CH640244A5 - Biologically active substance - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft therapeutische Stoffe und insbesondere eine neue, durch Züchten geeigneter Stämme der Mikroorganismen Bordetella pertussis (Phase I oder II) in geeigneten Kulturmedien erhältliche Substanz.

Es wurde gefunden, dass die Zellen von Mikroorganismen aus der Gruppe Bordetella pertussis und die Kulturbrühe von Kulturmedien dieser Mikroorganismen einen Stoff mit überraschender pharmakologischer Wirkung in bezug auf die Förderung der Insulinsekretion und die Erhaltung normaler Blutzuckerwerte enthalten, der für die Behandlung oder Vorbeu-tung verschiedener Formen der Diabetes grossen medizinischen Wert besitzt. Diese neue proteinische Substanz konnte als ein die Insulinsekretion verstärkender Faktor isoliert und chemisch identifiziert werden und wird als inselaktivierendes Protein (IAP) bezeichnet. Ferner wurde gefunden, dass die neue Substanz in ausserordentlich geringen Dosen (annähernd 0,1 |ig/kg Körpergewicht) eine hervorragende Wirksamkeit auf die Förderung der Insulinsekretion zeigt und für Behandlung und Vorbeugung verschiedener Formen von Diabetes geeignet ist.

Gegenstand der Erfindung ist die neue biologisch aktive Substanz IAP, die durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet ist: Molekulargewicht 77000 ± 6400, bestimmt durch Gelfiltration; chemische Zusammensetzung: Proteingehalt über 95 Gew.-%, bestimmt nach der Methode von Lowry; Kohlehydratgehalt (Glucid): etwa 1 Gew.-%, bestimmt nach der Phenol-H2S04-Methode; Lipidgehalt: niedriger als die Erfassungsgrenze; Aminosäurezusammensetzung des Proteinteils (Durchschnittsverhältnis, uM/100 uM): Asparaginsäure 7,5, Threonin 7,3, Serin 6,4, Glutaminsäure 10,0, Prolin 5,8, Glycin 8,8, Alanin 9,3, Cystin/2 2,5, Valin 6,5, Methionin 2,8, Isoleucin 4,0, Leucin 7,8, Tyrosin 6,5, Phenylalanin 3,7, Lysin 3,3, Histidin 1,5 und Arginin 6,4; isoelektrischer pH-Wert: 8,4 ± 0,5 und Scheibenelektrophoresebild: die Acrylamid-Schei-benelektrophorese (Polyacrylamid-Konzentration 7,5%, 1 n KOH-Eisessig-Puffer (pH 4,3) der Substanz ergibt auf der Kathodenseite eine sehr scharfe Einzelbande.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung der neuen Substanz IAP oder eines Äquivalents hiervon durch Kultivieren von Bordetella pertussis und Gewinnung des IAP aus dem Kulturmaterial (Kulturbrühe bzw. -medium und/oder Bakterienzellen).

Erfindungsgemäss sind ferner auch pharmazeutische Mittel, die IAP oder ein Äquivalent hiervon zusammen mit einem pharmakologisch zulässigen Träger enthalten.

Im folgenden werden Herstellung, Identifizierung und Aktivitätsbestimmungen der erfindungsgemässen Substanz unter Bezugnahme auf die Zeichnungen erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 das Chromatographie-Diagramm an einer Hydro-xylapatitsäule, wobei die Proteinkonzentration in ug/ml auf der linken Ordinate aufgetragen ist und der durchgezogenen Messkurve mit den offenen Messwerten entspricht, während auf der rechten Ordinate die Aktivitätseinheiten entsprechend der durchbrochen gezeichneten Messkurve mit den ausgefüllten Messpunkten angegeben sind; auf der Abszisse ist das Elutionsvolumen in ml angegeben,

Fig. 2 das Diagramm einer Chromatographie an einer Carboxymethyl/Sepharose CL-6B-Säule, wobei für die Ordi-naten, die Abszisse und die Messkurven das zu Fig. 1 Gesagte gilt;

Fig. 3 das Diagramm einer Chromatographie an einer «Con-A»-Sepharose-Säule, wiederum analog dargestellt wie in Fig. 1 ;

Fig. 4 das Diagramm einer Chromatographie an einer «Biogel P-100»-Säule, ebenfalls in analoger Darstellung gemäss Fig. 1 ;

Fig. 5 ein Elektrophoresebild von IAP, und

Fig. 6 das SDS-Elektrophoresebild von IAP.

Der erfindungsgemässe neue und die Insulinsekretion bestimmende («secretogoge») aktive Faktor (im folgenden kurz als «aktiver Faktor» bezeichnet) ist eine proteinische Substanz, die allgemein durch Züchten der Mikroorganismen Bordetella pertussis (Phase I oder II), einem bekannten pathogenen Bakterium, vorzugsweise Bordetella pertussis (Phase I), in einem festen oder flüssigen Medium und durch Sammeln und Reinigen der entsprechenden Substanz aus den gezüchteten Bakterienzellen oder/und dem von den Zellen befreiten Kulturmedium gewonnen wird.

Zur Sammlung und Reinigung des aktiven Faktors aus der Kultur sind alle allgemein in der Technik üblichen Methoden dieser Art geeignet, wie Fällungsmethoden, chromatographische Methoden, Molekularsiebmethoden, elektrophoretische und biologische Methoden; diese Methoden können einzeln oder in entsprechenden Kombinationen angewendet werden und die Erfindung ist nicht auf eine spezifische Sammlungsund Reinigungsmethode beschränkt.

Die Säulenchromatographie ist ein Beispiel einer besonders vorteilhaften Sammlungs- und Reinigungsmethode zur

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Gewinnung des neuen aktiven Faktors. Bei diesem Verfahren wird die Kulturbrühe des Kulturmediums durch eine Kolonne geführt, die beispielsweise mit einem der folgenden Stoffe gefüllt ist: Hydroxylapatit (z.B. der Firma Biochemical Industry, Ltd.), Carboxymethyl-Sepharose, Typ CL-6B, oder «ConA-Sepharose-4B» (beide von der Firma Pharmacia Fine Chemicals).

An einer solchen Kolonne wird der aktive Faktor mit hoher Selektivität adsorbiert und kann dann mit einem entsprechend ausgewählten Eluiermittel, wie einem 0,1 molaren Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0), der 0,5 m Natriumchlorid enthält, eluiert werden. Das gereinigte Produkt kann dann zur Entfernung der nicht erforderlichen Salze dialysiert werden und liefert so den reinen aktiven Faktor. Der aktive Faktor ist auch in den gezüchteten Bakterienzellen vorhanden und kann gewünschtenfalls aus diesen, beispielsweise durch Zugabe von Natriumchlorid zur Zellsuspension zum Auslaugen des aktiven Faktors und Übergang in die Lösung, gewonnen werden.

Auch die viel verwendete Ammoniumsulfat-Fällungsmethode ist zur Gewinnung des aktiven Faktors geeignet. Hierzu wird festes (NH^SCU zur überstehenden Kulturbrühe bis annähend zum Erreichen der Löslichkeitsgrenze gegeben und der pH-Wert dann mit verdünntem wässrigem Ammoniak auf 6 bis 7 eingestellt. Dann wird der Niederschlag mit Wasser gewaschen und der aktive Faktor mit 0,1 m «Tris»-Puffer (pH-Wert 8) extrahiert, der 0,5 m Natriumchlorid enthält.

Die zur Gewinnung des neuen aktiven Faktors verwendeten Mikroorganismen Bordetella pertussis sind die bekannten Keuchhustenbazillen. Zur Gewinnung der erfindungsgemäs-sen aktiven Substanz können aber auch vArianten dieser pa-thogenen Bakterien verwendet werden, wie sie durch Mutation nach verschiedenen an sich bekannten Methoden, z.B. durch Veränderung der Zusammensetzung des Mediums, durch Einwirkung verschiedener Strahlungsarten, wie UV-Strahlen oder Röntgenstrahlen, oder durch Verwendung von chemischen Mutagenen, erhältlich sind. Zur Züchtung der Bakterien können erfindungsgemäss alle Kulturverfahren angewendet werden. Aus Gründen der Produktaktivität und -ausbeute werden Schüttelkulturmethoden in flüssiger Phase meist bevorzugt. Die mykologischen Eigenschaften und Kulturbedingungen der zu den Bordetella gehörenden Mikroorganismen sind in der Literatur beschrieben, z.B. Bergy, «Manual of Determinative Bacteriology», Band 8,1974, Baltimore, The Williams & Wilkins C.; J. Exp. Med. 129,

523-550 (1969) und «Mycological Training Handbook», 3. Auflage, Seite 6 ff., 1972, Maruzen & Co.

Allgemein beruht das erfindungsgemässe Verfahren auf der Gewinnung des inselaktivierenden Proteins (IAP) mit der angegebenen chemischen Charakteristik, umfasst aber auch die Herstellung von allgemein insulinsekretionsfördernden Stoffen, die ein dem IAP im wesentlichen ähnliches oder gleichwertiges Protein, d.h. IAP-Äquivalente sind.

