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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Umwandeln eines
Multimers von humanem Serumalbumin in Monomere davon. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Umwandeln eines
Multimers von humanem Serumalbumin, das während der Herstellung von humanem
Serumalbumin aus humanem Plasma als Ausgangsmaterial dafür oder während der
Herstellung von humanem Serumalbumin gemäß der Genrekombinationstechnik
erzeugt wird, in Monomere, wobei das Verfahren den Schritt des Behandelns
des Multimers mit einer alkalischen Lösung umfasst (nachstehend auch
als „Alkalibehandlung" bezeichnet).
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Verhindern
von unkorrigiertem Falten von humanem Serumalbumin, das während der
vorstehend genannten Behandlung mit einer alkalischen Lösung gebildet
worden ist, was durch die Bildung falscher intermolekularer oder
intramolekularer Disulfidbindungen verursacht wird, wobei das Verfahren
den Schritt des Zusetzens einer eine SH-Gruppe enthaltenden Verbindung
umfasst.
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Humanes
Serumalbumin (nachstehend auch als „HSA" bezeichnet) ist eine Hauptproteinkomponente, die
im Plasma vorliegt, besteht aus einem Einzelkettenpolypeptid, das
585 Aminosäurereste
umfasst, und weist ein Molekulargewicht von etwa 66000 Dalton auf
(vgl. P. P. Minghetti et al. (1986), "Molecular structure of the human albumin
gene is revealed by nucleotide sequence within 11-22 of chromosome
4", J. Biol. Chem. 261,
Seiten 6747–6757).
Es war bekannt, dass die Hauptrolle von HAS nicht nur darin besteht,
den normalen osmotischen Druck des Bluts aufrechtzuerhalten, sondern
auch darin, an verschiedene Substanzen, wie z.B. Calciumionen, Fettsäuren, Bilirubin,
Tryptophan und Arzneistoffen, die möglicherweise im Blut vorliegen,
zu binden, wodurch es die Rolle eines Trägers zum Transportieren dieser
Substanzen spielt. Gereinigtes HSA wurde z.B. bei der postoperativen
Behandlung nach chirurgischen Operationen und der Behandlung einer
Hypoalbuminämie,
die durch den Verlust von Albumin, wie z.B. bei einem hämorraghischen
Schock, einer Verbrennung und nephrotischen Syndromen, verursacht
wird.
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Herkömmlich wurde
HSA dadurch hergestellt, dass das humane Plasma dem Niedertemperatur-Ethanolfraktionierverfahren
von Cone oder jedwedem entsprechenden Verfahren unterzogen wurde,
so dass HSA enthaltende Fraktionen erhalten wurden (HSA wird in
der Fraktion V fraktioniert), und dann die Fraktion unter Verwendung
verschiedener Reinigungstechni ken gereinigt wurde. Darüber hinaus
wurde kürzlich
ein Verfahren entwickelt, bei dem das humane Plasma nicht als Ausgangsmaterial
verwendet wird, wie z.B. eine Technik zur Herstellung von humanem
Serumalbumin unter Verwendung von Hefe-, Escherichia coli- oder
Bacillus subtilis-Zellen, wobei die Genrekombinationstechnik genutzt
wird.
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Diese
Genrekombinationstechniken sind in (1) "Production of Recombinant Human Serum
Albumin from Saccharomyces cerevisiae", R. Quirk et al., Biotechnology and
Applied Biochemistry, 1989, 11, 273–287, (2) "Secretory Expression of the Human Serum
Albumin Gene in the Yeast, Saccharomyces cerevisiae", Ken Okabayashi
et al., J. Biochemistry, 1991, 110, 103–110, (3) "Yeast Systems for the Commercial Production
of Heterologous Proteins",
Richard G. Buckholz und Martin A. G. Gleeson, Bio/Technology, 1991,
9, 1067–1072, bezüglich Hefe,
(4) "Construction
of DNA sequences and their use for microbial production of proteins,
in particular, human serum albumin", R. M. Lawn, europäische Patentveröffentlichung
Nr. 0073646 A (1983), (5) "Synthesis
and Purification of mature human serum albumin from E. coli, L.
Latta et al., Biotechnique, 1897, 5, 1309–1314, bezüglich Escherichia coli (E.
coli), (6) "Secretion
of human serum albumin from Bacillus subtilis", C. W. Saunders et al., J. Bacteriol.
1987, 169, 2917–2925,
bezüglich
Bacillus subtilis detailliert beschrieben.
