CS216547B2 - Method of production of the proteinous factor - Google Patents

Description

216547 3 4

Vynález se týká způsobu výroby biologie- ;ky aktivní látky z Bordatella pertussis (fá-ze I nebo II). Způsob podle vynálezu spočí-vá v tom, že se uvedený mikroorganismuspěstuje ve vhodném živném prostředí a ú-činný faktor se izoluje.

Bylo zjištěno, že mikroorganismy Borde-tella pertussis a živné prostředí, v němž jsoutyto mikroorganismy pěstovány obsahujílátku, která má tu zajímavou farmakologic-kou vlastnost, že vyvolává sekreci inzulínua udržuje tak normální krevní hladinu cuk-ru. Z tohoto důvodu může tato látka mítširoké použití v lékařství při léčbě různýchdruhů cukrovky a při prevenci této choro-by. Uvedenou látku je možno izolovat a che-micky identifikovat jako faktor, který zvy-šuje sekreci inzulínu. Nová látka se obvyklenazývá bílkovina, aktivující činnost Langer-hanzových ostrůvků a má schopnost vyvolatsekreci inzulínu ve velmi malé dávce, při-bližně 0,1 mikrogramu/kg tělesné váhy. Z toho důvodu je tuto látku možno užítk léčbě a prevenci cukrovky, jak již bylouvedeno. Předmětem vynálezu je tedy způsob výro-by bílkovinného faktoru, schopného vyvolatsekreci inzulínu a zlepšit toleranci glukózyu savců, vyznačující se tím, že se pěstujepathogenní kmen Bordetella pertussis a zeživného prostředí po skončené kultivaci sejako účinný faktor izoluje bílkovina s mole-kulovou hmotností 77 000 + 6400 za průka-zu gelovou filtrací.

Izolace a čištění účinného faktoru ze živ-ného prostředí je možno provádět jakýmkolizpůsobem, kterého se obvykle užívá v bakte-riologii, jako je například srážení, chroma-tografické metody, užití molekulárních sít,elektroforéza a biologické postupy, přičemžtyto metody je možno užít jednotlivě nebove vhodných kombinacích. Způsob podle vy-nálezu tedy není možno omezit na specific-ký postup izolace nebo čištění.

Chromatografie na sloupci může být pří-kladem velmi výhodného způsobu izolace ačištění účinného faktoru. Při provádění to-hoto postupu se živné prostředí po odstředěníbakteriální hmoty nechá procházet sloup-cem, který je naplněn příslušným absorpč-ním prostředkem, jako jsou například pro-středky Hydraxyapatit (Biochemical Indus-try Ltd.j, CM-Sepharose CI-6B (PharmaciaFine Chemicals) nebo Con A-Sepharose-4B(Pharmacia Fine Chemicals). Účinný faktor se adsorbuje na materiálsloupce vysoce selektivně a pak se vymývávhodným elučním činidlem, jako je napří-klad 0,1 M fosfátový pufr o _pH 7,0 s obsa-hem 0,5 M chloridu sodného. Čištěný produktse pak dialyzuje, aby bylo možno jej zbavitsolí a získat jej v čistém stavu. Účinný fak-tor je přítomný i v bakteriálních buňkách,z nichž je možno jej popřípadě izolovat, na-příklad tak, že se k buněčné hmotě přidáchlorid sodný, čímž se účinný faktor vymyjedo roztoku. Při srážení síranem amonným, jehož sek tomuto účelu často užívá se postupujetak, že se síran amonný přidá v pevnémstavu k supernatantu k odstředění kulturypřibližně až do nasycení roztoku, načež sepH upraví na hodnotu 6 až 7 zředěnýmamoniakem. Vzniklá sraženina se promyjevodou a účinný faktor se extrahuje 0,1 Mtrispufrem o pH 8 s obsahem 0,5 M chloridusodného.

Jak již bylo uvedeno, mikroorganismyBordetella pertussis obsahují účinný faktor,je však možno užit i mutant tohoto mikro-organismu, které lze získat různými známý-mi prostředky, jako jsou například změnasložení živného prostředí, expozice záření,například ultrafialovému nebo paprskům Xnebo je také možno užít chemických muta-genních látek.

Mikroorganismus je možno pěstovat ja-kýmkoli způsobem, výhodné je postup pro-vádět v kapalné třepací kultuře, protožetímto postupem je možno získat zvláště vy-soké výtěžky, a vysokou účinnost získanélátky.

Pokud jde o vlastnosti mikroorganismu ao podmínky pěstování, jsou tyto skutečnostiuvedeny v Bergy’s Manual of DeterminativeBacteriology, sv. 8, 1974, Baltimore, TheWilliams a Wilkins C.; J, Exp. Med. 129, 523až 550 (1969) a v Mycological TrainingHandbock, 3. vydání, str. 6 ff, 1972, Maruzena Co.

Vynález se tedy týká způsobu výroby ú-činné bílkoviny a mimoto také výroby širší-ho spektra látek, které podporují sekreciinzulínu a které jsou velmi podobné účin-nému faktoru.

Chemické a fyzikální vlastnosti účinnéhofaktoru budou dále popsány.

Vzhled a rozpustnost Účinný faktor, získaný lyofilizací po od-stranění soli je bílý nebo velmi světle žlutýprášek, který je možno rozpustit ve voděpři teplotě místnosti až do koncentrace 3až 5 mg/ml. Při pokusu o rozpuštění v 6 Nkyselině chlorovodíkové se vytvoří neroz-pustná bílá sraženina. Materiál je rozpustnýv pyridinu, docedylsíranu sodném, 2-mer-kaptoethanolu a v roztoku cystinu. V případě, že se k roztoku přidá bezvodýledový aceton nebo ethanol, kyselina tri-chloroctová nebo roztok chloridu zinečnaté-ho nebo roztok jiné soli kovových iontů přiteplotě 4 °C, vytváří se bílá sraženina. Vesměsi vody a chloroformu nebo ve směsivody a n-butanolu je účinný faktor neroz-pustný a většinou se nahromadí na rozhraníobou kapalin. V případě, že se vodný roztok účinnéhofaktoru zahřívá na teplotu 80 °C nebo· vyšší,roztok se zakalí. V případě, že se účinnýfaktor rozpustí v 0,1 M fosfátovém pufru opH 7,0 s obsahem 0,5 M chloridu sodnéhoa roztok se dialyzuje proti destilované vo- 216547

S dě, roztok se dočasně zakalí, avšak při dal-ším provádění dialýzy se účinný faktor zno-vu rozpustí a bílý zákal zmizí. V případě, žese roztok o vysoké koncentraci podrobí dia-lýze při použití 0,01 M octanového pufruo pH 4,5, může se účinný faktor zbarvitsvětle hnědě a rozpustit.

Molekulová hmotnost

Molekulová hmotnost účinného faktoru,stanovená gelovou filtrací na sloupci o roz-měrech 2,8X80 cm s obsahem přípravkuBiogel P-100 (BIO.RAD Corp.) v rovnováž-ném stavu v 0,1 M fosfátového pufru s ob-sahem 0,5 M chloridu sodného je 77 000 ±±6400.

Složení

Obsah bílkovin při stanovení Lowryhometodou byl přes 95 hmotnostních %, obsahtlycidů, stanovený metodou s použitím fe-nolu a kyseliny sírové je přibližně 1 hmot-nostní %. Koncentrace lipidů je pod spodníhranicí možnosti stanovení.

Pokud jde o metody, jichž bylo použito přistanovení složek účinného faktoru, je mož-no odkázat na následující publikace:Bílkoviny

Lowry, O. Η., N. J. Rosebrough, A. L. Farra R. J. Randall: J. Biol. Chem. 193, 265,1951.Glycidy

Metoda s použitím fenolu a kyseliny síro-rové, Dobois, Μ., K. A. Giles, J. K. Hamilton,P. A. Rebers a F. Smith: Anal. Chem. 28,350, 1956.

Lipidy

Celkové lipidy a konjugáty lipidů byly mě-řeny způsobem podle Marsha a Weinsteina(J. B. Marsh a D. B. Weinstein: J. Lipid Res.,7, 574, 1966] extrakcí materiálu před apo hydrolýze v chloroformu, směsi chloro-formu a methanolu a v heptanu.

Aminokyselinové složení bílkovinné slož-ky (průměrný poměr, mikromoly/100 mikro-molů po hydrolýze trvající 16 nebo 24 hodinpři teplotě 110 °C v 6 N kyselině chlorovodí-kové: kyselina asparagová 7,5, threonin 7,3,serin 6,4, kyselina glutamová 10,0, prolin5,8, glycin 8,8 alanin 9,3, cystin/2 2,5, valin6,5, methionin 2,8, isoleucin 4,0, leucin 7,8,tyrosin 6,5, fenylalanin 3,7, lysin 3,3, histi-din 1,5 a arginin 6,4.

Isoelektrický bod při 8,4 ± 0,5.