Im folgenden werden weitere Eigenschaften von IAP beschrieben.

Zustands- und Lösungseigenschaften:

Der nach dem Entsalzen durch Gefriertrocknen erhaltene pulverförmige aktive Faktor ist ein nicht zerfliessliches, weisses oder hellbraunes Pulver, das sich bei Raumtemperatur in Konzentrationen von bis 3-5 mg/ml löst. In 6n HCl bildet das Material einen unlöslichen weissen Niederschlag und ist in Pyridin, Dodecylnatriumsulfat, 2-Mercaptoäthanol und Cysinlösung löslich. Die Zugabe einer Mischung von Trok-keneis mit Aceton oder Äthanol, Trichloressigsäure bzw. Zinkchloridlösung oder einer verschiedene Arten von Metallionen enthaltenden Lösung zur Lösung des gereinigten aktiven Materials in der Kälte (4°C) ergibt eine weisslich-trübe

Fällung. In Mischungen von Wasser mit Chloroform oder n-Butanol ist der aktive Faktor unlöslich und sammelt sich an der Grenzfläche der beiden Flüssigkeiten. Beim Erwärmen einer wässrigen Lösung des aktiven Faktors auf 80 °C oder mehr wird die Lösung weisslich-trüb. Auch beim Auflösen des aktiven Faktors in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 m Natriumchlorid enthält, und folgendem Dialysieren mit destilliertem Wasser als Aussenflüssigkeit wird der Faktor zeitweilig weisslich-trüb, löst sich aber bei Fortsetzung der Dialyse vollständig und die weisse Trübung verschwindet. Wenn eine hochkonzentrierte Lösung mit 0,01 m Acetatpuffer (pH-Wert 4,5) gründlich dialysiert wird, verfärbt sich der aktive Faktor nach Hellbraun und löst sich.

Das oben angegebene Molekulargewicht des aktiven Faktors wurde durch Gelfiltration an einer Kolonne (2,8 x 80 cm) «Biogel P-100» (der Firma Bio. Rad Corp.) bestimmt, die mit 0,1 m Phosphatpuffer, der 0,5 m Natriumchlorid enthielt, equilibriert worden war.

In bezug auf die Methoden zur Bestimmung der weiter oben genannten Eigenschaften von IAP ist auf folgende Literaturstellen zu verweisen:

Proteingehalt

Lowry O.H., N.J. Rosebrough, A, L. Farr und RJ. Randall: J. Biol. Chem. 193,265 (1951).

Kohlehydrat (Glucid)-Gehalt

Phenol-H2SC>4-Methode, Dobois M., K.A. Giles, J.K. Hamilton, P.A. Rebers und F. Smith: Anal. Chem. 28, 350 (1956);

Lipidgehalt

Gesamtlipid und Lipidkonjugat wurden nach der Methode von Marsh und Weinstein (J.B. Marsh und D.B. Weinstein: J. Lipid Res. 7, 574 (1966) durch Extraktion des Materials vor und nach der Hydrolyse, und zwar mit Chloroform, Chloroform-Methanol und Heptan als Extraktionsmittel, bestimmt.

Die Aminosäurezusammensetzung der Proteinkomponente (mittleres Zusammensetzungsverhältnis, p.M/100 uM, 16- oder 24stündige Hydrolyse bei 110°C in 6 normaler HCl):

Asparaginsäure 7,5 ; Thfeonin 7,3 ; Serin 6,4;

Glutaminsäure 10,0; Prolin 5,8; Glycin 8,8;

Alanin 9,3 ; Cystin-2 2,5 ; Valin 6,5 ;

Methionin 2,8; Isoleucin 4,0; Leucin 7,8;

Tyrosin 6,5; Phenylalanin 3,7; Lysin 3,3;

Histidin 1,5 und Arginin 6,4.

Der isoelektrische Punkt der Substanz liegt bei pH 8,4 ±

0,5.

Das scheibenelektrophoretische Bild wurde durch Scheibenelektrophorese bei einer Acrylamid(Polyacrylamid)-Kon-zentration von 7,5% in 1 n KOH-Eisessig-Puffer (pH-Wert 4,3) mit einer Probenmenge von 30 (ig, einem Strom von 4 mA (Dauer Std./Gel), Anfärben mit Amidschwarz 10B und Entfärben mit 7%iger Essigsäurelösung durchgeführt. Es wurde ein sehr scharfes einzelnes Band in einer Entfernung von 2,221 + 0,061 cm erhalten, wobei das am Abstandsstück liegende Gel-Ende als Bezugspunkt diente.

Wie anhand der weiter unten beschriebenen Versuchsergebnisse zu den biologischen Eigenschaften ersichtlich ist, hat der neue aktive Faktor allgemein für Säuger eine die Insulinsekretion fördernde und die Glucosetoleranz verbessernde Wirkung. Die Wirkungsdauer einer einzigen Dosis beträgt einige Wochen bis einige Monate (durch intravenöse Injektion). Die Akuttoxizität (LDso) beträgt annähernd 200 (ig pro Kilogramm Körpergewicht (intravenös an Mäusen, Stamm ddy).

Im folgenden werden Beispiele für die Gewinnung der

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erfindungsgemässen aktiven Substanz gegeben. Das verwendete Bakterienmaterial stammte von der bakteriologischen Abteilung der Kitasato University School of Pharmaceutical Sciences.

Beispiel 1

Gefriergetrocknetes und konserviertes Bakterienmaterial Bordetella pertussis (Stamm Tohama Phase I) wurde zwei Tage bei 37 °C in Bordet-Gengou-Medium auf Platten gezüchtet. Dann wurde die mit einer Platindrahtschleife entnommene Bakterienmenge in einen 500-ml-Schüttelkolben überimpft, in welchem 200 ml eines durch Zusatz von Ionenaustauscherharz modifizierten Nährmediums nach Cohen-Wheeler (im folgenden als CW-Medium bezeichnet) mit der in Tabelle I unten angegebenen Zusammensetzung einpipettiert worden war, und dann bei 37 °C unter Schütteln während 20-22 Stunden gezüchtet. Die Bakterienkonzentration in der Kulturlösung wurde mit einem Spektrofotometer (Wellenlänge 650 nm) gemessen und diese Lösung wurde in einen Zweiliter-Schüttelkolben gegeben, in welchem 1 Liter des mit Ionenaustauscherharz versetzten CW-Mediums einpipettiert worden war. Die Bakterien-Endkonzentration betrug etwa 0,1 • 109 Zellen pro Milliliter. Das Bakterienmaterial wurde dann noch 48 Stunden bei 37 °C unter Schütteln (Schüttelfrequenz 97 Mal pro Minute) gezüchtet.

Die bakteriologischen Eigenschaften des oben genannten Bakterienstammes stimmten mit den Angaben in den oben genannten Literaturstellen für Bordetella pertussis (Phase I) Stämme überein.

Tabelle I

Zusammensetzung des modifizierten Cohen-Wheeler-Mediums

Casaminosäure 10 g

Hefeestrakt 1 g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 g lösliche Stärke 2 g

0,5%ige Kupfersulfatlösung 1 ml l%ige Calciumchloridlösung 1 ml

4%ige Magnesiumchloridlösung 1 ml

Polypepton 5 g l%ige Cystinlösung 2,5 ml

0,5%ige Eisensulfatlösung 1 ml

Natriumchlorid 2,5 g

Dieses Medium wurde vor der Verwendung zunächst mit destilliertem Wasser auf insgesamt 10001 aufgefüllt, nach Einstellen des pH-Wertes mit 20%iger Natriumhydroxidlösung auf 7,2 mit 3 g Anionenaustauscherharz («Diaion SA-20 AP», Mitsubishi Kasei Co.) versetzt und dann 15 min bei 121 °C im Autoklav behandelt.

Die erhaltene 48-Stunden-Schüttelkulturlösung wurde 30 min auf 56°C erwärmt und dann bei 4°C zentrifugiert (15000 U/min), um die überstehende Kulturbrühe von den Bakterienzellen abzutrennen. Die so erhaltene Kulturbrühe wurde als Ausgangsmaterial für die Reinigung und Isolierung des gewünschten aktiven Faktors verwendet.

Zur Durchführung des ersten Einigungsschrittes wurden 10 Liter dieser Kulturbrühe nach Einstellen des pH-Wertes mit 1 n Salzsäure auf 6,0 mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/Std. durch eine Hydroxylapatit-Kolonne (2,5 x 4 cm) geführt.

Der grösste Teil des Proteins ging durch die Kolonne hindurch, ohne an dieser adsorbiert zu werden, und es wurde wenig der angestrebten Insulinsekretionsaktivität (siehe die weiter unten beschriebene Aktivitätsmessungsmethode) festgestellt. Die Proteinkonzentration wurde nach der am Ende der Tabelle II weiter unten angegebenen Methode von Lowry et al. gemessen.