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Die
Verfahren zur Reinigung des humanen Serumalbumins, die hier verwendet
werden können,
umfassen im Allgemeinen diejenigen, die gegenwärtig in der Proteinchemie verwendet
werden, wie z.B. ein Aussalzverfahren, ein Ultrafiltrationsverfahren,
ein isoelektrisches Fällungsverfahren,
ein Elektrophoreseverfahren, eine Ionenaustauschchromatographietechnik,
eine Gelfiltrationschromatographietechnik und/oder eine Affinitätschromatographietechnik.
Tatsächlich
umfasst die humanes Serumalbumin enthaltende Fraktion verschiedene
Arten von Verunreinigungen, die z.B. von biologischen Geweben, Zellen
und Blut stammen, und daher wurde das humane Serumalbumin durch
eine komplizierte Kombination der vorstehend genannten Verfahren
gereinigt.
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Bei
der industriellen Herstellung von humanem Serumalbumin ist es unvermeidlich,
das humane Serumalbumin unter verschiedenen Bedingungen zu behandeln,
die von den Umgebungsbedingungen verschieden sind, die im menschlichen
Körper
vorliegen, und demgemäß werden
Multimere von humanem Serumalbumin gebildet. Bisher gibt es noch
keine Berichte darüber,
dass diese Multimere den menschlichen Körper bei der klinischen Anwendung
von humanem Serumalbumin nachteilig beeinflussen, jedoch besteht
ein Verdacht dahingehend, dass diese Multimere eine neue Antigenität entwickeln
können.
Aus diesem Grund ist in dem Standardisierungstest für „humanes
Serumalbumin" als
pharmazeutisches Mittel eine Obergrenze der Verunreinigung mit diesen
Multimeren im Hinblick auf dessen Sicherheit als Me dikament vorgeschrieben,
und daher wird es bei der Herstellung eines pharmazeutischen Präparats,
das dieses enthält,
zu einem wichtigen Problem, den Gehalt solcher Multimere in dem
Präparat
wesentlich zu vermindern.
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Es
wurden mehrere Verfahren zur Entfernung der Multimere beschrieben,
die während
des Verfahrens zur Herstellung von humanem Serumalbumin erzeugt
werden. Beispielsweise ist in Journal of Applied Biochemistry, 1983,
5, 282–292
beschrieben, dass HSA mit einer Reinheit von 99% und einen Aggregatgehalt
(synonym mit „Multimer"-Gehalt) von nicht
mehr als 1% dadurch erhalten wurde, dass die Fraktion V, die gemäß der Ethanolfraktionierung
des Plasmas hergestellt wurde, einer Kombination von verschiedenen
Chromatographietechniken unterzogen wurde (wie z.B. Sephadex G-25,
DEAE- und CE-Sepharose CL-6B und Sephacryl S-200), und die japanische
Patentanmeldung mit der Seriennummer Sho 63-265025 und die japanische ungeprüfte Patentoffenlegungsschrift
Nr. Hei 2-111728 beschreiben ein Verfahren, das die Schritte des
Zugebens eines Stabilisators zur Fraktion V, Wärmebehandeln des resultierenden
Gemischs (bei einer Temperatur im Bereich von 50 bis 70°C für 1 bis
10 Stunden) und dann Unterziehen des Gemischs der Ammoniumsulfat-Fällungstechnik, der Polyethylenglykol-Fraktionierungstechnik
und der isoelektrischen Fällungstechnik
umfasst, um folglich jedwede Verunreinigung und jedwedes Multimer
von HSA zu entfernen.
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Alle
diese Verfahren betreffen Verfahren zur Herstellung von HSA, das
frei von jedwedem Multimer davon ist, jedoch umfassen die Verfahren
den Schritt der Entfernung solcher Multimere von HSA, die während des
Verfahrens zur Herstellung von HSA aus einer Lösung, welche die Multimere
enthält,
erzeugt werden. Aus diesem Grund weisen die vorstehend genannten
Verfahren zwangsläufig
den Mangel einer Verminderung der Ausbeute von HSA-Monomeren auf, da
sie die Multimere von HSA entfernen und beseitigen, die in deren
Monomere umgewandelt werden können,
und ferner weisen sie den Mangel einer Verminderung der Ausbeute von
Monomeren auf, der mit den vorstehend genannten Verfahren zur Entfernung
der Multimere einhergeht. Das HSA enthaltende pharmazeutische Präparat ist
ein Präparat,
das an einen Patienten in einer großen Menge verabreicht wird,
und demgemäß sollte
es verglichen mit anderen Protein enthaltenden pharmazeutischen Präparaten
in einer wesentlich größeren Menge
bereitgestellt werden.