Elektroforéza na kotoučích z různého ma-teriálu byla prováděna na akrylamidu s kon-cetrací polyakrylamídu 7,5 % při použitípufru o koncentraci 1 N hydroxidu draselné-ho s příměsí ledové kyseliny octové o pH4,3. Bylo užito 30 mikrogramů materiálu,proudu 4 mA, barvení amidovou černí 10Ba odbarvení 7% kyselinou octovou ve vodě. β

Byl získán velmi silný jediný pás ve vzdále-nosti 2,221 ± 0,061 cm oproti kontrolnímuvzorku.

Biologické vlastnosti Účinný faktor vyvolává a podporuje sekre-ci inzulínu a zvyšuje toleranci glukózy usavců. Tento účinek přetrvává několik týd-nů až několik měsíců o jediné dávce účin-ného faktoru. Akutní toxicida LDso je při-bližně 200 mg/kg váhy u myší kmene vždypři nitrožilním podání.

Vynález bude osvětlen následujícími pří-klady. j Příklad 1 Příprava bílkovinné aktivní látky 1. Lyofilizovaný a konzervovaný vzorekBordetalla pertussis kmen Tohama fáze I,dodaný Department of Bacteriology, Kita-sato University School of PharmaceuticalSciences byl pěstován na plotnách Berdet--Gangova prostředí při teplotě 37 °C 2 dny,načež se platinovou kličkou přenese určitémnožství bakterií do třepací láhve o obsahu500 ml s obsahem 200 ml iontoměničovépryskyřice a modifikovaného Cohen-Wheele-rova prostředí (prostředí CWj se složením,uvedeným v následující tabulce 1. Pak setřepací kultura udržuje 20 až 22 hodin nateplotě 37 °C.

Koncentrace bakterií v roztoku se měříspektrometricky při vlnové délce 650 nm.Vzniklý roztok se přidá do třepací láhve oobsahu 2 litry s obcahem 1 litr inotoměničo-vé pryskyřice v CW prostředí, takže konečnákoncentrace bakterií je přibližně 0,1 X109buněk/ml načež se udržuje třepací kultura48 hodin při 97 výkyvech za minutu na tep-lotě 37 °C.

Bakteriologické vlastnosti uvedeného kme-ne souhlasí s vlastnostmi, které jsou popsá-ny pro Bordetella pertussis fáze I.

Tabulka 1

Složení modifikovaného Cohen-Wheelerovaprostředí

Casamino kyselina 10 g extrakt z kvasnic 1 g dichlorfosforečnan draselný 0,5 g rozpustný škrob 2 g 0,9% síran měďnatý 1 ml 1% chlorid vápenatý 1 ml 4% chlorid hořečnatý 1 ml polypepton 5 g 1% roztok cystinu 2,5 ml 0,5% síran železnatý 1 ml chlorid sodný 2,5 g Při použití se toto kapalné prostředí při-dá do destilované vody tak, aby vznikl cel-kový objem 1000 ml, načež se pH upraví 216547 7 8 20% roztokem hydroxidu sodného na hodno-tu 7,2 a k prostředí se přidají 3 g anionto-měničové pryskyřice (Diaion SA-20 AP, Mit-subishi Kasei Co.) a pak se prostředí auto-klávuje při teplotě 121 °C 15 minut. Třepací kultura, získaná po 48 hodináchse zahřeje na 30 minut na teplotě 56 °C apak se odstředí při 15 000 otáčkách za mi-nutu a teplotě 4 °C, čímž se materiál rozdělína buněčnou hmotu a supernantant, super-nantant je výchozí látkou pro izolaci a čiš-tění účinného faktoru podle vynálezu. 10 litrů supernatantu se upraví na pH 6přidáním 1 N kyseliny chlorovodíkové, zís-kaný materiál se nanese na sloupec o rozmě-rech 2,5X4 cm s obsahem hydroxylapatitua při prvním čisticím stupni se upraví rych-lost průtoku na 200 ml za hodinu. Většina bílkoviny projde sloupcem bez ad',sorbce a není proto možno měřit účinnost,na inzulín. Způsob měření bude dále posán?Koncentrace bílkoviny byla měřena způso-,bem podle Lowryho tak, jak je uvedeno ve’spodní části následující tabulky 2. |

Aby bylo možno stanovit adsorbované lát-iky, byl sloupec promýván nejprve 0,01 Mjfosfátovým pufrem o pH 6,0 a pak po zvý-ašéní molární koncentrace fosfátového pufru!na 0,1 a po zvýšení pH na 7,0 bylo možno!vymývat adsorbované bílkoviny. Za těchto!podmínek však nedošlo k vymytí účinného’faktoru. Byla proto prováděna další eluce’fosfátovým pufrem téhož složení s přídav-kem 0,5 M chloridu sodného. Za těchto pod-mínek bylo možno účinný faktor výhodněizolovat, jak je zřejmé z obr. 1. i Získaný účinný faktor byl koncentrovánia podroben dialýze při použití dialyzačníjmembrány (Thomas Cat. ŇO. 3787-F-25) ssmaximální propustností pro molekulovou»hmotnost 8000. Dialýza byla prováděna dva-lkrát celkem 12 hodin proti destilované voděla dvakrát celkem 12 hodin proti 0,01 M fos-jfátovému pufru o pH 6,0. Pro další čištěníbyl roztok s obsahem dialyzovaného účin-ného faktoru podroben průchodu sloupcem o rozměrech 1,5X10 cm s obsahem příprav-ku Carboxymethyl Sepharose CL-6B v rovno-vážném stavu v 0,01 M fosfátového pufru opH 6,0. Neadsorbovaný materiál neměl žád-nou účinnost. Po zvýšení molární koncentra-ce pufru na 0,1 a po zvýšení pH na 7,0 bylpostup prováděn ještě jednou za přidání0,5 M chloridu sodného, čímž byl získánvýsledný účinný faktor, jak je možno zjistitz obr. 2.

Tento produkt stále ještě obsahoval malémnožství nečistot, jak bylo· možno prokázatelektrolýzou. Z tohoto důvodu byl účinnýfaktor dále koncentrován a to dvojí dialý-zou při použití téže membrány jako svrchu! celkem 12 hodin proti destilované vodě at dvojí dialýzou celkem 12 hodin proti 0,01 M^fosfátovému pufru o pH 7,0, načež byl dia-llyzovaný vzorek podroben průchodu sloup-Icem o rozměrech 1,5X8 cm s obsahem pří-Ipravku Con A-Sepharose 4B v rovnovážnémgstavu v 0,01 M fosfátovém pufru o pH 7,0.i Sloupec byl vymýván tímtéž pufrem, čímžIbylo možno vymýt stopy neúčinné bílkoviny.Pak byl sloupec vymýván 0,1 M fosfátovýmpufrem o pH 7,0 s obsahem 0,5 M chloridusodného, čímž bylo možno vymýt účinnýfaktor, jak je zřejmé z obr. 3.

Protože účinný faktor i pak ještě obsaho-val nepatrné množství nečistot, jak bylomožno prokázat elektroforeticky, byla tatolátka po zahuštění podrobena dialýze protir0,01 M fosfátového pufru o pH 7,0 s obsa-hem 0,5 M chloridu sodného a dialyzovanývzorek byl podroben filtraci na sloupci orozměrech 2,8X60 cm s obsahem přípravkuBiogel P-100 (BIO.RED Co.) v rovnovážnémstavu v tomtéž pufru. Tímto způsobem bylomožno získat čistý účinný faktor, totožnýs bílkovinným podílem původního materiálus molekulovou hmotností přibližně 80 000,jak je zřejmé z obr. 4. Čištění materiálu a další údaje, týkajícíse způsobu čištění jsou uvedeny v následu-jící tabulce 2. 216547

Stupně ........ , Množství Koncentrace Celková Specifická Výtěžek Stupeň roztoku bílkoviny bílkovina účinnost účinnosti čištění (ml) (jUg/ml) (mg) (jednotky/^g) (%) o CD to CD o O CD co P rti Oti rti T"*í rti

o tOO IO

CM

tO

CO 00 CO O O O CO r-f θ' CD CD CM CO CM rti CO CO -Φ

GO CDO rtiOCMCM 00

CO

CG

O CD rti co co O to IO CG o rti CM rti rti CM O IDO CMO rti

O to T3 Φ >Fm 7)

O P-i

P Φ co

O ?ti ctí 3=5

P Φ cn cdPcd>*

Xo t-i .£ φ E? ň -jti •'M iG ·ιΉ c J>N í+M q-l+□ Ctí ·Γ^ Cd 'TÍ <—j ¢-1 Φ ?-ι Φ

2 00 P 00 P

23 O G Ó G toto

O 35 Ό

G Φ co

O

Pm cti 3=5

P Φ

CO cdGts

ω oP CmG 35CO O ctí

S O ů 3ti octi I—l s ™ s

Cti φ &amp;o o cti

P-1 O00 PO G

Cti iCO o ctí o 216547 9 10

Poznámka k tabulce

Koncentrace bílkovin byla měřena Lowry-ho metodou (Lowry, O. Η., N. J. Rosenbrough,A. L. Farr a R. J. Randall: J. Biol. Chem. 193,265, 1951), přičemž jako standardu bylo u-žito hovězího sérového albuminu. Čistota takto získané výsledné látky bylastanovena elektroforézou na polyakrylami-dovém gelu při koncentraci gelu 7,5 % připoužití pufru s obsahem 1 N hydroxidu dra-selného a ledové kyseliny octové o pH 4,3. V experimentální části bylo užito metodypodle publikace J. V. Maizel, Jr. (Biochem.Biophys. Res. Comm., 1963, 13, 483).

