CH644521A5

CH644521A5 - Therapeutisches immunosuppressives mittel und verfahren zu dessen herstellung.

Info

Publication number: CH644521A5
Application number: CH124078A
Authority: CH
Inventors: David Harvey Katz
Original assignee: David Harvey Katz
Priority date: 1977-02-03
Filing date: 1978-02-03
Publication date: 1984-08-15
Also published as: SE464616B; US4191668A; ZA78613B; MX6266E; BE863656A; GB1599454A; NO153419C; CA1118347A; AU515181B2; NO153419B; SE7801268L; DE2804457C2; DK155174C; FR2379287B1; FI780312A; NO780366L; DE2804457A1; DK49178A; LU78997A1; JPH0428689B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein therapeutisches immunosuppressives Mittel, das in der Lage ist, eine spezifische immunologische Toleranz gegenüber einem Antigen zu induzieren. Diese Toleranz wird dabei induziert, indem die Antikörperresponse unterdrückt wird. In den erfindungsge-mässen immunosuppressiven Mitteln ist das Antigen vorzugsweise ein Allergen oder ein Auto-Antigen.

Die Grundfunktion von Organen, Zellen und Molekülen, die das Immunsystem umfassen, ist diejenige, körperfremde Substanzen zu erkennen und zu beseitigen. Diese körperfremden Substanzen werden durch eine Reaktion zwischen den Fremdsubstanzen und den Antikörpern, welche aufgrund der körperfremden Substanzen gebildet wurden, also in Response auf die körperfremde Substanz gebildet wurden, eliminiert. Im allgemeinen läuft dieser Wirkungsmechanismus des Immunsystems wirksam und ohne irgendwelche nachteilige Einflüsse auf das Individuum ab. In bestimmten Fällen kann jedoch eine Störung auftreten, die zu pathogenen Erscheinungen führen kann, wie zum Beispiel einem unkontrollierten Ansprechen (allergische Störungen) oder einem abnormalen Ansprechen (Autoimmunkrankheiten). Die Krankheitsentstehung, also die Pathogenese dieser beiden genannten Störungen, ist direkt oder indirekt mit der Bildung von Antikörpern verbunden, und zwar entweder Antikörper gegen Antigene (Allergene) der Umgebung oder gegen Auto-Antigene. Da ferner die Wirkung des Immunsystems darin besteht, Fremdsubstanzen zu erkennen und aus dem Organismus zu eliminieren, ist auch die Transplantation von gesundem Gewebe und gesunden Organen von einem Spender auf einen genetisch nichtidentisch aufgebauten Empfängerorganismus, also einen allogenen Empfängerorganismus, schwierig zu erreichen, weil von dem Empfänger-45 Organismus die Transplantate wieder abgestossen werden (Allograftreaktion).

Wenn ein Individuum in einen sogenannten «geänderten Zustand» kommt, und zwar aufgrund der Tatsache, dass es mit einem Antigen in Berührung kommt und gegen dieses so Antigen Antikörper ausbildet, dann kann ein nachfolgendes in Berührung kommen dieses Individuums mit dem genannten Antigen oder einer strukturell ähnlichen Substanz zu einer pathologischen Reaktion führen. Derartige Individuen werden als überempfindlich oder hypersensitiv gegen ein 55 oder mehrere spezifische Reaktionen hervorrufende Antigene bezeichnet. Wenn diese Individuen das entsprechende Antigen aufnehmen, beispielsweise einatmen oder über den Magen-Darm-Trakt aufnehmen, dann führt dies zu starken allgemeinen Körperreaktionen, wie zum Beispiel Heuschnup-60 fen, Asthma oder Ausschlägen. Die Neigung, solche Formen der Allergien zu entwickeln («Atopie»), ist vererbbar.

Eine erste Antikörperreaktion oder Antikörperresponse gegenüber einem Antigen ruft eine geringere und etwas unterschiedliche Antikörperreaktion oder Antikörperresponse es hervor, als die Reaktion, die hervorgerufen wird, wenn das Individuum nachfolgend wieder der Einwirkung des Antigens unterworfen wird. Wenn das Individuum zum ersten Mal mit einem Antigen in Berührung kommt, dann führt

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dieses Antigen zu der primären Reaktion oder primären Response. Sobald die Antikörperspiegel bei der primären Response abgesunken sind, sogar bis zu einem solchen Punkt, dass sie nicht mehr länger feststellbar sind, führt eine nachfolgende Berührung mit dem gleichen Antigen üblicherweise zu einer verstärkten zweiten Reaktion, der sogenannten sekundären Reaktion oder anamnestischen Response oder Reaktion.

Das Auftreten dieser Atopie ist mit der Bildung einer Art eines Gewebe sensibilisierenden IgE-Antikörpers innerhalb des Individuums verbunden, wobei dieser IgE-Antikörper Reagin genannt wird. Die fraglichen IgE-Antikörper besitzen eine hohe Affinität gegenüber Rezeptorzellen, die in verschiedenen Körpergeweben anwesend sind. Die Rezeptoren befinden sich auf Fresszellen, welche die englische Bezeichnung «mast cell» haben, die in naher Umgebung von Kapillaren in den verbindenden Geweben im ganzen Körper zu finden sind, und ferner auch auf basophilen Leukocyten (Blutzellen). Die Fresszellen und die basophilen Leukocyten weisen einen hohen Gehalt an pharmakologisch aktiven Mediatoren auf, wie zum Beispiel Histamin, Serotonin (5-Hy-droxytryptamin) und Kininen (basische Peptide), wobei diese Mediatoren in cytoplasmischen Körnern konzentriert sind. Wenn die IgE-Antikörper, die auf den Fresszellen und den Basophilen fixiert sind, mit Antigenen in Berührung kommen, dann kann dies zu einer Auslösung der Vernetzung der IgE-Antikörper führen. Diese Vernetzung führt selbst wieder zu einer Degranulation der Fresszellen und der Basophilen, welche chemische Mediatoren freisetzt, und welche zu den Erscheinungen der allergischen Reaktion führt, die bereits weiter oben beschrieben wurde.

Während das Auftreten von Atopie von der Bildung von an Zellen gebundenen IgE-Antikörpern abhängig ist, so ist ein weiterer Typ der Antikörper, der von Wichtigkeit für das Immunsystem ist, derjenige der IgG-Klasse. Diese IgG-An-tikörper werden als zirkulierende Antikörper oder «blockierende Antikörper» bezeichnet. Die IgG-Antikörper sind auch in der Lage, sich mit Antigenen zu kombinieren. Diese Kombination kann die Antigene inaktivieren, indem die Fähigkeit der Antigene, mit den zellgebundenen IgE-Antikörpern zu reagieren, blockiert werden kann, und auch die nachfolgende Vernetzung der IgE-Antikörper.

Ein übliches Verfahren zur Behandlung von allergischen Störungen besteht darin, dass man die zu behandelnde Person immunisiert oder desensibilisiert, indem man wiederholte Injektionen von kleinen und ansteigenden Mengen des Antigens in bestimmten Zeiträumen verabreicht, beispielsweise wöchentlich, und zwar unter Einhaltung von solchen Dosierungsniveaus, dass die Auslösung der Degranulierung der Fresszellen oder der Basophilen vermieden wird. Man nimmt an, dass wiederholte Injektionen das Niveau der Blockierung der IgG-Antikörper erhöhen, jedoch nicht das Niveau der zellgebundenen IgE-Antikörper.

Diese Annäherung durch die Desensibilisierung weist eine Anzahl von Nachteilen auf. Die therapeutischen Vorteile können schwierig übereinstimmend und konsequent erreicht werden, und die Behandlungsmethodik ist sehr langwierig. Da ausserdem das Inberührungbringen mit Antigen aus der Umgebung eine nachfolgende Bildung von IgE-An-tikörpern hervorruft, ist die Möglichkeit einer IgE-Antigen-reaktion und einer nachfolgenden IgE-Vernetzung immer gegeben.

Eine Autoimmun-Krankheit ist ein pathologischer Zustand, der durch eine Autoimmun-response oder Autoimmunreaktion hervorgerufen wird, in welcher ein Individuum immunologisch durch Bildung von Antikörpern auf ein Auto-Antigen reagiert. Autoimmunerscheinungen können praktisch jeden Teil des Körpers angreifen, und im allgemeinen führen sie zu einer Reaktion zwischen Auto-Antigen und IgG-Antikörper. Typische Beispiele für Autoimmun-Krankheiten sind solche, an denen die Membranen der Schilddrüse (Thyroidmembranen), der Magenschleimhaut, der Nebennieren, der Haut, der roten Blutkörperchen und Gelenkskörpermembranen (Synovial-membranen) teilnehmen.