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Demgemäß bestand
in industrieller Hinsicht ein Bedarf für die Entwicklung eines Verfahrens
zur Herstellung von HSA, dessen Multimergehalt auf ein möglichst
niedriges Niveau vermindert ist, in einer höheren Ausbeute.
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Demgemäß ist es
eine erste Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur
Herstellung von humanem Serumalbumin bereitzustellen, das die effiziente
Umwandlung der Multimere von humanem Serumalbumin, die in den herkömmlichen
Verfahren entfernt und beseitigt werden, in deren Monomere erlaubt.
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Es
ist eine zweite Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren
zum Verhindern jedweden intramolekularen unkorrigierten Faltens
eines humanen Serumalbuminmoleküls
oder jedweden intermolekularen unkorrigierten Faltens zwischen humanen
Serumalbuminmolekülen
oder zwischen einem humanen Serumalbuminmolekül und anderen Verunreinigungen,
die während
einer Behandlung mit einer alkalischen Lösung (einschließlich z.B.
einer Chromatographie) in dem Verfahren zur Herstellung des humanen
Serumalbumings gebildet werden, bereitzustellen.
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Es
ist eine dritte Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein humanes
Serumalbuminprodukt mit einer hohen Sicherheit als Medikament bereitzustellen.
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Die
Erfinder dieser Erfindung haben verschiedene Untersuchungen durchgeführt, wobei
der vorstehend beschriebene gegenwärtige Stand der Technik berücksichtigt
wurde, und gefunden, dass dann, wenn eine wässrige, Multimer enthaltende
HSA- oder rHSA-Lösung
(Genrekombinations-HSA-Lösung) über einen geeigneten
Zeitraum unter alkalischen Bedingungen stehen gelassen wird, die
Multimere in die Monomere von HSA umgewandelt werden können. Die
Erfinder haben ferner gefunden, dass in der vorstehend genannten
Behandlung mit einer alkalischen Lösung die Zugabe einer eine
SH-Gruppe enthaltenden Verbindung, wie z.B. Cystein, zu der Verarbeitungsflüssigkeit,
das Inhibieren des Auftretens jedweden intramolekularen und/oder intermolekularen
unkorrigierten Faltens von HSA erlaubt.
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Die
vorliegende Erfindung wurde auf der Basis der vorstehend genannten
Erkenntnisse gemacht.
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Gemäß eines
ersten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Umwandeln eines Multimers des humanen Serumalbumins in Monomere
davon bereitgestellt, wobei das Multimer mit einer alkalischen Lösung mit
einem pH-Wert von 8 bis 9,5 behandelt wird.
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Gemäß eines
zweiten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Umwandeln eines Multimers des humanen Serumalbumins in Monomere
davon bereitgestellt, wobei das Multimer mit einer alkalischen Lösung mit
einem pH-Wert von 8 bis 9,5 in Anwesenheit einer eine SH-Gruppe
enthaltenden Verbindung behandelt wird.
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Gemäß eines
dritten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum
Verhindern von unkorrigiertem Falten des humanen Serumalbumins während des
Verfahrens zum Umwandeln eines Multimers von humanem Serumalbumin
in Monomere davon durch Behandeln des Multimers mit einer alkalischen
Lösung
mit einem pH-Wert von 8 bis 9,5 bereitgestellt, wobei die Lösung, die
das humane Serumalbumin enthält, mit
der alkalischen Lösung
in Anwesenheit einer eine SH-Gruppe enthaltenden Verbindung behandelt
wird.
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Gemäß eines
vierten Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein HSA-Produkt
bereitgestellt, dessen Multimergehalt auf ein möglichst niedriges Niveau vermindert
ist und das mit einem Verfahren zum Umwandeln des Multimers von
HSA in die Monomere davon gemäß dem ersten
Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt wird.
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Gemäß eines
fünften
Aspekts der vorliegenden Erfindung wird ein HSA-Produkt bereitgestellt,
das frei von jedwedem derartigen Komplex ist und das mit einem Verfahren
gemäß dem zweiten
oder dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung hergestellt wird.