Zur Bestimmung der adsorbierten Substanzen wurde die Kolonne zuerst mit 0,01 m Phospha.tpuffer (pH-Wert 6,0) gewaschen. Dann wurden die adsorbierten Proteine nach Erhöhen der molaren Konzentration des Phosphatpuffers auf 0,1 (pH-Wert 7,0) langsam eluiert. Unter diesen Bedingungen wurde der gewünschte aktuve Faktor jedoch nicht eluiert. Es wurde daher eine zusätzliche Eluierung mit Phosphatpuffer grundsätzlich gleicher Zusammensetzung, aber mit einem Gehalt von 0,5 ml Natriumchlorid, durchgeführt. Unter diesen Bedingungen konnte der gewünschte aktive Faktor mit hoher Wirksamkeit und in Übereinstimmung mit dem eluier-ten Protein gewonnen werden. Das entsprechende Diagramm ist in Fig. 1 dargestellt. Der erhaltene aktive Faktor wurde konzentriert und nach Einführen in eine Dialysemembran (Thomas Cat. No. 3787-F25) mit einer oberen Durchlässigkeitsgrenze entsprechend einem Molekulargewicht von 8000 zweimal (insgesamt 12 Std.) mit destilliertem Wasser und zweimal (insgesamt 12 Std.) mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH-Wert 6,0) dialysiert. Zur weiteren Reinigung wurde die den dialysierten aktiven Faktor enthaltende Lösung durch eine Kolonne (1,5 x 10 cm) mit einer Füllung aus Carboxymethyl-Sepharose CL-6B, die mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH-Wert 6,0) equilibriert war, geführt. Das an dieser Kolonne nicht adsorbierte Material zeigte keine Aktivität. Dann wurde nach Erhöhung der molaren Konzentration und des pH-Wertes des Phosphatpuffers auf 0,1 bzw. 7,0 eine ähnliche Eluierung unter Zusatz von 0,5 m Kochsalzlösung durchgeführt, wodurch der gewünschte aktive Faktor in Übereinstimmung mit dem eluierten Protein erhalten wurde. Das entsprechende Diagramm ist in Fig. 2 dargestellt.

Da dieses Produkt ausweislich der Scheibenelektrophorese immer noch geringe Mengen an Verunreinigungen enthielt, wurde dieser aktive Faktor weiter konzentriert und nach Einführen in eine Dialysemembran (gleicher Art wie oben) zweimal (insgesamt 12 Std.) mit destilliertem Wasser und zweimal (insgesamt 12 Std.) mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) dialysiert. Die dialysierte Probe wurde durch eine Kolonne (1,5 x 8 cm) geführt, die mit ConA-Sepharose 4B gefüllt und mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) equilibriert worden war. Beim Entwickeln mit dem gleichen Puffer wurde eine Spurenmenge Protein eluiert, das aber keine Aktivität zeigte. Durch weiteres Eluieren mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 m Natriumchlorid enthielt, wurde der mit dem eluierten Protein übereinstimmende aktive Faktor gewonnen (Diagramm siehe Fig. 3).

Da dieser Teil ausweislich Scheibenelektrophorese immer noch eine sehr geringe Verunreinigungsmenge enthielt, wurde dieser Proteinteil gesammelt, eingeengt und mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 m Natriumchlorid enthielt, dialysiert. Die dialysierte Probe wurde dann der Gelfiltration unterworfen, indem sie durch eine Kolonne (2,8 x 60 cm) geführt wurde, die mit Biogel P-100 (Bio. Rad Co.) gefüllt und mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war. Dies ergab den reinen aktiven Faktor in Übereinstimmung mit dem Proteinanteil, der die Spitze beim Molekulargewichtswert von etwa 80000 (Fig. 4) zeigt.

Das so erhaltne neue Protein ist erfindungsgemässes Inselaktivierungsprotein (IAO). Aktivitätswerte, Reinigung und andere, bei dieser Reinigungsbehandlung ermittelten Daten sind in Tabelle II zusammengestellt. Die Charakterisierung dieser Substanz erfolgte in der oben angegebenen Weise.

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Tabelle II

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Stufen Lösungsmenge Proteinkonzen- Gesamtprotein Spezif. Aktivitätsaus- Reinigung

(ml) tration* (mg) Aktivität beute

(Hg/ml) (Einh./jig) (%)

Überstehende Kulturbrühe

10000

2000

22000

0,318

100

1

Säulenchromatographie mit

125

159

19,9

193,0

55

607

Hydroxylapatit

Säulenchromatographie mit

45

251

11,3

321,0

52

1009

CM-Sepharose

Säulenchromatographie mit

50

176

8,8

380,0

48

1195

Con A-Sepharose

Säulenchromatographie mit

40

168

6,7

429,0

41

1349

Biogel P-100

* Die Proteinkonzentration wurde nach der Methode von Lowry et al. (Lowry O.H., N.J. Rosenbrough, A.L. Farr und

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Die Reinheit der in der letzten, oben genannten Stufe erhaltenen Substanz IAP wurde durch Scheibenelektrophorese mit Polyacrylamidgel (Polyacrylkonzentration von 7,5%, 1 n Puffer aus KOH/Eisessig, pH 4,3) bestimmt, und zwar entsprechend der von J.V. Maizel jun. (Biochem. Biophys. 25 Res. Comm., 1963, Band 13,483) beschriebenen Methode.

Die Probenmenge pro Gel betrug 30 |ig (als Protein). Der Versuch wurde mit einem Strom von 4 mA während 2 Std., Anfärben mit Amidschwarz 10B und Entfärben mit 7%iger Essigsäurelösung durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse 30 sind in Fig. 5 gezeigt, die eine mit einem Densitometer aufgezeichnete Kurve des Gelzustandes und das elektrophoretische Bild darstellt. Es wurde festgestellt, dass die in dieser abschliessenden Stufe erhaltene Probe eine einzige, von Verunreinigungen völlig freie Substanz ist und dass die gemäss 35 den weiter unten beschriebenen Aktivitätstests bestimmte Wirkung auf die Förderung der Insulinsekretion derjenigen dieser isolierten Substanz entspricht. Zur Bestimmung der Strukturen der Untereinheiten des IAP wurde dieses der folgenden SDS-(Natriumdodecylsulfat-)Elektrophorese auf io Polyacrylamid-Gel nach der Methode von Shapilo (A.L. Sha-pilo et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 1967, Band 28,

Seite 815) unterworfen. Hierzu wurden 50 p.g IAP-Probenmaterial (als Protein) pro Röhrchen zu einer Mischung aus 1% Natriumdodecylsulfat, 1% Mercaptoäthanol und 4 m Harn- « stoff gegeben. Nach zweistündiger Inkubation bei 37 °C wurde die Mischung auf 10%iges Polyacrylamidgel aufgetragen, das 1% Natriumdodecylsulfat enthielt. Nach vierstündiger Einwirkung eines Stromes von 8 mA/Gel wurde mit Coo-massieblau gefärbt und mit 7,5%iger Essigsäure entfärbt. Die so Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt, die eine zeichnerische Darstellung des Gelzustandes und das mit einem Densitometer aufgenommene elektrophoretische Bild zeigt.

Beispiel 2 55

Gefriergetrocknete und konservierte Bordetella pertussis (Stamm NIH 114/3779B) wurde wie in Beispiel 1 der Schüttelkultur unterzogen und abgetrennt. Es wurden 10 Liter überstehende Kulturbrühe der flüssigen Kultur erhalten.

Die so erhaltene Kulturbrühe wurde in zwei Teile geteilt. 60 Der eine Teil wurde mit einer Geschwindigkeit von 200 ml/Std. durch eine Hydoxylapatit-Kolonne (2,5 x 4 cm)

geführt, nachdem der pH-Wert der Kulturbrühe mit 1 n HCl auf 6,0 eingestellt worden war. Die Kolonne wurde mit Wasser gewaschen und das Adsorbat dann mit 0,1 m Phosphat- Dä puffer eluiert, der 0,5 m NaCl (pH-Wert 7,0) enthielt. Das erhaltene Eluat wurde in eine Dialysemembran gebracht, die eine obere Molekulargewichts-Durchlässigkeitsgrenze von

R.J. Randall: J. Biol. Chem. 193,265 (1951) unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Bezugssubstanz gemessen.

8000 aufwies (Thomas Cat. No. 3787-F25) und dreimal gegen destilliertes Wasser (insgesamt 18 Std.) dialysiert, was die aktive Substanz ergab, die nach dem Gefriertrocknen als feines Proteinpulver mit bräunlich-weisser Farbe (Probe A) vorlag. Dieses Material ist ein IAP-Äquivalent, d.h. ein aus Bordetella gewonnener und die Insulinsekretion fördernder Faktor.