Für einige Arten der Autoimmun-Krankheiten wurden nichtspezifische immununterdrückende Behandlungen angewandt, wie zum Beispiel Ganzkörper-Bestrahlungen mit Röntgenstrahlung oder die Verabreichung von cytotoxi-schen Wirkstoffen. Derartige Behandlungen führten zu einem beschränkten Erfolg. Die Nachteile von solchen Behandlungen bestehen in der Giftigkeit der verwendeten Mittel und in der erhöhten Wahrscheinlichkeit des Auftretens verschiedener Krebsarten, insbesondere Lymphomen und Sarcomen der Retikulumzellen (Retikulumzellen-sarcom oder Retothelsarcom), die als Folge derartiger therapeutischer Massnahmen auftreten können. Ausserdem führt die Verwendung von nichtspezifischen Mitteln zur chronischen Immunosuppression zu einer starken Erhöhung der Empfindlichkeit des Patienten gegenüber schweren Krankheiten, die von Pilzen, Bakterien oder Viren der Umgebung hervorgerufen werden, wobei unter normalen Umständen diese Mikroorganismen für den Patienten keine Probleme darstellen würden.

Wenn man den Stand der Technik auf dem Gebiet der Immunologie betrachtet, dann ist es wichtig, den Unterschied zwischen einem Antigen und einem Hapten zu erkennen. Haptene sind spezifische, proteinfreie Teile von vollständigen Antigenen, die zwar in vitro reaktiv sind, jedoch keine oder nur eine geringe Antikörperreaktion hervorrufen. Wie bereits weiter oben definiert wurde, führen Antigene zur Bildung von Antikörpern und sie reagieren auch spezifisch mit dem gebildeten Antikörper. Im Gegensatz dazu sind Haptene als ein kleines Molekül definiert, welches selbst die Antikörperbildung nicht stimulieren kann, welches sich jedoch mit einem einmal gebildeten Antikörper vereinigen wird. Ferner induzieren Haptene in der Regel keine Zellimmunität und sie können nicht als Trägermaterial für andere Haptene dienen, und Haptene induzieren eine Antikörperbildung nur dann, wenn sie auf einem immunogenetischen Trägermaterial eingeführt werden. Eine Hapten-Antikörperreaktion hat eine strikte Trägermaterialspezifität. Eine sekundäre Reaktion auf das Hapten kann nur hervorgerufen werden, wenn es auf dem gleichen Trägermaterial verabreicht wird. Wenn jedoch das Hapten auf einem immunologisch nichtverwandten Trägermaterial eingeführt wird, dann zeigt das Individuum keine immunologische Erinnerung gegenüber diesem Hapten, und es wird eine typische primäre Reaktion stattfinden.

Da die Kapazität der sekundären Reaktion während vieler Jahre bestehen bleiben kann, kann diese zu einer langdauernden Immunität führen.Die primäre Reaktion ist weniger gut schützend, weil die Antikörper langsamer auftreten. In einer Reihe von Veröffentlichungen wurde ein System einer verlängerten Hapten-spezifischen Knochenmark-abge-leiteten Zelltoleranz unter Verwendung von D-Glutamin-säure: D-lysin-copolymeren, an welche geeignete Haptene gebunden waren, gezeigt und charakterisiert. Es sei in diesem Zusammenhang auf die folgenden Veröffentlichungen hingewiesen:

J. Exp. Med., Band 134, Seiten 201-223 (1971); Band 136, Seiten 1404-1429 und 426-438 (1972); Band 138, Seiten 312-317 (1973); Band 139, Seiten 1446-1463 (1974); und Proc. Nati Acad. Sci. U.S.A. Band 71, Seiten 3111-3114.

Diese Untersuchungen zeigten Fortschritte bei der Induzierung einer Toleranz bei den vom Knochenmark abge5

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leiteten Lymphocytvorläufern von Antikörper bildenden Zellen der Antikörperklassen, welche gegenüber dem 2,4-Di-nitrophenylhapten spezifisch waren. Das 2,4-Dinitrophenyl wird in der Folge als DnP abgekürzt. Bei diesen Untersuchungen wurden Konjugate von DnP und D-Glutamin-säure: D-Lysin verwendet, die in der Folge auch als D-GL abgekürzt werden.

Neue Untersuchungen zeigten, dass eine Toleranz gegenüber Nucleosiddeterminanten erhalten werden konnte, indem man Konjügate von Nucleosiden und D-Glutamin-säure : D-Lysin verwendete. Es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung in J. Immunol., Band 114, Seiten 872-876 (1975) hingewiesen. Die Nucleosid-Arbeit handelte von der Einführung einer Toleranz gegenüber einer Mischung von Nucleosiden, welche aus einer heterocycli-schen Base und einem Zucker mit 5 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind. Diese Arbeit ist ähnlich der Einführung einer Toleranz gegen 2,4-Dinitrophenyl-D-glutaminsäure : D-ly-sin mit der Abkürzung DNP-D-GL.

Während diese immunologischen Studien von Interesse beim Zeigen der Unterdrückung einer Antikörper-response gegen solche chemischen Mittel sind, die als einzige Determinanten wirken, wenn sie an geeignete nichtimmunologische Träger gekuppelt sind, so wird dennoch darin keine im-munotherapeutische Anwendung auf Antigene beschrieben. Geeignete, nichtimmunologische Träger sind beispielsweise D-Glutaminsäure : D-lysin-copolymere mit der Abkürzimg D-GL-Copolymer.

Die darin gegebenen experimentellen Resultate, die sich auf eine Penicillinallergie beziehen, und die Verwendung der hauptsächlichen antigenetischen Determinante, nämlich des Benzylpenicilloyles mit der Abkürzung BPO, sind in der VerôSÉfentlichung Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., Band 73, Nr. 6, Seiten 2091-2095 (1976) beschrieben.

Ziel der vorliegenden Erfindung war es, ein neues therapeutisches immunosuppressives Mittel zur Verfügung zu stellen, das spezifisch ist und nur die Antikörperreaktion gegenüber dem angreifenden oder störenden Antigen unterdrückt. Mit Hilfe dieser therapeutischen immunosuppressiven Mittel soll die Induzierung eines lang anhaltenden Zu-standes einer spezifischen immunologischen Toleranz möglich sein und dadurch die Unterdrückung der Bildung von Antikörpern gegen spezifische Antigene.

Überraschenderweise zeigte es sich, dass die angestrebten Ziele mit einem Mittel erreicht werden können, das ein Konjugat eines bestimmten Copolymeren mit einem Antigen enthält.

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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher ein therapeutisches immunosuppressives Mittel, das in der Lage ist, eine spezifische immunologische Toleranz gegenüber einem Antigen zu induzieren, indem die Antikörperresponse unterdrückt wird und das dadurch gekennzeichnet ist, dass es als Wirkstoff ein Konjugat eines D-Glutaminsäure : D-Lysin-copolymeren und eines Antigens enthält.

Vorzugsweise ist die Antigenkomponente der erfindungs-gemässen immunosuppressiven Mittel entweder ein Allergen oder ein Auto-Antigen.

In der bisher zur Bekämpfung von Allergien, die durch Umweltstoffe hervorgerufen werden, eingesetzten Antigenextrakten, war nur eine «blockierende» Desensibilisierungs-15 annäherung möglich, und auch bei der Behandlung von Auto-Immunkrankheiten wurde lediglich eine nichtspezifische Immunosuppression erreicht und sowohl bei der Behandlung von Allergien als auch bei der Behandlung von Auto-Immunkrankheiten traten die weiter vorne eingehend 20 erläuterten Nachteile auf. Im Gegensatz dazu ist es jetzt mit den erfindungsgemässen neuen therapeutischen immunosuppressiven Mitteln möglich, einen lang anhaltenden Zustand einer spezifischen immunologischen Toleranz zu erreichen und damit die Unterdrückung der Bildung von An-25 tikörpern gegen spezifische Antigene.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung des erfindungsgemässen therapeutischen immunosuppressiven Mittels. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man D-Glutaminsäure : D-Lysin-copolymer mit einem Antigen umsetzt, wobei sich ein Konjugat des D-Glutaminsäure : D-Lysin-copolymeren und des Antigens bildet und diesen Wirkstoff zu dem therapeutischen immunosuppressiven Mittel formuliert Zur Herstellung bevorzugter erfindungsgemässer Mittel wird ein D-35 Glutaminsäure : D-Lysin-copolymere verwendet, welches ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von 34 000 bis 64 000 besitzt und ein molares Verhältnis von Glutaminsäure zu Lysin von 60 : 40 aufweist. Als Antigen wird zur Herstellung des Konjugates vorzugsweise ein Aller-40 gen oder ein Auto-Antigen verwendet.