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1 ist
eine Photographie, welche die Ergebnisse zeigt, die dadurch erhalten
worden sind, dass Proben einer humanes Serumalbumin enthaltenden
Lösung,
die im Herstellungsbeispiel 1 hergestellt worden ist, vor und nach
der Behandlung mit einer alkalischen Lösung einer SDS-PAGE unterzogen
worden sind und dann die Proben gemäß der Western-Blot-Technik analysiert
worden sind. In dieser Photographie entspricht das Ergebnis ➀ der
Probe vor der Behandlung mit einer alkalischen Lösung und das Ergebnis ➁ der
Probe nach der Behandlung.
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Das
Verfahren gemäß des ersten
Aspekts der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass
es beispielsweise die Schritte des Zusetzens einer alkalischen Substanz
zu einer wässrigen
Lösung,
die Multimere von humanem Serumalbumin enthält, unter Rühren, so dass die wässrige Lösung alkalisch
gemacht wird, und dann des Stehenlassens der wässrigen alkalischen Lösung, welche
die Multimere enthält,
so dass die Multimere in die Monomere des humanen Serumalbumins
umgewandelt werden, umfasst. Dieses Verfahren kann zweckmäßig einmal
oder mehrmals durchgeführt
werden, um so humanes Serumalbumin, dessen Multimergehalt auf ein
möglichst
niedriges Niveau vermindert ist, mit hoher Reinheit effizient herzustellen.
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Das
Verfahren gemäß des zweiten
Aspekts der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass
es den Schritt umfasst, bei dem eine eine SH-Gruppe enthaltende
Verbindung gleichzeitig in der alkalischen Lösung bereitgestellt wird, die
in dem Verfahren zur Herstel lung des humanen Serumalbumins zum Umwandeln
des Multimers von humanem Serumalbumin in dessen Monomere verwendet
wird.
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Im
Allgemeinen können
dann, wenn eine Proteinlösung
alkalisch gemacht wird, die in einem Proteinmolekül vorliegenden
SH-Gruppen eine intermolekulare oder intramolekulare Disulfidbindung
bilden (einschließlich
Disulfidbindungs-Austauschreaktionen). Auf dieser Stufe werden häufig falsche
Disulfidbindungen gebildet und dies kann zur Bildung eines Proteins
mit einer dreidimensionalen Struktur führen, die von derjenigen des
ursprünglichen
Proteins verschieden ist. Die Bildung dieser falschen Disulfidbindung
kann intermolekular oder intramolekular stattfinden. Daher können, wenn
gleichzeitig verschiedene Verunreinigungen vorliegen, solche Disulfidbindungen
zwischen dem Proteinmolekül
und den Verunreinigungen gebildet werden, so dass neue Substanzen
gebildet werden. Die Bildung einer solchen falschen Disulfidbindung
wird als „unkorrigiertes
Falten" bezeichnet.
Wenn aufgrund dieses unkorrigierten Faltens eine neue Substanz gebildet
wird, ist es ziemlich schwierig und mühsam, diese zu entfernen. Die
neue Substanz kann ungünstige
Nebenwirkungen in dem Patienten verursachen, dem die Substanz verabreicht
wird, wie z.B. allergische Reaktionen aufgrund der Expression einer
neuen Immunogenität
und anderer Ursachen. Das zweite Verfahren der vorliegenden Erfindung
ermöglicht
jedoch die effektive Inhibierung des Auftretens jedweder intramolekularen
oder intermolekularen unkorrigierten Faltung von humanem Serumalbumin,
die verursacht werden kann, wenn eine humanes Serumalbumin enthaltende
Lösung
alkalisch gemacht wird, und erlaubt deshalb die Herstellung von
humanem Serumalbumin mit einer höheren
Reinheit.
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Quellen
von Multimeren von humanem Serumalbumin, die in der vorliegenden
Erfindung verwendet werden können,
sind nicht auf spezifische Quellen beschränkt, und es kann sich z.B.
um solche handeln, die aus dem von Plasma abgeleiteten HSA hergestellt
werden, oder um das HSA, das durch die Genrekombinationstechnik
hergestellt wird (nachstehend auch als „rHSA" bezeichnet), welche der Alkalibehandlung
der vorliegenden Erfindung unterzogen werden können. Die Multimere von HSA
und rHSA werden nachstehend einfach als „Multimer(e)" bezeichnet.
