DE3032488C2

DE3032488C2 -

Info

Publication number: DE3032488C2
Application number: DE3032488A
Authority: DE
Inventors: Tyoku Kawaguchi Saitama Jp Matuhashi; Mitsuko Tokio/Tokyo Jp Usui; Akio Higashikurume Tokio/Tokyo Jp Yamamoto; Masakazu Mitsuhashi; Shunsaku Okayama Jp Koyama
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1979-09-05
Filing date: 1980-08-28
Publication date: 1988-06-09
Also published as: GB2061955B; GB2061955A; FR2464074A1; FR2464074B1; JPS5639022A; CA1156553A; DE3032488A1; JPS578090B2; US4372883A

Description

Gegenstand des Patents ist ein Verfahren zum Herstellen von als Impfstoffe einsetzbaren Konjugaten durch kovalente Bindung von biologisch toxischen Substanzen an Saccharide. Die Gegenstände der Ansprüche 2 und 3 umfassen vorteilhaft Ausgestaltungen nach Anspruch 1.

Das Herstellen von Konjugaten durch kovalente Bindung von biologisch aktiven Substanzen an saure Polysaccharide (GB-PS- 11 74 854 und US-PS-40 03 792) oder Lipopolysaccharide (US-PS- 40 57 685) oder von toxischen Substanzen an funktionalisiertes Dextran (US-PS- 40 46 722, Spalte 1 Zeilen 14 bis 40) ist bekannt. Es ist auch vorgeschlagen worden, solche Konjugate (US-PS- 40 57 685, Beispiel 3A) oder deren Salze (GB-PS 11 74 854, Seite 2 Zeile 124 bis Seite 3 Zeile 45, US-PS-40 03 792, Spalte 3 Zeilen 26 bis 32) als Impfstoffe zu verwenden. Die Konjugate von Lipopolysacchariden und Antigenen zeigen eine verbesserte Immunantwort im Vergleich zu den einzeln verabreichten Kompo nenten (US-PS-40 57 685, Spalte 3 Zeilen 15 bis 17 und Bei spiel 8).

Im allgemeinen stellt man bisher Impfstoffe her, indem man hochreine biologisch giftige Substanzen mit einem Reagenz, wie z. B. Formalin oder β-Propiolacton, entgiftete oder inaktivierte, ohne ihre Immunisierungswirkung (immuno genicities) herabzusetzen, und man verwendete diese Impf stoffe zur Verhütung, Behandlung und klinischen Untersu chung verschiedener Krankheiten. Die Ergiebigkeit an Anti körpern, wie z. B. Immunoglobulin G und M, die Infektionen verhüten, wird im Vergleich zu jener der intakten biolo gisch giftigen Substanz stärker herabgesetzt, wenn man den Impfstoff auf übliche Weise herstellt, und ferner weckt die Verabreichung des Impfstoffs nachteilig die Fähigkeit Immunoglobulin-E-Antikörper zu erzeugen, der Allergien und/oder einen anaphylaktischen Schock bewirkt.

Es bestand daher ein Bedürfnis, Impfstoffe bereitzustellen, deren Toxizität erniedrigt ist und die die Bildung von Immun globulin-E-Antikörpern praktisch oder vollkommen vermeiden, ohne die Bildung von Immunglobulin-M- oder Immunglobolin-G- Antikörpern herabzusetzen. Diese Aufgabe wurde erfindungs gemäß durch ein Verfahren zum Herstellen von als Impfstoffe einsetzbaren Konjugaten durch kovalente Bindung von biolo gisch toxischen Substanzen an Saccharide gelöst, dadurch gekennzeichnet, daß man die bilogisch toxische Substanz kovalent an ein Saccharid aus der Gruppe Pullulan, Elsinan und deren partielle Hydrolysate mit einem mittleren Molekular gewicht von 500 bis 1 000 000 bindet und das resultierende Konjugat, in dem die biologisch toxische Substanz entgiftet ist, sammelt.

Wie man den Beispielen weiter unten entnehmen kann, bewirkt die erfindungsgemäße Konjugation der biologisch toxischen Substanz an die Polysaccharide Pullulan, Elsinan oder deren partielle Hydrolysate in vorteilhafter Weise, daß diese Substanzen entgiftet werden und die ursprüngliche Ergiebigkeit an Antikörpern, wie z. B. Immunglobulin G und Immunglobulin M, welche Infektionen verhüten, bemerkenswert erhöht wird, anderer seits jedoch die Erzeugung von Immunglobulin-E-Antikörpern, welche Allergien und/oder einen anaphylaktischen Schock bewir ken können, praktisch vermieden wird.