Množství vzorků bylo 30 mikrogramů,vztaženo na bílkovinu a pokus byl prová-děn při použití proudu o intenzitě 4 mAna 2 hodiny, k barvení bylo užito amidovéčerni 10B a k odbarvení 7% kyseliny octové.Výsledky jsou zřejmé z obr. 5. Bylo zjištěno,že vzorek, získaný v konečném stupni jejediná látka, prostá nečistot a účinnostna sekreci inzulínu, tak jak je dále defino-vána v příkladu 2 je v souhlasu s účinnostítakto izolované látky. Při stanovení dalšístruktury takto izolovaného účinného fak-toru byl tento faktor podroben elektroforézena polyakrylamidovém gelu způsobem po-dle publikace A. L. Shapilo a další: Bio-chem. Biophys. Res. Comm., 1967, 28, 815). 50 mikrogramů materiálu ve formě bílko-viny se vloží do jedné zkumavky, v níž senachází směs 1 % dodecylsíranu sodného,1 % 2-merkaptoethanolu a roztok močovinyo koncentraci 4 N, materiál se 2 hodiny in-kubuje při teplotě 37 °C a pak se směs na-nese na 10% polyakrylamidový gel s obsa-hem 1 % dodecylsíranu sodného a 4 hodinyse nechá procházet proud o intenzitě 8 mA,k barvení se užije modři (Coomassie Blue)a k odbarvení 7,5% kyseliny octové. Výsled-ky jsou znázorněny na obr. 6. 2. Lyofilizovaný kmen Bordetella pertus-sis NIH 114 (3779B), dodaný Department ofBacteriology, Kitasato University School ofPharmaceutical Sciences se pěstuje v třepa-cí kultuře a dělí stejným způsobem jakov první části příkladu 1, čímž se získá 10litrů supernatantu.

Celé získané množství supernatantu serozdělí na dvě poloviny. Jedna polovina senanese na sloupec o rozměrech 2,5X4 cms obsahem hydroxyapatitu při průtoku 200mililitrů za hodinu po úpravě pH superna-tantu na 6,0 přidáním 1 N kyseliny chloro-vodíkové. Sloupec se promývá vodou a ad-sorbovaný materiál se vymývá 0,1 M fosfá-tovým pufrem s obsahem 0,5 M chloridusodného o pH 7,4. Získaný eluát se podrobí dialýze při po-užití membrány pro molekulární hmotnost8000 (Thomas Cat. No. 3787-F25) a dialýza se provádí třikrát proti destilované voděcelkem 18 hodin, čímž se získá účinná látka.Získaná látka se lyofilizuje za vzniku jem-ného bílkovinného prášku hnědobílé barvy(vzorek A), tato látka je totožná s účinnýmfaktorem, který podporuje sekreci inzulínu.

Druhý podíl 5 litrů supernatantu se zpra-covává tak, že se přidává síran amonný aždo 90% nasycení, přičemž se upravuje pHna 6,5 roztokem hydroxidu amonného, tak-že dojde k vysrážení téměř veškerého bílko-vinného podílu. Sraženina se důkladně pro-myje vodou a pak se extrahuje 0,1 M tris-pufrem o pH 9 s přísadou 0,5 M chloridusodného,. Získaný extrakt se nejprve neu-tralizuje 1N kyselinou chlorovodíkovou apak se třikrát dialyzuje celkem 18 hodinproti destilované vodě při použití svrchuúčinné látky v množství 11,2 mg, po lyo-filizaci jde o jemný prášek (vzorek B). 3. Bordetella pertussis (kmen Maeno fá-ze I) Při použití svrchu uvedeného lyofilizova-ného kmene dodaného Department of Bac-teriology, Kitasato University School ofPharmaceutical Sciences se opakuje postuppodle prvního stupně příkladu 1, čímž sezíská 23,6 mg a 10,8 mg lyofilizovanéhopráškovitého výsledného účinného faktoru(vzorky C a D). Účinnost a akutní toxicita vzorku

Specifická účinnost jednotlivých vzorkůbyla zjišťována podle příkladu 2 a je uve-dena v následující tabulce 3.

Tabulka 3

Vzorek Specifická účinnost (jednotky/mikr ogramy) A 57,1 B 93,0 C 127,2 D 81,0

Akutní toxicita LDso jednotlivých vzorkůje uvedena v tabulce 4.

Tabulka 4 LDos v mikrogramech/kg váhy

Vzorek Nitrožilní podání myším A 1,620 B 2,510 C 2,890 D 3,020

Je zřejmé, že práškovité vzorky účinnýchlátek je možno užít k léčbě nebo profylaxicukrovky v dávkách 1 až 100 mikrogram/kghmotnosti. 4. Bordetella pertussis kmen Tohama, fá- 216547 11 12 ze I, dodaný Department of Bacteriology,Kitasato University School of Pharmaceuti-cal Sciences se pěstuje týmž způsobem jakov prvním stupni příkladu 1 a supernatant,získaný oddělením buněčné hmoty od živ-ného prostředí se užívá jako výchozí mate-riál. Aceton, chlazený suchým ledem, sepřidává po kapkách do 100 litrů supernatan-tu při stálém třepání a za chlazení ledemaž do konečné koncentrace 60 °/o. Pak seoddělí vzniklá sraženina průtokovou odstře-divkou při teplotě 4 °C při 5000 otáčkáchza minutu. Získaná sraženina se usuší a pakse rozpustí v 500 ml 0,01 M fosfátovéhopufru o pH 6,0 a pak se nanese na sloupeco rozměru 5X4 cm s obsahem hydroxyapa-titu. Veškerá účinnost se nahromadí v ma-teriálu, který se získá vymýváním sloupce0,1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0 s přídav-kem 0,5 M chloridu sodného. Eluát se za-hustí a dialyzuje proti 0,01 M fosfátovéhopufru o pH 6,0 a pak se nanese na sloupeco rozměru 2,5X25 cm s obsahem přípravkuCM-Sepharose CL-6B v rovnovážném stavuv tomtéž pufru a účinná látka se pak vymý-vá 0,1 M fosfátovým pufrem chloridu sod-ného. Takto získaná účinná látka se zahustía dialyzuje proti 0,1 M fosfátového pufru opH 7,0 s obsahem 0,5 M chloridu sodného.Pak se účinná látka nanese na vrchol sloup-ce o rozměru 2jXlO5 cm s obsahem příprav-ku Biogel P-150 v rovnovážném stavu v 0,1M fosfátového pufru s obsahem 0,5 M chlo-ridu sodného a 4 M močoviny. Účinný faktorje bílkovina s molekulární hmotností při-bližně 80 000. Bylo získáno 38 mg tohotomateriálu v lyofilizovaném stavu. Chemickésložení získané látky bylo přibližně 95 hmot-nostních % bílkoviny, 1 až 2 hmotnostní %glycidů, lipidy nebylo možno prokázat. Spe-cifická účinnost je 930 jednotek/mikrogram. 5. Lyofilizovaný kmen Bordetella pertussisTohama, fáze I dodaný Department of Bacte-riology, Kitasato University School of Phar-maceutical Sciences se pěstuje v třepacíkutuře stejným způsobem jako v příkladu 4. Získá se 100 litrů supernatantu, k němužse přidá 50% vodný roztok chloridu zineč-natého za chlazení ledem a stálého mícháníaž do pH 6,0 a do konečné koncentrace 1 %.Výsledná sraženina se rozpustí v 10% roz-toku hydrofosforečnanu sodného a pak sepodrobí dialýze proti vodě a pak proti 0,01M fosfátového pufru. Získaný roztok se na-nese na vrchol sloupce o rozměru 10x5 cms obsahem hydroxylapatitu a sloupec se pro-mývá 0,1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0 apak se vymývá 0,1 M fosfátovým pufrems obsahem 0,5 M chloridu sodného. Eluátse zahustí a nanese na vrchol sloupce o roz-měru 2,5 X100 cm s obsahem přípravkuSephacryl S-200 (Pharmacia Fine ChemicalsJa sloupec se vymývá 0,1 M fosfátovým puf-rem o pH 7,0 s obsahem 0,5 M chloridusodného a 4 M močoviny. Pak se provádígelová filtrace, čímž se získá výsledná látka.

