DE2803397C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die im Anspruch 1 angegebene biologisch aktive Substanz, gemäß Anspruch 2 deren Verfahren zur Herstellung und gemäß Anspruch 3 deren Verwendung.

Es wurde gefunden, daß in den Zellen der zu Bordetella pertussis gehörenden Mikroorganismen und im Überstand ihres Kultivierungsmediums eine Substanz vorliegt, welche die erstaunliche pharmakologische Wirkung hat, die Insulinsekretion zu fördern und den normalen Blutzuckerspiegel aufrechtzuerhalten, so daß sie sich für eine wertvolle medizinische Verwendbarkeit zur Behandlung verschiedener Arten von Diabetes und zur Verhütung desselben anbietet. Es ist auch gelungen, diese neue proteinartige Substanz zu isolieren und als einen Insulinsekretion-potenzierenden Faktor chemisch zu identifizieren. Die erfindungsgemäße biologisch aktive Substanz, welche mit Islets-Aktivierungs-Protein (IAP) bezeichnet wurde, zeigt eine auffallend hohe Insulinsekretion-fördernde Aktivität bei einer extrem geringen Dosis (etwa 0,1 µg/kg Körpergewicht) und erweist sich als brauchbar zur Behandlung und Verhütung verschiedener Arten von Diabetes.

Der erfindungsgemäße Insulinsekretion-fördernde aktive Faktor (im folgenden einfach mit "aktiver Faktor" bezeichnet) ist eine proteinartige Substanz, die gewonnen werden kann durch Kultivierung der zu Bordetella pertussis (Phase I) gehörenden Mikroorganismen, die als pathogene Bakterien bekannt sind, in einem festen oder flüssigen Medium, und Isolierung und Reinigung der betreffenden Substanz aus den kultivierten Bakterienzellen und dem Kulturmedium.

Das Isolieren und Reinigen des aktiven Faktors aus der Bakterienkultur kann in üblicher bekannter Weise erfolgen, z. B. nach einer Ausfäll-, Chromatographie-, Molekularsieb- oder Elektrophorese-Methode, wobei diese Methoden entweder für sich allein oder in geeigneter Kombination miteinander anwendbar sind, so daß kein spezielles Isolier- und Reinigungsverfahren definierbar ist.

Als besonders vorteilhaft zur Gewinnung und Reinigung des erfindungsgemäßen aktiven Faktors hat sich z. B. ein Säulenchromatographie- Verfahren erwiesen, wonach der Überstand des Kulturmediums durch eine Säule geleitet wird, die mit einem Füllstoff wie Hydroxyapatit, CM-Sepharose Cl-6B oder Con A-Sepharose-4B gefüllt ist.

Der aktive Faktor wird an diese Säulenfüllungen hochgradig selektiv adsorbiert und anschließend mit Hilfe eines geeignet ausgewählten Elutionsmittels, z. B. mit 0,1 M Phosphatpuffer (ph 7,0), der 0,5 M NaCl enthält, eluiert. Das gereinigte Produkt wird sodann dialysiert zur Entfernung unnötiger Salze, wobei der reine aktive Faktor erhalten wird. Da der aktive Faktor auch in den kultivierten Bakterienzellen vorliegt, kann er gewünschtenfalls auch aus diesen isoliert werden, z. B. durch Zugabe von NaCl zu der Zellsuspension, um auf diese Weise den aktiven Faktor in die Lösung auszulaugen.

Zur Gewinnung des aktiven Faktors steht ferner die weit verbreitete sogenannte Ammoniumsulfat-Ausfällmethode zur Verfügung, wonach zum Überstand der Bakterienkultur festes (NH₄)₂SO₄ bis zu einem fast die Sättigungslöslichkeit erreichenden Punkt zugegeben und der pH-Wert auf 6 bis 7 mit verdünntem Ammoniakwasser eingestellt wird. Dann wird der Niederschlag mit Wasser gewaschen und der aktive Faktor mit 0,1 M-Trispuffer (ph 8), der 0,5 M NaCl enthält, extrahiert.

Wie bereits erwähnt, sind Pertussis Bacillus diejenigen Bordetella- Organismen, welche den erfindungsgemäßen aktiven Faktor ergeben, doch stellen die Variationen dieser pathogenen Bakterien, z. B. diejenigen, welche durch Mutation mit Hilfe verschiedener bekannter Mittel erhalten werden, z. B. durch Änderung der Mediumzusammensetzung, Exponierung gegenüber verschiedenen Arten von Strahlung, z. B. Ultraviolett- oder Röntgenstrahlung, oder Verwendung eines chemischen Mutagens, eine weitere brauchbare Quelle für den aktiven Faktor dar.

Erfindungsgemäß kann zur Kultivierung jede übliche bekannte Methode angewandt werden, doch sind flüssige Schüttelkulturen bevorzugt im Hinblick auf Aktivität und Ausbeute.

Bezüglich der mycologischen Eigenschaften und Kultivierungsbedingungen der zu Bordetella gehörenden Mikroorganismen sei verwiesen auf Bergy′s Manual of Determinative Bacteriology, Band 8, 1974, Baltimore, The Williams & Wilkins C.; J. Exp. Med. 129, 523-550 (1969); und Mycological Training Handbook, 3. Auflage, S. 6 ff, 1972, Maruzen & Co.

Ganz allgemein gesagt, umfaßt das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung von Islets-Aktivierungs-Protein (IAP), dessen chemische Identifizierung zu den unten angegebenen Werten führte, und ebenso die Herstellung des Typs von Insulinsekretionfördernder Substanz, bei dem es sich um ein dem IAP praktisch ähnliches oder äquivalentes Protein handelt.

Die chemischen und physikalischen Eigenschaften des erfindungsgemäß als IAP erhaltenen aktiven Faktors werden im folgenden beschrieben.

Verhaltensweise und Löslichkeitseigenschaften

Das nach dem Entsalzen durch Gefriertrocknung erhaltene Pulver des aktiven Faktors ist nicht-zerfließlich, weiß oder leicht braun, und löslich in Wasser bei Raumtemperatur in Konzentrationen von bis zu etwa 3 bis 5 mg/ml. Beim Einbringen in 6 N-HCl bildet es einen unlöslichen weißen Niederschlag. Es ist löslich in Pyridin, Natriumdodecylsulfat, 2-Mercaptoäthanol und Cystinlösung. Die Zugabe von Trockeneis-Aceton oder -Äthanol, Trichloressigsäure oder Zinkchloridlösung oder einer anderen Lösung, die verschiedene andere Typen von Metallionen enthält, zu der Lösung des gereinigten aktiven Materials in der Kälte (4°C) führt zu einem weiß-trüben Niederschlag. Beim Einbringen in eine Mischlösung aus Wasser und Chloroform oder n-Butanol erweist sich der aktive Faktor als in einer derartigen Lösung unlöslich und sammelt sich um die Grenzfläche der beiden Flüssigkeiten.

Beim Erhitzen einer wäßrigen Lösung des aktiven Faktors auf 80°C oder höher wird diese weißlich-trüb. Auch beim Lösen des aktiven Faktors in 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthält, und anschließender Dialyse unter Verwendung von destilliertem Wasser als äußere Flüssigkeit, wird dieser Faktor temporär weiß- trüb, doch ist der aktive Faktor bei fortgesetzter Dialyse erneut vollkommen gelöst und die weiße Trübung verschwindet. Wird eine hochkonzentrierte Lösung einer ausgiebigen Dialyse unter Verwendung von 0,01 M-Acetatpuffer (pH 4,5) unterworfen, so kann der aktive Faktor leicht-bräunlich gefärbt und gelöst werden.

Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des aktiven Faktors ergab sich zu 77 000 ± 6400 bestimmt durch Gelfiltration durch eine Säule (2,8 × 80 cm) mit Biogel P-100, das ins Gleichgewicht gesetzt war mit 0,1 M-Phosphatpuffer, der 0,5 M NaCl enthielt.

Zusammensetzung

Der Proteingehalt betrug über 95 Gew.-%, bestimmt nach der Lowry-Methode, und der Glucidgehalt (Glucide: s. Hackle′s Chemical Dictionary 4. Aufl. McGraw-Hill Book 60. S. 300) war etwa 1 Gew.-%, bestimmt nach der Phenol-H₂SO₄-Methode. Die Lipidkonzentration lag unter der unteren Grenze der Nachweisbarkeit.