Wenn das in den erfindungsgemässen Mitteln im Konjugat enthaltene Antigen ein Allergen ist, dann sind typische Beispiele für derartige Allergene die folgenden: Benzylpeni-45 cilloyl, also der Acylrest der Benzylpenicillinsäure, der die folgende Formel aufweist:

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C6H5-CH2-C

und ferner Insulin, Obalbumin, Lactalbumin, Graspollen, wie Bermudagraspollen, Timothygraspollen, Orchard-graspollen (Obstgartengraspollen) und Kombinationen von Graspollen, Pollen des Unkrautes mit der englischen Bezeichnung Ragweed, Ragweed-Antigen E, Birkenbaumpollen, Bienengift, Schlangengift, Teile, die von Pferden stam-6s men (horse dander) wie zum Beispiel Pferdehaare, Katzenepithel, Schellfisch (Haddock), Hausstaubmilbe, Chrysan-themum-leucanthemum, Alternaria-tenuis, Trypsin, Chymo-trypsin, trockenes verfaultes Material, Backhefe, Tetanusto-

xoid, Diphtherietoxin und Ficin (ein proteolytisches Enzym, das im Latex von tropischen Bäumen der Gattung Ficus, Untergattung Pharmacosyce und Moraceae, vorkommt).

Wenn die erfindungsgemässen immunosuppressiven Mittel als Antigenkomponente ein Auto-Antigen enthalten, dann sind typische Beispiele für derartige Auto-Antigene die folgenden:

Nucleinsäuren, Oligodeoxynucleotide, Thyroglobulin, Oberfläche oder Cytoplasmen der Thyroidzellen (Zellen der Schilddrüse), Parietalzellen (wandständige Zellen, Scheitelbeinzellen), Adrenalzellen (Nebennierenzellen), Epidermal-zellen, Uveazellen (Zellen der Gefässhaut des Augeninneren), Grundmembranzellen (basement membrane cell), Oberfläche der roten Blutkörperchen (red cell), Oberfläche der Plättchenzellen, Muskelzellen, Thymus-myoid-zellen, Mitochondrien (dies sind längliche oder ovale Zellorgane, die von einer Doppelmembran begrenzt sind), Zellen von Sekretleitern, Desoxyribonucleinsäure-protein, Acetylcholin-rezeptor-substanzen, Insulin und andere normale Hormone und Gewebefaktoren.

Bei der Verwendung der erfindungsgemässen therapeutischen immunosuppressiven Mittel erfolgt die Induzierung einer immunologischen Toleranz gegenüber spezifischen angreifenden Antigenen. Das Antigen wird an ein D-Glutaminsäure : D-lysin-copolymer gekuppelt. Die immunologische Toleranz, die erreicht werden kann, kann als spezifischer nichtansprechender Zustand (unresponsiver Zustand) definiert werden, wobei bei diesem spezifischen nichtansprechenden Zustand das Lebewesen keine Antikörper als Reaktion der Einführung des Antigenes in das Lebewesen bildet. Die Toleranz, die durch die Verabreichung des erfindungsgemässen immunosuppressiven Mittels erreicht, also induziert werden kann, konnte durch die folgenden Erscheinungen bestätigt werden:

1. Die Unfähigkeit des Lebewesens, das mit Antigen, D-Glutaminsäure : D-lysin behandelt wurde, eine primäre An-tigen-spezifische Antikörperreaktion zu entwickeln.

2. Die Fähigkeit des Antigen-D-Glutaminsäure : D-lysin-konjugates eine ablaufende Anti-Antigen-Antikörperreak-tion aufzuheben.

3. Die Unfähigkeit eines Lebewesens, welches vorher mit einem Antigen vorbehandelt worden war, eine sekundäre Anti-Antigen-reaktion zu entwickeln, nachdem eine Behandlung mit dem Antigen-D-Glutaminsäure : D-lysin-konjugat erfolgt war.

Die Unterdrückung wird erreicht, indem man dem Lebewesen oder Individuum eine Menge an dem Antigen-D-Glutaminsäure : D-lysin-konjugat verabreicht, welche einen wirksamen unterdrückenden Effekt auf die spezielle Antikörperreaktion hat. Unter dem Ausdruck «Lebewesen» oder «Individuum» sind in der vorliegenden Beschreibung Menschen oder Versuchstiere zu verstehen, die ein Modell für entsprechende Erscheinungen bei Menschen veranschaulichen. Medizinische Indikationen für die Verwendung der erfindungsgemässen Konjugate sind beliebige Zustände, bei welchen es erwünscht ist, in dem Lebewesen die Antikörperreaktion auf ein spezielles Antigen zu unterdrücken. Unter dem Ausdruck «Unterdrückung der Antikörperreaktion» oder unter irgendwelchen entsprechenden anderen Ausdrücken, wie «Unterdrückung der Antikörper-response» versteht man ein bedeutendes Ansteigen in der immunologischen Toleranz gegenüber einem speziellen Antigen. Diese Unterdrückung wird erreicht, indem man an das Individuum eine Einzeldosis oder eine Reihe von Einzeldosierungen verabreicht, welche die Antikörperreaktion unterdrücken oder vermindern. Obwohl die zu verabreichende Menge von In644 521

dividuum zu Individuum verschieden ist und auch von Indikation zu Indikation unterschiedlich ist, so kann sie dennoch leicht vom Fachmann bestimmt werden, ohne dass er unzumutbar viele Versuche durchführen muss. Eine subkutane Verabreichung ist bevorzugt. Dosierungsformen für die Verabreichung des Konjugales können nach in der pharmazeutischen Wissenschaft bekannten und anerkannten Methoden hergestellt werden.

Hypersensitive Reaktionen gegenüber Medikamenten, wie zum Beispiel Penicillin, sind eine übliche allergische Krankheit bei Menschen. Die Mechanismen, die auftreten und anhand des Penicillins veranschaulicht werden, können als Modell für Allergien ganz allgemein betrachtet werden. Um eine gründliche Untersuchung der Unterdrückung einer spezifischen Antigen-Antikörperreaktion durchzuführen, wurde die Penicillinallergie als Modell verwendet.

Penicillin ist ziemlich unbeständig, und die meisten seiner Lösungen enthalten mindestens kleine Mengen an Penicil-linat, ein hochreaktives Derivat, welches Penicilloyl bildet und andere Substituenten von Aminogruppen und Sulfhy-dralgruppen der Proteine. Penicillin G, welches sich von kristallinem Kalium-Benzylpenicillin G ableitet (dieses kann als KPG abgekürzt werden), ist das am häufigsten verwendete Penicillin. Bei diesem Penicillin ist eine Benzylgruppe an die Carboxylgruppe gebunden. Der Teil des Penicillins G, der hauptsächlich antigenetisch bestimmend ist, ist das Benzylpenicilloyl, das in der Folge auch mit BPO abgekürzt wird. Dieser hauptsächlich Antigen bestimmende Teil des Penicillins G ist der beschränkte Teil des Antigenmoleküles, der die Spezifizität der Antikörper-Antigenreaktion bestimmt.

Das Verfahren zur Herstellung der Antigen-D-Glutaminsäure : D-lysin-konjugate wird zweckmässigerweise durchgeführt, indem man das D-Glutaminsäure : D-lysin-copolyme-re in einer alkalischen Lösung auflöst und die alkalische Lösung mit etwa 2 bis 3 Moläquivalenten des Antigens umsetzt. Die Reaktionsmischung wird bei einer Temperatur im Bereich von etwa 10 bis 30 °C während etwa 1 Stunde belassen. Der pH-Wert der Reaktionsmischung wird auf einen Bereich von etwa 10 bis 12 eingestellt, indem man ein alkalisches Material, beispielsweise Kalilauge oder Natronlauge, zugibt. Die Antigen-Konjugate werden nach bekannten Arbeitsverfahren gewaschen und gereinigt, beispielsweise durch Dialyse. Geeignete Copolymere, die ein Molekulargewicht von etwa 34 000 bzw. 50 000 bzw. 64 000 besitzen, und die ein molares Verhältnis von Glutaminsäure zu Lysin von 60 : 40 aufweisen, sind von der Firma Miles Laboratories, Inc., 1127 Myrtle Street, Elkhart, Indiana, 46 514, erhältlich.