Biologisch giftige Substanzen, die man erfindungsgemäß ver wenden kann, und die im allgemeinen ein giftiges Protein, ein proteinartiges Toxin und/oder giftige Enzyme, wie z. B. Kollagenase oder Protease enthalten, sind beispielsweise Bakterientoxine, wie z. B. jene von Diphtherie, Tetanus, Botulinus, Gasgangrän und Cholera, die menschliche und/oder tierische Krankheiten bewirken, Zootoxine, einschließlich von Giften bzw. Schlangengiften, wie z. B. von Agkistrodon halys, Trimeresurus flavoviridis und Skorpionen, und Phyto toxine, wie z. B. Rizin.

Man kann beliebige Arbeitsmethoden erfindungsgemäß anwenden, sofern man dadurch die Bindung der Substanz an das Saccharid bewirkt. Beispielsweise bevorzugt man die Methode der Diazo kopplung, die Peptidmethode, die Alkylierungsmethode, die Vernetzungsmethode und die Methode der Disulfidkopplung.

Die Methode der Diazokopplung beinhaltet eine Kopplungsreak tion der Substanz mit einem diazotierten Saccharid, das einen oder mehrere aromatische Aminreste enthält, die man aus der aus p-Aminobenzyl-, m-Aminobenzyl-, p-Aminobenzoyl-, m-Aminobenzoyl-, m-Aminoanisoyl-, p-Aminobenzyloxymethyl-, 3-(p-Aminophenoxy)-2-hydroxylpropionyl- und 3-(p-Amino-m- methylanilino)-5-chlortrianzinylresten bestehenden Gruppe ausgewählt hat, und die man auf übliche Weise einführen kann.

Die Peptidmethode umfaßt eine Reaktion der genannten Substanz mit einem aktivierten Saccharid, wie z. B. mit BrCN aktivier ten Sacchariden, Zuckercarbonaten, Säureaziden, Säurehalo geniden. Carbodiimiden oder Isocyanatderivaten von Saccha riden, die einen Carboxylrest tragen.

Die Alkylierungsmethode beinhaltet eine Reaktion der genann ten Substanz mit einem Alkylhalogenidderivat des Sacchari des, z. B. einem Derivat, das einen funktionellen Rest aus der aus Chloracetyl-, Bromacetyl-, Jodacetyl- und Triazi nylhalogenidresten bestehenden Gruppe trägt.

Die Vernetzungsmethode führt man in Gegenwart der genannten Substanz und eines polyfunktionellen Reagenzes durch, wie z. B. Glutaraldehyd, Glyoxal, Bernsteindialdehyd, Hexamethy lendiisocyanat, Toluol-2,4-diisocyanat, Bisazobenzidin oder N,N′-Äthylenbismaleinimid.

Als Gewichtsverhältnis der biologisch giftigen Substanz zum Saccharid bei bzw. nach der Konjugationsreaktion kann man im allgemeinen ein Verhältnis im Bereich von etwa 1 : 1000 bis 1000 : 1, jedoch vorzugsweise im Bereich von etwa 1 : 100 bis 100 : 1 erfindungsgemäß anwenden. Erfindungsgemäß sind die biologisch giftige Substanz bzw. das Saccharid nicht auf einen Typ bzw. auf eine Art beschränkt: Man kann also eine Konjugation sowohl entweder unter Verwendung eines Typs an biologisch giftiger Substanz und zweier oder mehre rer Typen an Sacchariden oder eine Konjugation unter Verwen dung eines Typs an Saccharid undf zweier oder mehrerer Typen an biologisch giftigen Substanzen zur Herstellung eines Impfstoffgemischs als auch unter Verwendung zwei oder meh rerer Typen von biologisch giftigen Substanzen bzw. Saccha riden erfindungsgemäß anwenden.