Die angewandten Meßmethoden der angegebenen Komponenten werden in folgenden Literaturstellen beschrieben:
Bestimmungsmethoden:
Protein:
Lowry, O. H., N. J. Rosebrough, A. L. Farr und R. J. Randall: J. Biol. Chem. 193, 265, 1951;
Glucide (wobei mit diesem Ausdruck hier und im folgenden alle mit der genannten Methode erfaßbaren Zucker und deren Derivate bezeichnet werden):
Phenol-H₂SO₄-Methode nach Dobois, M., K. A. Giles, J. K. Hamilton, P. A. Rebers und F. Smith: Anal. Chem., 28, 350, 1956;
Lipide:
Gesamtlipid und Lipidkonjugat wurden gemessen nach der Marsh und Weinstein-Methode (J. B. Marsh und D. B. Weinstein: J. Lipid Res., 7, 574, 1966) durch Extraktion des Materials vor und nach Hydrolyse in Chloroform, Chloroform-Methanol und Heptan.

Die Aminosäurezusammensetzung der Proteinkomponente (Durchschnittsmenge in µM/100 µM, 16- oder 24stündige Hydrolyse bei 110°C in 6 N-HCl) war wie folgt:
Asparaginsäure 7,5; Threonin 7,3; Serin 6,4; Glutaminsäure 10,0; Prolin 5,8; Glycin 8,8; Alanin 9,3; Cystin/2 2,5; Valin 6,5; Methionin 2,8; Isoleucin 4,0; Leucin 7,8; Tyrosin 6,5; Phenylalanin 3,7; Lysin 3,3; Histidin 1,5 und Arginin 6,4;
Isoelektrischer pH-Wert: 8,4 ± 0,5;
Discelektrophorogramm:
Die Acrylamid-Discelektrophorese (Polyamidkonzentration 7,5%; 1N-KOH-Eisessig-Puffer von pH 4,3) unter den Bedingungen 30 µg Probe, Stromstärke 4 mA, Dauer 2 h/Gel, Anfärbung mit Amidoschwarz 10B und Entfärbung mit 7 %-Essigsäurelösung, ergab ein sehr scharfes Einzelband im Abstand von 2,221 ± 0,061 cm (mit dem Distanzhalter-Gelende als Bezugspunkt);
Biologische Eigenschaften:
Der erfindungsgemäße aktive Faktor hat eine Insulinsekretionsfördernde und Glucosetoleranz-verbessernde Wirkung für Säugetiere und diese Wirkungen halten mehrere Wochen bis mehrere Monate mit einer Einzeldosis an. Die akute Toxizität (LD₅₀) beträgt etwa 200 µg/kg Körpergewicht in Mäusen von ddy-Stamm (bei intravenöser Injektion).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel I Gewinnung der proteinartigen biologisch aktiven Substanz

1. Lyophilisierte und konservierte Bordetella pertussis (Stamm Tohama Phase I)-Mikroorganismen (zur Verfügung gestellt vom Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) wurden 2 Tage lang nach der Plattenmethode kultiviert in Bordet-Gengou-Medium bei 37°C, worauf mit einem Platinlöffel ein Löffel voll des Bakteriums eingeimpft wurde in einen 500 ml-Schüttelkolben, in den 200 ml eines Ionenaustauscherharzes unter Zusatz von modifiziertem Cohen-Wheeler- Medium (CW-Medium) der in der unten angegebenen Tabelle 1 angegebenen Zusammensetzung einpipettiert worden war, worauf schließlich 20 bis 22 Stunden lang als Schüttelkultur bei 37°C kultiviert wurde. Die Bakterienkonzentration in der Kulturlösung wurde mit Hilfe eines Spektrophotometers (Wellenlänge 650 nm) gemessen und diese Lösung wurde in einen 2-l-Schüttelkolben eingebracht, in den das mit CW-Medium versetzte Ionenaustauscherharz in solcher Menge einpipetiert worden war, daß die Endkonzentration an Bakterien etwa 0,1 × 10⁹ Zellen/ml betrug, und anschließend wurde 48 Stunden lang als Schüttelkultur (Schüttelfrequenz 97mal/ min) bei 37°C kultiviert.

Die bakteriologischen Eigenschaften des angegebenen Stammes waren in Übereinstimmung mit denjenigen, wie sie in der oben genannten Literatur bezüglich Bordetella pertussis Phase I-Stämmen beschrieben werden.

Die Zusammensetzung des verwendeten Cohen-Wheeler Mediums (CW- Mediums) ist in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1

Zum Gebrauch wurde dieses flüssige Medium mit destilliertem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1000 ml aufgefüllt und nach Einstellung des pH-Werts auf 7,2 mit 20%iger NaOH-Lösung wurde außerdem mit 3 g eines Anionenaustauschharzes versetzt und anschließend im Autoklaven 15 Minuten lang bei 121°C behandelt.

Die nach 48stündiger Züchtung erhaltene Schüttelkulturlösung wurde bei 56°C 30 Minuten lang erhitzt und danach bei 4°C zentrifugiert (bei 15 000 UpM), um in einen Überstand und die Bakterienzellen zu trennen, worauf der auf diese Weise erhaltene Überstand der Kulturlösung als Ausgangsmaterial zur Reinigung und Isolierung des erfindungsgemäßen aktiven Faktors verwendet wurde.

10 l des Überstands wurden nach Einstellung des pH-Werts auf 6,0 mit 1 N-HCl auf eine Hydroxylapatit-Säule (2,5 × 4 cm) bei einer Fließrate von 200 ml/h aufgebracht, wobei dies die erste Isolier- bzw. Reinigungsstufe darstellte.

Der Hauptanteil des Proteins passierte die Säule ohne daran adsorbiert zu werden und an dieser Fraktion war die gesuchte Insulinsekretion- Aktivität (vgl. die weiter unten beschriebene Aktivitäts- Meßmethode) kaum feststellbar. Die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Lowry et al (vgl. die Fußnote am Ende der weiter unten angegebenen Tabelle 2) gemessen.

Zur Bestimmung der adsorbierten Substanzen wurde die Säule zuerst mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 6,0) gewaschen und anschließend wurden nach Erhöhung der molaren Konzentration des Phosphatpuffers auf 0,1 und des pH-Werts auf 7,0 die adsorbierten Proteine successiv eluiert. Der erfindungsgemäße aktive Faktor wurde jedoch unter diesen Bedingungen nicht eluiert. Eine zusätzliche Elution wurde daher durchgeführt mit einem Phosphatpuffer der gleichen Zusammensetzung, der jedoch 0,5 M NaCl enthielt. Unter diesen Bedingungen konnte der erfindungsgemäße aktive Faktor mit hoher Wirksamkeit eluiert werden in Übereinstimmung mit der eluierten Proteinfraktion (vgl. Fig. 1, in der "Phosphatpuffer" mit "P. B." abgekürzt ist).

Der erhaltene aktive Faktor wurde konzentriert und nach Einbringung in eine Dialysemembran mit maximaler Durchlässigkeit für Molekulargewicht 8000 wurde er zweimal (insgesamt 12 Stunden) mit destilliertem Wasser und zweimal (insgesamt 12 Stunden) mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 6,0) dialysiert. Zur weiteren Reinigung wurde die den dialysierten aktiven Faktor enthaltende Lösung durch eine Säule (1,5 × 10 cm) von "Carboxymethyl Sepharose CL-6B", die ins Gleichgewicht gesetzt war mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 6,0), geschickt. Die an diese Säulenfüllung nicht adsorbierten Materialien hatten keine Aktivität. Dann wurde nach Erhöhung der molaren Konzentration und des pH-Werts des Phosphatpuffers auf 0,1 bzw. 7,0 eine entsprechende Elution unter Zusatz von 0,5 M Natriumchlorid durchgeführt, wobei der erfindungsgemäße aktive Faktor in Übereinstimmung mit der eluierten Proteinfraktion erhalten wurde (vgl. Fig. 2, in der die gleichen Abkürzungen wie in Fig. 1 verwendet werden).

Da das erhaltene Produkt noch immer eine geringe Menge an in der Discelektrophorese nachweisbaren Verunreinigungen enthielt, wurde der aktive Faktor weiter konzentriert und nach Einbringung in eine Dialysemembran zweimal (insgesamt 12 Stunden) mit destilliertem Wasser und zweimal (insgesamt 12 Stunden) mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert, und die dialysierte Probe wurde durch eine Säule (1,5 × 8 cm) von "Con A-Sepharose 4B" geschickt, die ins Gleichgewicht gesetzt worden war mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 7,0).

Durch Entwicklung mit der gleichen Pufferlösung wurde eine nur in Spuren vorliegende Menge an Protein eluiert, doch wies diese Proteinfraktion keine Aktivität auf. Die weitere Elution mit 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthielt, ergab den aktiven Faktor in Übereinstimmung mit der eluierten Proteinfraktion (vgl. Fig. 3, in der die gleichen Abkürzungen wie in Fig. 1 verwendet werden).