Die restlichen 5 Liter der Kulturbrühe wurden mit Ammoniumsulfat bis zu 90% des Sättigungswertes (Einstellen des pH-Wertes mit schwachem wässrigem Ammoniak auf 6,5) versetzt, wodurch praktisch alle proteinartigen Stoffe ausgefällt wurden. Dann wurde der Niederschlag vollständig mit Wasser gewaschen, mit 0,1 m Tris-0,5 m NaCl-Puffer (pH 9) verflüssigt und die Extraktlösung erhalten. Diese wurde zuerst mit 1 n HCl neutralisiert und dann mit der oben beschriebenen Dialysemembran dreimal (insgesamt 18 Std.) gegen destilliertes Wasser dialysiert. Dies ergab die aktive Substanz, und zwar 11,2 mg gefriergetrocknetes Pulver (Probe B).

Beispiel 3

Unter Verwendung von Bordetella pertussis (Stamm Maeno, Phase I) in gefriergetrockneter und konservierter Form wurden die in Beispiel 1 beschriebenen Verfahrensschritte durchgeführt. Dies ergab 23,6 bzw. 10,8 mg gefriergetrocknete Pulverproben der aktiven Substanzen (Proben C und D).

Die spezifischen Aktivitäten und Toxizitätswerte der nach den Beispielen 1-3 erhaltenen Proben A-D, bestimmt nach der weiter unten beschriebenen Methode, sind in den Tabellen III und IV zusammengestellt.

Tabelle III

Probe

Spezifische Aktivität

(Einheiten/|ig)

A

57,1

B

93,0

C

127,2

D

81,0

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Tabelle IV

Probe

LD 50 (ug/kg Körpergewicht,

intravenös, Maus)

A

1620

B

2510

C

2890

D

3020

Demzufolge sind auch diese Pulverproben der aktiven Substanzen ebenso wie IAP zur Verwendung für die Behandlung oder Vorbeugung von Diabetes geeignet. Die wirksame Dosis dieser IAP-Äquivalente beträgt 1-100 (ig pro Kilogramm Körpergewicht.

Beispiel 4

Bordetella pertussis (Stamm Tohama, Phase I) wurde in gleicher Weise wie in Beispiel 1 gezüchtet und die nach Abtrennung der Organismen aus dem Kulturmedium gewonnene Kulturbrühe als Ausgangsmaterial verwendet. Mit Trok-keneis gekühltes Aceton wurde auf die 100 Liter der Kulturbrühe unter Schütteln und Kühlung auf Eis zum Erzielen einer Endkonzentration von 60% aufgegossen. Dann wurde der Niederschlag mit einer kontinuierlichen Zentrifugen-trennanlage (5000 U/min, 4°C) gesammelt. Der erhaltene Niederschlag wurde getrocknet, das erhaltene Material in 500 ml 0,01 m Phosphatpuffer (pH-Wert 6,0) gelöst und dann durch eine Hydoxylapatit-Kolonne (5x4 cm) geführt. Die Aktivität sammelte sich in der Substanz, die mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert wurde, der 0,5 m NaCl enthielt. Die eluierte Substanz wurde gesammelt, eingeengt, gegen 0,01 m Phosphatpuffer (pH 6,0) dialysiert und dann durch eine Kolonne mit CM-Sepharose (CL-6B (2,5 x 25 cm) geführt, die mit dem gleichen Puffer equilibriert worden war. Dann wurde die aktive Substanz mit 0,1 m Phosphatpuffer, der 0,5 m NaCl enthielt, eluiert. Die eluierte aktive Substanz wurde gesammelt, konzentriert und gegen 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 m NaCl enthielt, dialysiert. Dann wurde die aktive Substanz durch eine Biogel P-150-Kolonne (2 x 105 cm) geführt, die mit 0,1 m Phosphatpuffer quilibriert worden war, der 0,5 m NaCl und 4 m Harnstoff enthielt. Diese aktive Substanz war ein Protein, dessen Spitzenanteil ein Molekulargewicht von etwa 80000 aufwies und als gefriergetrocknetes Pulver in einer Menge von 38 mg erhalten wurde. Die chemische Zusammensetzung der erhaltenen Substanz war wie folgt: Protein 95 Gew.-% und mehr, Kohlehydrate 1-2 Gew.-% und kein Lipid. Die spezifische Aktivität betrug 930 Einheiten/|ig.

Beispiel 5

Gefriergetrocknete konservierte Bordetella pertussis (Stamm Tohama, Phase I) wurde wie in Beispiel 4 der Schüttelkultur unterworfen. Nach dem Abtrennen der Bakterienzellen aus der flüssigen Kultur wurden 100 Liter Kulturbrühe gewonnen. Die erhaltene Kulturbrühe wurde mit 50%iger wässriger Zinkchloridlösung unter Schütteln bei niedriger Temperatur zur Einstellung ihres pH-Wertes auf 6,0 (Endkonzentration 1%) versetzt. Der Niederschlag wurde mit 10%iger Dinatriumhydrogenphosphatlösung gelöst, in eine Dialysemembran gebracht, dann mit Wasser dialysiert und schliesslich mit 0,01 m Phosphatpuffer quilibriert. Diese Lösung wurde dann auf eine Hydroxylapatit-Kolonne (10 x 5 cm) gebracht, mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und mit 0,1 m Phosphatpuffer, der 0,5 m NaCl enthielt, eluiert. Das erhaltene Eluat wurde konzentriert, in eine Sephacryl S-200- (der Firma Pharmacia Fine Chemicals)-Kolonne (2,5 x 100 cm) gebracht und mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH

7,0), der 0,5 m NaCl und 4 m Harnstoff enthielt, eluiert. Dann wurde das Material der Gelfiltration unterworfen und die aktive Substanz gewonnen.

Das Molekulargewicht der erhaltenen aktiven Substanz (40 mg trockenes Pulver) Hess sich ausweislich Gelfiltration auf 72000 schätzen. Diese Substanz bestand zu etwa 95 Gew.-% oder mehr aus Protein und enthielt 1-2 Gew.-% Kohlehydrate. Lipid wurde nicht festgestellt. Die spezifische Aktivität betrug 890 Einheiten/^g.

Beispiel 6

Bordetella pertussis (Stamm Tohama, Phase I) wurde zwei Tage bei 37 °C in Bordet-Gengou-Medium und dann noch 20-24 Std. in einer Schrägkultur bei 37 °C Bordet-Gengou-Medium gezüchtet. Dann wurde die mit einer Platindrahtöse aufgenommene Bakterienmenge in festes Cohen-Wheeler-Medium überimpft, das mit Aktivkohle versetzt worden war (CA-Medium) und die in der folgenden Tabelle V angegebene Zusammensetzung hatte. Es wurde 48 Std. bei 37 °C auf diesem Medium kultiviert. 5 kg der erhaltenen nassen Bakterienzellen wurden in 5 Liter destilliertem Wasser suspendiert und 1 Std. auf 56 °C gehalten.

Nach dem Abkühlen wurde die Suspension mit Thimero-sal versetzt, um eine Endkonzentration von 0,01% zu ergeben und zur Sammlung der Bakterienzellen zentrifugiert (15000 U/min während 30 min). Die gesammelten Zellen wurde in destilliertem Wasser suspendiert, das 4 m Harnstoff und 1 m NaCl enthielt, und dann einer Behandlung mit Ultraschall (Anlage der Firma Tomy Précision Machinery Company) bei tiefer Temperatur (4°C) zur Zerstörung der Bakterienzellen unterworfen.

Die erhaltene Suspension wurde zentrigugiert (15000 U/ min, während 30 min). Das vom Niederschlag befreite überstehende flüssige Material wurde mit Wasser dialysiert und dann mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 0,6) equilibriert. Dann wurde das Material durch eine Hydroxylapatit-Kolonne (10 x 5 cm) geführt. Nach dem Waschen der adsorbierten Verunreinigungen mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 0,6) und 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) wurde die gewünschte aktive Substanz mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert, der 0,5 m Natriumchlorid enthielt.

Die erhaltene aktive Substanz wurde mit 0,01 m Phosphatpuffer (pH 6,0) equilibriert und dann auf eine CM-Sepharose CL-6B-Kolonne (2,5 x 30 cm) aufgebracht. Die Kolonne wurde zuerst mit 0,05 m Phosphatpuffer (pH 6,0) gewaschen und dann zum Auswaschen der aktiven Substanz mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert, der 0,5 m NaCl enthielt. Die eluierte Substanz wurde konzentriert, in 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,1), der 4 m Harnstoff und 0,5 m NaCl enthielt, gelöst und dann auf eine mit Sephacryl S-200-Kolonne (2,5 x 115 cm) gebracht. Dann wurde mit Nichtlö-sungsmittel eluiert und 40 mg der aktiven Zielsubstanz erhalten.

Das Molargewicht dieser Substanz betrug ausweislich Gelfiltration 74000; die Substanz enthielt mehr als 95 Gew.-% Protein, 2 Gew.-% Kohlehydrat und keine messbaren Lipid-anteile. Die spezifische Aktivität betrug 920 Einheiten/ug.