Molekulární hmotnost takto získané účin-né látky je přibližně 72 000. Bylo získáno40 mg lyofilizovaného prášku. Prášek obsa-hoval přibližně 95 hmotnostních % bílko-viny, 1 až 2 hmotnostní % glycidů a žádnélipidy. Specifická účinnost byla 890 jedno-tek/mikrogram. 6. Bordetella pertussis kmen Tohana, fá-ze I dodaný Department of Bacteriology,Kitasato University School of Pharmaceu-tical Sciences se pěstuje v Bordet-Gangou-ově prostředí při teplotě 37 °C 2 dny a pakna Bordet-Gangouově šikmém agaru při tep-lotě 37 °C po dobu 20 až 24 hodin, načež semateriál odebraný platinovou kličkou na-nese na Cohen-Wheelerovo pevné prostředí(prostředí CA), jehož složení je uvedeno vtabulce 5 s přísadou aktivního uhlí a natomto prostředí se kultura pěstuje 48 hodinpři teplotě 37 °C. Získá se 5 kg vlhké bak-teriální hmoty, která se uvede v suspenzi v5 litrech destilované vody a pak se hodinuudržuje na teplotě 56 °C.

Po ochlazení se k suspenzi přidá Thime-rosal k dosažení výsledné koncentrace 0,01procenta, načež se roztok odstředí 30 minutpři 15 000 otáčkách za minutu k odděleníbakteriálních buněk. Oddělené buňky se u-vedou v suspenzi v destilované vodě s ob-sahem 4 M močoviny a 1 M chloridu sod-ného, načež se podrobí při teplotě 4 °C vlivuultrazvuku (přístroj Tomy Precision Machi-nery Co.) k rozrušení buněčné hmoty. Výsledná suspenze se odstřeďuje 30 minutpři 15 000 otáčkách za minutu a supernatantse dialyzuje proti vodě a pak se uvede dorovnovážného stavu v 0,1 M fosfátovéhopufru o pH 6,0, načež se roztok nanese nasloupec hydroxylapatitu o rozměru 10X5centimetrů. Po promytí adsorbovaných ne-čistot 0,1 M fosfátovým pufrem o pH 6,0 a0,1 M fosfátovým pufrem o pH 7,0 se účinnálátka vymývá 0,1 M fosfátovým pufrem o pH7,0 s obsahem 0,5 M chloridu sodného. Získaná účinná látka se uvede do roztokuv 0,01 M fosfátového pufru o pH 6,0 a pakse nanese na sloupec o rozměru 2,5X30 cms obsahem přípravku CM-Sepharose CL-6B.Sloupec se nejprve promyje 0,05 fosfátovýmpufrem o pH 6,0 a pak se vymývá 0,1 Mfosfátovým pufrem o pH 7,0 s obsahem 0,5M chloridu sodného. Takto získaná účinnálátka se zahustí a rozpustí v 0,1 M fosfáto-vém pufru o pH 7,1 s obsahem 4M močo-viny a 0,5 M chloridu sodného, načež senanese na vrchol sloupce o rozměru 2,5 XX115 cm s obsahem přípravku Sephacryl S-200.

Pak se sloupec vymývá tímtéž pufrem,čímž se získá 40 mg účinné látky.

Molekulová hmotnost takto získané účin-né látky je 74 000 a chemické složení vícenež 95 hmotnostních % bílkovin, 2 hmot-nostní % glycidů, lipidy nebylo možno zjis-tit. Specifická účinnost byla 920 jednotek//mikrogram. 216547 13

Tabulka 5

Složení prostředí CA

Casamino kyselina 10 g extrakt z kvasnic 1 g dihydrofosforečnan draselný 0,5 g rozpustný škrob 1,5 g 0,5!% roztok síranu měďnatého 1 ml 1% roztok chloridu horečnatého 1 ml polypepton 5 g 1% roztok cystinu 2,5 ml 0,5% roztok síranu železnatého 1 ml chlorid sodný 2 g práškový agar 18 g destilovaná voda 1000 ml

Toto pevné prostředí se rozpustí zahřívá-ním, pH se upraví na 7,2, k prostředí sepřidá 5 g aktivního uhlí a výsledné prostředíse autoklávuie 20 minut při teplotě 121 °C. í , 7. Účinným způsobem výroby účinnéhofaktoru je jakýkoli vhodný typ chromato-grafie, při němž se využívá vlastností účin-ného faktoru. Tento způsob je napříkladpopsán v příkladu 1 a popřípadě dovolujeněkteré stupně přípravy vypustit. I při vy-puštění některých stupňů je čistota a výtě-žek výsledného produktu téměř identickýjako v příkladu 1. Způsob je možno popsattakto: A. Bordetella pertussis kmen Tohama, fá-ze I dodaný Department of Bacteriology,Kitasato University School of Pharmaceuti-cal Sciences v lyofilizovaném a konzervova-ném stavu se pastuje stejným způsobem jakov příkladu 1. 10 litrů takto získaného super-natantu se nanese na sloupec hydroxyapa-titu o rozměru 5 X 2 cm při rychlosti prů-toku 60 ml za hodinu a sloupec se promyje300 ml 0,01 M fosfátového pufru o pH 7,0.Pak se sloupec vymývá 0,1 M fosfátovýmpufrem o pH 7,0 s obsahem 0,5 M chloridusodného při průtoku 15 ml za hodinu, čímžse vymývá účinná látka, která se zahustíaž na obsah 15 ml při použití přípravkuFicol 400 (Pharmacia Fine Chemicals) apak se dialyzuje celkem 4X 24 hodin proti2 litrům destilované vody, načež se dáledialyzuje 4X celkem 24 hodin proti 1 litru0,01 M acetátovému pufru o pH 4,5 s obsa-hem 0,1 M chloridu sodného nebo 0,1 Mchloridu lithného s příměsí chlorovodíkuo pH 4,5. Pak se produkt nanese na vrcholsloupce o rozměru 1,2X8 cm s obsahempřípravku p-acetoxymercurianilin-Sepharose6MB. Sloupec je uveden do rovnovážnéhostavu v tomtéž pufru, rychlost průtoku 5 mlza hodinu. Po· promytí týmž pufrem se ad-sorbovaná účinná látka vymývá tímtéž puf-rem s přídavkem 0,01 M L-cysteinu. Získanáúčinná látka se zahustí na objem 5 ml apak se dialyzuje 3X celkem 12 hodin proti0,1 M fosfátovému pufru o pH 7,0 s obsahem4 M močoviny a 0,5 M chloridu sodného vcelkovém množství 2 litry. Filtrace se pro- 14 vádí na sloupci o rozměru 2,8X95 cm nasloupci gelu Sephacryl S-200 (PharmaciaFine Chemicals). Účinná látka má molekulovou hmotnost65 000 + 7000. Tato látka se podrobí dalšídialýze proti destilované vodě. Užije se 2litrů vody a dialýza se provádí 5 X celkem48 hodin a pak se získaný materiál lyofili-zuje, čímž se získá 2,,1 mg bílého prásku. Při elektroforéze na polyakrylamidovémgelu při pH 4,3 se získá jediný pás. Účinnálátka sestává z více než 98 % bílkoviny,glycidy ani lipidy nebylo možno prokázat.