Man kann beliebige Reaktionsbedingungen erfindungsgemäß anwenden, sofern man dadurch das erhaltene Konjugat der biologisch giftigen Substanz mit dem Saccharid entgiftet und diese Bedingungen bemerkenswert die Ergiebigkeit an Immunoglobulin-E-Antikörper vermindern, der Allergie und/ oder anaphylaktischen Schoch bewirkt, ohne im wesentlichen die Ergiebigkeit an den Antikörpern Immunoglobulin G und M zu vermindern, die Infektionen verhüten. Beispielsweise führt man die Konjugation bei einer Temperatur von etwa 0 bis 100°C und bei einem pH-Wert von etwa 3 bis 12 etwa 0,1 bis 50 h lang durch.

Das derart erhaltene Konjugat aus der biologisch giftigen Substanz mit dem Saccharid unterwirft man im allgemeinen Reinigungs- und Trennmethoden, wie z. B. Filtration, Waschen, Zentrifugieren, Aussalzen, Dialyse, Adsorption und Desorption mit einem Ionenaustauscher, Gelfiltration, Ionenaustausch chromatographie, Affinitätschromatographie oder Elektropho rese, und dem nachfolgenden Eineingen zu einem Sirup oder einer Flüssigkeit oder dem Trocknen zu einem Pulver, und man erhält als Produkt den Impfstoff.

Zur Desensibilisierung oder zur Induktion von menschlichem oder tierischem Interferon kann man den hergestellten Impf stoff vorteilhaft allein oder in Kombination mit anderen Substanzen verwenden, wie z. B. antiseptischen Mitteln oder Hilfsstoffen. Ferner besteht bei der Impfstoffherstellung gemäß dem Stand der Technik unter Verwendung von Formalin, bei der man i. allg. einen Zeitraum von 20 bis 90 Tagen zur Entgif tung braucht, weiterhin die Befürchtung, daß sich die poten tielle bzw. latente Toxizität wieder herstellen könnte. Ob wohl andererseits das erfindungsgemäße Verfahren im allge meinen nur einen Zeitraum von 1 bis 2 d zur Entgiftung be nötigt, ist das Produkt über lange Lagerzeiten sehr stabil, ohne daß man die genannte Befürchtungen haben müßte. Da durch werden die Maßnahmen im Kampf gegen das Überhandnehmen von Krankheiten beträchtlich erleichtert. Weil man ferner durch die erfindungsgemäße Impfstoffherstellung tödliche Allergien und anaphylaktischen Schock aufgrund von verunrei nigenden Proteinen verhütet, benötigt man nicht unbedingt eine hochgereinigte biologisch giftige Substanz als Ausgangs stoff. Demgemäß ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren eine direkte Entgiftung der Substanz ohne vorangehende Rei nigungsstufen, und man erzielt dadurch eine Kostenverminde rung und eine ausreichende Versorgung mit dem Impfstoff. Ferner wurde festgestellt, daß der Impfstoff, den man aus einem rohen Ausgangsstoff hergestellt hat, eine immunisie rende Aktivität aufweist, die mit jener vergleichbar ist oder viel höher ist als jene eines Impfstoffs, den man aus einem hochgereinigten Ausgangsstoff hergestellt hat.

Nachstehend wird die Erfindung durch Beispiele näher erläu tert.

Beispiel 1: Tetanustoxid-Impfstoff (a) Herstellung von Tetanustoxin

Tetanustoxin stellte man gemäß der Meßmethode her, die in Japan J. Med. Sci. Biol., Bd. 14, S. 121 (1961) beschrieben ist: Man impfte Harbard A 47-Stamm in 100 l P II-Medium ein und kultivierte danach 7 d lang die erhaltene Mischung bei 35°C.

Zu der überstehenden Flüssigkeit, die man durch Zentrifugie ren der Kulturbrühe erhalten hatte, gab man eine 50%ige (Gewicht/Volumen) wäßrige Zinkchloridlösung, extrahierte das Toxin mit einer wäßrigen Natriummonohydrogenphosphat lösung aus dem gebildeten Niederschlag, gab danach Ammonium sulfat zu dem Extrakt bis zu einer 40 bis 60%igen Sätti gung und sammelte danach den gebildeten Niederschlag. Man stellte eine rohe Tetanustoxinlösung her, indem man den Nie derschlag in destilliertem Wasser löste.

Danach reinigte man das rohe Toxin, indem man es auf Dextran gel- und Ionenaustauschersäulensysteme unter Verwendung von Sephadex G-100, bzw. DEAE-Zellulose aufbrachte, wodurch man ein hochgereinigtes Tetranustoxin mit einem Wert von 3000 Lf/mg Proteinstickstoff erzielte. Die Einheit von 1 Lf wird als die Toxinmenge bzw. Toxoidmenge definiert, die am schnell sten die Ausblockungsreaktion bewirkt, wenn man es mit einer Einheit Antitoxin mischt.