Tabelle V Zusammensetzung des CA-Mediums*

Casaminosäure 10 g

Hefeextrakt 1 g

Kaliumdihydrogenphosphat 0,5 g lösliche Stärke 1,5 g

0,5%ige Kupfersulfatlösung 1 ml l%ige Magnesiumchloridlösung 1 ml

Polypepton 5 g

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

o5

7

640 244

l%ige Cystinlösung 2,5 ml

0,5%ige Eisensulfatlösung 1 ml

Natriumchlorid 2,0 g pulverförmiges Agar-Agar 18 g destilliertes Wasser 1000 ml

* Zur Verwendung wurde dieses feste Medium durch Erwärmen verflüssigt, nach Einstellen des pH-Wertes auf 7,2 mit 5 g Aktivkohlepulver versetzt und dann 20 min bei 121 °C im Autoklav behandelt.

Beispiel 7

Verschiedene Affinitäts-Chromatographiemethoden, die auf Eigenschaften von IAP ansprechen, sind als weitere Beispiele für wirksame Methoden zur Herstellung der aktiven Substanz zu nennen. Bei entsprechender Kombination einer Folge solcher Verfahrensschritte der in Beispiel 1 beschriebenen Art können einige Verfahrensschritte entfallen. Produktreinheit und -ausbeute sind bei dieser Methode nahezu gleich wie in Beispiel 1. Hierzu kann wie folgt gearbeitet werden:

(A) Gefriergetrocknete und konservierte Bordetella pertussis (Stamm Tohama, Phase I) wurde wie in Beispiel 1 gezüchtet. 10 Liter der überstehenden Kulturbrühe der flüssigen Kultur wurden auf eine Hydroxylapatit-Kolonne (5x2 cm, Durchflussgeschwindigkeit 60 ml/Std.) gebracht und dann mit 300 ml eines 0,01 m Phosphatpuffers (pH 7,0) gewaschen. Zum Eluieren der aktiven Substanz wurde mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,5 m NaCl enthielt, und einer Durchflussgeschwindigkeit von 15 ml/Std. gespült. Die erhaltene aktive Substanz wurde mit «Ficol 400» (Pharmacia Fine Chemicals) auf etwa 15 ml konzentriert und dann viermal während einer Gesamtdauer von 24 Std. mit 2 Liter destilliertem Wasser dialysiert. Dann wurde zur Equilibrierung noch viermal während insgesamt 24 Stunden mit 1 Liter eines 0,01 m Acetatpuffers (pH 4,5) dialysiert, der 0,1 m Natriumchlorid oder 0,1 m Lithiumchlorid/Chlorwasserstoff (pH 4,5) enthielt. Das Produkt wurde mit einer Geschwindigkeit von 5 ml/Std. auf eine mit p-Acetoxymercurianilin-Sepharose 6MB gefüllte Kolonne (siehe die weiter unten beschriebene Herstellungsmethode, Kolonnengrösse 1,2 x 8 cm) gebracht, die mit dem oben erwähnten Puffer equilibriert worden war.

Nach gründlichem Waschen mit dem gleichen Puffer wurde die adsorbierte aktive Substanz mit dem gleichen Puffer, der mit 0,01 m L-Cystein versetzt worden war, eluiert. Die erhaltene aktive Substanz wurde gesammelt, mit «Ficol-400» auf etwa 5 ml eingeengt und dann dreimal währrend insgesamt 12 Stunden gegen 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert. Hierzu wurden 2 Liter dieses Puffers mit einem Gehalt von 4 m Harnstoff und 0,5 m Natriumchlorid verwendet. Dieser Puffer wurde auch für die weitere Equilibrierung verwendet. Die Gelfiltration erfolgte an einer Sephacryl-200-(Pharmacia Fine Chemicals)-Kolonne (2,8 x 95 cm).

Die aktive Substanz wurde als eine einzelne Spitze mit Molekulargewichten von 65000 ± 7000 (was später durch Hindurchströmen von markiertem Protein bestätigt wurde) in Übereinstimmung mit der Aktivitätsspitze gewonnen. Die aktive Substanz wurde dialysiert (gegen 2 Liter destilliertes Wasser, fünfmal, während 48 Std.) und dann gefriergetrocknet, was 2,1 mg weisses Pulver ergab.

Dieses Produkt zeigte bei der Elektrophorese auf Polyacrylamidgel (Gel bei pH 4,3) eine einzige Bande und bestand zu mehr als 98% aus Protein; es wurde weder Kohlehydrat noch Lipid als Bestandteil festgestellt.

Die oben erwähnte p-Acetoxymercurianilin-(PAMA-) Sepharose 6MB kann nach folgender Methode hergestellt werden:

4 g mit CNBr aktivierte Sepharose 6MB (Pharmacia Fine Chemicals) wurden mehrmals gewaschen und auf einem

Glasfilter unter Verwendung von 1 Liter 0,001 n HCl gequollen. Getrennt hiervor wurde eine Lösung aus 172 mg (0,5 mM) p-Acetzoxymercurianilin in 50 ml 60%iger Dimethyl-formamidlösung von 0,1 m Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,3, enthaltend 0,5 m Natriumchlorid) hergestellt. Nach dem Waschen und Quellen des Gels wurde die oben genannte Lösung zur Mischung gegeben und 2 Std. bei Raumtemperatur (22-25 °C) gut geschüttelt. Nach Beendigung der Reaktion wurde das Produkt mit demselben Puffer gut gewaschen.

Nach Zusatz von 50 ml 1 molarem Monoäthanolamin (pH 9,0) zum Gel wurde die Mischung 2 Std. bei Raumtemperatur geschüttelt. Dann wurde das Gel unter Sog auf einer Glas-fritte abgenutscht, mehrmals abwechselnd mit 1 Liter 0,1 m Boratpuffer (pH 8,5) und 1 Liter 0,1 m Acetatpuffer (pH 4,0) gewaschen und schliesslich mit 0,01 m Acetatpuffer (pH 4,5, enthaltend 0,1 m Natriumchlorid) oder mit 0,1 m Lithiumchlorid/Chlorwasserstoff (pH 4,5) equilibriert. Man kann das Gel aber auch zunächst mit dem gleichen Puffer behandeln, der 1% Mercaptoäthanol enthält, und es dann ausreichend waschen und mit dem gleichen Puffer equilibrieren.

(B) Gefriergetrocknete und konservierte Bordetella pertussis (Stamm Tohama, Phase I) wurde wie in Beispiel l gezüchtet. 10 Liter der erhaltenen Kulturbrühe der flüssigen Kultur wurden auf eine Hydroxylapatit-Kolonne (5x2 cm, Durchflussgeschwindigkeit 60 ml/Std.) gebracht, mit 300 ml 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,0) gewaschen und dann mit 0,1 m Phosphatpuffer (pH 7,0) mit einer Geschwindigkeit von 15 ml/Std. durchströmt.

Die erhaltene aktive Substanz wurde mit «Ficol-400» (Pharmacia Fine Chemicals) auf etwa 15 ml eingeengt, dann viermal während insgesamt 24 Std. gegen 2 Liter destilliertes Wasser dialysiert und dann noch 24 Std. viermal gegen 1 Liter 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,0) zur Equilibrierung dialysiert.

Die aktive Substanz wurde auf eine Kolonne mit Anti-IAP-Antikörper-Sepharose 4B (siehe Bemerkung weiter unten, Kolonnengrösse 1,8 x 13 cm) gebracht und dann mit etwa 200 ml 0,01 m Phosphatpuffer (pH 7,0), der 0,1 m NaCl enthielt, gut gewaschen. Dann wurde mit 0,1 m Glycin/ Chlorwasserstoff (pH 3,0), enthaltend 2 mM EDTA und 0,15 m NaCl mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/Std. eluiert.

Das Eluat wurde einmal mit 1 m Glycinpuffer (pH 11,5) neutralisiert. Die aktive Substanz wurde gesammelt, gegen destilliertes Wasser (5 Liter, dreimal, während 48 Std.) dialysiert und als weisses Pulver in einer Menge von 1,9 mg erhalten.

Das Molekulargewicht dieser Substanz beträgt ausweislich Messung durch Gelfiltration 70000 ± 5000 und zeigt bei Elektrophorese auf Polyacrylamidgel (Gelb bei pH 4,3) eine einzige Bande. Die Substanz bestand zu etwa 97% oder mehr aus Protein und enthielt etwa 1% oder weniger Kohlehydrat; Lipid konnte nicht festgestellt werden.

Die oben erwähnte Anti-IAP-Antikörper-Sepharose 4B kann wie folgt hergestellt werden: 10 g CNBr-aktivierte Sepharose 4B (Pharmacia Fine Chemicals) werden auf einer Glasfritte mit 2 Liter 0,001 n HCl wiederholt gewaschen und gequollen. Getrennt hiervon wird eine Lösung durch Auflösen von 100 g Anti-IAP-Antikörper in 50 ml 0,1 m Natriumbicarbonatpuffer (pH 8,3), der 0,5 m NaCl enthält, hergestellt. Unmittelbar nach Beendigung des Waschens und Quellens des Gels wird diese Lösung zugegeben und die Mischung 2 Std. bei Raumtemperatur (22-25 °C) gut geschüttelt.