Um die immunospezifischen Eigenschaften der Konjugate zu bestimmen, wurden hohe Titer von IgE-Antikörperre-aktionen, IgG-Antikörperreaktionen und IgM-Antikörper-reaktionen gegen ein Antigen bei Mäusen hervorgerufen, und zwar indem man an die Mäuse durch intraperitoneale Injektion ein Antigen-Schlüsselloch-napfschnecken-hemo-cyanid mit der Abkürzung KLH verabreichte. Die Menge an Antikörper, die als Reaktion auf diese Injektion gebildet wurde, wurde dann bestimmt, indem man die in der Folge beschriebenen Testverfahren durchführte.

Die Behandlung derartiger Mäuse mit einem erfindungsgemässen Mittel, das als Wirkstoff ein Konjugat einer D-Glutaminsäure : D-Lysin-copolymeren und des Antigens enthält, wurde entweder vor oder nach der primären Immunisierung durchgeführt. Diese Behandlung führte zu einer bedeutenden Unterdrückung der nachfolgenden Anti-An-tigen-Antikörperreaktion der Klassen IgE und IgG, und zwar bestimmt sowohl beim humoralen Spiegel als auch beim zellularen Spiegel.

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Beschreibung der Testverfahren und Prüfverfahren

I. Herstellung der Benzylpenicilloyl-Träger-Konjugate (BPO-Träger-Konjugate)

a) Herstellung von Benzylpenicilloyl-Schlüsselloch-Napfschnecken-hemocyanin und Benzylpenicilloyl-Rinder-serumalbumin:

Das Benzylpenicilloyl, welches in der Folge mit BPO abgekürzt wird, wurde an das Hemocyanin der Schlüsselloch-Napfschnecke mit der englischen Bezeichnung (keyhole lim-pet) gekoppelt, wobei für das Schlüsselloch-Napfschnecken-Hemocyanin in der Folge die Abkürzung KLH verwendet wird. Ferner wurde das BPO auch an das Rinderserumalbumin gekoppelt, welches in der Folge mit BSA abgekürzt wird. Es wurden dabei Arbeitsverfahren angewandt, wie sie in J. Clin. Invest. 47, Seiten 556-567 (1968) und Int. Arch. Allergy, 39, Seiten 156-171 (1970) beschrieben sind.

Die Proteinkonzentration der Konjugate wurde mit Hilfe einer Stickstoffanalyse nach Kjeldahl bestimmt, wobei eine Korrektur für die Menge an Stickstoff angewandt wurde, der von den Benzylpenicilloylgruppen geliefert wurde. Die Konjugate wurden auf ihren Gehalt an Benzylpenicilloyl geprüft, indem man die Penamaldatkonzentration feststellte. Die Bestimmung des Penamaldates bringt eine spektro-photometrisch quantitative Bestimmung des Benzylpenicil-loyl-D-Glutaminsäure : D-lysin-konjugates mit der Abkürzung BPO-D-GL mit sich. Es sei in diesem Zusammenhang auf «Methods in Immunology and Immunochemistry, Aca-demic Press», Seiten 141-142 (1967) hingewiesen. Das molare Verhältnis von Benzylpenicilloyl zu Schlüsselloch-Napf-schnecken-Hemocyanin, also das Verhältnis BPO : KLH und das molare Verhältnis von Benzylpenicilloyl zu Rinderserumalbumin, also das Verhältnis BPO : BSA, das erhalten wurde, war das folgende:

bpo35-bsa

(10 Äquivalente an Kaliumbenzyl-penicillin-äquivalen-ten zu -NH2)

BPOjo-KLH

(10 Äquivalente an Kaliumbenzyl-penicillin-äquivalen-ten zu -NHZ. Molekulargewicht der Untereinheit von KLH von 100 000 abgeschätzten 50-NH2-Gruppen.

b) Herstellung von Benzylpenicilloyl-Schaferythrocyten mit der Abkürzung BPO-SRBC:

Zur Verwendung bei den Testen von Serum auf BPO-spezifische IgM-Antikörper und BPO-spezifische IgG-An-tikörper wurde das BPO auf die Schaferythrocyten mit der Abkürzung SRBC nach einem Arbeitsverfahren gekuppelt, das in J. Immunol. 96, Seiten 707-718 (1966) beschrieben ist.

Die BPO-Träger-Konjugate, die wie oben beschrieben hergestellt wurden, wurden verwendet, um Mäuse zu immunisieren oder um die Messung von Anti-BPO-Antikör-pern nach dem in der Folge im Detail beschriebenen Verfahren durchzuführen.

II. Durchführung des Immunisierungsverfahrens

Es wurden Mäuse immunisiert, indem man an sie durch intraperitoneale Injektion 1 (ig an dem BPO-KLH verabreichte, wobei diese 1 |xg an dem BPO-KLH auf 4 mg Alu-miniumhydroxyd-gel (Al(OH)3-Gel (Alum)) absorbiert waren, und sich die zu injizierende Menge in einem Volumen von 0,5 ml an steriler Kochsalzlösung befand. Es wurden verstärkende Injektionen intraperitoneal 2 bis 4 Wochen nach der primären Injektion verabreicht. Die verstärkenden Injektionen wurden hergestellt, indem man 1 |xg an BPO-KLH, vermischt mit 2 mg Aluminiumhydroxyd-gel, verabreichte. Zu unterschiedlichen Zeiträumen nach der primären und sekundären Immunisierung wurde den Mäusen Blut aus dem Retro-orbital Plexus entnommen, und der Antikörperspiegel im Serum nach dem weiter unten beschriebenen Verfahren bestimmt.

III. Bestimmung der Anti-BPO-Antikörper Bestimmung der Serum-IgE-Antikörper 5 Passive Haut-Anaphylaxe. Diese wird in der Folge mit PCA abgekürzt.

Das Verfahren der passiven Haut-Anaphylaxe, das heisst die PCA-Methode, benötigt, dass man Seren einer bestimmten Gruppe an Mäusen gewinnt und eine serielle Verdün-10 nung (2fach) der Seren in 2prozentigem normal Rattenserum vornimmt. Ein Anteil von 0,1 ml jeder der verschiedenen Verdünnungen wurde in die Haut injiziert (intradermale Injektion), wobei die Injektion in die rasierte Rückenhaut (Dorsalhaut) der getesteten Ratten erfolgte. Nach einer 4 bis 15 24 Stunden dauernden Sensibilisierungsreaktion wurden die PCA-Reaktionen hervorgerufen, die bei diesem Arbeitsverfahren nur ein Mass für die IgE-Antikörper sind. Diese PCA-Reaktionen wurden hervorgerufen, indem man eine intravenöse Injektion von BPO-BSA in 1,0% Evans-blauem 20 Farbstoff, gelöst in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung, verabreichte. Die verabreichte Menge an dem BPO-BSA betrug dabei 1 mg pro 250 g Körpergewicht der rasierten Ratte. Der PCA-Titer wird als reziproker Wert der höchsten Verdünnung des Serums ausgedrückt, welcher eine Bläu-25 ungsreaktion eines Durchmessers von 5 mm liefert. Im Zusammenhang mit diesem Verfahren sei auf die Veröffentlichung in «Life Sciences», 81, Seiten 813-820 (1969) hingewiesen.

3o IV. Bestimmung der Serum-Antx-KLH-Antikörper

Die Spiegel an dem Serum-IgE-Anti-KLH-Antikörper wurden mit Hilfe der PCA-Reaktionen, wie oben beschrieben, bestimmt. Die IgG-Anti-KLH-Antikörper wurden durch Radioimmuntests bestimmt, indem man mit 125I-markierte Monomere KLH verwendete, wie dies in der Veröffentlichung J. Immunol. 114, Seiten 872-876 (1975) beschrieben ist.

Anhand der folgenden Beispiele werden die Herstellung von erfindungsgemässen Konjugaten erläutert.

40 Beispiel 1

Herstellung eines Konjugates aus Benzylpenicilloyl und D-Glutaminsäure : D-Lysin (BPO-D-GL-Konjugat) Ein Anteil von 1 g des D-Glutaminsäure : D-Lysin-Co-polymerisates, das ein durchschnittliches Molekulargewicht 45 von etwa 50 000 aufwies, und ein molares Verhältnis der Reste der Glutaminsäure zu denjenigen der Lysinsäure von 60 : 40 besass, wurde in einer 0, lmolaren Natriumcarbonat-lösung eines pH-Wertes von 11,5 aufgelöst. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Natronlauge auf 10 bis 12 auf-50 rechterhalten. 2 bis 3 Moläquivalente an Kaliumbenzyl-peni-cilloyl wurden zugegeben und die Reaktionsmischung wurde bei einer Temperatur von etwa 10 bis 30 °C während 1 Stunde belassen.