Způsob přípravy p-acetomercurianilin(PAMA) — Sepharose 6MB 4 g bromkyanu ve směsi s přípravkemSepharose 6MB (Pharmacia Fine Chemi-cals) se opakovaně promývá a nechá se na-bobtnat ne skleněném filtru při použití 1litru 10-3 ]\j kyseliny chlorovodíkové. Od-děleně se připraví roztok 172 mg (0,5 mmo-lu) p-acetoxymercurianilinu v 50 ml 60%dimethylformamidu v 0,1 M pufru s hydro-uhličitanem sodným o pH 8,3 s obsahem0,5 M chloridu sodného. Po skončeném pro-mývání a nabobtnání gelu se svrchu uve-dený roztok smísí s gelem a směs se míchápři teplotě místnosti 22 až 25 °C 2 hodiny.Pak se produkt dobře promyje týmž puf-rem, přidá se 50 ml 1 M monoethanolaminuo pH 9,0 a směs se míchá při teplotě míst-nosti další 2 hodiny. Pak se gel zfiltruje zaodsávání na skleněném filtru a promývá seněkolikrát střídavě 1 litrem 0,1 M boritano-vým pufrem o pH 8,5 a 1 litrem 0,1 M ace-tátového pufru o pH 4,0, načež se uvede dorovnovážného stavu v 0,01 M acetátovéhopufru o, pH 4,5 s obsahem 0,1 M chloridusodného nebo 0,1 M lithiumchloridu ve smě-si s chlorovodíkem o pH 4,5. Je také možnopostupovat tak, že se gel předběžně zpra-covává týmž pufrem s obsahem 1 % 2-mer-kaptoethanolu, načež se důkladně promyjetýmž pufrem. B. Bordetella pertussis kmen Tohama, fá-ze I, dodaný Department of Bacteriology,Kitasato University School of Pharmaceuti-cal Sciences v lyofilizovaném a konzervo-vaném stavu se pěstuje stejným způsobemjako v příkladu 1, načež se 10 litrů taktozískaného supernatantu nanese na vrcholsloupce hydroxylapatitu o rozměru 5X2 cmpři rychlosti průtoku 60 ml za hodinu, slou-pec se promývá 300 ml 0,01 M fosfátovéhopufru, o pH 7,0, načež se vymývá 0,1 Mfosfátovým pufrem o pH 7,0 při rychlostiprůtoku 15 ml za hodinu. Získaná účinná látka se zahustí na obsah15 ml a pak se 4X dialyzuje celkem 24 ho-din proti 2 litrům destilované vody, načežse dále 4 X dialyzuje celkem 24 hodiny proti1 litru 0,01 M fosfátového pufru o pH 7,0. Účinná látka se nanese na sloupec pří-pravku Sepharose 4B s obsahem protilátek 216547 13 16 proti účinnému faktoru, sloupec má rozměr1,8X13 cm. Sloupec se promývá 200 ml 0,01M fosfátového pufru o pil 7,0 s obsahem0,1 M NaCl, načež se vymývá 0,1 M glycin-hydrochloridu o pH 3,0 s obsahem 2 mmolůkyseliny ethylendiamintetraoctové a 0,15 Mchloridu sodného při rychlosti průtoku 60mililitrů za hodinu.

Eluát se neutralizuje 1 M glycinovým puf ·rem o pH 11,5. Účinná látka se oddělí a třikrát dialyzujecelkem 48 hodin proti 3 litrům destilovanévody, čímž se získá 1,9 mg bílého prášku.

Molekulová hmotnost účinné látky je70 000 + 5000, při elektrolýze na polyakryl-amidovém gelu při pH 4,3 se získá jedinýpás. Účinná látka se stává přibližně z 97 %bílkoviny, 1 % glycidů, lipidy nebylo možnoprokázat.

Způsob výroby přípravku Sepharose 4Bs obsahem protilátek proti účinnémufaktoru. 10 g přípravku Sepharose 4B, aktivovanébromkyanem se promyje a nechá nabobtnatna skleněném filtru při použití 2 litrů 10~3N kyseliny chlorovodíkové. Odděleně se při-praví roztok 100 g protilátky proti účinnémufaktoru v 50 ml 0,1 M hydrouhličitanu sod-ného o pH 8,3 s obsahem 0,5 M chloridusodného. Okamžitě po promytí a nabobtná-ní gelu se přidá svrchu uvedený roztok asměs se míchá 2 hodony při teplotě 22 až25 °C C.

Po skončení reakce se gel zfiltruje naskleněném filtru za odsávání a pak se ně-kolikrát promyje týmž pufrem k odstraněnípřebytku protilátky, pak se přidá 100 ml1 M monoethanolaminu a směs se důkladněmíchá 2 hodiny při teplotě místnosti.

Po skončené reakci se materiál promýváněkolikrát svrchu uvedeným pufrem a pakse promyje 1 litrem 0,1 M kyseliny octovéo pH 4,0 s obsahem 0,5 M chloridu sodnéhoa tento postup se opakuje třikrát při růz-ném pH.

Nakonec se produkt promyje 1 litrem svr-chu uvedeného pufru. Skladování materiáluse provádí při teplotě 4 až 8 °C. P ř í k 1 a d 2

Farmakologické účinky bílkovinné účinné látky 1. Stanovení účinnosti pokud jde o sekre-ci inzulínu

Tuto· účinnost je možno stanovit tak, žese měří odpověď u jednotlivých zvířat narůzné látky, které vyvolávají sekreci inzulí-nu. Obvykle se k tomuto účelu užívá glu-kóza.

Pokusná zvířata K pokusům bylo užito krysích samců kme-ne Wistar o hmotnosti 130 až 140 g.Pokusné metody Částečně čištěná nebo čištěná účin-ná látka s různou koncentrací se rozpustíve fyziologickém roztoku a vždy 0,2 ml to-hoto roztoku se podá nitrožilně v etherovénarkóze krysám do stehenní žíly. Účinnosttohoto podání se měří po 3 dnech. Krysy se18 až 20 hodin před pokusem chovají bezpodání potravy. Účinnost se měří tak, že seodebere 0,1 ml krve z ocasní žíly každékrysy bezprostředně po intraperitoneálnímpodání 30% glukózy v dávce 1 ml/100 g ži-vé hmotnosti a přesně 15 minut po tomtopodání se znovu odebere 0,1 ml krve stej-ným způsobem. Účinnost sloučeniny na se-kreci inzulínu se stanoví z rozdílu mezihladinou glukózy v krvi a koncentraci in-zulínu v krvi před a po podání glukózy.Glukóza se měří glukózooxidázou a koncen-trace inzulínu metodou, užívající dvojíchprotilátek. Dále jsou uvedeny metody, užité pro sta-novení glukózy v krvi a inzulínu v plazmě.Hladina glukózy v krvi

Stanoví se glukózooxodázou podle publi-kace Bergmeyer, H. -U., a Bernet, E. v „Me-thods of enzymatic analysis”, Bergmeyer,H. -U,, New York Academie Press P 123(1963). Ke stanovení se užívá přístroje Glu-kostat.

Koncentrace inzulínu

Ke stanovení se užívá metody dvojíchprotilátek podle publikace Morgan, C. R., aRazarow A.: Diabetes, 12, 115 (1963) Insulinimmunoassay kit by Dainabot RadioisotopeLaboratories.

Zvýšení sekrece inzulínu se propočítátak, že se nejprve zjistí hodnoty ΛΙ/AG prourčitou koncentraci látky, podanou jedinéskupině a pro kontrolní skupinu z následu-jící rovnice: 216347 17 16 ΔΙ/ΔΘ (mikro-jednotky/mg)

Koncentrace inzulínu vplazmě po zatížení glu-kózou (mitorojednotky/fenl)___

Koncentrace glukózy vkrvi po zatížení glu-kózou (mg/ml)

Koncentrace inzulínuv plazmě před zatí-žením glukózou(mikr cij ednotky/ml)Koncentrace glukózy v — krvi před zatíženímglukózou (mg/ml)

Stanovení koncentrace glukózy v krvi kestanovení účinnosti výsledné látky se užíváz toho důvodu, že množství vylučovanéhoinzulínu je tímto faktorem vysoce ovlivněno.

Jednotky účinného faktoru Je možno vy-počítat z následující rovnice. jednotka = průměr ΔΙ/ΔΘ ošetřenýchzvířat průměr ΔΙ/ΔΘ kontrolníchzvířat průměr ΔΙ/ΔΘ kontrolních zvířat x 100

Specifická účinnost této látky se vypočítávydělením svrchu uvedené jednotky množ-stvím bílkoviny.

Vztah mezi dávkou a účinkem

Počet jednotek a velikost dávky ve forměbílkoviny je pro materiál z příkladu 1 uve-den v tabulce 6.

Tabulka 6 Dávka (ng/krysa) Jednotka * 8 62 16 53 32 54 63 81 125 104 250 129 500 208 1000 445 2000 571 * Výsledky byly získány jako průměr proskupinu 5 zvířat. Čištěný vzorek účinného fakotu má účin-nost, jejíž průběh je možno vyjádřit sig-moidním tvarem, část křivky, která je v roz-sahu 250 až 1000 ng přibližně lineární, bylaužita pro propočítávání jednotek a pro prů-kaz stupně pro propočítávání jednotek a proprůkaz stupně čištění účinného fakotoru ajeho ekvivalentu. 2, Celkové farmakologické účinky bílko-vinného faktoru

Uvedená látka podporuje sekreci inzulí-nu, avšak má i další farmakologické účinky,například zlepšení tolerance pro glukózu,urychlení zhojení cukrovky vyvolané strep-tozotocinem a zlepšení tolerance pro glukó-zu i u vrozené cukrovky. Tyto účinky pře-trvávají několik týdnů až několik měsícůpo jednorázovém podání sloučeniny. Vzhle-dem k tomu, že účinky bylo možno pozoro-vat u všech zvířat bez výjimky včetně myší,krys a psů, je možno mít za to, že způsobúčinku se nebude podstatně měnit u různýchživočišných druhů.