Da die erhaltene Fraktion noch immer eine winzige Menge an in der Discelektrophorese nachweisbaren Verunreinigungen enthielt, wurde dieser Proteinanteil gesammelt und kondensiert sowie mit 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthielt, dialysiert, worauf die dialysierte Probe einer Gelfiltration durch eine Säule (2,8 × 60 cm) von "Biogel P-100", die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzt worden war, unterworfen wurde. Auf diese Weise wurde der reine aktive Faktor in Übereinstimmung mit der erhaltenen Proteinfraktion erhalten, der seinen Gipfel beim Molekulargewichtswert von etwa 80 000 aufwies (vgl. Fig. 4).

Das auf diese Weise erhaltene neue Protein wurde, wie bereits erwähnt, Islets-Aktivierungs-Protein (IAP) genannt.

Die bei diesem Isolier- und Reinigungsverfahren erhaltenen Aktivitäten, Reinheitsgrade und anderen Daten sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt. Die Charakterisierung dieser Substanz wurde weiter oben bereits beschrieben.

Tabelle 2

Die Reinheit der in der angegebenen Endstufe erhaltenen, mit Islets-Aktivierungs-Protein (IAP) bezeichneten Substanz wurde nach der Discelektrophorese bestimmt mit Polyacrylamidgel (Polyacrylamidkonzentration 7,5%, 1 N-KOH-Eisessigpuffer (pH 4,3)).

Die Methode von J. V. Maizel, Jr. (Biochem. Biophys. Res. Comm., 1963, 13, 483) wurde für die experimentelle Durchführung verwendet.

Die Probenmenge pro Gel betrug 30 µg (als Protein) und die experimentelle Durchführung erfolgte durch Anlegen eines Stroms von 4 mA während 2 Stunden, Anfärben mit Amidoschwarz 10B und Entfärben mit 7%iger Essigsäurelösung. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 5 wiedergegeben (welche eine graphische Darstellung der Gelbande und das entsprechende, unter Verwendung eines Densitometers erhaltene Elektropherogramm zeigt).

Es wurde sichergestellt, daß die in dieser Endstufe erhaltene Verbindung eine einzige, von Verunreinigungen völlig freie Substanz ist, und daß die in Beispiel 2 erläuterte Insulinsekretionsfördernde Aktivität in guter Übereinstimmung mit dieser isolierten Substanz war. Zur Bestimmung der Substruktur von IAP wurde die Substanz der im folgenden näher beschriebenen SDS (Natriumdodecylsulfat)- Polyacrylamidgel-Elektrophorese nach der Methode von Shapilo et al (A. L. Shapilo et al, Biochem. Biophys. Res. Comm., 1967, 28, 815) unterworfen.

50 µg/Röhrchen (Einwaage als Protein) IAP-Probe wurden zu einem Gemisch von 1% SDS, 1% 2-Mercaptoäthanol und 4 M-Harnstoff zugegeben und nach 2 Stunden langer Inkubation bei 37°C wurde das Gemisch auf 10% Polyacrylamidgel mit einem Gehalt an 1% SDS aufgebracht, worauf nach 4 Stunden langer Stromeinwirkung von 8 mA/Gel mit Coomassie-Blau gefärbt und mit 7,5%iger Essigsäure entfärbt wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Fig. 6 wiedergegeben (welche eine graphische Darstellung der Gelbanden und das entsprechende, mit Hilfe eines Densitometers erhaltene Elektropherogramm zeigt, wobei die Abkürzung "SDS" für "Natriumdodecylsulfat" steht).

2. Lyophilisierte und konservierte Bordetella pertussis-Mikroorganismen (Stamm NIH 114 (3779B) (zur Verfügung gestellt vom Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) wurden sie in Beispiel I-1 beschrieben als Schüttelkultur gezüchtet und getrennt, wobei 10 l Überstand der Flüssigkultur erhalten wurden.

Der erhaltene Überstand wurde in zwei Teile geteilt, wovon einer auf eine Hydroxyapatitsäule (2,5 × 4 cm) bei einer Fließrate von 200 ml/h aufgebracht wurde nach Einstellung des pH-Werts des Überstands auf 6,0 mit 1N HCl. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und dann wurde das Adsorbat eluiert mit 0,1 M Phosphatpuffer, der 0,5 M NaCl enthielt und einen pH-Wert von 7,0 hatte.

Das auf diese Weise erhaltene Eluat wurde in die Dialysemembran mit maximaler Durchlässigkeit für Molekulargewicht 8000 eingebracht und dreimal (insgesamt 18 Stunden) gegen destilliertes Wasser dialysiert, wobei die aktive Substanz erhalten wurde. Die erhaltene Substanz wurde sodann lyophilisiert, wobei ein feines Proteinpulver mit bräunlich-weißer Farbe (Probe A) erhalten wurde, das äquivalent war dem IAP, dem Insulinsekretion-fördernden Faktor.

Der zweite Teil des Überstands (5 l) der Flüssigkultur wurde mit (NH₄)₂SO₄ bis zu einem 90%igen Sättigungswert (Einstellung des pH-Werts auf 6,5 mit schwachem Ammoniakwasser) versetzt, wodurch fast die gesamten proteinartigen Substanzen ausgefällt wurden. Danach wurde der Niederschlag vollständig mit Wasser gewaschen und anschließend ausgelaugt mit 0,1 M Tris-0,5 M NaCl- Puffer (pH 9). Die erhaltene Extraktlösung wurde zunächst mit 1 N HCl neutralisiert und danach dreimal (insgesamt 18 Stunden) gegen destilliertes Wasser dialysiert unter Verwendung der angegebenen Dialysemembran, und es wurden 11,2 mg lyophilisiertes Pulver (Probe B) erhalten.

3. Unter Verwendung von lyophilisierten und konservierten Bordetella pertussis-Mikroorganismen, Stamm Maeno Phase I (zur Verfügung gestellt vom Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) wurde das in Beispiel I-1 beschriebene Verfahren wiederholt und es wurden 23,6 bzw. 10,8 mg lyophilisierte Pulverproben der aktiven Substanzen (Proben C und D) erhalten.

Aktivität und akute Toxizität jeder Probe.

Die spezifische Aktivität jeder Probe wurde nach der in Beispiel II beschriebenen Methode bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt.

Probe
Spezifische Aktivität (Einheiten/µg)
A
57,1
B	93,0
C	127,2
D	81,0

Die akute Toxizität (LD₅₀) jeder Probe ist in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt.

Probe
LD₅₀ (µg/kg Körpergewicht)
Intravenöse Injektion an Mäuse
A
1620
B	2510
C	2890
D	3020

Die Ergebnisse zeigen, daß die in Form von Pulver erhaltenen Proben der aktiven Substanz als Arzneimittel oder Prophylaktika für Diabetes ebenso wie IAP geeignet sind, wobei zu berücksichtigen ist, daß ihre effektive Dosis 1 bis 100 µg/kg Körpergewicht beträgt.

4. Bordetella pertussis-Mikroorganismen (Stamm Tohama, Phase I) (zur Verfügung gestellt vom Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Science) wurden in gleicher Weise wie im Beispiel I-1 beschrieben kultiviert und der Überstand des Kulturmediums, der durch Abtrennung der Organismen aus dem Medium erhalten wurde, diente als Ausgangsmaterial. Durch Trockeneis gekühltes Aceton wurde in 100 l Überstand unter Schütteln und Eiskühlung in solcher Weise eingetropft, daß eine Endkonzentration von 60% erzielt wurde. Dann wurde der gebildete Niederschlag mit einem kontinuierlichen Zentrifugalseparator (5000 UpM, 4°C) abgetrennt. Der auf diese Weise erhaltene Niederschlag wurde getrocknet und das erhaltene Produkt wurde in 500 ml 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 6,0) gelöst und danach auf eine Säule (5 × 4 cm) von Hydroxylapatit aufgebracht. Die Aktivität war in derjenigen Fraktion angesammelt, welche mit 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthielt, eluiert wurde. Die eluierte Substanz wurde gesammelt, konzentriert und dialysiert gegen 0,01 M-Phosphatpuffer (pH 6,0), worauf sie auf eine Säule (2,5 × 25 cm) von "CM-Sepharose CL-6B", die mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gesetzt worden war, aufgebracht wurde, und die aktive Substanz wurde schließlich in 0,1 M-Phosphatpuffer mit einem Gehalt an 0,5 M NaCl eluiert. Die auf diese Weise eluierte aktive Substanz wurde gesammelt, konzentriert und dialysiert gegen 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthielt. Danach wurde die aktive Substanz auf eine Säule (2 × 105 cm) von "Biogel P-150" aufgebracht, die ins Gleichgewicht gesetzt worden war mit 0,1 M-Phosphatpuffer, der 0,5 M NaCl und 4 M Harnstoff enthielt. Bei der erhaltenen aktiven Substanz handelte es sich um ein Protein, das seinen Gipfel im Bereich eines Molekulargewichts von etwa 80 000 hatte, und es wurden 38 mg der Substanz in Form ihres lyophilisierten Pulvers erhalten. Die chemische Zusammensetzung der auf diese Weise erhaltenen Substanz war wie folgt: Protein 95 Gew.-% und darüber, Kohlenhydrat 1 bis 2 Gew.-% und Lipide nicht feststellbar. Die spezifische Aktivität betrug 930 Einheiten/µg.

