und (3) einer Pufferlösung mit einem pH von etwa 5,5 und mit etwa 0,1 M Salz,

(d) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix durch Inkontaktbringen der Matrix zuerst mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems geringer Leitfähigkeit, relativ zum Matrixvolumen, das ein linearer Gradient ist, beginnend bei 20 % gesättigtem Ammoniumsulfat, das bei pH 5,0 gepuffert ist und endend mit 0 % Ammoniumsulfat, das mit dem gleichen Puffer bei pH 4,0 gepuffert ist, wodurch aberrante IGF-1 Peptide von der Matrix verdrängt werden ohne ein Verdrängen wesentlicher Mengen der intakten monomeren korrekt gefalteten Form von adsorbiertem IGF-1 aus der ersten hydrophoben Interaktionschromatographiematrix, gefolgt von Inkontaktbringen der Matrix mit im Bereich von etwa 1 bis zu 10 Volumina eines Puffersystems mit hohem PH-Wert, relativ zum Matrixvolumen, das ein zunehmender pH-Gradient ist, beginnend bei etwa pH 4 und endend bei etwa pH 7, wobei weitgehend alle der verbliebenen adsorbierten Formen von IGF-1 von der Matrix verdrängt werden,

(e) Inkontaktbringen der Fraktionen des Eluats aus Schritt (d), die als die vorwiegende Form von IGF-1 intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, in einer geeigneten Lösung um den pH der Fraktionen auf etwa pH 4,5 einzustellen, mit einer ausreichenden Menge einer zweiten Kationenaustauschmatrix und unter geeigneten Bedingungen, um im Bereich von etwa 95 bis zu 100 % des gesamten IGF-1 aus dem Eluat zu adsorbieren,

(f) Eluieren des adsorbierten IGF-1 aus der zweiten Kationenaustauschmatrix durch Inkontaktbringen der Matrix mit mindestens 1 Volumen eines Puffersystems, relativ zum Matrixvolumen, das ein linearer Salzgradient ist, beginnend bei 0 % NaCl, das bei pH 5,5 gepuffert ist, und endend mit 0,3 M NaCl, das mit dem gleichen Puffer bei pH 5,5 gepuffert ist, wobei weitgehend alle der IGF-1 Peptide differentiell von der Matrix verdrängt werden und wobei vor der Elution die zweite Kationenaustauschmatrix durch Inkontaktbringen der Matrix mit einer ausreichenden Menge einer gepufferten salzfreien Lösung mit einem pH von etwa pH 4,5, gefolgt von einer ausreichenden Menge einer gepufferten salzfreien Lösung mit einem pH von etwa pH 5,5 gewaschen wird,

(g) nach Schritt (f) Inkontaktbringen der Fraktionen des Eluats aus Schritt (f), die intakten monomeren, korrekt gefalteten IGF-1 enthalten, in einem geeigneten Lösungsmittelsystem mit einer ausreichenden Menge Toyopearl HW50F Gelfiltrationschromatographiematrix, um eine Auftrennung der intakten monomeren, korrekt gefalteten Form von IGF-1 von weitgehend allen multimeren IGF-1 Formen zu bewirken und

(h) Eluieren der Gelfiltrationschormatographiematrix mit einer ausreichenden Menge eines 0,2 M Essigsäureeluenten, um zu bewirken, daß die intakte monomere korrekt gefaltete Form von IGF-1 von den multimeren IGF-1 Formen aufgetrennt wird.