(b) Herstellung von Tetanustoxin/Pullulan-Konjugat

Eine Pullulanlösung, die man mit 400 ml Wasser und 5 g Pullu lan (mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 140 000) hergestellt hatte, stellte man auf einen pH-Wert von 10,7 mit 1 n Natriumhydroxid ein. Während man den pH- Wert auf diesem Niveau hielt, gab man zu der Mischung allmäh lich 3 g BrCN zu, setzte die Reaktion 1 h lang fort und ak tivierte das Pullulan, stellte danach den pH-Wert auf 5,0 mit 1 n Salzsäure ein und dialysierte danach die Reaktions mischung gegen gekühltes Wasser bei einem pH-Wert von 5,0.

Zur Lösung des aktivierten Pullulans gab man 200 ml der hochgereinigten Tetanustoxinlösung von Beispiel 1a und ließ danach die Konjugationsreaktion bei Raumtemperatur 24 h lang fortschreiten. Nach Beendigung der Konjugationsreaktion gab man zu der Reaktionsmischung 3 Volumina Aceton und sammel te den erhaltenen Niederschlag. Danach löste man den Nieder schlag in 0,01 m Phosphatpuffer (pH-Wert = 7,0, 0,01 Mol/l), zentrifugierte und entfernte unlösliche Stoffe. Die erhal tene überstehende Flüssigkeit unterwarf man einer Gelfiltra tion, sammelte die Fraktion, die das Toxin/Pullulan-Konjugat enthielt, filtrierte die Fraktion mit einem Membranfilter (Millipore) und erhielt einen Tetanustoxoid-Impf stoff in einer Ausbeute von etwa 70%, bezogen auf das einge setzte Toxinprotein.

Gemäß einer Methode des Standes der Technik stellte man einen Vergleichsimpfstoff her, indem man eine pharmacopoeische Formalinlösung zu 50 ml der hochgereinigten Tetanustoxin lösung bis zu einer Endkonzentration von 0,4% (Volumen/ Volumen) zugab und 3 Wochen lang die Mischung bei 37°C stehen ließ. Die Ausbeute betrug etwa 60%, bezogen auf das eingesetzte Toxinprotein.

(c) Verabreichungstest des Impfstoffs an Tieren

Der Verabreichungstest des erhaltenen Impfstoffs an Mäusen zeigte, daß die Toxizität des Toxins auf etwa 1/50 000 durch die Konjugation vermindert worden war, und seine tödliche Mindestdosis (MLD) betrug etwa 1 oder viel mehr pro Lf. Fer ner führte man eine intravenöse Injektion des Impfstoffs an Mäusen in einer Menge von 10 Lf des erfindungsgemäßen Impf stoffs und des Vergleichsimpfstoffs durch und wiederholte sie in der gleichen Dosierung 7 d später. 10 d nach der letzten Verabreichung entnahm man den Mäusen Blut und bestimmte den Gehalt an Antikörpern. Den Gehalt an den Antikörpern Immuno globulin G und M bestimmte man durch die passive Haemagglu tinationsreaktion (PHA), die in Japan J. Med. Sci. Biol., Bd. 28, S. 127 (1975) beschrieben ist, und den Gehalt an Immunoglobulin-E-Antikörper bestimmte man durch die passive Haut-Anaphylaxereaktion (PCA), die in "Life Science", Bd. 8, S. 813 (1969) beschrieben ist. Die Versuche zeigten, daß eine Verabreichung des erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffs zu einer etwa 12mal höheren Erzeugung der Antikörper Immunoglobulin G und M im Vergleich zu jener führte, die man mit dem Vergleichsimpfstoff erzielte, und daß man keiner lei Erzeugung von Immunoglobulin-E-Antikörper feststellen konnte.

Wie aus den genannten Ergebnissen ersichtlich ist, war das Konjugat als Tetanustoxoid-Impfstoff geeignet.

Beispiel 2: Diphterietoxoid-Impfstoff (a) Herstellung von Diphterietoxin

Diphterietoxin stellte man gemäß der Methode her, die in "Journal of Immunology", Bd. 40, SS. 21-32 (1941) beschrie ben ist: Park Williams Nr. 8-Stamm impfte man in 20 l Nähr medium von Mueller & Miller, kultivierte danach 48 h lang die erhaltene Mischung bei 35°C unter Rühren und aerobischen Bedingungen.