Dabei erhielt man das Benzyl-penicilloyl-D-Glutamin-55 säure : D-Lysin-Konjugat, also das BPO-D-GL-Konjugat, welches von dem unumgesetzten Penicillinsalz durch Dialysereinigung abgetrennt wurde. Bei der Dialyse wurden verschiedene Wechsel an 0,1 molarem Natriumbicarbonat, welches 1 % Diäthylaminoäthylcellulose enthielt, angewandt, 60 und schliesslich dialysierte man gegen eine mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung. Die Analyse des BPO-D-GL-Konjugates nach dem weiter oben beschriebenen Analyseverfahren zeigte an, dass das BPO-D-GL-molare Verhältnis BPO40-p-GL betrug (2 Äquivalente Kaliumbenzylpenicil-65 lin pro Äquivalent-NH2). Das gebildete BPO-D-GL-Kon-jugat hatte ein molares Verhältnis von Benzylpenicilloyl oder eines Derivates desselben zu dem Copolymeren von mindestens 40:1.

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Es wurden Antikörperreaktionen mit hohem Titer, und zwar IgE-, IgG- und IgM-Antikörperreaktionen gegenüber BPO hervorgerufen, indem man intraperitoneal an Schlüs-selloch-Napfschnecken-hemocyanin gekoppeltes Benzylpenicilloyl, also ein Produkt der Bezeichnung BPO-KLH, injizierte. Die Behandlung derartiger Mäuse, die in der Folge dann beschrieben wird, mit dem erfindungsgemässen BPO-D-GL-Konjugat entweder vor oder nach der primären Immunisierung, führte zu einer wesentlichen Unterdrückung der nachfolgenden Anti-BPO-Antikörperreaktion der IgE-Klasse und der IgG-Klasse, die sowohl beim humoralen Niveau (Niveau der Körpersäfte) als auch beim zellularen Niveau bestimmt wurde.

Einführung einer BPO-spezifischen Toleranz mit Hilfe von

BPO-D-GL, wobei die Behandlung mit dem BPO-D—GL vor einer vorherigen Immunisierung durchgeführt wurde Analyse der humoralen Immunreaktion:

An zwei Gruppen normaler BALB/c-Mäuse wurden durch subkutane Injektion 4 Dosierungen entweder einer Kochsalzlösung oder einer Lösung von 500 (ig an BPO-D-GL in einem Intervall von 3 Tagen verabreicht. Diese Behandlungsweise wurde auf Basis von Vorversuchen ausgewählt, aus denen man folgendes sah:

1. Die subkutane Verabreichung ist genau so gut oder besser geeignet als die intraperitoneale Verabreichung, um eine Toleranzinduktion mit D-GL-Konjugaten hervorzurufen.

2. Zwei Dosierungen von 500 |ig an BPO-D-GL führten zu einem wesentlichen, aber unvollständigen Ausmass der Toleranz. 1 Woche nach der letzten Dosierung wurden die Tiere zuerst mit 1 (ig des sensibilisierenden Antigen-BPO-KLH immunisiert. Die Sensibilisierung mit dem An-tigen-BPO-KLH erfolgte so, dass ein (ig des Antigen-BPO-KLH mit 4 mg Aluminiumhydroxyd vermischt verabreicht wurde. Es zeigte sich, dass das angewandte Immunisierungsverfahren geeignet war, um gute IgE-, IgM- und IgG-primäre anti-BPO-Antikörperreaktionen bei derartigen Mäusen hervorzurufen. Allen Tieren wurde in wöchentlichen Intervallen Blut entnommen, und ihre Seren wurden auf Anti-BPO-Antikörper und Anti-KLH-Antikörper analysiert. Am 28. Tag nach der primären Immunisierung wurden die Mäuse in beiden Gruppen der sekundären Auslösung unterworfen, indem man an sie 1 (ig an BPO-KLH, gemischt mit 2 mg an Aluminiumhydroxyd, verabreichte. 7 Tage später entnahm man den Mäusen Blut und tötete die Tiere. Das Protokoll und die Ergebnisse der Serum-Antikör-perreaktion sind in der Tabelle I zusammengestellt. Die Tiere zu Vergleichszwecken entwickelten eine gute primäre IgE-Anti-BPO-Antikörperreaktion am 14. Tag, wobei die stärkste Reaktion, also der Peak, am 21. Tag festzustellen war. Diese Tiere zeigten eine scharfe anamnestische Reaktion am Tag 35, folgend einer zweiten Auslösung am Tage 28.

Im Gegensatz dazu zeigten diejenigen Mäuse, die der Vorbehandlung mit dem BPO-D-GL unterworfen worden waren, keine feststellbare IgE-Anti-BPO-Reaktion während der 28 Tage der primären Anregung, und sie bildeten nur geringe Mengen an Antikörpern nach der zweiten Auslösung. Vergleichbare IgE-Anti-KLH-Antikörper-Titer zwischen behandelten Mäusen und Mäusen zu Vergleichszwecken während der 35 Tage dauernden Beobachtungszeit zeigten, dass die Toleranz spezifisch war.

Die BPO-spezifischen IgM- und IgG-Antikörper wurden durch passive Hemagglutination bestimmt, wobei man hiezu Benzylpenicilloyl, also BPO, verwendete, das an Schafery-throcyten gekuppelt war, wie dies in J. Immunol. III, Seiten 638-640 (1973) beschrieben ist. Die Anti-BPO-Antikörperreaktion der IgG-Klasse und der IgM-Klasse waren ähnlich den oben beschriebenen Resultaten der IgE-Klasse. Mäuse, die mit BPO-D-GL behandelt worden waren, zeigten deutlich tiefere Niveaus an IgG-Anti-BPO-Serum-Antikörper während der gesamten Immunisierungszeit, und der folgenden zweiten Auslösung, und zwar wieder im Vergleich zu Tieren zu Vergleichszwecken.

Milzzellen wurden unter sterilen Bedingungen aus den Tieren entfernt und sie wurden auf BPO-spezifische belagsbildende Zellen (Plaque-bildende Zellen) nach denjenigen Arbeitsweisen analysiert, die in Science 140, Seiten 405-411 (1963) beschrieben sind. Es wurden heterologe adoptive Hautanaphylaxe-Reaktionen in derjenigen Weise durchgeführt, die in dem J. Immunol. 111, Seiten 638-640 (1973) beschrieben ist. Die Ergebnisse zeigten an, dass wesentlich weniger BPO spezifische Antikörper der IgG-Klasse und IgM-Klasse in den Milzzellen derjenigen Mäuse vorhanden waren, die mit dem BPO-D — GL behandelt worden waren, und zwar im Vergleich zu den unbehandelten Mäusen der Vergleichsversuche.

Tabelle I Serum-Antikörper-Reaktion Einfluss einer Vorbehandlung mit BPO-D-GL auf die primäre IgE-Anti-BPO-Antikörper-Reaktion von BALB/c-Mäusen auf BPO-KLH (PCA Titer)

Protokoll

Gruppe

Vorbehandlung

Tage nach

Serum-Anti-

primärer

BPO-Antikörper

Immunisierung

IgE

I

Vergleich

7

<10

Kochsalz s.c.

14

160

21

320

28

320

35

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II

BPO-D-GL s.

c. 7

<10

(500 (ig x 4)

14

<10

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<10

28

<10

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Die sekundäre Auslösung wurde am 28. Tag verabreicht. Der Ausdruck s.c. bedeutet subkutan.