5. Lyophilisierte und konservierte Bordetella pertussis-Mikroorganismen (Stamm Tohama, Phase I) (zur Verfügung gestellt vom Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) wurden wie im Beispiel I-4 beschrieben als Schüttelkultur gezüchtet und es wurden 100 l Überstand durch Abtrennen der Bakterienzellen von der Flüssigkultur erhalten. Der erhaltene Überstand wurde mit 50% wäßrigem Zinkchlorid unter Schütteln und bei niedriger Temperatur versetzt zur Einstellung des pH-Werts auf 6,0 (Endkonzentration 1%). Der erhaltene Niederschlag wurde in 10%igem Dinatriumhydrogenphosphat gelöst und in eine Dialysemembran eingebracht, worauf mit Wasser dialysiert und anschließend mit 0,01 M-Phosphatpuffer ins Gleichgewicht gesetzt wurde. Die erhaltene Lösung wurde auf eine Säule (10 × 5 cm) von Hydroxylapatit aufgebracht und zunächst wurde mit 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und anschließend mit 0,1 M- Phosphatpuffer, der 0,5 M NaCl enthielt, eluiert. Das erhaltene Eluat wurde konzentriert und auf eine Säule (2,5 × 100 cm) aus "Sephacryl S-200" aufgebracht, worauf mit 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl und 4 M-Harnstoff enthielt, eluiert wurde. Danach wurde eine Gelfiltration durchgeführt und die aktive Substanz wurde auf diese Weise erhalten.

Das Molekulargewicht der erhaltenen aktiven Substanz wurde mit Hilfe der Gelfiltration auf etwa 72 000 geschätzt und es wurden 40 mg in Form des getrockneten Pulvers erhalten. Die gewonnene Substanz hatte eine chemische Zusammensetzung von etwa 95 und mehr Gew.-% Protein, 1 bis 2 Gew.-% Kohlenhydrat und kein nachweisbares Lipoid. Die spezifische Aktivität betrug 890 Einheiten/ µg.

6. Bordetella pertussis-Mikroorganismen (Stamm Tohama, Phase I) (zur Verfügung gestellt vom Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) wurden in Bordet-Gengou-Medium bei 37°C zwei Tage lang und ferner in Bordet-Gengou-Schrägkultur bei 37°C 20 bis 24 Stunden lang kultiviert, worauf mit einem Platinlöffel ein Löffel voll des Bakteriums eingeimpft wurde in mit Aktivkohle versetztes modifiziertes festes Cohen-Wheeler-Medium (CA-Medium), das die in der unten angegebenen Tabelle 5 aufgeführte Zusammensetzung hatte, und es wurde 48 Stunden lang bei 37°C kultiviert. 5 kg der erhaltenen feuchten Bakterienzellen wurden in 5 l destilliertem Wasser suspendiert und 1 Stunde lang bei 56°C gehalten.

Nach dem Abkühlen wurde die Suspension mit Thimerosal bis zu einer Endkonzentration von 0,01% versetzt und zentrifugiert (15 000 UpM, 30 Minuten), um die Bakterienzellen zu sammeln. Die erhaltenen Zellen wurden in destilliertem Wasser, das 4 M Harnstoff und 1 M NaCl enthielt, suspendiert und danach der Einwirkung von Ultraschall bei niedriger Temperatur (4°C) unterworfen, um die Bakterienzellen zu zerstören.

Die erhaltene Suspension wurde zentrifugiert (15 000 UpM, 30 Minuten) und der niederschlagfreie Überstand wurde mit Wasser dialysiert und danach mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 0,6) ins Gleichgewicht gesetzt, worauf er auf eine Säule (10 × 5 cm) von Hydroxylapatit aufgebracht wurde. Nach dem Waschen der adsorbierten Verunreinigungen mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 0,6) und 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) wurde die gesuchte aktive Substanz mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthielt, eluiert.

Die auf diese Weise erhaltene aktive Substanz wurde ins Gleichgewicht gesetzt mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 6,0) und danach auf eine Säule (2,5 × 30 cm) von "CM-Sepharose CL-6B" aufgebracht. Die Säule wurde zuerst mit 0,05 M Phosphatpuffer (pH 6,0) gewaschen und dann mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthielt, eluiert, wobei die aktive Substanz herauseluiert wurde. Die erhaltene aktive Substanz wurde konzentriert und in 0,1 M Phoshatpuffer (pH 7,1), der 4 M Harnstoff und 0,5 M NaCl enthielt, gelöst und die Lösung wurde auf eine Säule (2,5 × 115 cm) von "Sephacryl S-200" aufgebracht.

Daran schloß sich eine Elution mit einem Lösungsmittel an und es wurden 40 mg der gesuchten aktiven Substanz erhalten.

Das Molekulargewicht dieser Substanz, gemessen durch Gelfiltration, ergab sich zu 74 000, und die chemische Zusammensetzung war mehr als 95 Gew.-% Protein, 2 Gew.-% Kohlenhydrat und kein nachweisbares Lipoid. Die spezifische Aktivität betrug 920 Einheiten/ µg.

Die Zusammensetzung des verwendeten CA-Mediums ist in der folgenden Tabelle 5 aufgeführt.

Casaminosäure|10 g
Hefeextrakt	1 g
Kaliumdihydrogenphosphat	0,5 g
lösliche Stärke	1,5 g
0,5%ige Kupfersulfatlösung	1 ml
1%ige Magnesiumchloridlösung	1 ml
Polypepton	5 g
1%ige Cystinlösung	2,5 ml
0,5%ige Eisensulfatlösung	1 ml
Natriumchlorid	2,5 g
pulverförmiger Agar-Agar	18 g
destilliertes Wasser	1000 ml

Zum Gebrauch dieses festen Mediums wurde das Gemisch durch Erhitzen gelöst, nach Einstellung des pH-Wertes auf 7,2 wurde das Medium ferner mit 5 g pulverförmiger Aktivkohle versetzt und danach im Autoklaven bei 121°C 20 Minuten lang behandelt.

7. Verschiedene Affinitätschromatographieverfahren, die von den Eigenschaften von IAP Gebrauch machen, erwiesen sich als erfolgreich zur Herstellung der erfindungsgemäßen aktiven Substanz. Diese Methode ermöglicht es durch geeignete Kombination einer Reihe von Prozeduren, wie sie in Beispiel I-1 beschrieben werden, einen Teil der Verfahrensstufen auszulassen. Ferner sind bei dieser Methode sowohl Reinigungsgrad als auch Ausbeute fast die gleichen wie in Beispiel I-1. Die Durchführung dieser Methode ist wie folgt.

A) Lyophilisierte und konservierte Bordetella pertussis-Mikroorganismen (Stamm Tohama, Phase I) (zur Verfügung gestellt vom Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) wurden wie in Beispiel I-1 beschrieben kultiviert. 10 l des erhaltenen Überstands der Flüssigkultur wurden auf eine Säule (Säulenabmessungen 5 × 2 cm, Fließrate 60 ml/h) von Hydroxylapatit aufgebracht und dann mit 300 ml 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen. Danach wurde 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 M NaCl enthielt, mit einer Fließrate von 15 ml/h durchgeleitet, um die aktive Substanz heraus zu eluieren. Die erhaltene aktive Substanz wurde konzentriert bis zu etwa 15 ml mit "Ficol 400" und danach viermal (Gesamtdauer 24 Stunden) mit 2 l destilliertem Wasser und außerdem viermal (Gesamtdauer 24 Stunden) mit 1 l 0,01 M Acetatpuffer (pH 4,5), der 0,1 M Natriumchlorid enthielt, oder mit 0,1 M Lithiumchlorid- Hydrogenchlorid (pH 4,5) dialysiert, um ins Gleichgewicht zu setzen. Das erhaltene Produkt wurde auf eine Säule (1,2 × 8 cm) von p-Acetoxymercurianilin-Sepharose 6 MB (vgl. die unten angegebene Herstellungsmethode), die mit dem gleichen Puffer wie oben angegeben ins Gleichgewicht gesetzt worden war, aufgebracht mit einer Fließrate von 5 ml/h, und nach gutem Waschen mit dem gleichen Puffer wurde die adsorbierte aktive Substanz eluiert mit dem gleichen Puffer, der mit 0,01 M L-Cystein versetzt worden war.