Nach dem Zentrifugieren der Kulturbrühe kühlte man die über stehende Flüssigkeit (pH-Wert 8,4) auf 4°C, gab allmählich eine 50%ige (Gewicht/Volumen) wäßrige Zinkchloridlösung bis zu einem pH-Wert von 6,0 zu, zentrifugierte danach die Mischung und sammelte danach den erhaltenen Niederschlag. Den Niederschlag löste man in 1/10 des Volumens an 25%iger (Gewicht/Volumen) Na₂HPO₄ · 12 H₂O-Lösung, ließ die erhaltene Lösung 1 h lang bei 35°C stehen und zentrifugierte.

Zu der erhaltenen überstehenden Flüssigkeit gab man 0,3% (Gewicht/Volumen) Aktivkohle und Ammoniumsulfat bis zur 40%igen Sättigung, ließ die Mischung 3 h lang stehen und filtrierte. Danach gab man zu dem Filtrat weiter Ammonium sulfat bis zu einer 60%igen Sättigung, ließ über Nacht stehen, zentrifugierte die Mischung und sammelte danach den Niederschlag. Den Niederschlag löste man in 700 ml eines 1/15 m Phosphatpuffers (pH-Wert = 8,0, 1/15 Mol/l) und unterwarf einer Ionenaustauschchromatographie und Gel filtration. Dadurch erhielt man ein Diphtherietoxin (etwa 3000 Lf/m).

(b) Herstellung des Diphtherietoxin/Pullulan-Konjugates

Eine Lösung von aktiviertem Pullulan, die man gemäß Beispiel 1b hergestellt hatte, stelle man auf einen pH-Wert von 0,8 mit 0,05 m Carbonatpuffer ein (0,05 Mol/l) und gab danach 200 ml Diphtherietoxinlösung zu. Die erhaltene Lösung unter warf man der Konjugationsreaktion bei Raumtemperatur 24 h lang, reinigte und trennte das gebildete Toxin-Pullulan-Konju gat wie in Beispiel 1b ab und erhielt einen Diphtherietoxoid impfstoff in einer Ausbeute von etwa 70%, bezogen auf das eingesetzte Toxinprotein.

Einen Vergleichsimpfstoff stellte man her, indem man eine pharmacopoeische Formalinlösung zu 50 ml Toxinlösung gemäß Beispiel 2a bis zu einer Endkonzentration von etwa 0,4% (Volumen/Volumen) zugab, 5 Wochen lang bei 37°C stehen ließ, 2 d lang dialysierte und durch ein Membranfilter (Millipore) filtrierte. Die Ausbeute betrug etwa 60%, be zogen auf das eingesetzte Toxinprotein.

(c) Verabreichungstest des Impfstoffs an Tieren

Die Verabreichung von 0,02 Lf des Vergleichsimpfstoffs, den man mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt hatte, an Meerschweinchen (mit einem Gewicht von etwa 300 g) ergab ihren Gifttod. Im Gegensatz dazu bewirkte die Verabreichung des Toxoidimpfstoffs (Konzentration pro Tier (c. a.) 500 Lf), den man erfindungsgemäß hergestellt hatte, keinen Todesfall. Die Bestimmung des Gehaltes an den Antikörpern Immunoglobu lin G und M gemäß der Methode, die in Beispiel 1c beschrieben wurde, zeigte, daß der Gehalt durch die Konjugation auf einen etwa 10mal höheren Wert als jener gestiegen war, den man bei dem Vergleich erzielt hatte, und daß man keinerlei Erzeugung von Immunoglobulin-E-Antikörper feststellen konnte. Ferner stellte man sowohl eine beträchtliche Menge an Immunoglobu lin-E-Antikörper als auch an den Antikörpern Immunoglobulin G und M nach der Immunisierung mit 1 ml Vergleichsimpfstoff plus 1 mg Aluminiumhydroxid-Hilfsstoff fest.

Wie aus den genannten Ergebnissen ersichtlich ist, und da man keinerlei Allergie oder anaphylaktischen Schock bei der Verabreichung des erfindungsgemäß hergestellten Impfstoffs befürchten mußte, was das Produkt als Diphtherietoxoid- Impfstoff geeignet.