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Wenn
HSA aus dem Plasma hergestellt wird, wird davon ausgegangen, dass
das Multimer in jedem Schritt gebildet werden kann, jedoch können wässrige,
Multimer enthaltende Lösungen,
die in jedwedem solchen Schritt erhalten werden, in der Erfindung
verwendet werden. Beispiele für
eine solche wässrige
Lösung sind
eine wässrige
Lösung
der Fraktion V, die durch die Niedertemperatur-Alkoholfraktionierung
erhalten worden ist, und Multimer enthal tende wässrige Lösungen, die in den anschließenden verschiedenen
Schritten zur Reinigung der Fraktion V (wie z.B. Chromatographie
und Wärmebehandlung)
erzeugt werden.
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Die
in den verschiedenen Schritten zur Herstellung von rHSA erzeugten
wässrigen,
Multimer enthaltenden Lösungen
können
entsprechend in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Spezifische
Beispiele dafür
sind eine Kulturbrühe
von rHSA-erzeugenden Wirtszellen und Multimer enthaltende wässrige Lösungen,
die in den anschließenden
verschiedenen Reinigungsschritten (wie z.B. Chromatographie und
Wärmebehandlung)
für die
Kulturbrühe
erzeugt werden. Diesbezüglich
umfasst der Begriff „Kulturbrühe", der hier verwendet
wird, die Kulturbrühe,
in der die vorstehend genannten Wirtszellen kultiviert werden, und
zertrümmerte Wirtszellen
enthaltende Flüssigkeiten,
worin die Wirtszellen durch jedwedes gegenwärtig verwendete Verfahren zertrümmert worden
sind.
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Die
für die
Herstellung von rHSA verwendeten Wirtszellen sind insoweit nicht
auf spezifische Wirtszellen beschränkt, als sie rHSA erzeugen
können,
und Beispiele dafür
umfassen Hefezellen, Bakterienzellen, Tierzellen und Pflanzenzellen,
wobei Hefezellen hier bevorzugt verwendet werden.
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Wenn
die Multimere, die in einer HSA oder rHSA enthaltenden Lösung vorliegen,
in dem Verfahren zur Herstellung von humanem Serumalbumin mit einer
alkalischen Lösung
behandelt werden, ist die Konzentration von HSA oder rHSA nicht
auf irgendeine spezifische Konzentration beschränkt, insoweit es im gelösten Zustand
vorliegt, jedoch beträgt
dessen Konzentration vorzugsweise nicht mehr als 100 mg/ml.
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Der
pH-Wert der alkalischen Lösung,
die zum Umwandeln der Multimere von HSA oder rHSA in die Monomere
davon verwendet wird, liegt im Bereich von 8 bis 9,5, mehr bevorzugt
von 8,5 bis 9,5 und insbesondere bei 9,0.
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Chemische
Substanzen, die für
die Alkalisierung des pH-Werts der Flüssigkeit verwendet werden,
die für
die Alkalibehandlung verwendet wird, sind nicht auf spezielle chemische
Substanzen beschränkt.
Beispiele dafür
umfassen einen oder mindestens zwei Vertreter, der bzw. die aus
der Gruppe bestehend aus alkalischen organischen Verbindungen und
alkalischen anorganischen Verbindungen ausgewählt ist bzw. sind. Spezielle Beispiele
dafür sind
Ammoniak, Ammoniumsalze, basische Metallhydroxide (wie z.B. Natriumhydroxid
und Kaliumhydroxid), Borate, Phosphate, Acetate, Oxalate, Zitrate,
Trishydroxyaminomethan und Gemische von mindestens zwei dieser Substanzen.
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Solche
chemischen Substanzen werden in einer Konzentration verwendet, die
keinesfalls irgendeine Modifizierung von HSA oder rHSA verursacht
und die abhängig
von der Konzentration der Multimer enthaltenden wässrigen
Lösung
variieren kann.
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Die
Multimere von humanem Serumalbumin werden durch eine Alkalisierung
der wässrigen,
Multimer enthaltenden Lösung
und dann Stehenlassen der Lösung
für einen
vorgegebenen Zeitraum, vorzugsweise für nicht weniger als 15 min
und mehr bevorzugt für
nicht weniger als 3 Stunden, in die Monomere davon umgewandelt.
Bei diesem Verfahren gilt für
die Zeit des Stehenlassens der Lösung
keine spezielle Obergrenze.
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Die
Temperatur dieser Alkalibehandlung ist entsprechend nicht auf irgendeine
spezielle Temperatur beschränkt,
insoweit sie keinesfalls irgendeine Modifizierung oder Denaturierung
von HSA und rHSA verursacht, und sie liegt z.B. im Bereich von 0
bis 65°C,
vorzugsweise von 10 bis 40°C
und mehr bevorzugt bei Raumtemperatur (etwa 25°C).