Nach Beendigung der Reaktion wird das Gel auf einer Glasfritte abgenutscht und mehrmals zur Entfernung von überschüssigem Anti-I AP-Antikörper mit dem gleichen Puffer gewaschen. Dann werden 100 ml 1 m Monoäthanolamin zugegeben und die Mischung 2 Std. bei Raumtemperatur zur guten Durchmischung geschüttelt.

Nach der Umsetzung wird mehrmals mit dem oben

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

o5

640 244

8

genannten Puffer und dann mit 1 Liter 0,1 m Essigsäurepuffer (pH 4,0), der 0,5 m NaCl enthält, gewaschen. Diese Behandlung wird dreimal unter Veränderung des pH-Wertes wiederholt. Schliesslich wird das Produkt mit 1 Liter des oben erwähnten Puffers gewaschen. Zur Konservierung kann bei Temperaturen von 4-8 °C gearbeitet werden.

Zur Bewertung der pharmakologischen Wirkungen wurden die im folgenden angegebenen Untersuchungen durchgeführt.

1. Bestimmung der die Insulinsekretion fördernden Aktivität

Die insulinsekretionsfördernde Aktivität von IAP und seinen Äquivalenten kann durch Messung der Tierreaktion auf verschiedenen Stimulantien für die Insulinsekretion bestimmt werden; Glucose wird hierbei meist als Stimulans bevorzugt. Als Versuchstiere wurden männliche Ratten (Wistar, Körpergewicht 130-140 g) verwendet.

Testmethode: Die grob oder vollständig gereinigten aktiven Substanzen verschiedener Stärke werden in physiologischer Kochsalzlösung gelöst; jeweils 0,2 ml jeder dieser Lösungen wird intravenös unter Betäubung mit Äther in die Femoralvene des Versuchstieres injiziert. Die die Insulinsekretion leitende Aktivität jeder Substanz wird drei Tage später gemessen. Die Versuchstiere wurden 18-20 Std. vor dem Versuch ohne Nahrung belassen. Zur Messung der Aktivität werden aus der Schwanzvene jeder Ratte 0,1 ml Blut entnommen; unmittelbar darauf wird intraperitoneal eine 30%ige

20

Glucoselösung in einer Menge von 1 ml/100 g Körpergewicht injiziert. Genau 15 min später werden nochmals 0,1 ml Blut in ähnlicher Weise entnommen. Die die Insulinsekretion leitende Aktivität wird aus der Differenz von Blutglucosegehalt Und der Insulinkonzentration im Blut vor und nach der Glu-coseverabreichung bestimmt. Der Blutglucosegehalt wird nach der Glucoseoxydase-Methode, die Insulinkonzentration nach der Doppelantikörpermethode bestimmt.

Die für die folgenden pharmakologischen Versuche verwendete parenterale Lösung zur intravenösen Injektion besteht aus den gleichen Komponenten wie oben. Die zur Bestimmung der Blutglucose und des Plasmainsulins verwendeten Messmethoden entsprechen den Angaben in den folgenden Literaturstellen und es wurden die angegebenen Geräte bzw. Substanzen verwendet.

Blutglucosegehalt: Glucose-Oxidase-Methode nach Bergmeyer H.-U. und Bernet E. in «Methods of Enzymatic Analy-sis», Bergmeyer H.-U. (Hrsg.), New York, Academic Press P 123 (1963);

Glucostat; Insulinkonzentration: Doppel-Antikörper-Methode nach Morgan C.R. und Razarow A.: Diabetes, 12, 115 (1963), Insulin-Immunotestsatz der Firma Dainabot Radioisotope Laboratories ;

Berechnungsmethode für die Insulinsekretionsaktivität: Zunächst werden die AI/AG-Werte der mit der aktiven Substanz behandelten Gruppe und der Kontrollgruppe aus folgender Gleichung bestimmt:

AI/AG (txU/mg) =

Plasmainsulin-Konzen-tration nach Glucose-Belastung (ji.U/ml)

Blutglucose-Konzentration nach Glucosebe-lastung (mg/ml)

Plasmainsulin-Kon-zentration vor Glu-cosebelastung (jj.U/ml)

Die Verwendung des Blutglucosegehaltes für die Aktivitätsberechnung ist dadurch bedingt, dass die Menge des abgesonderten Insulins vom Blutzuckergehalt sehr stark beeinBlutglucose-Konzentration vor Glucose-belastung (mg/ml)

flusst wird.

Die Einheit ist für jede aktive Substanz durch die folgende Gleichung bestimmt:

Einheit =

Durchschnitt ÀI/ÀG der behandelten Gruppe

Durchschnitt AI/AG der Kontrollgruppe

Durchschnitt AI/AG der Kontrollgruppe

-x 100

Die spezifische Aktivität jeder Substanz wird durch Dividieren der Einheiten durch die Proteinmenge (die Methode von Lowry et al.) bestimmt.

Zusammenhang zwischen Dosierung und Ansprechen

Einheit und Dosis (als Protein) des gemäss Beispiel 1 erhaltenen IAP sind in der folgenden Tabelle VI zusammengestellt.

Tabelle VI

Dosis (ng/Ratte)

Einheit*

8

62

16

53

32

54

63

81

125

104

250

129

500

208

1000

445

2000

571

* Mittelwert von fünf Tieren

Die gereinigten IAP-Proben zeigen eine sigmoide (S-förmige) Dosis-Ansprech-Beziehung; es wurde ein möglichst linearer Teil (250 ng bis 1000 ng) zur Einheitenberechnung bzw. für die Reinigungsschritte, sowohl von IAP als auch von so dessen Äquivalenten, gewählt.

2. Zusammenfassung der pharmakologischen Effekte der proteinischen aktiven Substanz

Diese Substanz ist besonders wegen ihrer hervorragenden 55 Aktivität in bezug auf die Förderung der Insulinsekretion bemerkenswert, hat aber auch andere pharmakologisch vorteilhafte Wirkungen, wie Verbesserung der Glucosetoleranz, Verstärkung der Insulinabscheidungsreaktion, Förderung der Heilung von durch Streptozotocin induzierte Diabetes und 60 Verbesserung der Glucosetoleranz bei vererbter Diabetes. Dabei halten diese Wirkungen bei einmaliger Verabreichung der Substanz mehrere Wochen bis mehrere Monate an. In Anbetracht der Tatsache, dass bei den verschiedenen Versuchstieren einschliesslich von Mäusen, Ratten und Hunden o5 vollständig gleiche Erscheinungen beobachtet werden, kann angenommen werden, dass die pharmakologischen Wirkungen dieser Substanz im wesentlichen nicht auf bestimmte Tierarten beschränkt sind.

9

640 244

Es ist anzunehmen, dass die erfindungsgemässe Substanz für die Remedialmedizin zur Diabetesbehandlung besonders gut brauchbar ist. Gemäss Stand der Technik beruht die Diabetes-Medikation auf der Insulininjektion oder der oralen Verabreichung von antidiabetischen Pharmaka, aber es han- 5 delt sich hierbei nur um symptomatische Behandlungen, denn nach heutigem Wissen gilt Diabetes als unheilbares Leiden.

Dabei muss der Patient für die Insulininjektion häufig noch den Fachmann bzw. das Krankenhaus aufsuchen und darüber hinaus besteht die Gefahr, dass die antidiabetischen io Mittel eine abnormale Abnahme des Blutglucosegehaltes bewirken. Der besondere Vorteil der erfindungsgemässen Substanz besteht darin, dass diese nicht nur als solche eine bemerkenswerte Aktivität in bezug auf die Insulinsekretion besitzt, sondern auch die Wirkung hat, dass sie die Insulin- is konzentration im Blut nur dann erhöht, wenn der Blutgluxo-segehalt aus irgendwelchen Gründen zu hoch ist (hyperglykä-mischer Zustand, insbesondere bei Glucosebelastung, wie etwa bei der Verdauung von Nahrungsmitteln), und der erhöhte Blutglucosegehalt rasch auf einen normalen Wert 20 zurückkehrt. Ein anderer bemerkenswerter Vorteil dieser Substanz besteht darin, dass ihre Aktivität bei einmaliger Verabreichung während Zeitspannen von einigen Wochen bis einigen Monaten anhält. Wenn daher die durch den Blutglucosegehalt ausgelöste Insulinsekretion abgeklungen ist, bewirkt 25 die Verabreichung der erfindungsgemässen Substanz nur eine normale Insulinsekretionsaktivität. Dank dieser Eigenschaft findet die Substanz einen weiteren Anwendungsbereich, d.h. sie ist nicht nur für Remedialmedizin der Diabetes oder ihrer Komplikationen bzw. der durch Diabetes ausgelösten geria- 30 trischen Leiden, sondern auch gegen prediabetische Krankheitsformen sowie als präventives, remediales oder diagnostisches Mittel für Jugenddiabetes brauchbar, für die es bisher keine wirksamen Heilmittel gibt.

3. Insulinsekretionsfördernde Aktivität

Diese Wirkung ist die besonders hervorragende Eigenschaft der vorliegenden Substanz; entsprechende Versuche wurden an Ratten (männlichen Ratten vom Stamm Wistar) und an Hunden (sowohl männlichen als auch weiblichen der Rasse Beagle) durchgeführt.