Je zřejmé, že účinný faktor bude možnopoužít k léčbě cukrovky. V současné doběléčba cukrovky závisí na injekčním podáníinzulínu nebo na perorálním podání růz-ných léčiv, avšak oba tyto způsoby nezasa-hují příčinu choroby a cukrovka jako tako-vá je tedy nevyléčitelná. Nemocný se musídostavit každý den na injekci inzulínu amimoto peronální podání příslušných lékůmá v sobě obvykle nebezpečí příliš velkéhosnížení hladiny glukózy v krvi. Nesmírnouvýhodou účinného faktoru podle vynálezuje skutečnost, že účinný faktor jednak pod-poruje uvolňování inzulínu, na druhé straněvšak zvyšuje koncentraci inzulínu v krvipouze v tom případě, že byla zvýšena hla-dina glukózy v krvi. V tomto případě způ-sobí rychlou úpravu této hladiny na normál-ní hodnotu.

Další podstatnou výhodou účinného fak-toru je skutečnost, že po jediném podánípřetrvává účinek několik týdnů až několikměsíců. To znamená, že jakmile se prokážesnížená sekrece inzulínu, je možno znovuobnovit původní hladinu dalším podánímúčinného faktoru. Je tedy zřejmé, že účinnýfaktor je možno užít nejen k léčbě cukrovky,komplikací cukrovky a chorob stáří, jejichžpříčinou je cukrovka, je však možno i účin-ně zasáhnout preventivně v případech, kdycukrovka není ještě zcela vyvinuta, zejménapři jejím rodinném výskytu u mladých lidí,kde jinak nebylo vůbec možno účinně za-sáhnout. 3. Vliv na sekreci inzulínu

Tento účinek byl pokusně prokázán nakrysách kmene Wistar a na psech kmeneBeagle.

Krysy

Pokusné podmínky odpovídaly podmín-kám, které byly uvedeny při stanovení účin-nosti, avšak byla měřena reaktivita na lát-ky, stimulující sekreci inzulínu třetí den popodání účinného faktoru a zjištěná hladinabyla srovnána s hladinou u normálníchkrys, jak je uvedeno v tabulce 7. Po zatíže-ní glukózou došlo k významnému vzestupu 19 23 koncentrace inzulínu v krvi oproti kontrolnískupině nezávisle na to, jakým způsobembyla glukóza podána. Podstatný vzestup bylrovněž zaznamenán při podání glukagonuv dávce 1 mg/kg a epinefrinu v dávce 200mikrogramů/kg. Bylo rovněž možno pozoro-vat zvýšenou účinnost tlbutamidu v dávce200 mg/kg a glibenclamidu v dávce 2 mg//kg. Tyto látky jsou běžně užívány jako an- tidiabetika. Výsledky prokázaly, že podáníúčinného faktoru může významně zvýšitreaktivitu organismu na jiné látky, zvyšujícísekreci inzulínu. 1 mikrogram účinného faktoru byl podánnitrožilně vždy 3 dny před pokusem. V ta-bulce jsou pak uvedeny průměrné hodnotya směrované odchylky vždy pro skupinupěti zvířat. 216547

S Φ tí Ο 4-» cd a

Cl

• ř—I >o 'd >1-1 d Φ >tí 4-i φ >w o cd r—4 3 '43 cd

H

'CD

G

>N >0) Λ Ό

CD >f-i ft

O ft cn >< S-i 44

O

CD f-i 44

<D

M 44

CD 4—· ω °d tí >tí Ρμ cd s a'^d 6 2w Ό s-

GO O o

CM d '<d Ί3

O £L< T3 Φ >tí p4 4444 JgCD 3+-> iícn ΰ<G CD&amp; 'o

>f-l J--I 44

CO g

Oh B 44 \ců -cn -o >T-4 O - c a; O 'Of-J Q) * d £o

OJ Ο

OJ

CO

CO » ΟΙ 00 Ι>- ΙΩ 03 05

I>S •Φ rH rH CO CO in rH rHr-1 co +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 0> OJ OJ rH O ’Φ CD ID 1T5 rH rH OJ o rH OJ co OJ in IO ÍO •φΐ co CO Φ< +1 +1 +1 +1 +! 4-1 +1 ΙΓ5 in ΙΓ5 co O HO uo OJ uo OJ OJ co OJ ΪΓ3 rH OJ t>>

rH CO 05

CO 00

OJ 3 co m S co +1 +| +1 +1 +1 +| +1 O oo ® 05 N co d tí

O &amp; Ό o a a 'cd444—* 'cd

i—I a

G

N »3

fcH 44 +1 +1 +1 +1 +1 co £ co 'Φ oj

rH 04 rH OJ OJ w>~ bo bo +1

OJ co +1

CO

CM >Φ Λ o 'cd 4—1 d d 44 cd Φ tí a d 4-» w Φ

N >

>φ >Φ d d >φ p—4 r—1 'cd tí O d p—H 'cd Φ >N O tí 4-» tí Φ a tí o +-» •p—H >Φ •i-4 d d cd tí d o N Φ do Ό a >N cd 4tí cd O d r—4 O tí 4-4 d t—1 tí 4—> <r4 G d i—4 O bo a

jq-ιη ” m O in -LmO ,-H O rH O i—l O rH

&amp;Q 3. O OOJ co bo a 03 o" >CD >φ, d tí '73 tí >N o O tí pití φ a O a TO d •i—C tí )—1 i—1 Ϊ—í d cd 43 r—1q &amp; CD G • ^4 d φ a <i-4p—I w O bo a

o o oCD CM CO d d >i-4 d 'cd Ό

O a o a >ω

G 'cd φ

H bO gcd O >CDfj O 43

cd cd °U 44 cdG > 43O 'Ctí oMQQ 216547 21 Účinný faktor v různém množství byl po-dán nitrožilně psům a po třech dnech bylonitrožilně podáno 25 mikrogramů/kg gluka-gonu nebo 0,3 g/kg glukózy, načež bylazkoumaná koncentrace inzulínu. Pokusnázvířata byla 18 hodin před pokusem chová-na v oddělených klecích bez potravy. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny vtabulce 8. Je možno pozorovat zvýšení se-krece inzulínu oproti kontrolám 5 minutpo podání glukagonu v dávce 50 ng/kghmotnosti ve formě bílkoviny, není-li jinak 22 uvedeno, sekrece inzulínu se zvýšila úměr-ně se zvýšením dávky, přičemž nejvyššíhozvýšení bylo dosaženo v dávce 1 mikrogram//kg. Podobného zvýšení sekrece inzulínubylo možno dosáhnout i při použití glukózyperorálně nebo nitrožilně s následným po-dání epinefrinu, jak je uvedeno v tabulce 9. Tyto výsledky ukazují, že je možno pod-statně zvýšit reaktivitu na látky, podporujícísekreci inzulínu u psů podáním účinnéhofaktoru.

O

CD

ID

O

CO

Tabulka 8

Vzestup sekrece inzulínu po podání glukagonu u psů předem ošetřených účinným faktoremDoba v minutách po podání glukagonu 0 5 15 Dávka

CO cd cm id co

l> ID rH CO CD

CM co o o oCO CO O CO CO

rH CM rH o co cd o q

CO ID C^· O) CD CM

r-i CO CO ý c0 >JL, CO CM CO CO CM CM 'gEM00 s a β 4tí w ω

N p >a> 00 «3 + ň te ΰ •as a 3 &amp; ca34 3ω 44 W>Ot-í 'ta 343 '3c/j B3

34 LOO Q cn

H ID O O

htí pq C? θ' θ' τΗ C\T 216347 4tí «2 ',2 «•β βo >on iao 3* g 'β s-

'SS s ctí xj 9φ 3 >f-i β0-j £w

CD

CD CO rH

CO

CM + +1+1 +1

O CD CO

CM CO

ID

CM

CM + +|+l + CD co 00 *β a 4tí +-»

O a Ό Φ Ί“-Ί

O S-i 4tí

CO 4tí

i—I β Λ

CO

H β P-l

O +-» 4tí

CO q-i

O Λ

'CD β .s

>G a \ι—1 β 'β

TD

O a o a °β w a

CD a

tSJΌΛβ&amp;0\r—I β

'CO

O a o a β

>S 3

N a •R-l

CD

O

CD P-í 4tí ω w a +j co ω

N > co 5ι—Ι >

N

CO a •1^ Pí 3 34 cn 3« \r-< '2 «3 rtcn Oβ £

° o* M

WI 3 '3 3

O P< a '3 f-““t

>N

O

SU

O a +j β

cO

N Ό 4tí β 3

rH a β 4tí

CO

CD

N

Ctiβ

•rH aβ4tíw'ββw β β4tí 4tí° >>Λ CJTOo 'ββ+-»βΌΟΕ-ι >ω β

'CO

O a

>ι—I a l—H•f—t

>N

O t-i

O a +-» β β í-l Q-i

O β •r-í

<W w +1 >ω a »3 f-í Ρι 34wΟ3Όω’(—»ο ř-i 4tí β 4tí

S 'β β Ν Ο a 216547 23 24 4. Zlepšení tolerance glukózy

Glukóza byla podána krysám perorálně abylo měřeno snížení hladiny glukózy v krvia koncentrace inzulínu v krvi. Obdobné po-kusy byly provedeny na psech. Dávka glu-kózy u krys byla 0,5 g/100 g hmotnosti a upsů 15 g/pes po 18 až 20 hodinovém hlado-vění. U krys a psů, kteří byli předběžně oše- třeni podáním účinného faktoru, byl vzestupglukózy v krvi daleko nižší a koncentraceinzulínu daleko vyšší, avšak koncentraceinzulínu se rychle vracela na původní hla-dinu v souvislosti s normalizací hladinyglukózy v krvi, takže nebylo možno pozoro-vat snížení hladiny glukózy, které by bylomožno připsat příliš velké sekreci inzulínu,jak je zřejmé z tabulek 10 a 11. Tyto vý-sledky ukazují zvýšenou toleranci glukózyu zvířat, jimž byl podán účinný faktor. 216547