Induktion einer BPO-spezifischen Toleranz bei vorher immunisierten Mäusen durch Verabreichung von Benzylpenicilloyl-D-Glutaminsäure : D-Lysin (BPO-D-GL)

Drei Gruppen an BALB/c-Mäusen wurden intraperitoneal immunisiert, indem man 1 (ig an Benzyl-penicilloyl, gekoppelt an Schlüsselloch-Napfschnecken-hemocyanin, also dem Produkt BPO-KLH, gemischt mit 4 mg Aluminiumhydroxyd verwendete. Zwei Wochen später entnahm man aus den Mäusegruppen Blut und behandelte sie dann entweder mit Kochsalzlösung oder mit 500 (ig an BPO-D-GL intraperitoneal oder mit 500 (ig an BPO-D-GL subkutan an zwei abwechselnden Tagen, nämlich den Tagen 14 und 16. Am Tage 18 werden alle Tiere der sekundären Auslösung unterworfen, indem man 1 (ig an BPO-KLH, vermischt mit 2 mg Aluminiumhydroxyd verabreichte und Blut wurde den Tieren in Intervallen von 7 Tagen während drei darauffolgenden Wochen entnommen. 21 Tage nach der sekundären Immunisierung wurden die Tiere getötet und ihre Milzzellen wurden auf BPO-spezifische belagsbildende (Plaque-bilden-de) Zellen untersucht.

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Das Protokoll und die Ergebnisse der Serum-Antikör-perreaktion sind summarisch in der folgenden Tabelle II zusammengestellt. Alle drei Gruppen der Mäuse zeigten vergleichbare Spiegel an IgE-Anti-BPO-Antikörpern unmittelbar vor der BPO-D-GL-Behandlung. Nach der zweiten Auslösung unter Verwendung von BPO-KLH zeigten die unbehandelten Mäuse zu Vergleichszwecken eine anamnestische IgE-Reaktion, welche an den Tagen 7 und 14 ein ebenes Niveau erreicht hatte, und dann am 21. Tag nach der Auslösung an etwas abnahm. Im Gegensatz dazu reagierten die zwei Gruppen an Mäusen, die mit dem BPO-D-GL behandelt worden waren, nicht auf die zweite Immunisierung mit dem BPO-KLH, und ausserdem zeigten diese beiden behandelten Gruppen eine Abnahme des Spiegels an zirkulierendem IgE-Anti-BPO-Antikörper. Diese Abnahme war besonders deutlich bei derjenigen Gruppe, die mit dem BPO-D-GL durch subkutane Injektion behandelt worden war. Der IgE-Titer der zuletzt genannten Gruppe nahm fortschreitend ab, bis keiner mehr am 21. Tag festzustellen war. Vergleichbare IgE-Anti-KLH-Antikörper-Titer zwischen behandelten Mäusen und Mäusen zu Kontrollzwecken während des Beobachtungszeitraumes von 21 Tagen zeigten die Toleranzspezifität an. Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Anti-BPO-Antikörperreaktion der IgG-Klasse erhalten. Dementsprechend waren die Mäuse, die mit dem BPO-D-GL behandelt worden waren, wesentlich in ihrer IgG-Anti-BPO-Reaktion im Vergleich zu den Mäusen zu Vergleichszwecken unterdrückt.

Tabelle II

Einfluss einer dazwischengeschalteten Behandlung mit BPO-D-GL auf die sekundäre IgE-Anti-BPO- und Anti-KLH-Antikörper-Reaktion von BALB/c-Mäusen gegenüber BPO-KLH

Protokoll

Gruppe dazwischenge- Tage nach der Serum-Anti-

schaltete sekundären BPO-Antikörper

Behandlung Auslösung (PCA-Titer)

IgE

I Vergl.-Versuch

-4

320

Kochsalz

7

1280

14

1280

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300

II BPO-D-GL Lp.

-4

320

(500 ng x 2)

7

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14

40

21

40

III BPO-D-GL s.k.

-4

320

(500 [ig x 2)

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14

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i.p. bedeutet intraperitoneale Verabreichung, s.k. bedeutet subkutane Verabreichung.

Die Tests mit den Milzzellen zeigten, dass der Spiegel an den BPO-spezifischen Antikörpern der IgG-Klasse und der IgM-Klasse in den Milzen der behandelten Mäuse tiefer waren als in den Milzen der unbehandelten Mäuse zu Vergleichszwecken.

Aus den obigen Ergebnissen kann man sehen, dass die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfügung stellt, durch das ein Zustand der immunologischen Toleranz gegenüber einem speziellen Antigen bei einem Lebewesen induziert werden kann, indem man dem Lebewesen eine geeignete Menge an einem geeigneten Antigen-D-GL-Kon-jugat verabreicht Die Toleranz zeigt sich bei der Klasse der IgE-Antikörper und auch bei der Klasse der IgG-Antikörper und IgM-Antikörper. Ausserdem sieht man aus den gegebenen Testresultaten, dass eine Toleranz unabhängig von dem Immunstatus des Tieres zu dem Zeitpunkt, wo die Behandlung stattfindet, eingestellt bzw. erreicht werden kann.

Beispiel 2

Herstellung eines Benzylpenicilloyl-D-Glutaminsäure : D-Lysin-Konjugates (BPO-D-GL-Konjugat)

Eine 1-g-Portion an dem Copolymerisat aus D-Glutaminsäure und D-Lysin, also dem D-GL-Copolymeren, welches ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 64 000 besass, und in welchem das molare Verhältnis der Glutaminsäurereste zu den Lysinresten im Bereich von 60:40 lag, und ein 0,5-g-Anteil an Kaliumbenzylpenicilloyl wurden in 0,lmolarer Natriumcarbonatlösung gelöst. Der pH-Wert wurde durch mehrmalige Zugaben von 1 normaler Natronlauge auf 10 bis 12 gehalten. Die Reaktionsmischung wurde während 1 Vi Stunden bei einer Temperatur von etwa 30 °C belassen. Man erhielt dabei das Konjugat von Benzylpenicilloyl an D-Glutaminsäure : D-Lysin, also das BPO-D-GL-Konjugat, und dieses würde von dem unumge-setzten Penicillinsalz durch Dialyse gegen 0,1 molare Na-triumbicarbonatlösung abgetrennt, welche 1 % Diäthylami-noäthylcellulose enthielt. Die Dialyse liess man während eines Zeitraumes von etwa 1 Woche ablaufen.

Die Analyse des so erhaltenen BPO-D-GL-Konjugates nach der weiter vorne beschriebenen Methode zeigte an, dass das molare Verhältnis von Benzylpenicilloyl zu dem D-Glutaminsäure : D-Lysin-Copolymer, also das BPO : D-GL-mo-lare Verhältnis, diesmal BPÖ63-D-GL betrug.

Beispiel 3

Herstellung eines Insulin-D-Glutaminsäure : D-Lysin-

Konjugates, also eines Insulin-D-GL-Konjugates Ein Anteil von 50 mg Schweineinsulin wurde in 0,01molarer Äthylendiamintetra-essigsäure (in der Folge auch abgekürzt als EDTA) bei einem pH-Wert von 3,1 gelöst. Das gelöste Insulin wurde dann gegen die gleiche EDTA-Lösung über Nacht dialysiert. Das Dialysiermedium wurde dann gegen einen 0,033molaren Boratpuffer eines pH-Wertes von 9,5 ausgetauscht, der 2,5 x 10"5 Mol an EDTA enthielt. Dann setzte man Toluol-2,4-diisocyat, das in der Folge auch mit TDIC abgekürzt wird, zu der Insulinlösung bei 0 °C zu. Die Reaktionsmischung wurde über Nacht bei 0 °C während etwa 30 Minuten heftig gerührt, und dann zen-trifugierte man 10 Minuten lang mit 12 000 g während 10 Min. bei einer Temperatur von etwa 2 bis 4 °C. Die darüber stehende Lösung wurde in ein Teströhrchen abdekantiert, dieses zugestöpselt und das Teströhrchen in ein Eisbad gegeben. Man liess die Reaktion noch während einer weiteren Stundein der Temperatur des Eisbades fortschreiten.

Ein Anteil von 50 mg des D-GL-Copolymeren, welches ein durchschnittliches Molekulargewicht von 64 000 besass und ein molares Verhältnis von Glutaminsäure zu Lysin von 60:40 aufwies, wurden in 0,033molarem Boratpuffer eines pH-Wertes von 9,5 aufgelöst, welcher 2,5 x 10-s Mol an EDTA enthielt. Der pH-Wert wurde auf etwa 10 bis 12 unter Verwendung von 2 normaler Natronlauge eingestellt.

Die Lösung des D-Glutaminsäure : D-Lysin-Copolyme-ren wurde zu der Insulinlösung zugegeben, und das molare

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Verhältnis von Insulin zu dem zu der Reaktionsmischung zugegebenen Copolymeren aus D-Glutaminsäure : D-Lysin betrug 10:1. Man liess die Reaktion 1 Stunde lang bei 35 bis 40 °C weiterlaufen. Dann dialysierte man die Mischung gegen eine 0,lmolare Lösung von Ammoniumcarbonat der Formel (NH4)2C03, welche 2,5 x 10"5 Mol EDTA enthielt. Dann fraktionierte man auf einer Säule aus Sephadex 675, indem man eine 0,01molare Lösung an Ammoniumbicar-bonat der Formel NH4HC03, welche 2,5 x 10"5 Mol EDTA enthielt, als Elutionsmittel verwendete. Das Konjugat wurde weiter gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.