Die erhaltene aktive Substanz wurde gesammelt und danach auf etwa 5 ml mit dem angegebenen "Ficol-400" konzentriert, worauf sie dreimal (Gesamtdauer 12 Stunden) gegen 2 l 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) enthaltend 4 M Harnstoff und 0,5 M Natriumchlorid, dialysiert wurde, um sie ins Gleichgewicht zu bringen, und sie wurde ferner ins Gleichgewicht gesetzt mit dem gleichen Puffer. Die Gelfiltration wurde an einer Säule (2,8 × 95 cm) von "Sephacryl S200" durchgeführt.

Die aktive Substanz wurde als einziger Gipfel erhalten im Molekulargewichtsbereich von 65 000 ± 7000 (was später durch fließendes Markierungsprotein entschieden wurde), der mit dem Aktivitätsgipfel übereinstimmte. Die aktive Substanz wurde dialysiert (gegen 2 l destilliertes Wasser, fünfmal 48 h) und danach lyophilisiert, wobei 2,1 mg weißes Pulver erhalten wurden.

Das erhaltene Produkt ergab eine einzige Bande bei der Polyacrylamidgel- Elektrophorese (Gel von pH 4,3) und wies eine Zusammensetzung von mehr als 98% Protein auf und es wurde weder Kohlenhydrat noch Lipoid festgestellt.

Die Methode zur Herstellung von p-Acetoxymercurianilin (PAMA)- Sepharose 6 MB war wie folgt: 4 g CNBr-aktivierte Sepharose 6 MB wurde mehrmals gewaschen und auf einem Glasfilter gequollen unter Verwendung von 1 l 10^-3N HCl. Getrennt davon wurde eine Lösung hergestellt durch Lösen von 172 mg (0,5 m M) p-Acetoxymercurianilin in 50 ml 60%iger Dimethylformamidlösung von 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,3, enthaltend 0,5 M Natriumchlorid). Nach Beendigung des Waschens und Quellens des Gels wurde die angegebene Lösung zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur (22 bis 25°C) 2 Stunden lang gut geschüttelt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Produkt gut mit dem gleichen Puffer gewaschen, und nach Zugabe von 50 ml 1 M Monoäthanolamin (pH 9,0) zu dem Gel wurde das Gemisch bei Raumtemperatur 2 Stunden lang gut geschüttelt. Dann wurde das Gel mit einem Glasfilter abgesaugt, mehrere Male abwechselnd mit 1 l 0,1 M Boratpuffer (pH 8,5) und 1 l 0,1 M Acetatpuffer (pH 4,0) gewaschen, und schließlich ins Gleichgewicht gesetzt mit 0,01 M Acetatpuffer (pH 4,5, der 0,1 M Natriumchlorid enthielt) oder mit 0,1 M Lithiumchlorid- Salzsäure (pH 4,5). Wahlweise wird das Gel zuvor mit dem gleichen Puffer, der 1% 2-Mercaptoäthanol enthält, behandelt und danach ausreichend gewaschen und mit dem gleichen Puffer ins Gleichgewicht gebracht.

B) Lyophilisierte und konservierte Bordetella pertussis-Mikroorganismen (Stamm Tohama, Phase I) (zur Verfügung gestellt vom Department of Bacteriology, Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences) wurden wie in Beispiel I-1 beschrieben kultiviert und 10 l des auf diese Weise erhaltenen Überstands der Flüssigkultur wurden auf eine Säule (Säulenabmessungen 5 × 2 cm, Fließrate 60 ml/h) von Hydroxylapatit aufgebracht und dann mit 300 ml 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und anschließend wurde 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0) bei einer Fließrate von 15 ml/h durchfließen gelassen.

Die erhaltene aktive Substanz wurde konzentriert bis zu etwa 15 ml mit "Ficol 400" und dann viermal (Gesamtdauer 24 Stunden) mit 2 l destilliertem Wasser und ferner viermal (Gesamtdauer 24 Stunden) mit 1 l 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert, um mit diesem Puffer ins Gleichgewicht zu setzen.

Die aktive Substanz wurde sodann auf eine Säule (1,8 × 13 cm) von Anti-IAP Antikörper-Sepharose 4B (vgl. das weiter unten angegebene Herstellungsverfahren) aufgebracht und dann gut mit etwa 200 ml 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 M NaCl enthielt, gewaschen, worauf mit 0,1 M Glycin-Salzsäure (pH 3,0), enthaltend 2 mM Äthylendiamintetraessigsaures Na (EDTA) und 0,15 M NaCl eluiert wurde bei einer Fließrate von 60 ml/h.

Das Eluat wurde sofort mit 1 M Glycinpuffer (pH 11,5) neutralisiert.

Die aktive Substanz wurde gesammelt und dialysiert (dreimal 48 h) gegen 5 l destilliertes Wasser und es wurden 1,9 mg weißes Pulver erhalten.

Das Molekulargewicht dieser Substanz, gemessen durch Gelfiltration, betrug 70 000 ± 5000 und die Substanz ergab eine einzige Bande bei der Polyacrylamidgelelektrophorese (Gel von pH 4,3). Sie hatte eine chemische Zusammensetzung von etwa 97% und mehr Protein, 1% und weniger Kohlenhydrate und kein Lipoid war feststellbar.

Das Verfahren zur Herstellung von Anti-IAP Antikörper-Sepharose 4B war wie folgt: 10 g CNBr-aktivierte "Sepharose 4B" wurden gewaschen und wiederholt gequollen auf einem Glasfilter unter Verwendung von 2 l 10^-3 N-HCl. Getrennt davon wurde eine Lösung hergestellt durch Lösen von 100 g Anti-IAP Antikörper in 50 ml 0,1 M Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,3), der 0,5 M NaCl enthielt. Unmittelbar nach Beendigung des Waschens und Quellens des Gels wurde die angegebene Lösung zugesetzt und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur (22 bis 25°C) 2 Stunden lang gut geschüttelt.

Nach Beendigung der Reaktion wurde das Gel mit einem Glasfilter abgenutscht und mehrere Male mit dem gleichen Puffer gewaschen zur Entfernung von überschüssigem Anti-IAP Antikörper, worauf 100 ml 1 M Monoäthanolamin zugesetzt und das Gemisch zur guten Durchmischung 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gut geschüttelt wurde.

Nach der Umsetzung wurde mehrere Male mit dem angegebenen Puffer gewaschen, worauf mit 1 l 0,1 M Essigsäurepuffer (pH 4,0), der 0,5 M NaCl enthielt, gewaschen wurde (diese Prozedur wurde dreimal wiederholt unter pH-Änderung).

Schließlich wurde das Produkt mit 1 l des gleichen Puffers wie angegeben gewaschen (Konservierung erfolgt im Bereich von 4 bis 8°C).

Beispiel II Pharmakologische Eigenschaften der proteinartigen aktiven Substanz 1. Bestimmung der Insulinsekretion-fördernden Aktivität

Die Insulinsekretion-fördernde Aktivität von IAP und seinen äquivalenten Verbindungen ist bestimmbar durch Messen des Tierverhaltens gegen verschiedene Arten von Insulinsekretion-Stimulantien, wobei für diesen Zweck in der Regel Glucose als Stimulans verwendet wird.

Als Versuchstiere dienten männliche Wistar-Ratten (mit einem Körpergewicht von 130 bis 140 g).

Die Testmethode war wie folgt: Die roh gereinigten oder hoch gereinigten aktiven Substanzen mit verschiedener Stärke wurden in einer physiologischen Kochsalzlösung gelöst und jeweils 0,2 ml dieser Lösungen wurden unter Ätheranästhesie intravenös injiziert in die Femoralvene der Testratten, und die Insulinsekretionsaktivität jeder Substanz wurde 3 Tage später gemessen. Die Ratten wurden 18 bis 20 Stunden vor dem Experiment fasten gelassen. Zum Messen der Aktivität wurde 0,1 ml Blut aus der Schwanzvene jeder Ratte entnommen, unmittelbar danach wurden eine 30%ige Glucoselösung in einer Menge von 1 ml pro 100 g Körpergewicht intraperitoneal injiziert und genau 15 Minuten später wurde erneut 0,1 ml Blut in der angegebenen Weise entnommen. Die Insulinsekretionsaktivität wurde bestimmt aus der Differenz des Blutglucosespiegels und der Insulinkonzentration im Blut vor und nach der Glucoseverabreichung. Der Blutglucosespiegel wurde gemessen nach der Glucoseoxidase-Methode und die Insulinkonzentration nach der Doppelantikörper-Methode.