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Die
SH-Gruppe enthaltenden Verbindungen, die der HSA- oder rHSA-Lösung bei
deren Alkalibehandlung zugesetzt werden, sind nicht auf spezielle
Verbindungen beschränkt,
insoweit es sich um Verbindungen handelt, die eine SH-Gruppe aufweisen,
jedoch sind niedermolekulare Verbindungen, die eine SH-Gruppe aufweisen,
bevorzugt. Spezielle Beispiele dafür umfassen Cystein, Cysteamin,
Cystamin und Methionin, wobei Cystein hier bevorzugt verwendet wird.
Die SH-Gruppe enthaltende Verbindung wird der HSA- oder rHSA-Lösung in
einer Endkonzentration von vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 50
mM, mehr bevorzugt von 0,2 bis 15 mM und insbesondere von 0,5 bis
5 mM, bezogen auf eine HSA- oder rHSA-Konzentration im Bereich von 1 bis 100
mg/ml, zugesetzt.
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Im
Fall der Herstellung von humanem Serumalbumin gemäß der Genrekombinationstechnik
wird eine Kulturbrühe,
in der rHSA-sekretierende Wirtszellen kultiviert werden, oder eine
zertrümmerte
Wirtszellen enthaltende Flüssigkeit,
die unmittelbar nach dem Zertrümmern
der rHSA-erzeugenden Wirtszellen erhalten worden ist, mit einer
niedrigen Drehzahl zentrifugiert, und dann wird rHSA in dem zentrifugierten
Produkt durch verschiedene Reinigungsverfahren, wie z.B. eine Kationenaustausch-,
Anionenaustausch-, Gelfiltrations-, Aussalz-, Chelatchromatographie-,
hydrophobe Chromatographie- oder Adsorptionschromatographietechnik oder
jedwede Kombination davon, sehr gut gereinigt.
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Alternativ
wird das von dem Plasma abgeleitete HSA z.B. dadurch gereinigt,
dass das humane Plasma einer Niedertemperatur-Ethanolfraktionierung
unterzogen wird, so dass eine Fraktion V erhalten wird, die etwa 90%
HSA enthält,
und dann die Fraktion V behandelt wird, wobei die vorstehend genannten
Reinigungsverfahren genutzt werden. Das Plasma wird manchmal vor
der Niedertemperatur-Ethanolfraktionierung einer Wärmebehandlung
unterzogen, um jedwede Zersetzung durch die Einwirkung einer Protease
zu verhindern.
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Das
erste Verfahren der vorliegenden Erfindung kann in jedwedem Schritt
des vorstehend genannten Verfahrens zur Herstellung von HSA oder
rHSA verwendet werden. Vorzugsweise ist es effektiv, die Multimere davon,
die nach dem Schritt zum Behandeln einer humanen Serumalbuminlösung bei
einem pH-Wert von nicht mehr als 5 erzeugt worden sind, z.B. mittels
Kationenaustauschchromatographie- und/oder Anionenaustauschchromatographieschritten
behandelt werden, wodurch diese in die Monomere von humanem Serumalbumin
umgewandelt werden.
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Das
zweite Verfahren der vorliegenden Erfindung kann entsprechend in
jedwedem Schritt des vorstehend genannten Verfahrens zur Herstellung
von HSA oder rHSA verwendet werden. Vorzugsweise ist es effektiv,
das zweite Verfahren zu verwenden, wenn die Multimere, die nach
dem Schritt zum Behandeln einer humanen Serumalbuminlösung bei
einem pH-Wert von
nicht mehr als 5 erzeugt worden sind, z.B. mittels Kationenaustauschchromatographie-
und/oder Anionenaustauschchromatographieschritten mit einer alkalischen Lösung behandelt
werden, wodurch diese in die Monomere von humanem Serumalbumin umgewandelt
werden.