Tierversuche an Ratten

Die Versuchsbedingungen waren gleich wie bei der oben beschriebenen Messung der Aktivitäten, doch wurde hier die Reaktionsfähigkeit bzw. Reaktivität auf die jeweiligen Stimu-lantien der Insulinsekretion am dritten Tag nach der Verabreichung von IAP an die Ratten gemessen und mit den entsprechenden Werten bei normalen Ratten (Kontrollgruppe) verglichen (Tabelle VII). Bei der Glucoseprovokation, dem physiologisch typischsten Faktor, zeigt sich gegenüber der Kontrollgruppe eine markante Zunahme der Insulinkonzentration im Blut, und zwar unbeschadet unterschiedlicher Wege der Glucoseverabreichung. Eine signifikante Zunahme wurde auch bei der Reaktion auf Hormonstimulantien, wie Glucagon (1 mg/kg) und Epinephrin (200 ug/kg) festgestellt. Ferner wurde eine erhöhte insulinsekretorische Aktivität mit Tolbutamid (200 mg/kg) und Glibenclamid (2 mg/kg) beobachtet, zwei gegenwärtig als Antidiabetesmittel klinisch verwendeten Mitteln. Diese Resultate zeigen, dass die Verabreichung der erfindungsgemässen aktiven Substanz die Reaktionsfähigkeit des Organismus auf Stimulantien für die Insulinsekretion bemerkenswert verstärken kann.

Tabelle VII

Förderung der Reaktionsfähigkeit für verschiedene Insulinstimulantien bei mit IAP vorbehandelten Ratten

Kontrollgruppe Behandelte Gruppe vor nach Änderung vor nach Änderung

Verabreichung Verabrreichung (p.U) Verabreichung Verabreichung

(|iU/ml)* (p.U/ml)

Glucose, oral 0,5 g**, 15***

16

+

4

90

±

4

74

25

±

5

227

±

47

202

intraperitoneal 0,3 g, 15

26

±

3

68

±

12

42

55

+

5

401

±

114

346

intravenös 0,05 g, 15

16

±

1

27

±

3

11

25

±

5

56

+

6

31

Glucagon intravenös 0,1 mg, 5

24

±

3

56

±

5

32

28

±

4

115

+

3

87

Epinephrin subkutan 20 (ig, 30

22

±

5

29

±

4

7

30

±

3

102

±

15

72

Glibenclamid oral 0,2 mg, 60

13

±

4

52

±

16

39

25

±

3

82

±

11

57

Tolbutamid intraperitoneal 20 mg, 6023

±

6

46

+

8

23

55

+

4

247

±

73

192

* Insulinkonzentration im Plasma - ** Dosis/100 g Körpergewicht - *** Zeit (min) der Blutprobenentnahme nach Verabrei chung

Bei diesem Test wurde 3 Tage vor d m Versuch 1 ug IAP 55 intravenös injiziert. In der Tabelle sind die Durchschnittswerte und Standardfehler bei 5 Tieren der jeweiligen Gruppe angegeben.

Tierversuche an Hunden 60

Die IAP-Substanzen mit unterschiedlichen Einheitswerten wurden den Hunden intravenös verabreicht. Drei Tage später wurde Glucagon (25 ug/kg Körpergewicht, intravenös) oder Glucose (0,3 g/kg Körpergewicht, intravenös) zur Stimulation verabreicht, um die Wirkung auf die Förderung der Insulinse- 05 kretion zu untersuchen. Die Versuchstiere wurden 18 Std. vor dem Versuch nicht mehr gefüttert.

Die Versuchsergebnisse der Glucagon-Stimulierung sind in Tabelle VIII zusammengestellt. Eine wenn auch schwache Förderung der Insulinsekretion wurde gegenüber der Kontrollgruppe 5 min nach der Glucagonverabrreichung bei einer Dosis von 50 ng Substanz (als Protein, wie auch in den folgenden Angaben, sofern nicht anders vermekrt) pro kg Körpergewicht beobachtet. Die Insulinsekretion wurde proportional zur Zunahme der Dosierung gefördert. Bei einer Dosis von 1 jig/kg wurde praktisch die Maximalreaktion erreicht. Eine ähnliche Potenzierung der Insulinsekretionsaktivität wurde bei Glucose- (orale und intravenöse Verabreichung) sowie Epinephrin-Provokation beobachtet (Tabelle IX).

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Verabreichen von IAP auch bei Hunden eine bemerkenswerte Verstärkung der Reaktion auf Mittel induziert, welche die Insulinsekretion stimulieren.

640 244

10

Tabelle Vili

Potenzierung der Insulinsekretion nach Verabreichung von Glucagon an mit IAP vorbehandelte Hunde

Zeit (min) nach Glucagon-Verabreichung Dosis

0

5

15

30

45

60

Kontrollgruppe*

3

31

32

16

10

8

Versuchsgruppe

0,05 ug/kg

2

50

43

18

17

6

0,1 ug/kg

3

73

37

9

5

2

0,5 ug/kg

3

196

100

24

11

5

1,0 .ug/kg

2

360

230

10

13

7

2,0 jig/kg

2

320

60

19

6

8

* jiU/ml Durchschnittswert aus jeweils 3 Tieren der betreffenden Gruppe

Tabelle IX

Verstärkung der Insulinsekretion nach Provokation durch 20 Glucose und Epinephrin an mit IAP vorbehandelten Hunden

vor der nach der

Provokation mit

Provokation

Stimulans mit Stimulans

Kontrollgruppe*

6 ± 1

20 + 9

Glucose (5 min nach der

intravenösen Injektion)

Versuchsgruppe

7 ± 1

89 ± 36

Kontrollgruppe

8 ± 1

8 + 1

Epinephrin (5 min nach der

intravenösen Injektion)

Versuchsgruppe

18 ± 6

225 + 28

* n.U/ml Durchschnittswert ± Standardabweichung bei 3 Tieren der jeweiligen Gruppe

4. Glucosetoleranz-Verbesserung

Ratten und Hunde wurden oral mit Glucose belastet und die Abnahme des Blutglucosegehaltes sowie die Insulinkonzentration im Blut nach der Glucosebelastung zur Bestimmung der Glucosetoleranz gemessen. Die Glucose wurde den Ratten in einer Dosis von 0,5 g/100 g Körpergewicht, den Hunden mit einer Dosis von 15 g/Hund, jeweils nach 18- bis 20stündigem Hungern, verabreicht.

Bei den mit IAP behandelten Ratten- und Hundegruppen war der Anstieg des Blutglucosegehaltes erheblich unterdrückt, wohingegen eine offensichtliche Zunahme der Insulinkonzentration im Blut erfolgte; die Insulinkonzentration ging jedoch in Übereinstimmung mit der Normalisierung des Blutglucosegehaltes rasch wieder auf die Werte vor der Glucosebelastung zurück, und es wurde keine Abnahme des Blutglucosegehaltes wegen übermässiger Insulinsekretion festgestellt (siehe Tabellen X und XI). Diese Ergebnisse zeigen deutlich die markante Verbesserung der Glucosetoleranz bei den mit IAP behandelten Versuchstieren.

Tabelle X

Veränderung der Konzentrationen der Blutglucose und des Plasmainsulins bei Hunden nach Glucosebelastung

Zeit nach Ö 15 30 60 90 120 : 180

Glucosebehandlung (min)

Blutglucose (mg/dl)

Kontrollgruppe 125 + 9

Versuchsgruppe 97 + 3 Plasmainsulin (^U/ml)

Kontrollgruppe 3 + 2

Versuchsgruppe 9 ± 5

117 ± 14 123 + 9 118 + 4

117 ±9 108 + 7 118 + 4

17 + 2 23 ± 15 8 ± 2

63+10 16 ± 6 20 ± 2

111 +9 113 + 13 109 + 1

96 + 6 88 + 8 97 ± 3

12 + 2 8 + 3 8+1

12 + 4 9+1 10+1

Der Versuchsgruppe wurde 1 [ig (Protein) IAP pro kg 3 Tage vor dem Versuch intravenös injiziert. Durchschnittlich ± Standardabweichung bei 4 Tieren der jeweiligen Gruppe.

Tabelle XI

Veränderungen der Konzentrationen von Blutglucose und Plasmainsulin bei Ratten nach Glucosebelastung

Zeit nach GlucosebelastungO 30 60 90 120 180

(min)

Blutglucose (mg/dl)

Kontrollgruppe 68 + 1

Versuchsgruppe 51 + 1 Plasmainsulin (|iU/ml)

Kontrollgruppe 19 + 2

Versuchsgruppe 25 + 4

102 + 9

12 ±6

47 ± 6 126 + 9

98 ± 3 54 ± 2

38 ± 4 79 ± 10

108 + 4 48 ± 5

41+2 61 ± 6

114 + 4 62 + 6

41 ± 5 69 ± 7

120 + 4 69 ± 7

55 + 5 104 ± 18

11

640 244

Der Versuchsgruppe wurde 0,5 |ig IAP 3 Tage vor dem Versuch intravenös injiziert. Durchschnitt ± Standardfehler bei 5 Tieren der jeweiligen Gruppe.