Die für den folgenden pharmakologischen Versuch verwendete Parenterallösung zur intravenösen Injektion hatte die gleiche Zusammensetzung wie angegeben. Die Meßmethoden, welche zur Bestimmung von Blutglucose und Plasmainsulin angewandt wurden, ergeben sich aus folgenden Literaturstellen bzw. Fertigpacks:
Blutglucosespiegel:
Glucoseoxidase-Methode nach Bergmeyer H. U. und Bernet E. in "Methods of Enzymatic Analysis", Herausgeber Bergmeyer H.-U., New York Academic Press P 123 (1963);
Glucostat:
Insulinkonzentration:
Doppelantikörper-Methode nach Morgan C. R. und Razarow A.: Diabetes, 12, 115 (1963), Insulin immunoassay kit von Dainabot Radioisotope Laboratories;
Berechnungsmethode der Insulinsekretionsaktivität:
Zunächst wurden die ΔI/ΔG-Werte an aktiver Substanz der behandelten und der Vergleichsgruppe der Versuchstiere nach folgender Gleichung berechnet:

Die Einbeziehung des Blutglucosespiegels für die Berechnung der Aktivität erfolgt deshalb, weil die Menge an ausgeschiedenem Insulin vom Blutzuckerspiegel stark beeinflußt wird.

Die Einheit jeder aktiven Substanz wird durch die folgende Gleichung wiedergegeben:

Die spezifische Aktivität dieser Substanz wird durch Division der Einheit durch die Proteinmenge (bestimmt nach der Methode von Lowry et al) erhalten.

Beziehung zwischen Dosierung und Ansprechbarkeit

Die Einheit und Dosierung (ausgedrückt als Protein) von IAP, das gemäß Beispiel I-1 erhalten wurde, sind in der folgenden Tabelle 6 wiedergegeben.

Tabelle 6

Die gereinigte IAP-Probe zeigt eine S-förmige Dosis-Ansprechbarkeit- Beziehung, doch wurde ein möglichst linearer Teil der Kurve (250 bis 1000 ng) zur Berechnung von Einheiten und Reinigungsstufen sowohl für IAP als auch seine äquivalenten Verbindungen ausgewählt.

2. Zusammenfassung der pharmakologischen Wirkungen der proteinartigen aktiven Substanzen

Die erfindungsgemäße biologisch aktive Substanz zeichnet sich insbesondere durch ihre hervorstehende Insulinsekretion-fördernde Aktivität aus, sie besitzt jedoch auch andere pharmakologisch wertvolle Wirkungen, z. B. eine Verbesserung der Glucosetoleranz, eine Erhöhung der Insulinsekretion-Ansprechbarkeit, eine Beschleunigung der Heilung von Streptozotocin-induziertem Diabetes und eine Verbesserung der Glucosetoleranz bei Hereditär-Diabetes. Als vorteilhaft erweist sich ferner, daß diese Aktivitäten mehrere Wochen bis mehrere Monate anhalten bei einer einzigen Verabreichung dieser Substanz. Aufgrund der Tatsache, daß in den getesteten Tieren, einschließlich Mäusen, Ratten und Hunden, vollständig die gleichen Phänomene gefunden wurden, ist anzunehmen, daß die pharmakologischen Wirkungen dieser Substanz bei unterschiedlichen Tierarten nicht wesentlich variieren.

Es wird angenommen, daß diese Substanz ihre beste Anwendbarkeit als Heilmittel für Diabetes hat. Zur Zeit besteht die Medikation für Diabetes aus Insulininjektion oder oraler Verabreichung von Antidiabetesmitteln, doch handelt es sich dabei lediglich um symptomatische Behandlungen und nach Lage der Dinge kann Diabetes als unheilbare Krankheit angesehen werden. Erschwerend ist, daß der Patient praktisch täglich zur Insulininjektion ins Krankenhaus gehen muß und die Verabreichung der antidiabetischen Heilmittel schließt die Gefahr in sich, daß ein abnormer Abfall des Blutglucosespiegels bewirkt wird. Der hervorstehendste Vorteil der erfindungsgemäßen biologisch aktiven Substanz ist darin zu sehen, daß sie nicht nur von sich aus eine ausgeprägte Insulinsekretionsaktivität hat, sondern darüber hinaus auch die Wirkung besitzt, die Insulinkonzentration im Blut nur dann zu erhöhen, wenn der Blutglucosespiegel unter verschiedenen Bedingungen erhöht wurde (bei hyperglykämischem Zustand, insbesondere bei Glucosezufuhr, z. B. während der Nahrungsaufnahme) und den erhöhten Blutglucosewert rasch wieder auf den Normalwert zu bringen. Ein weiterer hervorstehender Vorteil der erfindungsgemäßen Substanz ist der, daß ihre Aktivität während einer Zeitdauer von mehreren Wochen bis sogar mehreren Monaten bei nur einer einzigen Verabreichung anhält. Hat daher die Insulinsekretionsreaktion auf den Blutglucosespiegel abgenommen, so ruft die Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz eine normale Insulinsekretionsaktivität hervor. Aufgrund dieser Eigenschaften findet die erfindungsgemäße Substanz einen weiten Anwendungsbereich, d. h. daß sie nicht nur als medizinisches Heilmittel für Diabetes, darauf zurückzuführende Komplikationen und durch Diabetes verursachte Alterskrankheiten brauchbar ist, sondern sich auch als wirksam erweist bei der Anwendung für Vordiabetes-Beschwerden oder als ein Vorbeugungsmittel oder Behandlungs- oder Diagnosemittel für Juvenildiabetes, für den eine wirksame Heilbehandlung noch nicht zur Verfügung steht.

3) Insulinsekretion-fördernde Aktivität

Diese Wirkung ist eine der bemerkenswerten Eigenschaften der erfindungsgemäßen biologisch aktiven Substanz, mit der Versuche durchgeführt wurden an Ratten (männliche Ratten des Stammes Wistar) und Hunden (sowohl männlichen als auch weiblichen Hunden der Beagle-Rasse).

Versuche an Ratten

Die experimentellen Bedingungen waren die gleichen wie sie zur Messung der oben beschriebenen Aktivitäten angewandt wurden, doch wurde in den vorliegenden Versuchen die Reaktivität gegen das betreffende Insulinsekretionsstimulans am dritten Tag nach Verabreichung von IAP an Ratten gemessen und mit den Werten an normalen Ratten (Vergleichstieren) verglichen (vgl. die unten angegebene Tabelle 7). Bei Verabreichung von Glucose, welche den häufigsten physiologischen Faktor darstellt, wurde eine ausgeprägte Erhöhung der Insulinkonzentration im Blut festgestellt über die Gruppe von Vergleichstieren, unabhängig vom Unterschied in der Art der Glucoseverabreichung. Ein merklicher Anstieg wurde auch in der Reaktivität gegen Hormonstimulantien, z. B. Glucagon (1 mg/kg) und Epinephrin (200 µg/kg) beobachtet. Ferner wurde auch eine erhöhte Insulinsekretionsaktivität von Tolbutamid (200 mg/kg) und Glibenclamid (2 mg/kg), die zur Zeit als Antidiabetesmittel in klinischem Gebrauch sind, festgestellt. Aus diesen Ergebnissen wurde sichergestellt, daß die Verabreichung der erfindungsgemäßen aktiven Substanz die Reaktivität des Organismus gegen Insulinsekretionsstimulantien merklich verbessern kann.

Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 aufgeführt, welche die Reaktivitätserhöhung gegen verschiedene Insulinstimulantien in mit IAP vorbehandelten Ratten wiedergibt.

Tabelle 7

1 µg IAP wurde 3 Tage vor Versuchsdurchführung intravenös injiziert.

Tabelle 7 zeigt Mittelwerte und Standardabweichungen aus den Werten von 5 Versuchstieren im jeweiligen Versuchsansatz.

In weiteren Versuchen wurden IAP-Proben mit verschiedenen Einheiten intravenös Hunden appliziert und 3 Tage später wurde mit Glucagon (25 µg/kg Körpergewicht, intravenöse Injektion) oder Glucose (0,3 g/kg Körpergewicht, intravenöse Injektion) stimuliert, um die Insulinsekretion-fördernde Aktivität zu bestimmen. Die Versuchstiere wurden 18 Stunden vor Versuchsdurchführung fasten gelassen.

