DE2457047C3 - Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, dessen Verwendung zur Tetanusprophylaxe - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, dessen Verwendung zur Tetanusprophylaxe

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DE2457047C3 DE2457047A DE2457047A DE2457047C3 DE 2457047 C3 DE2457047 C3 DE 2457047C3 DE 2457047 A DE2457047 A DE 2457047A DE 2457047 A DE2457047 A DE 2457047A DE 2457047 C3 DE2457047 C3 DE 2457047C3
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins durch Modifizierung eines Teilmoleküls des Tetanustoxins sowie die Verwendung dieses Derivates zur Tetanusphrophylaxe.
Die herkömmlichen Tetanusimpfstoffe zur aktiven Immunisierung enthalten fast ausschließlich durch Inaktivierung des Tetanustoxins mit Formaldehyd hergestelltes Antigen. Diese als Toxoid bezeichnete Substanz ist mit einer Vielzahl von antigenen Determinanten ausgestattet, wovon nur einige für die Erzeugung von schützenden Antikörpern gegen Tetanus eine Rolle spielen dürften. Die Abtrennung von für den Schutz nicht erforderlichen Determinanten ist wünschenswert, um zu antigenen bzw. immunogenen Stoffen zu kommen, die wegen eines engeren Spektrums von determinants Gruppen eine erhöhte Spezifität und eine verbesserte Verträglichkeit erwarten lassen.
Tetanustoxin wird von Zellen der CL tetani synthetisiert und kann sowohl aus der Zellmasse als auch aus dem Kulturfiltrat gewonnen werden. Während das extrazellulär gewonnene Toxin aus zwei Polypeptidketten besteht, die nach Behandlung mit Disulfid-Brücken reduzierenden Mitteln (z.B. Dithiothreitol [DTT]1 Dithioerylthrit [DTE], Merkaptoäthanol, Cystein) unter denaturierenden Bedingungen getrennt werden können, besteht das intrazelluläre Toxin aus einer einzigen
is Polypeptidkette, die in bekannter Weise durch eine milde Trypsinbehandlung in ein dem extrazellulären Toxin identisches Produkt überführt werden kann. Die beiden davon zu erhaltenden Bruchstücke, hier bezeichnet als die leichte Kette (Mol.-Gew. ca. 50 000) und die schwere Kette (Mol.-Gew. ca. 100 000) sind bisher nur durch Maßnahmen, die unter denaturierenden Bedingungen, z. B. in Natriumdodecylsulfat haltiger Lösung, durchgeführt werden, trennbar, und die getrennten Fragmente können nach dem bisherigen Stand der Technik nur durch denaturierende Mittel in Lösung gehalten werden (Biochimica et Biophysica acta 317, 277-285 [1973]).
Der hier vorgelegten Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, die leichte Kette des Tetanustoxins in einer Weise zu modifizieren, daß sie ohne Verlust der Antigenität in einem physiologisch verträglichen Medium gehalten werden kann. Im besonderen soll die leichte Kette als wesentlicher immunogener Bestandteil von Tetanusimpfstoffen zur Verfügung stehen und darin das herkömmliche Toxoid ersetzen.
Es wurde gefunden, daß dieses Ziel dadurch erreicht werden kann, daß man die leichte Kette entweder vor oder nach Abtrennung der schweren Kette aus dem Molekülverband des Tetanustoxins, das einen Komplex der leichten und schweren Kette darstellt, einer geringgradigen chemischen Modifizierung unterwirft. Dadurch läßt sich die spontane, irreversible Ausfällung der leichten Kette, die nach Entfernung von denaturierenden Agenzien wie Harnstoff beobachtet wird, vermeiden.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) eine wäßrige Lösung von extrazellulären Tetanustoxin mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1 -6 Kohlenstoffatomen in einer Aldehydkonzentration von 0,01 bis 0,05 M Aldehyd bei 1-200C, 5 Minuten bis 50 Stunden behandelt,
b) das Toxin in Gegenwart einer Disulfidbrücken reduzierenden Verbindung (I) und eines denaturierenden Agens (I I) umsetzt,
c) das nach b) erhaltene Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins in Gegenwart von II mit den dafür üblichen proteinchemischen Isolierungsverfahren gewinnt,
wobei im Verfahren die Stufe b) der Stufe a) vorangestellt werden kann.