Beispiel 3: Diphtherietoxoid-Impfstoff

Die Elsinan-Lösung, die man mit 200 ml heißem Wasser und 8 g Elsinan (durchschnittliches Molekulargewicht etwa 800 000) hergestellt hatte, kühlte man auf Raumtemperatur und gab danach 40 ml Cyanurchlorid (10% (Gewicht/Volumen)) in Dimethylformamid zu und ließ danach die Aktivierungsreak tion bei dieser Temperatur 2 h lang fortschreiten, während man den pH-Wert bei 7,0 hielt. Nach Beendigung der Reaktion dialysierte man die Reaktionsmischung gegen Wasser bei 4°C, während man den pH-Wert auf dem genannten Niveau hielt. Da durch erhielt man eine Lösung von aktiviertem Elsinan.

Zu der Lösung gab man 45 ml Diphtherietoxin-Lösung und be wirkte die Konjugationsreaktion, und man ließe die Reaktion 2 h lang bei einem pH-Wert von 9,0 und bei Raumtemperatur unter Rühren fortschreiten. Die Raktionsmischung reinigte und trennte man auf gleiche Weise wie in Beispiel 1b ab, und man erhielt den Toxoidimpfstoff in einer Ausbeute von etwa 60%, bezogen auf das eingesetzte Toxinprotein.

Die Untersuchung der Verabreichung des Toxoidimpfstoffs an Mäuse gemäß der Methode von Beispiel 1c zeigte, daß man das Toxin durch die Konjugation ausreichend entgiftet hatte. Ferner zeigte due Bestimmung des Gehalts der Antikörper Immunoglobulin G und M, daß der Gehalt durch die Konjuga tion auf einen etwa 10mal höheren Wert im Vergleich zu jenem erhöht wurde, den man mit dem Vergleichsimpfstoff von Beispiel 2c erhalten hatte; keinerlei Erzeugung von Immunoglobulin-E- Antikörper konnte man feststellen.

Die genannten Ergebnisse führen zu dem Schluß, daß das Kon jugat als Diphtherietoxoid-Impfstoff geeignet war.

Beispiel 4: Trimeresurus-flavoviridis-Toxoid-Impfstoff (a) Herstellung von Trimeresurus-flavoviridis-Toxin

Festes Trimeresurus-flavoviridis-Toxin löste man in 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. HCL-Puffer (pH-Wert = 8,5, 0,02 Mol/l Tris-HCl) bis zu einer Endkonzentration von etwa 5% (Gewicht/Volumen), zentrifugierte die erhaltene Mischung und entfernte unlösliche Stoffe. Die überstehende Flüssig keit verwendete man in den nachstehenden Versuchen als rohes Trimeresurus-flavoviridis-Toxin.

(b) Herstellung eines Konjugates von Trimeresurus-flavovi ridis-Toxin mit einem partiellen Pullulanhydrolysat

Eine Pullulanlösung, die man mit 110 ml Dimethylformamid und 5,2 g eines partiellen Pullulanhydrolysates (mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von etwa 10 000) unter Erwärmen hergestellt hatte, kühlte man auf Raumtemperatur, gab 10 ml Pyridin und 1,0 g p-Nitrobenzoylchlorid unter Rüh ren zu und ließ danach 17 h lang die erhaltene Lösung bei Raumtemperatur stehen. Zu der Reaktionsmischung gab man 2 Volumina n-Propylalkohol zu, sammelte den gebildeten Niederschlag und löste ihn in Dimethylformamid. Den genann ten Ausfällungsarbeitsgang wiederholte man 3mal, löste den schließlich erhaltenen Niederschlag in 100 ml einer 5%igen (Gewicht/Volumen) Natriumdithionitlösung und inkubierte da nach 30 min lang bei 80°C. Das Ergebnis entfärbte man mit Aktivkohle, und nach dem Filtrieren der Mischung gab man zu dem Filtrat 2 Volumina n-Propylalkohol. Den Niederschlag löste man in Wasser, dialysierte die erhaltene Lösung gegen Wasser über Nacht, kühlte danach das Dialysat auf weniger als 2°C und gab danach Salzsäure bis zu einer Endkonzentra tion von etwa 0,1 n zu. Zu der Lösung gab man ferner Natrium nitrit bis zu einer Konzentration von etwa 1% (Gewicht/Vo lumen) und diazotierte das partielle Pullulanhydrolysat. Nach Beendigung der Diazotierungsreaktion dialysierte man das Produkt gegen Wasser bei weniger als 4°C 2 h lang. Da durch erhielt man eine diazotiertes partielles Pullulanhydro lysat.