Die bei Glucagon-Stimulierung erhaltenen Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle 8 aufgeführt. Eine, wenn auch geringe, Anregung der Insulinsekretion gegenüber den Vergleichstieren 5 Minuten nach Glucagonverabreichung in einer Dosis von 50 ng/kg Körpergewicht (Mengenangabe als Protein, was auch für die folgenden Anlagen zutrifft, wenn nichts anderes gesagt ist) wurde festgestellt und die Insulinsekretion wurde proportional zum Anstieg der Dosierung gefördert, wobei praktisch die höchste Reaktion bei einer Dosierung von 1 µg/kg erreicht wurde.

Eine ähnliche Potentialisierung der Insulinsekretionsaktivität wurde bei Zuführung von Glucose (orale und intravenöse Verabreichungen) und Epinephrin festgestellt. Die diesbezüglichen Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle 9 aufgeführt. Diese Ergebnisse zeigen, daß eine bemerkenswerte Erhöhung der Reaktivität gegenüber Insulinsekretionsstimulantien auch in Hunden durch Verabreichung von IAP induziert wird.

Die Ergebnisse der Versuche über Insulinsekretion-Anregung nach Verabreichung von Glucagon an mit IAP vorbehandelte Hunde sind in der folgenden Tabelle 8 aufgeführt.

Tabelle 8

Die Ergebnisse der Versuche über die Verbesserung der Insulinsekretion nach Verabreichung von Glucose und Ephinephrin an mit IAP vorbehandelte Hunde sind in der folgenden Tabelle 9 aufgeführt.

In den Tabellen 9 bis 15 steht "SE" für "Standardabweichung".

Tabelle 9

4. Glucosetoleranz-verbessernde Aktivität

Glucose wurde oral an Ratten und Hunde verabreicht und der Abfall des Blutglucosespiegels und der Insulinkonzentration im Blut nach dem Glucosezusatz wurde gemessen, um die Glucosetoleranz zu bestimmen. Die Glucose wurde an Ratten in einer Dosierung von 0,5 g/100 g Körpergewicht und an Hunde in einer Dosierung von 15 g/Hund verabreicht, nachdem die Versuchstiere 18 bis 20 Stunden lang gefastet hatten.

In den mit IAP behandelten Gruppen von Ratten und Hunden wurde der Anstieg des Glucosespiegels im Blut sehr ausgeprägt unterdrückt, während ein auffallender Anstieg der Insulinkonzentration im Blut erfolgte, wobei jedoch die Insulinkonzentration rasch auf den Wert vor der Glucosezugabe entsprechend der Normalisierung des Blutglucosespiegels zurückkehrte und kein Abfall des Blutglucosespiegels aufgrund einer übermäßigen Sekretion von Insulin festzustellen war. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen 10 und 11 aufgeführt, wobei Tabelle 10 die Änderungen der Konzentration an Blutglucose und Plasmainsulin in Hunden nach Glucoseverabreichung zeigt und Tabelle 11 die entsprechenden Werte bei Ratten wiedergibt. Diese Ergebnisse beweisen die ausgeprägte Verbesserung der Glucosetoleranz in den mit IAP behandelten Tieren.

Tabelle 10

Tabelle 11

5. Heilung von Streptrozotocin-induziertem Diabetes durch Vorbehandlung mit IAP

Es ist bekannt, daß die Zufuhr von Streptozotocin (im folgenden abgekürzt mit STZ) bei Versuchstieren Diabetes induziert durch ausgeprägte Zerstörung von B-Zellen der Langerhans′schen Inseln. Es zeigte sich jedoch, daß in mit IAP behandelten Ratten der STZ-induzierte Diabetes prompt geheilt wurde und die Blutglucosekonzentration und -toleranz bei Nichtfastenzustand normalisiert wurden.

Zur Versuchsdurchführung wurde den Ratten zunächst 1 µg IAP verabreicht und danach wurde STZ (5 mg/100 g durch intravenöse Injektion) 3 bis 5 Tage später zugeführt. 24 Stunden nach der STZ- Verabreichung wurde eine Hyperglycämie beobachtet sowohl in der Vergleichs- als auch in der behandelten Gruppe, doch erreichte in der behandelten Gruppe der Blutglucosespiegel den normalen Wert am fünften und siebenten Tag graduell nach der STZ-Verabreichung und die Konzentration an Plasmainsulin war ebenfalls ausgeprägt höher als diejenige der Vergleichsgruppe. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der unten angegebenen Tabelle 12 aufgeführt.

Ferner wurde am siebenten Tag nach der STZ-Verabreichung auch der Glucosezugabe-Versuch durchgeführt und die Glucosetoleranz bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der weiter unten angegebenen Tabelle 13 aufgeführt.

Wurden diese Ratten fasten gelassen, so wurde die Konzentration an Blutglucose offensichtlich gleich sowohl in der Vergleichsgruppe (die nur STZ erhalten hatte) als auch in der mit IAP behandelten Gruppe, doch wurde die Störung der Glucosetoleranz in der Vergleichsgruppe klar beobachtet im Vergleich zur normalen Gruppe.

Andererseits wurde in der behandelten Gruppe die Glucosetoleranz in solchem Maße verbessert, daß sie vergleichbar war derjenigen der normalen Gruppe, und der Plasmainsulingehalt als Reaktion auf die Glucosezufuhr war höher als derjenige der Vergleichsgruppe. Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß der STZ-induzierte Diabetes in den mit IAP vorbehandelten Tieren geheilt wird.

In der folgenden Tabelle 12 sind die Ergebnisse der Versuche über die Heilung von Streptozotocin-Diabetes bei Vorbehandlung mit IAP aufgeführt.

Tabelle 12

In der folgenden Tabelle 13 sind die Ergebnisse der Versuche über die Verbesserung der Glucosetoleranz bei Streptozotocin- Diabetes durch Vorbehandlung mit IAP aufgeführt.

Tabelle 13

6. Verbesserung der Glucosetoleranz durch IAP-Verabreichung an spontan diabetische Mäuse (KK-Mäuse) ähnlich dem Diabetes beim Menschen

Die KK-Maus wird als Modelltier der Pathosis ähnlich dem Diabetes beim Menschen angesehen, da sie beim Altern einen durch Hereditär- und Umweltfaktoren verursachten spontanen Diabetes bekommen kann. Der Befund, ob der therapeutische Effekt von IAP bei diesem Tier wirksam ist oder nicht, ist daher ein starkes Anzeichen für eine analoge Wirkung beim Menschen, so daß aus derartigen Tierversuchen wichtige Rückschlüsse gezogen werden können.

Der folgende Versuch wurde daher durchgeführt. Bei den verwendeten Mäusen handelte es sich um KK-Mäuse, die ursprünglich geliefert wurden von der Faculty of Agriculture, Nagoya University, wo auch die Paarung zwischen deren Brüdern und Schwestern sowie deren Züchtung fortgesetzt wurde. Zur Versuchsdurchführung wurde die Glucose durch orale Application (0,15 g/20 g Körpergewicht) an 20 bis 25 Wochen alte Mäuse verabreicht, worauf 5 Tiere, welche eine eindeutige Störung der Glucosetoleranz im Vergleich zur Normalgruppe (ddy-Stamm) zeigten, ausgesucht wurden. Wie sich aus der unten angegebenen Tabelle 14 ergibt, wurde ein Verschwinden der Glucose nach der Glucosegabe bei diesen Mäusen nicht beobachtet und diese Tiere können offensichtlich als in diabetischem Zustand befindlich angesehen werden. Dieser Gruppe von KK-Mäusen wurde Glucose erneut verabreicht am dritten Tag nach der Injektion der erfindungsgemäßen Substanz in die Schwanzvene. Als Folge davon stieg die Glucosetoleranz stark an im Vergleich zum Zustand vor der Verabreichung der erfindungsgemäßen Substanz. Ferner wurde die Glucosetoleranz sehr viel stärker verbessert als in der Normalgruppe. Es ist daher festzustellen, daß die Verabreichung von IAP einen befriedigenden therapeutischen Effekt bei spontanem Diabetes zur Folge hat.

In der folgenden Tabelle 14 sind die Ergebnisse der Versuche zur Verbesserung der Glucosetoleranz in KK-Mäusen durch Behandlung mit IAP aufgeführt.

Tabelle 14

7. Dauer der pharmakologischen Wirkung

Die pharmakologischen Wirkungen von IAP äußern sich mehrere Stunden nach der Verabreichung und erreichen den höchsten Wert nach 3 bis 7 Tagen, worauf sie graduell abfallen. Weiter unten sind die Ergebnisse von Versuchen wiedergegeben über die Dauer der Wirkung in Ratten (0,5 µg) und Hunden (1,0 µg/kg).