Beispiel 4

Herstellung eines Nucleotid-D-Glutaminsäure : D-Lysin-Konjugates, also dem Nucleotid-D-GL-Konjugat

Oligodesoxynucleotid, und zwar Trimere und/oder Tetramere wurden hergestellt, indem man einen DNase 1 Abbau (Verdauung) des Kalbthymus DNA durchführte und dann eine Fraktionierung auf einer DEAE Sephadex A25-Säule vornahm. Dabei wurde ein Arbeitsverfahren angewandt, bei dem ein 0 bis 0,4molarer Gradient an Lithiumchlorid (LiCl) in 5 mMol Tris-(hydroxymethyl)aminome-than («TRIS»-7M Harnstoffpuffer eines pH-Wertes von 7,6 verwendet wurde. Der Harnstoff wurde von den hergestellten Oligodesoxynucleotiden durch chromatrographische Arbeitsverfahren entfernt, indem man destilliertes Wasser als Elutionsmittel verwendete.

Das gebildete Oligodesoxynucleotid wird mit dem Copolymeren aus D-Glutaminsäure : D-Lysin (abgekürzt D-GL-Copolymer) umgesetzt, wobei dieses Copolymermaterial ein durchschnittliches Molekulargewicht von etwa 64 000 aufweist und das molare Verhältnis von Glutaminsäure zu Lysin 60:40 beträgt. Die Reaktion wird in destilliertem Wasser durchgeführt, wobei man als Kupplungsmittel l-Äthyl-3-di-isopropylaminocarbodiimid-hydrochlorid, das in der Folge als EDC abgekürzt wird, verwendet.

Das so erhaltene Konjugat wird von den Verunreinigungen und unumgesetztem Ausgangsmaterial durch Dialyse während etwa 1 Woche bei einer Temperatur von 2 bis 4 °C abgetrennt, und es sei in diesem Zusammenhang auf die Veröffentlichung in J. of Immun., 96, 373 (1966) hingewiesen.

Die Oligonucleotide wurden auch hergestellt, indem man einen DNase 1 Abbau (Verdauung) von Kalbthymus DNA und nachfolgendes Passierenlassen des Materials durch einen Filter hergestellt, wobei das verwendete Filter Molekulargewichte von mehr als 10 000 nicht hindurchliess. Ein zu diesem Zweck geeignetes Filter ist von der Amicon, Abteilung der Rohm und Haas Co., Independence Mall West, Philadelphia, Pennsylvania, 19 105, unter der Handelsbezeichnung PM-10 erhältlich. Das dabei gewonnene Filtrat wurde als Quelle für die Oligodesoxynucleotide verwendet.

Nucleotide sind aus einer heterocyclischen Base, einem Zucker mit 5 Kohlenstoffatomen und einem Phosphat zusammengesetzt. Nucleinsäuren anderseits sind Polymermaterialien, die aus vier unterschiedlichen Nucleotiden zusammengesetzt sind, und die miteinander über Phosphor-diester-bindungen verbunden sind. Die Oligonucleotide sind kleine Polymere, die üblicherweise aus Nucleinsäuren erhalten werden, und die aus weniger als 10 Nucleotiden zusammengesetzt sind, welche miteinander über Phosphor-diesterbindun-gen verbunden sind. Die Diesterbindungen bewirken, dass die Nucleotide relativ kompliziert aufgebaute chemische Substanzen sind. Antikörper, die für Nucleinsäure spezifisch sind, sind nicht nur für die Base und/oder den Zuckerteil,

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sondern auch für das Phosphatrückgrat dieser Nucleotide spezifisch. Wenn man daher kleine Oligonucleotide verwendet, die an einen nichtimmunologischen Träger gebunden sind, beispielsweise an D-Glutaminsäure : D-Lysin-Copoly-mer, dann erhält man eine nucleinsäureähnliche Umgebung, die direkt verwandt mit dem pathologischen Zustand einer Autoimmun-Krankheit ist.

Nach dem Stande der Technik wurde eine Induktion der Toleranz gegenüber Nucleosiden durchgeführt, die keine Phosphor-diesterbindungen aufweisen. Ein derartiges Verfahren ist näher verwandt einer Hapten-D-GL-Toleranz, beispielsweise Dnp-D-GL. Eine Induktion der Toleranz gegenüber Oligodesoxynucleotiden kann im Gegensatz dazu als Äquivalent mit einer Induktion der Toleranz gegenüber Nucleinsäuren selbst betrachtet werden.

Beispiel 5

Herstellung des Ragweed-Antigen E-D-Glutamin-säure : D-Lysin-Konjugates (Ragweed Antigen E-D-GL-Konjugat)

Ein Anteil von 50 mg des D-Glutaminsäure : D-Lysin-Copolymeren mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 64 000 und einem molaren Verhältnis von Glutaminsäure zu Lysin von 60:40 wurde in 2 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Die Lösung wurde auf 0 °C in einem Eisbad gekühlt und gerührt. Ein Anteil von 50 mg an dem N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3'-sulfonat (W oodward-Rea-gens) wurde in 0,5 ml an destilliertem Wasser gelöst und zu der Lösung des D-Glutaminsäure : D-Lysin-Copolymeren zugegeben, und dann rührte man noch etwa 1 Stunde lang bei 0 °C weiter. Der pH-Wert wurde unter Verwendung von 2 normaler Natrolauge auf 7,5 bis 8,0 erhöht.

Ein Anteil von 5 mg des Ragweed Antigens E, das von der Worthington Biochemicals, Inc., Freehold, New Jersey, 07 728, erhältlich ist, wurde in destilliertem Wasser gelöst und zu der Lösung des D-Glutaminsäure : D-Lysin-Copoly-meren in der Woodward-Reagenslösung zugegeben. Dan Antigen E besass ein Molekulargewicht von 37 800, und sein Stickstoffgehalt betrug 17,1% und sein Kohlehydratgehalt 0,2%. Der S-Wert war 3,05 und der Extinctions-koeffizient bei 280 u einer lprozentigen Lösung bei 1 cm Schichtdicke betrug 11,3.

Die so hergestellte Mischung wurde 24 Stunden lang bei 6 °C gerührt. Die Reaktionsmischung wurde dann auf einer Sephadex G-100-Säule fraktioniert, wobei man eine 0,Olmolare Lösung von Ammoniumbicarbonat der Formel nh4hco3, die 0,1 Mol an NH4HC03 enthielt, als Elutionsmittel verwendete. Diejenigen Röhren, welche den ersten Peak enthielten, wurden miteinander vereinigt und das Konjugat weiter gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophilisiert.

Die erfindungsgemässen Mittel können zur therapeutischen Anwendung zur Behandlung von pathologischen Zuständen herangezogen werden, bei denen eine Antikörper-Dysfunktion auftritt. Da, wie bereits früher erwähnt wurde, eine grosse Anzahl an Einzellebewesen gegen Antigene der Umgebung hypersensitiv sind, ist ein Verfahren zur Behandlung oder Vermeidung dieser allergischen Symptome von ausserordentlichem therapeutischen Wert. Mit Hilfe der erfindungsgemässen Mittel wird die IgE-Antikörperbildung und die IgG-Antikörperbildung, die als Reaktion auf spezifische sensibilisierende Antigene auftritt, stark unterdrückt.