Zu der Lösung des diazotierten partiellen Pullulanhydrolysa tes gab man 20 ml Toxinlösung von Beispiel 5a und stellte danach den pH-Wert auf 8,5 mit Natriumcarbonat ein. Die Mi schung unterwarf man einer Diazokopplungsreaktion bei 4°C 2 h lang unter Rühren, reinigte und trennte die Reaktions mischung wie in Beispiel 1b ab und erhielt ein Konjugat von Trimeresurus-flavoviridis-Toxin mit dem partiellen Pul lulanhydrolysat in einer Ausbeute von etwa 60%, bezogen auf das eingesetzte Toxinprotein.

Einen Vergleichsimpfstoff stellte man durch Zugabe von 0,05% (Volumen/Volumen) einer pharmacopoeischen Formalinlösung zu der Toxinlösung von Beispiel 5a her, ließ 60 d lang bei 4°C stehen, inaktivierte das Toxin, zentrifugierte und filtrierte danach mit einem Membranfilter (Millipore). In diesem Fall betrug die Ausbeute etwa 50%, bezogen auf das eingesetzte Toxinprotein.

(c) Verabreichungstest des Impfstoffs an Tieren

Die Untersuchung der Verabreichung des erfindungsgemäßen Impfstoffs und des Vergleichsimpfstoffs an Mäuse gemäß der Methode von Beispiel 1c zeigte, daß man das Toxin durch die Konjugation ausreichend entgiftet hatte. Ferner zeigte die Bestimmung des Gehalts an den Antikörpern Immunoglobulin G und M eine Erhöhung des Gehalts auf einen etwa 5mal höheren Wert als den, den man mit dem Vergleichsimpfwert erzielt hatte; ferner war keinerlei Erzeugung von Immunoglobulin-E- Antikörper nach der Immunisierung mit dem erfindungsgemäß hergestellten Impfstoff aufgetreten. Im Gegensatz dazu stellte man bei einer Immunisierung mit dem Vergleichsimpfstoff so wohl eine bemerkenswerte Erzeugung an Immunoglobulin-E-Anti körper als auch der Antikörper Immunoglobulin G und M fest.

Aufgrund der genannten Ergebnisse und der Tatsache, daß die Verarbreichung des Konjugates keine Allergie und keinen anaphylaktischen Schock bewirkte, war das Konjugat als Tri meresurus-flavoviridis-Toxoid-Impfstoff vorteilhaft verwend bar.

Beispiel 5: Trimeresurus-flavoviridis-Toxoid-Impfstoff

Eine Elsinanlösung, die man mit 200 ml destilliertem Wasser und 10 g Elsinan (mit einem durchschnittlichen Molekularge wicht von etwa 200 000) unter Erwärmen hergestellt hatte, kühlte man auf Raumtemperatur, gab danach 5 g Hexamethylen diamin zu und stellte danach den pH-Wert auf 11,0 mit 1 n Natriumhydroxid ein. Danach gab man zu der Lösung allmäh lich 5 g BrCN unter Rühren und hielt die Temperatur unterhalb von 20°C durch Zugabe von Eis. Die Reaktion stetzte man 30 min unter Rühren fort, dialysierte danach die Reaktionsmischung gegen destilliertes Wasser bei 4°C 1 h lang und erhielt eine Lösung von aktiviertem Elsinan.

Zu der Lösung des aktivierten Elsinans gab man 2 ml einer 25%igen (Gewicht/Volumen) wäßrigen Glutaraldehydlösung, 60 ml rohe Trimeresurus-flavoviridis-Toxin-Lösung von Bei spiel 5a und 10 ml eines 1 m Acetatpuffers (pH-Wert = 5,0, 1 Mol/l), ließ danach die Konjugation bei 4°C 24 h lang unter Rühren fortschreiten, gab Glycin bis zu einer Konzentration von etwa 1 Mol/l zu und ließ danach 24 h lang bei Raumtemperatur stehen, wodurch man die nicht umgesetzten aktiven Reste blockierte. Danach zentrifugierte man die Reak tionsmischung, wandte auf die erhaltene überstehende Flüssig keit eine Gelfiltration an, sammelt die Fraktion, die das Toxin/Elsinan-Konjugat enthielt, engte danach die Fraktion ein und filtrierte danach das Produkt mit einem Membranfil ter (Millipore) und erhielt einen Trimeresurus-flavoviridis- Toxoid-Impfstoff in einer Ausbeute von etwa 50%, bezogen auf das eingesetzte Toxinprotein.