Eine bevorzugte Ausführungsform besteht darin, daß man eine wäßrige Lösung des Tetanustoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1—6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formalde-
hyd, mit einer Aldehydkonzentration von 0,02 M bis 0,03 M bei 1 -6° C 2 bis 20 Stunden behandelt, die das so modifizierte Toxin enthaltende Lösung mit einem Disulfidbrücken reduzierenden Agens versetzt, das Derivat der leichten Kette aus der erhaltenen Lösung in Gegenwart eines denaturierenden Agens mit proteinchemischen Isolierungsverfahren gewinnt und zweckmäßig vom denaturierenden Mittel abtrennt
Nach der Isolierung des Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins kann das denaturierende Agens durch Dialyse oder andere vergleichbare Methoden, die die Abtrennung von niedermolekularen Stoffen von hochmolekularem Protein gestattet, beispielsweise durch Gelchromatographie entfernt werden. Mit gleichen Maßnahmen ist auch der zur Umsetzung eingesetzte und dabei nicht verbrauchte Aldehyd aus den Ansätzen zu beseitigen.
Das entsprechend dem erfindungsgen.äßen Verfahren hergestellte Derivat zeigt danach in physiologisch verträglichen, isotonisch wäßrigen Medien nicht mehr die von der leichten Kette bekannten Denaturierungsund Ausfällungserscheinungen. Das Derivat hat nicht mehr die vom Tetanustoxin bekannte giftige Eigenschaft. Es verhält sich als Antigen und ist in der Lage, schützende Antikörper gegen Tetanus im menschlichen oder tierischen Organismus zu induzieren.
Das erfindungsgemäß hergestellte Derivat ist mit üblichen proteinchemischen Methoden weiter zu reinigen. Bei der bekannt hohen Toxizität des nativen Tetanustoxins und der ebenso bekannten Tatsache, daß Eiweißfraktionierungsmethoden nur in den seltensten Fällen zu einer 100%igen Abtrennung von Begleitsubstanzen, insbesondere ähnlich strukturierten Eiweißkörpern führen, ist es vorteilhaft, das erfindungsgemäß hergestellte Produkt einer weiteren Aldehydbehandlung zu unterziehen, dadurch gekennzeichnet, daß man das Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1 —6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd, bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,05 bis 0,2 M, vorzugsweise 0,08 M bis 0,15 M, versetzt und 14 - 28 Tage bei 20 - 370C stehen läßt, den Aldehyd, z.B. durch Dialyse, entfernt und das modifizierte Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins gewinnt.
Die zusätzliche Aldehydbehandlung führt zu einer weiteren Stabilisierung der leichten Kette des Tetanustoxins und zur Beseitigung eventuell noch vorhandener Resttoxizität.
Es ist naheliegend, das ein stabiles Derivat der leichten Kette auch dadurch hergestellt werden kann, daß man natives Tetanustoxin, gewonnen aus Kulturfiltraten der Cl. tetani mit Disulfidbrücken reduzierenden Stoffen, z. B. Thiolverbindungen, behandelt, die Abtrennung der leichten Kette von der schweren Kette unter denaturierenden Bedingungen vornimmt, vorteilhaft durch Chromatographie in beispielsweise harnstoffhaltigen Pufferlösungen, anschließend durch Maßnahmen, die die Abtrennung von niedermolekularen Stoffen von hochmolekularem Protein gestatten, das denaturierende Mittel zweckmäßig durch Gelchromatographie entfernt und die leichte Kette sofort mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen, vorzugsweise Formaldehyd mit einer Aldehydkonzentration von 0,01 M bis 0,05 M, 5 Minuten bis 50 Stunden bei l-20°C stehen läßt. Gewünschtenfalls kann eine zweite Aldehydbehandlung zur Modifizierung des Derivates angeschlossen werden. Es kann jedoch auch die leichte Kette unmittelbar nach deren Isolierung mit der für die Modifikation des Derivates verwendeten höheren Aldehydmenge umgesetzt werden. Diese Verfahren bieten jedoch keinen Vorteil, da die Ausbeute des Derivates der leichten Kette, die nach dem letztgenannten Verfahren hergestellt wird, erheblich unter der liegt, wie sie nach dem erstgenannten Verfahren erhalten werden kann.