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Beispiele
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Herstellungsbeispiel 1:
Herstellung einer Lösung
von Multimer enthaltendem humanen Serumalbumin
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Gemäß dem in
TOKUHYO Hei 11-509525 beschriebenen Verfahren wurde rHSA unter Verwendung von
Hefezellen (Saccharomyces cerevisiae) hergestellt. Diese rHSA enthaltende
Kulturbrühe
wurde mit gereinigtem Wasser auf ein Gesamtvolumen von etwa dem
Zweifachen des ursprünglichen
Volumens verdünnt
und dann wurde der pH-Wert der verdünnten Lösung unter Verwendung einer
wässrigen
Essigsäurelösung auf
4,5 eingestellt. Dann wurde die Lösung auf eine STREAMLINE SP-Säule (von
Amersham Pharmacia Biotech Company erhältlich, Durchmesser 60 cm × 16 cm)
aufgebracht, die mit einer 50 mM Natriumacetat-Pufferlösung (pH 4,5), die 50 mM Natriumchlorid
enthielt, äquilibriert
wurde. Danach wurde die Säule
mit einer Pufferlösung
gewaschen, die mit derjenigen identisch war, die zum Äquilibrieren
der Säule
verwendet worden ist, worauf eine 50 mM Phosphatpufferlösung (pH
9,0), die 300 mM Natriumchlorid enthielt, durch die Säule laufen gelassen
wurde, wobei rHSA enthaltende Fraktionen erhalten wurden.
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Beispiel 1: Umwandlung
von rHSA-Multimeren in Monomere unter Verwendung von Borat
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10
ml einer 10%igen wässrigen
rHSA-Lösung,
die 14,90% Multimere enthielt, die gemäß den Verfahren hergestellt
worden sind, die im Herstellungsbeispiel 1 verwendet worden sind,
wurden 15 ml einer 5% (w/v) Dikaliumtetraboratlösung zugesetzt und die Endkonzentration
der letztgenannten Lösung
wurde auf 3% (pH etwa 9,0) eingestellt. Anschließend wurde die resultierende
Lösung
3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, während Proben in zweckmäßigen Intervallen
entnommen und dann einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter
Verwendung einer Gelfiltrationssäule
TSKgel G3000SW (von Tosoh Corporation erhältlich), die mit einer 0,1
M KH2PO4/0,3 M NaCl-Pufferlösung äquilibriert
worden ist, unterzogen wurden. Dann wurde der Gehalt der in der
Lösung
vorliegenden Albuminmultimere auf der Basis der so erhaltenen Ergebnisse
berechnet. Die Umwandlung der Multimere in die Monomere lief während der
Alkalibehandlung von 3 Stunden ab. Dies zeigt deutlich, dass dieses
Verfahren für
die Umwandlung der rHSA-Multimere in deren Monomere ziemlich effektiv
ist (vgl. die nachstehend angegebene Tabelle 1).
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Beispiel 2: Umwandlung
von rHSA-Multimeren in Monomere unter Verwendung einer 0,5 M Natriumhydroxidlösung
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50
ml einer 10%igen wässrigen
rHSA-Lösung,
die 26,10% Multimere enthielt, die gemäß den Verfahren hergestellt
worden sind, die im Herstellungsbeispiel 1 verwendet worden sind,
wurden 2,8 ml einer wässrigen
0,5 M Natriumhydroxidlösung
zugesetzt und der pH-Wert des Gemischs wurde auf etwa 9 eingestellt. Anschließend wurde
die resultierende Lösung
3 Stunden bei Raumtemperatur stehen gelassen, während Proben in zweckmäßigen Intervallen
entnommen und dann einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung
einer Gelfiltrationssäule
TSKgel G3000SW (von Tosoh Corporation erhältlich), die mit einer 0,1 M
KH2PO4/0,3 M NaCl-Pufferlösung äquilibriert
worden ist, unterzogen wurden. Dann wurde der Gehalt der in der
Lösung
vorliegenden Albuminmultimere auf der Basis der so erhaltenen Ergebnisse
berechnet. Die Umwandlung der Multimere in die Monomere lief während der
Alkalibehandlung von 5 Stunden ab. Dies zeigt deutlich, dass dieses
Verfahren für die
Umwandlung der rHSA-Multimere in deren Monomere ziemlich effektiv
ist (vgl. die nachstehend angegebene Tabelle 2).
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Beispiel 3
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50
ml der rHSA enthaltenden Fraktion, die gemäß den Verfahren hergestellt
worden ist, die im Herstellungsbeispiel 1 verwendet worden sind,
wurden Cystein bis zu einer Endkonzentration im Bereich von 0 bis
15 mM und 2,8 ml einer 0,5 N Natriumhydroxidlösung zur Einstellung des pH-Werts
der resultierenden Lösung auf
etwa 9,0 zugesetzt, worauf die Lösung
5 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen wurde. Dann wurde der
Lösung
eine wässrige
Essigsäurelösung zugesetzt,
um deren pH-Wert auf 7,0 einzustellen und die Alkalilösungsbehandlung
abzuschließen.