Tabulka 10

Změny koncentrace glukózy v krvi a inzulínu v plazmě po zatížení glukózou u psů Čas po podání (minuty) 0 15 30 60 90 120 180 glukóza v krvi (mg/100 ml)

rH CO rH rH +1+1 +1+1 CT L·- co O O CTI rH rH CO rH 00 CO rH +1+1 +1+1 CO 00 00 CTI rH 00 rH CTI rH CO CM Mi +1+1 +1+1 rH CO CM CM rH CT rH rH rH Tři Tfi CM CM +1+1 +1+1 co oo 00 o rH rH CM rH rH in CT l> rH CO +1+1 +1+1 co oo co co CM O CM rH rH rH Tři O rH CT CM rH +1+1 +1+1 t> IN co b* rHrH rH rH CO □3 cn CM ΙΌ +1+1 +1+1 IÍ3 t> CO Ctí CM 03t—1 ¢0 >05 § 1,3 * a a >>·§ aΛ* H Sj a 'SaBS^aS1a a o m a

«3 2rf a S w 2C« W OT a \cd ** .a, a 'co3 a a o 3 a r μ 'j-j r co iJ s a jo .p a a λ g 'a a jío o a a o o 2»S ρ,ΰ 24 &amp; a 85 a 24

O a Ό >£ &amp; ί>** a Ό

CO

M "a r-i

O +» 24

CO «w

O Λ Ό) a a >o a *2

2 Xr-I CO > &amp;o NO M*ř-í

Sr

XD CO a a a ’g atj 24+3 stíž'«SŠ

Φ o>N ώ 'aό a 23 -Ho a~ "aa oa £a >ω

a S £ w ^+1 a j. 3 ao »aa f-iCu a 24

ι—1£rQCOH o co o cm

rH

O

CT

W f-i oa m a o

N Ό 24 a Ό (30 'r-í a a o 5 w

N

O Pí >φ a

N a a a a

5ι—I

r—H a

N a •^1 co

•i-H > F-l 24

N Ό δ &amp; 3 ω do .3 2 a a φ o a o 2tí 'f-í a <a Ό o a > oa &amp; >φ a a

N >O t> +1+1 O 03CM co tji co +1+1

Tři cmrH CO M* in 00 +1+1 in Třiin o in e> +1+1

rH OMí CO

CM CO +1+1 +1+1

co coO TřirH

Ml CO

CO CM +1+100 Ttlcti in 05 co +1+1 CM CMO t>

OTři rH

+Í+I CO CTco t>> a Φ co a 20

O a

TJ φ a t*'' a na CO 03 +1+1

t- COCM

rt H CM +1+1 +1+1

CO rHCD ID

03 inrd CM

M "a f-l o 4->

Cti 4-1

O 4=1 'Φ § «»4 >o '=5 cti >*-< Ϊ-Ι

g>FS £30 s.2 to 2< °3 aj «

>N ÓSO M

St a.a a "ao? o 'Ctí a t>o a s cti fGN OΌ to4d ' a 2a ·£ =3 9120 2«3 20« OTa <aa 5 O(3020

XD CZ33Ci 1½

Cti S >*·§nc s a5 o Ψ 3Ή a «20

f « « M > .92, a <aa o o c I a §3 a °C5 >φ a a 0í w 4tí , i ω+| 'Cti ,w >§ 3.0 o £a a 23 216347 5. Oprava cukrovky, vyvolané streptozo-tocinem u zvířat, předem ošetřenýchúčinným faktorem

Je známo, že podání streptozotocinu vedeu pokusných zvířat ke vzniku cukrovky zni-čením B-buněk v Langerhanzových ostrův-cích. Bylo však zjištěno, že u krys, jimž bylpředběžně podán účinný faktor, došlo velmirychle k vyhojení takto vzniklé cukrovkypři současné normalizaci hladiny glukózy vkrvi a toleranci glukózy při podávání nor-málního množství potravy. 26

Pokus byl prováděn tak, že krysám bylnejprve podán 1 mikrogram účinného fak-toru a pak streptozotocin nitrožilně v dávce5 mg/100 g po 3 až 5 dnech. Po 24 hodináchpo podání této látky bylo možno pozorovatzvýšenou hladinu glukózy v krvi u kontrol-ních zvířat i u pokusné skupiny, avšak upokusné skupiny se hladina glukózy v krvirychle vrátila na normální hodnoty a 5. až 7. dne již byla normální, přičemž koncen-trace inzulínu v plazmě byla rovněž sta-tisticky významně vyšší než u kontrolnískupiny, jak je zřejmé z tabulky 12.

CMCM +i+i +i+i in cmco 21B547 in co

CM

rM 0} 'Jd

i—I

CM 00 +1 in in co

Ml +1 05 05 co

tH 1Γ5

CO 'CO +1+1 +1+1 o coCO CMco,!

O M*IO ioCM

O

CM CO 05

I'IO +1+1 - wo oo en6* 00! lil cooo oo

Oprava streptozotocinového diabetůPředběžné ošetření účinným faktorem 3 3 •ř—< o o +-> o

N

O

+J a Q) 1-4 3 '3

O a o a \r-4 3 Ό +j v >o

O a oo cm cm uo +1+1 +1+1

M· O

O) CM oo coa co ctí >S-i > >4

Jel +j o 3

S O o 3O 3.

riS W)'— 3 >É?2 3- S β3 £ 3 S1ω ají

3 £i—í ceO N w > <0 ti A wti

—B 7)"3 a ®, o 2 s|

bO>B a-

—'XD a£ nb 3Jd 31 ►: 3

N 3S»% SM.S >% ti

•i-H a 3

Jel 09

V

N 3

Jel >> xí o Ό

O 'ti ti

+-J ctí Ό

O

>O

S CZ5 +1 xu a •3 t4 a 27 23 216S47

Sedmého dne po podání streptozotocinubyla zvířata zatížena glukózou a byla měře-na tolerance glukózy. Výsledky jsou uvede-ny v tabulce 13. V případě, že glukóza bylapodána po předchozím hladovění, byla kon-centrace glukózy v krvi stejná u kontrol-ních i ošetřených skupin, avšak u kontrol-ních skupin bylo možno pozorovat sníženoutoleranci glukózy ve srovnání s pokusnouskupinou. U pokusné skupiny byla tolerance proglukózu zlepšena na stupeň, srovnatelný stolerancí pro glukózu u normálních zvířat,kdežto koncentrace inzulínu v plazmě popodání glukózy byla vyšší než u kontrolnískupiny. Z toho je zřejmé, že takto vzniklácukrovka má pouze přechodný charakter,že zvířatům byl předem podán účinný fak-tor. 216547 CM CO CO Ή O +1 +1 +1 τΗ 00 CD co CM rH r-l

co CM O r-l +1 +1 +1 řx co ΙΩ CM ΙΩ CO r—1 rH

Zlepšení tolerance glukózy u streptozotocinového diabetů po předběžném ošetření účinným faktoremDoba po podání glukózy v minutách 0 15 30

CM rH IO +1 +1 +1 S £ § CM rH rd

OO

tH s cd Z—« ή *—>ID rH oq Η +1+1+1+1+1+1

rH

CM

CM CDCM ID

CD O COCO

CO CM CO r-lCM +1-4-1

1 CM "Ψ N t>eg co 00 cm 00 t-H 3 a • Γ—< a 3 4tí «3 ',+l+l+i+l cd 3 &amp; 3 4tí cn '3 3 cn 3 4tí

O CL, 3 3

•rH a 3 4tí cn '3 a o 2 cti >i—l >

N

LD tí

•í*H &amp; 2? 3a ^3 cn3 3 « Ό 3 CD >,

SS S Ό a ° a-s. bo a /3 3 > ti 4tí 3

N Ό 4tí 3 ι-H0 a ό N O3 ti &amp;a > ω S+l

3 t,N >CD a a «3 * * cu 216547 29 30 6. Zlepšení tolerance pro glukózu podá-ním účinného faktoru myším se spon-tánní cukrovkou (myši KK), podobnoulidské cukrovce