Als Ausgangsmaterial benötigt man Tetanustoxin, welches aus Kulturfiltraten der CL tetani in bekannter Weise gewonnen wurde (extrazelluläres Toxin). Als Alternative kann man ein nach beschriebenen Verfahren hergestelltes Tetanustoxin verwenden, das durch Extraktion der CL tetani-Bakterien gewonnen wurde (intrazelluläres Toxin). Hier ist jedoch eine nach bekannter Methode durchzuführende Trypsinbehandlung vor oder nach der Umsetzung mit Aldehyd notwendig. Falls die leichte Kette erst nach Abtrennung von der schweren Kette mit Aldehyd umgesetzt werden soll, muß bei intrazellulärem Toxin selbstverständlich eine Trypsinbehandlung vor der Aldehydumsetzung erfolgen, da der proteolytische Schritt eine Voraussetzung zur Isolierung der leichten Kette aus diesem Ausgangsmaterial darstellt Die als Ausgangsmaterial verwendete Tetanustoxin-Lösung enthält das Toxin zweckmäßig in einer Konzentration von 0,5 bis 10 mg/ml.
Als Disulfidbrücken reduzierende Verbindungen werden Thiolverbindungen bevorzugt. Hierfür kommen beispielsweise in Frage Cystein, Merkaptoäthanol,
Dithioerylthrit, vorzugsweise jedoch Dithiothreitol. Sie
werden in Mengen zugesetzt, die eine Konzentration der Disulfid-Brücken reduzierenden Verbindungen im
Reaktionsgemisch von 0,05 bis 0,3 M bewirken. Unter denaturierenden Agenzien im Sinne des
vorgelegten Verfahrens sind chemische Verbindungen zu verstehen, mit deren Hilfe eine Dissoziation von Proteinmolekülen in Untereinheiten, insbesondere durch !lösung von Wasserstoffbindungen, bewerkstelligt werden kann. Bekannte Wasserstoffbindungen lösende Agenzien sind beispielsweise Harnstoff oder Guanidinhydrochlorid. Harnstoff hat sich vorzugsweise in einer Konzentration von 4-6 M, Guanidinhydrochlorid bei 2 - 4 M besonders bewährt. Die Isolierung einer modifizierten leichten Kette aus dem herkömmlichen Tetanustoxoid ist nicht möglich, da hier durch Einsatz von wesentlich höheren Formaldehydmengen eine kovalente Quervernetzung zv/ischen der leichten und der schweren Kette stattgefunden hat. Es besteht jedoch kein Hinderungsgrund, jede die nicht
so denaturierte leichte Kette enthaltende Lösung mit
Aldehyden umzusetzen, um zu Derivaten mit den
vorteilhaften Eigenschaften bezüglich Stabilität und
Antigenität zu kommen. Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung
der erfindungsgemäßen Tetanustoxin-Derivate, insbesondere in der Form eines Tetanus-Impfstoffes, zur Prophylaxe der Tetanus-Erkrankung oder zur Herstellung von therapeutisch oder diagnostisch verwendbaren Tetanus-Antiseren, aber auch als diagnostische Präpara te, welche die Tetanustoxin-Derivate oder davon gewonnene Antiseren enthalten. Zur Erhöhung der Lösungsstabilität des erfindungsgemäß hergestellten Produkts kann es zweckmäßig sein, dem physiologisch verträglichen, wäßrigen Medium, in dem dieses gelöst ist, zur Stabilisierung von Proteinlösungen verwendete Verbindungen wie Aminosäuren oder Kohlenhydrate zuzusetzen. Es ist zum Schutz gegen mikrobielle Kontamination
empfehlenswert, den gebrauchsfertigen Lösungen antimikrobielle Substanzen wie z. B. Natrium-timerfonat zuzusetzen. Die Tetanustoxin-Derivate können zur Herstellung eines polyvalenten Impfstoffes mit anderen Antigenen und bzw. oder Toxoiden in herkömmlicher Weise vermischt werden.