Dementsprechend sind die Antigen-D-Glutamin-säure : D-Lysin-Konjugate mit Hilfe einer grossen Anzahl von Antigen der Umgebung, die als Allergene bezeichnet

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werden, herstellbar, und im Behandlungsverfahren zur Behandlung entsprechender Allergien geeignet. Beispiele für typische Allergene, die der Antigenbestandteil der erfindungsgemässen Mittel sein können sind Penicillin, Hormone wie zum Beispiel Insulin, Pollen von verschiedenen Pflanzen, wie zum Beispiel von Ragweed, von Bermudagras, von Obstgartengras und Timothygras, Pollen von Blumen wie zum Beispiel von Chrysanthemum-leucanthemum, und ferner Pollen von Bäumen wie zum Beispiel Birkenpollen. Ferner gehören dazu verschiedene Gifte, insbesondere tierische Gifte wie Bienengift, Wespengift und Schlangengift, feine Haare und sonstige Bestandteile von Tieren, wie zum Beispiel feine Pferdehaare (horse dander), tierische Hautbestandteile, wie zum Beispiel Bestandteile der tierischen Epidermis wie Katzenepithel, Nahrungsmittelprotein-Allergene wie zum Beispiel Schellfisch und Erdbeeren, die Hausstaubmilbe, Pilze wie zum Beispiel die Bäckerhefe mit der lateinischen Bezeichnung Saccharomyces cerevisiae, sowie ferner Schimmelpilze, wie zum Beispiel Alternaria tenuis, Toxine wie zum Beispiel das Diphtherietoxin, Toxoide wie zum Beispiel das Tetanustoxoid, Proteine wie zum Beispiel das Ovalbumin, Enzyme wie zum Beispiel das Trypsin, Chymotrypsin und das Ficin, sowie auch Derivate der genannten Allergene.

Zusätzlich zu den oben erwähnten, aus der Umgebung stammenden Allergenen, die bei hypersensitiven Personen zu allergischen Symptomen führen, können die erfindungsgemässen Mittel auch von therapeutischem Wert zur Behandlung von Autoimmunkrankheiten sein. Autoimmunkrankheiten können praktisch jeden Teil des Körpers eines Lebewesens angreifen. Einige Autoimmun-Reaktionen sind auf organspezifische Antikörper gerichtet, und sie können auch auf einen bestimmten Zellentyp gerichtet sein, beispielsweise Parietalzellen der Magenschleimhaut bei perniziöser Anämie. Andere Reaktionen sind gegen weit verbreitete Antigene gerichtet, und sie sind mit einem weiten Spektrum von Krankheitserscheinungen verbunden, wie zum Beispiel antinucleare Antikörper bei systemischem Lupus-Erythemato-sus (SLE). Bei noch anderen Krankheiten sind die Reaktionen Vermittler zwischen diesen Extremen, wie dies bei der Goodpasture-Krankheit der Fall ist, die durch eine chronische Glomerulonephritis und Lungenblutungen charakterisiert ist, wobei Antikörper auf den Grundmembranzellen der Nieren-Glomerul und der Lungen-Parenchyma abgeschieden werden.

Antikörper werden auch gegen spezifische Zellrezeptorseiten gebildet, wie dies bei der Myasthenia-Gravis der Fall ist, wo Antikörper für Acetylcholin-Rezeptorstellen bei der Übermittlung von Nervenimpulsen stören. Antikörper können auch gegen Insulin-Rezeptorstellen gebildet werden, wobei die Bindung des Insulins an die Zellen blockiert wird, was die regulierende Wirkung dieses Hormones stört.

Typische Autoimmunkrankheiten und das dafür verantwortliche Antigen sind die folgenden:

Befallenes Organ

Name der Krankheit

Verantwortliches

Antigen

Schilddrüse

Hashimoti-

Thyroglobulin und

Thyroiditis

(Hypothyroidis-

mus)

Thyrotoxicosis

Oberfläche der

(Hyperthyroidis-

Schilddrüsen

mus)

Magen Faktor (1)

Perniziöse Anämie

Innerlich

Muköse

(Vitamin-Bi2-

(Intrinsisch)

Mangel)

Parietalzellen

Nebennieren

Addison-Krank-

Nebennierenzellen

heit

Haut

Pemphigus

Epidermiszellen

vulgaris und Grund

Pemphigoid membran zwischen

Unterhaut und

Oberhaut

Auge

Sympathetische

Gefässhaut des

Ophthalmie

Augeninneren

(Uvea)

Rote Blut

Autoimmun-

Oberfläche der körperchen hämo-

roten Blut

lytische körperchen

Anämie

Blutplättchen

Idiopathische

Oberfläche der

Thrombocyto-

Plättchen

penische Purpura

Skelettmuskeln

Myasthenia gravis

Muskelzellen und und Herzmuskel

Thymus-myoid-

zellen

Leber

Primäre

Mitochondria

(Gallengegend)

Biliarzyrrhose

(hauptsächlich)

Speicheldrüsen

Sjögren's-

Einschliesslich der und Tränendrüsen

Krankheit

Sekretbahnen,

Mitochondrien,

Kerne und IgG

Synovial-

Rheumatoide

Fc-Bereich des

Membranen

Arthritis

IgG

Es dürfte möglich sein, mit Hilfe der erfindungsgemässen Mittel eine Beseitigung oder Linderung von Autoimmunkrankheiten zu erreichen, indem man ein entsprechendes Antigen an D-Glutaminsäure : D-Lysin-Copolymer kuppelt, wobei das Antigen ein solches ist, das bei den oben beschriebenen Autoimmunkrankheiten eine Rolle spielt. Die Unterdrückung der Bildung von IgG-Antikörpern gegenüber den Selbst-Antigenen würde von therapeutischem Wert sein.

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Claims

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PATENTANSPRÜCHE

1. Therapeutisches immunosuppressives Mittel, das in der Lage ist, eine spezifische immunologische Toleranz gegenüber einem Antigen zu induzieren, indem die Antikörper-response unterdrückt wird, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoff ein Konjugat eines D-Glutaminsäure: D-Ly-sin-copolymeren und eines Antigens enthält.
2. Immunosuppressives Mittel nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Allergen ist.
3. Immunosuppressives Mittel nach Patentanspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Allergen ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche die folgenden Allergene umfasst: Benzylpenicilloyl, Insulin, Ovalbumin, Lactalbumin, Pollen von Gräsern, insbesondere Bermuda-gras-Pollen, Tomothygras-Pollen, Obstgartengras-Pollen und Kombinationen von Graspollen, Pollen der Pflanze mit der englischen Bezeichnung «Ragweed», das Ragweed-An-tigen E, Pollen des Birkenbaumes, Bienengift, Schlangengift, von Pferden stammende Partikeln, Katzenepithel, Schellfisch, Hausstaub-milbe, Chrysanthemum-leucanthemum, Alternaria-tenuis, Trypsin, Chymotrypsin, trockene Verwesungsbestandteile, Backhefe, Tetanus-Toxoid, Diphterie-toxin und Ficin.
4. Immunosuppressives Mittel nach Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Auto-Antigen ist.
5. Immunosuppressives Mittel nach Patentanspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Auto-Antigen ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche die folgenden Materialien umfasst: Insulin, Nucleinsäure, Oligodesoxynu-cleotide, Thyroglobulin, Oberflächen oder Cytoplasma von Schilddrüsenzellen, Parietal-Zellen, Nebennieren-Zellen, Epidermis-Zellen, Uvea-Zellen, Grundmembran-Zellen, Oberfläche von roten Blutkörperchen-Zellen, Oberfläche von Plättchen-Zellen, Muskelzellen, Thymus-myoid-Zellen, Mitochondrien, Zellen von Sekretleitern, Desoxyribonu-cleinsäure-protein und Acetylcholin-Rezeptorsubstanz.
6. Immunosuppressives Mittel nach einem der Patentan-s spräche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Copoly-

mere ein Molekulargewicht besitzt, das im Bereich von 34 000 bis 64 000 liegt, und dass das molare Verhältnis von Glutaminsäure zu Lysin 60 :40 beträgt.
7. Immunosuppressives Mittel nach Patentanspruch 3, io dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen Benzylpenicilloyl ist.
8. Immunosuppressives Mittel nach Patentanspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das gebildete Konjugat ein molares Verhältnis von Benzylpenicilloyl zu dem Copolyme-

i5 ren von mindestens 40 :1 aufweist.
9. Immunosuppressives Mittel nach Patentanspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen Insulin ist.
10. Immunosuppressives Mittel nach Patentanspruch 3," dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen das Antigen E

20 der Pflanze «Ragweed» ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines therapeutischen im-munosuppressiven Mittels gemäss Patentanspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man D-Glutaminsäure: D-Ly-sin-copolymer mit einem Antigen umsetzt, wobei sich ein

25 Konjugat des D-Glutaminsäure: D-Lysin-copolymeren und des Antigens bildet und diesen Wirkstoff zu dem therapeutischen immunosuppressiven Mittel formuliert.
12. Verfahren nach Patentanspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen ein Allergen oder ein Auto-An-

30 tigèn ist und dass man ein D-Glutaminsäure: D-Lysin-copo-lymere verwendet, welches ein durchschnittliches Molekulargewicht im Bereich von 34 000 bis 64 000 besitzt und ein molares Verhältnis von Glutaminsäure zu Lysin von 60:40 aufweist.