Myši KK jsou pokládány za modelová zví-řata pro studium cukrovky u lidí, protožetento typ myší při stárnutí vždy trpí samo-činně vznikající cukrovkou, zřejmě na dědič-ném podkladě. Z toho vyplývá, že v případě,že účinný faktor zabrání vzniku této cu-krovky nebo ji alespoň zlepší, je možnopředpokládat, že bude možno získat analo-gické výsledky i v případě cukrovky u lidí.Pokusy byly prováděny tak, že myši KK do-dané Faculty of Agriculture, Nagayoya Uni-versity a pěstované tak, že páření probíhalojenom u myší téhož kmene, byly zatíženyglukózou perorálním podáním glukózy vmnožství 0,15 g/20 g hmotnosti ve stáří 20 až 25 týdnů. Pak byly vybrány myši, u nichžbylo možno pozorovat zřetelné snížení tole-rance pro glukózu ve srovnání s normálnískupinou (kmen ddy). Bylo vybráno vždy5 myší. Jak je zřejmé z tabulky 14, po zatí-žení glukózou nebylo možno pozorovat vy-mizení glukózy z krve, takže tyto myši bylomožno považovat za diabetické. Těmže my-ším byl podán účinný faktor a po třechdnech byla znovu podána glukóza do ocasní,žíly. V důsledku podání účinného faktorubylo možno podstatně zvýšit toleranci proglukózu ve srovnání se stavem před podá-ním této látky. Mimoto se tolerance proglukózu zvýšila podstatně více než u skupi-ny normálních krys. Z tóhoto pozorováníje možno učinit závěr, že podáním účinnéhofakotoru je možno dosáhnout u cukrovkyuspokojivých léčebných výsledků . 216 5 4 7 o co o

CM

O

CO

•SJI 03 rHtH CO rH +1+1+1

o cod H CDrH CO 03 00 +1+1+1

CM CO g03 CM 05rH CO CO rHrH CM 03 +1+1+1

03 00 00CO O rKCO CO τ—I

Mi Η ca 2

fQ cd

Eh

S

O ?-i

O

•W ca <w s 3 3

fM >o a '3 ω »d +-< Φ ><n

O 'Φ 3

>N

><U Λ Ό 0)

O a

W >1—1 ><Λ a 3

N Ό

•M 3 00 >2 Ř' ft o ω o tí ca φ CO CO tHrd CO rd +1+1+1 o o

d O Lf3CM CO tH

t> CO CO +1+1+1 00 t> <N<35 i-l t> ca

>P >r-l >

N in £ •f“4 a 3 <z> 3 r-H00\r—í Gχαo Ό•w o

§ O >CZ3 &amp;Q, £ 3

N >O 3 00) 05 a s

>F<Í3 M Ό ,— ' ca3 33 -3 _ •fh a 3a 3 ,53 A! '3Jd w « «iřrt "3 3

CO '3 '3 a

Id

o2 Q 05 05£5 >3 O *3aO_7 o« a ctí 3tí * »3 rt sa o oo '33Ή ΌO>05 > S3ŠW > +iŠ 3 Ό>3 A) 3,3 »3 <50 £«l P>4 * <50 a 216547 31 32 7. Trvání farmakologického účinku

Farmakologický účinek účinného faktoruse projevuje pó několika hodinách po po-dání, je nejvyšší 3 až 7 dní po podání a pakpostupně klesá. Pokusy byly prováděny nakrysách po podání 0,5 mikrograraů účinné-ho faktoru a u psů po podání 1 mikrogramuúčinného faktoru na kg váhy. U psů bylo prováděno sledování tolerancepro glukózu po zatížení glukózy nitrožilně15. děn po podání účinného faktoru, sou- časně byla sledována sekrece inzulínu poepinefrinu a glukagolu 2'9. a 42, den bylomožno pozorovat dostatečný účinek, jak jezřejmé z tabulky 15. U krys bylo 28. dnepo podání ještě možno pozorovat 50 % ma-ximálního účinku, který byl dosažen 3. dne.

Je zřejmé, že farmakologické účinky účin-ného faktoru přetrvávají několik týdnů ažněkolik měsíců, přestože není možno před-vídat velikost těchto účinků v závislosti nadávce. ' Tabulka 15

Vzestup sekrece inzulínu u psů po podání glukagonu 42. dne po podání účinného faktoru.

Doba po podání glukagonuv minutách 0 5 15 30 kontrolní skupinapokusná skupina 6 + 1* 6 + 1 14 + 1 9 + 2 8 + 1 71 + 9 28 + 8 7 + 1

Nitrožilní podání 25 mikrogramů/kg glukaganu.

Průměr + Směrodatná odchylka vždy pro5 zvířat. * mikrojednotky/ml. 8. Účinná dávka a způsob podání Účinná dávka účinného faktoru pro podá-ní u lidí je 10 ng až 1 mikrogram/kg hmot-nosti v případě čisté látky. Je však rovněžmožno podávat až 2 mikrogramy/kg i vyššínajednou.

Nejvýhodnějším způsobem podání je ni-trožilní injekce. 9. Stálost a účinnost

Odolnost proti teplým vlivům

Pokus byl prováděn tak, že pokusný roztoko koncentraci 40 mikrogramů bílkovin/mla o pH 7,0 byl vystaven různým teplotámv rozmezí 37 až 100 °C na 15 minut, načežbyly sledovány změny účinnosti pokud jdeo schopnost vyvolat sekreci inzulínu. Kon-trolní vzorek byl uchováván při teplotě 4°Ca je rovněž uveden s účinností 100 v násle-dující tabulce 16.

Tabulka 16

Teplota (°C) Relativní účinnost 4 100 37 100 56 113 60 76 70 53 80 18 100 13 Přestože hranice odolnosti proti teplu jepro účinný faktor nižší než 56 °C je možnopozorovat určitou účinnost ještě při teplotě80 °C.

Stálost při různém pH

Roztok účinného faktoru o koncentraci40 mikrogramů bílkoviny/ml se smísí s ur-čitým podílem 3 N kyseliny chlorovodíkovénebo hydroxidu sodného k úpravě pH a pakse skladuje při teplotě 4 °C po dobu 24 ho-din. Pak se výsledné roztoky podají zvířa-tům po předchozí úpravě pH na neutrálníhodnoty a sleduje se vzestup sekrece inzu-línu. Výsledky, které jsou uvedeny v tabul-ce 17 jsou vyjádřeny jako relativní účinnost,přičemž hodnota při pH 7,0 se považuje za100.

Tabulka 17 pH Relativní účinnost 1 2 3 479 10 11 12 16 27 43 112 100 120 89 23 0 Přestože oblast, při níž je účinný faktorstálý, se pohybuje v rozmezí pH 4 až 9, jemožno pozorovat určitou účinnost ještě připH nižším než 3 a při pH 10 a 11. 10. Akutní toxicita V následující tabulce je uvedena akutnítoxicita jako LDso v mikrogramech/kg hmot-

Claims (2)

1. 216547 33 34 nosti, přičemž bylo užito čištěného vzorkuúčinného faktoru a jako pokusných zvířatbylo užito myší kmene ddy. Akutní toxicita samci a samice podkožně 540 580 nitrožilně 222 155
2. 11. Farmaceutické použití Jak již bylo uvedeno, je možno užít účin-ný faktor, získaný způsobem podle vynálezuk léčbě a prevenci cukrovky. Dávka se po-hybuje v závislosti na specifické účinnostizískaného materiálu. Pro zlepšení sekreceinzulínu se obvykle podává dávka 10 ng/kg hmotnosti až několik desítek mikrográmů//kg hmotnosti. Pokud jde o způsob podání, nejúčinnějšíje nitrožilní injekce, je však možno užít ijiného způsobu podání, například intraperi-toneálně, nitrosvalově nebo podkožně, pří-mo do trávicí trubice, tj. perorálně, iptra-rektálně, sublinquálně, mimoto je možnéi podání v nosní sprayi, do tepen, do prů-dušnice. Účinný faktor je možno podávat ve forměinjekčních roztoků, čípků, dražé, tablet aroztoků, vhodných k inhalaci. Nejjednodu-ším injekčním roztokem je směs 1 ml roz-toku s 10 000 jednotkami účinného faktoru,9 mg chloridu sodného v destilované vodě. Je zcela zřejmé, že účinný faktor je možnppodávat i ve směsi s různými dalšími léčivy,pomocnými látkami nebo nosiči, tak jak jeto u farmaceutických přípravků běžné. předmEt Způsob výroby bílkovinného faktoru,schopného vyvolat sekreci inzulínu a zlepšittoleranci glukózy u savců, vyznačující setím, že se pěstuje pathogenní kmen Borde- tella pertussis a ze živého prostředí po skon-čené kultivaci se jako účinný faktor izolujebílkovina s molekulovou hmotností 77 000+ 6400 za průkazu gelovou filtrací. 4 listy výkresů