Dann wurde die Lösung
einer SDS-PAGE (10 bis 20% Gradientengel) und einem Western-Blotting
gemäß den üblichen
Verfahren unterzogen. Danach wurden Ziege-anti-Mensch-Serumalbumin
und Anti-Ziege-IgG-HRP-Konjugat als Primärantikörper bzw. Sekundärantikörper verwendet
und die Produkte, die durch die Elektro-phorese getrennt worden
sind, wurden mit der Chemilumineszenztechnik behandelt, so dass
sie Licht emittierten, auf einen Film übertragen und dann entwickelt.
Die 1 zeigt die Ergebnisse, die durch Analysieren
der Proben der humanes Serumalbumin enthaltenden Lösung, die
frei von jedwedem zugesetzten Cystein war, gemäß der Western-Blot-Technik
vor und nach der Behandlung mit einer alkalischen Lösung erhalten
worden sind. In der Probe ➁, die mit einer alkalischen
Lösung behandelt
worden ist, wurde eine Bande bei einem Molekulargewicht von etwa
68000 festgestellt, die dem intramolekularen unkorrigierten Falten
von rHSA zugeordnet wird. Diese Bande, die für jede Probe festgestellt wurde
und nach dem Behandeln mit einer alkalischen Lösung in der Gegenwart von Cystein
bei verschiedenen Konzentrationen erhalten wurde, wurde mit Coomassie
gefärbt
und die Dichte jeder Bande wurde mit einer Analysesoftware (Collage
Ver. 3) bestimmt. Die so erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden
Tabelle 3 zusammengefasst. Jeder Zahlenwert stellt einen Wert bezogen
auf die Dichte dar, die für
eine Probe festgestellt wurde, die keinerlei Cystein enthielt, und
die als 100% definiert ist.
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Die
in der Tabelle 3 angegebenen Ergebnisse zeigen deutlich, dass die
intramolekulare unkorrigierte Faltung von humanem Serumalbumin durch
die Durchführung
der Alkalibehandlung bei gleichzeitigem Vorliegen von Cystein effektiv
kontrolliert werden kann.
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Gemäß dem ersten
Verfahren der vorliegenden Erfindung ermöglicht die ziemlich einfache
und kostensenkende Alkalibehandlung die effiziente Umwandlung von
humanen Serumalbumin-Multimeren, die bei den herkömmlichen
Techniken entfernt und verworfen wurden, in Monomere davon. Als
Ergebnis kann der Gehalt der Multimere in pharmazeutischen Präparaten
auf ein Niveau vermindert werden, das mit demjenigen identisch ist,
das durch die herkömmlichen
Techniken erreicht wird, oder niedriger als dieses ist, und die
vorliegende Erfindung kann folglich ein sehr sicheres, humanes Serumalbumin
enthaltendes pharmazeutisches Präparat
bereitstellen.
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Gemäß dem ersten
Verfahren der vorliegenden Erfindung können die Multimere von humanem
Serumalbumin einfach in die Monomere davon umgewandelt werden und
die Monomere können
einfach dadurch gewonnen werden, dass die Multimere einer Alkalibehandlung
unterzogen werden, und daher weist das Verfahren anders als die
herkömmlichen
Verfahren, bei denen die Multimere entfernt werden, keinerlei Verlust
an humanem Serumalbumin auf. Dies zeigt, dass das erfindungsgemäße Verfahren
die Gewinnung von humanen Serumalbuminmonomeren in einer hohen Ausbeute
erlaubt. Demgemäß ermöglicht das
erfindungsgemäße Verfahren
die wesentliche Senkung der Herstellungskosten von humanem Serumalbumin.
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Das
zweite Verfahren der vorliegenden Erfindung erlaubt die effiziente
Inhibierung jedweden intramolekularen oder intermolekularen unkorrigierten
Faltens von humanem Serumalbumin, das spezifisch in einer oxidierenden
Atmosphäre
während
des Verfahrens zur Herstellung von HSA aus dem Plasma oder des Verfahrens
zur Herstellung von rHSA gemäß der Genrekombinationstechnik
verursacht wird.
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Darüber hinaus
erlaubt das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Herstellung
von humanem Serumalbumin mit hoher Reinheit mit einem verminderten
Gehalt einer neuen Substanz, die durch das unkorrigierte Falten
von humanem Serumalbumin gebildet wird und zu einer Ursache von
Nebenwirkungen wird, wie z.B. einer Allergie, die festgestellt werden,
wenn es an einen Patienten verabreicht wird.