Die Eignung der Produkte als impfstoffe wird im folgenden durch Versuche bewiesen, die eine gute Wirksamkeit des Produktes bescheinigen.
Wirksamkeitstest
a) in vitro
Um eine Auffassung über die protektive Wirksamkeit der determinanten Gruppen, die auf der leichten Kette vorhanden sind, zu bekommen, wurde folgender Versuch durchgeführt: Tetanus-Antitoxin-Serum von Pferd wurde mit steigenden Mengen des Produkts laut Beispiel 1 absorbiert. Durch Prüfung der Überstände mittels der immunologischen Doppeldiffusionstechnik wurde die Äquivalenzzone, in der sämtliche Antikörper, die gegen das Derivat der leichten Kette gerichtet waren, präzipitiert wurden, ermittelt Die Auswertung der Antikörper im Tierversuch ergab, daß bis zu 40% der schützenden Antikörper aus dem Antiserum von dem erfindungsgemäßen Produkt absorbiert werden konnten.
b) in vivo
Gruppen ä 10 Meerschweinchen erhielten subkutan 1 ml (20 μg) einer Suspension des Produktes nach Beispiel 1, adsorbiert an 0,2% Al(OH)3-GeI. Nach 4 Wochen wurden die Tiere mit Tetanustoxin, entsprechend 100 minimaltödlicher Dosen (=dlm) vergiftet Die Überlebensrate betrug 100%.
2 Kaninchen wurden in einem Intervall von 14 Tagen zweimal mit dem erfindungsgemäßen Produkt nach Beispiel 3 immunisiert (160 μg Tetanustoxin-Derivat in 1 ml kompletten Freundschem Adjuvans suspendiert je Applikation und Tier). Drei Tage nach der 2. Injektion wurden Blutproben vorgenommen. Die Auswertung der Tetanusantitoxintiter im Serum betrug 1001 E/ml bzw. 50 IE/ml.
Die Erfindung soll in den nachstehenden Beispielen näher erläutert werden.
Beispiel 1
Tetanustoxin, gewonnen aus dem Kulturfiltrat der Cl. tetani (40 000 Lf-Einheiten, entsprechend ca. 100 mg Protein) wird in 100 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8, aufgenommen und mit Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,03 M Aldehyd versetzt und 16 Stunden bei 4° C stehengelassen. Die Lösung wird anschließend gegen isotonische phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), pH 7,4, auf ca. 20 ml eingeengt; 150 ml Dithiothreitol und Harnstoff bis zu einer Endkonzentration von 6 Mol/l werden hinzugefügt Nach 30 Minuten bei Zimmertemperatur wird diese Lösung auf eine Säule (4,5 χ 100 cm) von Sephadex® (Warenzeichen der Fa. Pharmacia, Uppsala) -G 150.
äquilibriert mit 6 M Harnstoff in 0,1 M Trishydroxymethylaminomethan-HCi-Puffer (Tris), pH 8,0, und einem Zusatz von Dithiothreitol, 0,001 M, aufgetragen. Die Elution erfolgt mit dem Äquilibrierungsgemisch. Bei der Chromatographie werden durch Messung der UV-Ab-
sorption bei 280 nm zwei Proteinpeaks erkennbar. Dem ersten Peak entsprechendes Material wird verworfen. Der zweite Peak enthält das Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins. Die Lösung des isolierten Derivates der leichten Kette wird gegen 0,1 M Phosphatpuffer dialysiert und in einer Proteinkonzentration von 100 μg Protein/ml mit Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M Aldehyd versetzt und drei Wochen bei Zimmertemperatur stehengelassen. Nach einer abschließenden Dialyse gegen 0,15 M NaCl zur Entfer- nung von freiem Formaldehyd wird das modifizierte Derivat der leichten Kette gewonnen. Es kann durch Ultrafiltration ankonzentriert und in bekannter Weise zu einer Vakzine verarbeitet werden. Dabei können als Stabilisator Glycin oder Lysin verwendet werden. Als Adjuvans wird eine Suspension von Al(OH)3 verwendet Statt Formaldehyd kann auf die molare Aldehydmenge bezogen auch Glutardialdehyd, Propionaldehyd oder Butyraldehyd entweder in beiden Stufen oder auch nur in einer Stufe verwendet werden.