An Hunden wurden Untersuchungen durchgeführt über die Glucosetoleranz als Reaktion auf Glucoseverabreichung durch intravenöse Injektion am fünfzehnten Tag nach IAP-Applikation, und ebenso über die Insulinsekretionsaktivitäten als Reaktion auf Epinephrin- und Glucagongaben am neunundzwanzigsten bzw. zweiundvierzigsten Tag nach IAP-Applikation. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, daß ausreichende Aktivitäten noch am zweiundvierzigsten Tag beobachtet wurden, wie sich aus der unten angegebenen Tabelle 15 ergibt. Bei den Ratten wurde 50% der maximalen Aktivität (welche 3 Tage nach Verabreichung eintrat) am achtundzwanzigsten Tag nach der Applikation beobachtet. Aus diesen Ergebnissen ergibt sich, daß die pharmakologischen Aktivitäten von IAP mehrere Wochen bis mehrere Monate anhalten, wobei die Stärke derartiger Aktivitäten je nach Dosierung variiert.

In der folgenden Tabelle 15 sind die Ergebnisse von Versuchen zur Erhöhung der Insulinsekretion in Hunden durch Glucagongabe am zweiundvierzigsten Tag nach IAP-Applikation aufgeführt.

Tabelle 15

8. Effektive Dosis und Art der Verabreichung

Die effektive Dosis von IAP für die Verabreichung an Menschen beträgt 10 µg/kg Körpergewicht Körpergewicht bis 1 µg/kg Körpergewicht bei Anwendung der gereinigten erfindungsgemäßen Substanz. Es ist jedoch auch möglich, so hohe Dosen wie 2 µg/kg Körpergewicht und selbst noch mehr auf einmal zu verabreichen.

Die wirksamste Art der Verabreichung ist die intravenöse Injektion, doch sind auch andere Arten der Applikation anwendbar.

9. Stabilität der Aktivität Thermische Stabilität

Die Bestimmungsmethode war wie folgt: Die Probelösung (40 µg Protein/ml, pH 7,0) wurde verschiedenen, von 37 bis 100°C reichenden Temperaturen 15 Minuten lang exponiert und die Änderungen in der Insulinsekretion-fördernden Aktivität wurden bestimmt. Als Vergleichsprobe wurde eine bei 4°C gehaltene Probe verwendet und das Vorliegen von Aktivität wurde angegeben als relative Aktivität unter Festsetzung der 4°C-Probe als 100. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 16 aufgeführt.

Temperatur (°C)
Relative Aktivität
4
100
37	100
56	113
60	76
70	53
80	18
100	13

Obwohl der Bereich der thermischen Stabilität von IAP unter 56°C liegt, wurde eine Aktivität auch noch in der einer Temperatur von 80°C exponierten Lösung festgestellt.

pH-Stabilität

Eine Lösung von 40 µg Protein/ml wurde zur Einstellung des pH- Werts mit 3 N HCl oder 3 N NaOH versetzt und bei 4°C 24 Stunden lang aufbewahrt. Danach wurde die erhaltene Lösung den Versuchstieren verabreicht nach Wiedereinstellung des pH-Werts der Lösung nahe dem Neutralpunkt, worauf die Änderungen in der Insulinsekretion- fördernden Aktivität bestimmt wurden. Die Ergebnisse wurden als relative Aktivitäten angegeben mit dem Wert für pH 7,0 als 100. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 17 aufgeführt.

pH
Relative Aktivität
1
16
2	27
3	43
4	112
7	100
9	120
10	89
11	23
12	0

Obwohl der stabile Bereich von pH 4 bis 9 reicht, blieb auch noch eine Aktivität erhalten in den Lösungen eines pH-Werts von unter 3 und in Lösungen von pH 10 und 11.

10. Akute Toxizität

Die akute Toxizität LD₅₀ (µg/kg Körpergewicht) der gereinigten IAP-Probe wurde an Mäusen vom ddy-Stamm bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 18 aufgeführt.

Tabelle 18

11. Pharmazeutische Anwendungen

Wie weiter oben ausführlich beschrieben, sind die erfindungsgemäßen biologisch aktiven Substanzen sehr wertvoll als Heil- und Verhütungsmittel für Diabetes. Die effektive Dosis für die Applikation an Menschen variiert je nach spezifischer Aktivität der aktiven Substanzen. In der Regel werden sie bei Verwendung zur Erhöhung der Insulinsekretion-fördernden Aktivität innerhalb eines Konzentrationsbereichs von 10 ng/kg Körpergewicht bis mehrere Zehnermengen µg/kg Körpergewicht appliziert.

Bezüglich der Art der Verabreichung an den Patienten erweist sich die intravenöse Injektion als am wirksamsten für jeden Verwendungszweck, doch können auch andere Arten der Applikation angewandt werden, z. B. die intraperitoneale, intramuskuläre oder subcutane Injektion, die direkte Applikation, in die Verdauungsorgane, und die orale, intrarektale, sublinguale, nasal-mucosale, intraarterielle, intralymphangiale oder intratracheale Verabreichung.

Bezüglich geeigneter Verabreichungsformen können Injektionslösungen, Suppositorien, enterische und gastrische Überzugstabletten, Sublingualtabletten und Inhalationsmittel genannt werden. Ein Beispiel für eine ausgesprochen einfache Injektionszusammensetzung ist ein 1 ml-Gemisch aus 10 000 Einheiten Insulinsekretion- fördernder Substanz, 9 mg NaCl und sterilem destilliertem Wasser.

Selbstverständlich können andere Zusatzstoffe, welche die Aktivität der erfindungsgemäßen biologisch aktiven Substanz nicht zu beeinträchtigen vermögen, den erfindungsgemäßen pharmazeutischen Mitteln in geeigneter Weise einverleibt werden.

Claims (3)

1. Biologisch aktive Substanz, die als Islets-Aktivierungsprotein bezeichnet wird, mit Insulinsekretion-fördernder Wirkung, dadurch gekennzeichnet, daß sie folgende Eigenschaften besitzt:
Molekulargewicht 77 000 ± 6400, bestimmt durch Gelfiltration,
Chemische Zusammensetzung:
Proteingehalt, bestimmt nach der Lowry-Methode, über 95 Gew.-%,
Glucidgehalt, bestimmt nach der Phenol-H₂SO₄-Methode, ungefähr 1 Gew.-% und
Lipidgehalt unterhalb der Nachweisgrenze,
Aminosäurezusammensetzung der Proteinkomponente, Durchschnittswerte in µM/100 µM:
Asparaginsäure 7,5; Threonin 7,3; Serin 6,4; Glutaminsäure 10,0; Prolin 5,8; Glycin 8,8; Alanin 9,3; Cystin/2 2,5; Valin 6,5; Methionin 2,8; Isoleucin 4,0; Leucin 7,8; Tyrosin 6,5; Phenylalanin 3,7; Lysin 3,3; Histidin 1,5 und Arginin 6,4;
Isoelektrischer pH-Wert: 8,4 ± 0,5;
Discelektrophorogramm bei Acrylamid-Discelektrophorese mit einer Polyamidkonzentration von 7,5% und einem 1N-KOH-Eisessig-Puffer (pH 4,3) zeigt eine sehr scharfe einzige Bande auf der Kathodenseite,
wobei die Substanz eine Insulinsekretion-fördernde sowie Glucosetoleranz-verbessernde Wirkung für ein Säugetier zeigt und erhältlich ist durch Kultivierung der zu Bordetella pertussis Phase I gehörenden Mikroorganismen, die als pathogene Bakterien bekannt sind, in einem festen oder flüssigen Medium, wobei aus den kultivierten Bakterienzellen und/oder dem Kulturmedium die biologisch aktive Substanz in Rohform abgetrennt wird und dann nach der chromatografischen Methode, der Molekularsiebmethode und/oder der elektrophoretischen Methode gereinigt wird.

2. Verfahren zur Herstellung der biologisch aktiven Substanz nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man einen der zu Bordetella pertussis Phase I gehörenden Mikroorganismen-Stamm, die als pathogene Bakterien bekannt sind, in einem festen oder flüssigen Medium kultiviert, wobei aus den kultivierten Bakterienzellen und/oder dem Kulturmedium die biologisch aktive Substanz in Rohform abgetrennt wird und dann nach der chromatographischen Methode, der Molekularsiebmethode und/oder der elektrophoretischen Methode gereinigt wird.

3. Verwendung einer biologisch aktiven Substanz, die nach dem Verfahren gemäß Anspruch 2 hergestellt worden ist, zur Herstellung von pharmazeutischen Mitteln für die Behandlung und Verhütung von verschiedenen Arten von Diabetes.