Die Untersuchung der Verabreichung des hergestellten Impf stoffes an Mäuse gemäß der Methode von Beispiel 1c zeigte, daß man das Toxin durch die Konjugation ausreichend entgiftet hatte. Ferner stellte man nach der Bestimmung des Gehaltes an den Antikörpern Immunoglobulin G und M fest, daß der Gehalt durch die Konjugation auf einen etwa 8mal höheren Wert als jener erhöht war, den man mit dem Vergleichsimpf stoff von Beispiel 5b erzielt hatte; ferner konnte man keiner lei Erzeugung von Immunoglobulin-E-Antikörper feststellen.

Demgemäß war das Konjugat als Trimeresurus-flavoviridis- Toxoid-Impfstoff geeignet.

Beispiel 6: Entgiftetes Rizin (a) Herstellung von Rizin

Eine rohe Rizinlösung stellte man her, indem man mit einer 0,85%igen (Gewicht/Volumen) Kochsalzlösung ein Pulver von entfetteten Rizinussamen extrahierte, den Extrakt zentrifu gierte, die erhaltene überstehende Flüssigkeit mit Ammonium sulfat bei einer Sättigung von 33 bis 50% und einem pH-Wert von 8,0 aussalzte und schließlich den Niederschlag in Wasser löste.

(b) Herstellung des Rizin/Pullulan-Konjugates

Zu einer Lösung von aktiviertem Pullulan, die man gemäß der Methode von Beispiel 1b hergestellt hatte, gab man 200 ml rohe Rizinlösung, die man gemäß der Methode von Beispiel 8a hergestellt hatte, unterwarf die erhaltene Lösung der Konju gationsreaktion bei Raumtemperatur 24 h lang, erhielt ein Rizin/Pullulan-Konjugat und reinigte und trennte das gebil dete Konjugat danach gemäß der Methode von Beispiel 1b ab. Dadurch erhielt man ein entgiftetes Rizin in einer Ausbeute von etwa 40%, bezogen auf das eingesetzte Rizinprotein.

(c) Verabreichungstest des entgifteten Rizins an Tieren

Die Untersuchung der Verabreichung des entgifteten Rizins an Mäuse gemäß der Methode von Beispiel 1c zeigte, daß man das Rizin durch die Konjugation ausreichend entgiftet hatte. Ferner ergab eine wiederholte intravenöse Injektion des ent gifteten Rizins bei Mäusen keinen anaphylaktischen Schock.

Die genannten Ergebnisse lassen die Verwendung des Konjuga tes als Desensibilisierungsmittel oder als Interferon-In duktionsmittel möglich erscheinen.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen von als Impfstoffe einsetzbaren Konjugaten durch kovalente Bindung von biologisch toxischen Substanzen an Saccharide, dadurch gekennzeichnet, daß man die biologisch toxische Substanz kovalent an ein Saccharid aus der Gruppe Pullulan, Elsinan und deren partielle Hydrolysate bindet, die ein mittleres Molekulargewicht von 500 bis 1 000 000 aufweisen, und das resultierende Konjugat, in dem die biologisch toxische Substanz entgiftet ist, sammelt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich net, daß man als biologisch giftige Substanz eine oder mehrere der Substanzen aus der aus Bakterientoxinen einschließ lich jenen von Diphtherie, Tetanus, Botulinus, Gasgangrän und Cholera; Zootoxinen einschließlich Schlangengiften, wie z. B. jenen von Agkistrodon halys, Trimeresurus flavoviridis und Skorpionen; und Phytotoxinen einschließlich von Rizin bestehen den Gruppen verwendet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekenn zeichnet, daß man die kovalente Bindung bei einem Gewichtsver hältnis der genannten Substanz zum Saccharid im Bereich von 1 : 100 bis 100 : 1, einem pH-Wert im Bereich von 3 bis 12 und einer Temperatur im Bereich von 0 bis 100°C 0,1 bis 50 h lang vornimmt.