Beispiel 2
Tetanustoxin aus Zellextrakten wird in einer Proteinkonzentration von 0,1% in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,8, mit 100μg Trypsin versetzt und während 60 Minuten bei Zimmertemperatur stehengelassen. Anschließend wird Trypsininhibitor aus Rinderlunge (150 μg) hinzugefügt und das Produkt laut Beispiel 1 mit Formaldehyd umgesetzt, dialysiert, mit Dithiothreitol reduziert und in Harnstofflösung chromatographiert.
Beispiel 3
Tetanustoxin (20 ml, 0,5% Protein) in 0,1 M Tris, pH 8,0, wird mit Dithioerylthrit (1,50 mg) und Guanidinhydrochlorid bis zu einer Endkonzentration von 4 Mol/l umgesetzt und analog Beispiel 1 chromatographiert. Der zweite Peak wird gepoolt, das Volumen wird auf 400 ml eingestellt und das Guanidinhydrochlorid wird durch Chromatographie auf einer Säule mit Sephadex® -G 25 (Säuleninhalt 2000 ml) mit 0,1 M Phosphatpuf fer, pH 7,8, zusammen mit niedrigmolekularen Bestand teilen des Reaktionsgemisches eluiert Die leichte Kette wird dann mit Formaldehyd bis zu einer Endkonzentration von 0,1 M Aldehyd versetzt und 3 Wochen bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Verarbeitung zu einer Vakzine erfolgt laut Beispiel 1.

Claims (5)

Patentansprüche:
1. Verfahren zum Herstellen eines Derivates der leichten Kette des Tetanustoxins, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) eine wäßrige Lösung von extrazellulären Tetanustoxin mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1 — 6 Kohlenstoffatomen in einer Aldehydkonzentration von 0,01 bis 0,05 M Aldehyd bei 1 -200C, 5 Minuten bis 50 Stunden behandelt,
b) das Toxin in Gegenwart einer Disulfidbrückenreduzierenden Verbindung (I) und eines denaturierenden Agens (II) umsetzt,
c) das nach b) erhaltene Derivat der leichten Kette des Tetanustoxins in Gegenwart von II mit den dafür üblichen proteinchemischen Isolierungsverfahren gewinnt,
wobei im Verfahren die Stufe b) der Stufe a) vorangestellt werden kann.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sich an die Stufe c) d) anschließt, wonach das nach c) erhaltene Produkt mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,05 M bis 0,2 M versetzt und 14-28 Tage bei 200C -37'C stehen gelassen, den Aldehyd entfernt und das modifizierte Derivat der leichten Kette daraus entsprechend c) gewonnen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man an Stelle extrazellulären Tetanustoxins intrazelluläres Tetanustoxin verwendet, welches in bekannter Weise gewonnen und mit Trypsin behandelt worden ist.
4. Verfahren nach Anspruch ! und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man bei der Voranstellung der Stufe b) vor a) anstelle a) und d) nach c) die von denaturierendem Agenz freie leichte Kette des Tetanustoxins mit einem aliphatischen Mono- oder Dialdehyd der Kettenlänge von 1-6 Kohlenstoffatomen bis zu einer Aldehydkonzentration von 0,05 M bis 0,2 M versetzt und 14 - 28 Tage bei 20 bis 37°C stehen läßt, den Aldehyd entfernt und das modifizierte Derivat der leichten Kette entsprechend c) gewinnt.
5. Verwendung der nach Anspruch 1 -3 erhaltenen Derivate der leichten Kette des Tetanustoxins in Form eines Impfstoffs zur Tetanusprophylaxe.
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