5. Abklingen von mit Streptozotocin induzierter Diabetes bei 5 Vorbehandlung mit IAP

Es ist bekannt, dass die Provokation mit Streptozotocin (im folgenden als STZ bezeichnet) bei Versuchstieren Diabetes induziert, indem B-Zellen der Langerhansschen Inseln in erheblichem Masse zerstört werden. Bei mit IAP behandelten 10 Ratten wurde jedoch festgestellt, dass die durch STZ induzierte Diabetes rasch behoben wurde und dass sich Blutglucose und Bluttoleranz im Nichtfastenzustand normalisierten.

Die Versuche wurden durchgeführt, indem die Ratten zunächst mit 1 |ig IAP und dann mit STZ (5 mg/100 g, intra- 15 venöse Injektion) 3-5 Tage später provoziert wurden. 24 Std. nach der Provokation mit STZ wurde sowohl in der Kontrollgruppe als auch in der Versuchsgruppe Hyperglykämie beobachtet, jedoch erreichte dee Blutglucosewert bei der Ver-

20

suchsgruppe graduell den Normalwertbereich am 5. und 7. Tage nach der STZ-Provokation und die Konzentration des Plasmainsulins war ebenfalls merklich grösser als die bei der Kontrollgruppe (Tabelle XI).

Ferner wurde am 7. Tag nach der STZ-Provokation der Glucosebelastungsversuch durchgeführt und die Glucosetoleranz untersucht (Tabelle XIII). Wenn die Ratten nicht gefüttert wurden, war die Konzentration der Blutglucose bei der Kontrollgruppe (nur mit STZ-Provokation) und bei der mit IAP behandelten Gruppe natürlich gleich, doch war bei der Kontrollgruppe im Vergleich zur normalen Gruppe eine eindeutige Verschlechterung der Glucosetoleranz zu beobachten.

Dagegen war die Glucosetoleranz bei der Versuchsgruppe in einer den Werten der Kontrollgruppe vergleichbaren Weise verbessert und das Plasmainsulin als Reaktion auf die Glucosebelastung war höher als bei der Kontrollgruppe. Die obigen Befunde zeigen, dass die durch STZ induzierte Diabetes bei den mit IAP vorbehandelten Versuchstieren geheilt wurde.

Tabelle XII

Genesung von Streptozotocin-Diabetes bei Vorbehandlung mit IAP Anzahl Tage nach STZ-Provokation 0 2 3 5 7

Kontrollgruppe

Blutglucose (mg/dl) 94 ± 3 375 + 20 360 ± 16 355 ± 8 352 + 4

Plasmainsulin (iiU/ml) 20 + 2 30 ± 3 26 ± 4 - 24 ± 2

Versuchsgruppe

Blutglucose (mg/dl) 98 ± 2 358 + 19 250 ± 35 199 ± 41 145 + 22

Plasmainsulin ((iU/ml) 63 ± 5 69 + 5 54 + 6 - 62 + 4

Durchschnitt ± Standardabweichung bei 5 Tieren der jeweiligen Gruppe.

Tabelle XIII

Glucosetoleranz-Verbesserung von Streptozotin-Diabetes durch Vorbehandlung mit IAP Zeit nach Glucosebelastung (min) 0 15 30 60 90

Kontrollgruppe 83 + 7* (18 + 2)** 214 + 18 (22 ± 5) 291 ± 27 327 ± 23 264 + 32

Versuchsgruppe 82 ± 6(24 + 2) 159 + 16(49 ± 2) 177 ± 14 173 + 10 141 + 13

Normale Gruppe 82 + 3 (17 ±1) 130 ± 11 (43 ± 4) 161 ± 5 155 + 4 138 + 7

* Blutglucose (mg/dl)

** Plasmainsulin (uU/ml)

Durchschnitt ± Standardabweichung bei 5 Tieren der jeweiligen Gruppe.

6. Verbesserung der Glucosetoleranz durch IAP-Verabreichung bei spontan diabetischen Mäusen (KK-Mäuse) ähnlich menschlicher Diabetes

Mäuse vom Typ KK gelten als Versuchstiere, bei denen die Pathosis der Diabetes ähnlich wie beim Menschen verläuft, da diese Mäuse eine altersbedingte spontane Diabetes mit erblich und umgebungsbedingten Hintergrundsfaktoren entwickeln. Wenn daher die therapeutische Wirkung von IAP bei diesen Tieren ersichtlich bzw. fehlt, ist dies ein beachtlicher Hinweis auf die Zulässigkeit der Analogisierung der aus Tierversuchen abgeleiteten Ergebnisse für die Humanmedizin. Aus diesem Grund wurde folgender Versuch durchgeführt:

Die für den Versuch verwendeten Mäuse waren KK-Mäuse (ursprünglich von der landwirtschaftlichen Fakultät der Nagoya Universität stammend), die durch fortgesetzte

5o Züchtung von Geschwistertieren erhalten worden waren. Der Versuch wurde wie folgt durchgeführt: Die Glucosebelastung erfolgte durch orale Verabreichung (0,15 g/20 g Körpergewicht) an 20-25 Wochen alte Mäuse. Dann wurden 5 Versuchstiere ausgewählt, die im Vergleich zur normalen Gruppe 55 (ddy-Stamm) eine deutliche Verschlechterung der Glucosetoleranz zeigten. Wie in Tabelle XIV zusammengestellt, wurde bei diesen Mäusen nach der Glucosebelastung kein Verschwinden der Glucose beobachtet, und sie waren offensichtlich als im diabetischen Zustand befindlich anzusehen. Diese 60 Mäuse aus der KK-Gruppe wurden 3 Tage nach Injektion der erfindungsgemässen Substanz in die Schwanzvene erneut mit Glucose belastet. Die Versuchsergebnisse zeigen, dass die Glucosetoleranz im Vergleich zum Zustand vor der Verabreichung der erfindungsgemässen Substanz stark zugenommen o5 hatte. Ferner war die Glucosetoleranz viel besser verstärkt als bei der normalen Gruppe. Demzufolge kann man annehmen, dass die Verabreichung von IAP auch bei spontaner Diabetes zufriedenstellende therapeutische Wirkungen hat.

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12

Tabelle XIV

Verbesserung der Glucosetoleranz bei KK-Mäusen durch IAP-Behandlung Zeit nach Glucosebelastung (min) 0 30 60 120 180

Normalgruppe (ddy-Stamm) 98 ± 7* 214 ± 16 339 ± 13 192 ±9 144 ± 14 Diabetische Gruppe (KK-Stamm)

vor der Behandlung 117 + 6 300 + 33 308 + 21 326 ± 40 310 + 39

nach der Behandlung 72 + 3 150 + 11 118 + 9 90 + 8 63 + 11

Durchschnitt ± Standardabweichung bei 5 Tieren der jeweiligen Gruppe. *Blutglucose (mg/dl)

7. Dauer der pharmakologischen Wirkung

Die pharmakologischen Aktivitäten von IAP zeigen sich einige Stunden nach der Verabreichung, erreichen in 3-7 Tagen die Höchstwerte und fallen dann langsam ab. Weiter unten sind Versuchsergebnisse zur Dauer der Aktivitäten bei Ratten (0,5 ng) und Hunden 1,0 ug/kg) zusammengestellt.

Bei den Tierversuchen mit Hunden wurde die Glucosetoleranz als Reaktion auf die Glucosebelastung durch intravenöse Injektion am 15. Tag nach der IAP-Verabreichung und ferner die Insulinsekretionsaktivitäten als Reaktion auf Epinephrin- und Glucagon-Provokation am 29. bzw. 42. Tag nach der IPA-Verabreichung festgestellt. Dabei wurden noch am 42. Tag (Tabelle XV) ausreichende Aktivitäten beobachtet. Bei den Ratten wurden am 28. Tag nach der Verabreichung noch ungefähr 50% der Maximalaktivität (3 Tage nach Verabreichung) festgestellt.

Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass die pharmakologischen Aktivitäten von IAP mehrere Wochen bis mehrere Monate anhalten, wobei die Wirkungsstärke natürlich von der Dosierung beeinflusst wird.

Tabelle XV

Zunahme der Insulinsekretion bei Hunden durch Glucagon-Provokation am 42. Tag nach IAP-Verabreichung

Zeit nach 0 5 15 30

Glucagon-Provokation (min)

tätsangaben sind auf die als 100 gesetzte relative Aktivität der 4°C-Probe bezogen (Tabelle XVI).

Tabelle XVI

Temperatur (°C)

Relative Aktivität

4

100

37

100

56

113

60

76

70

53

80

18

100

13

Obwohl die thermische Stabilität von IAP im Bereich 30 unter 56 °C liegt, wurde auch in der auf 80 °C erwärmten Lösung noch Aktivität beobachtet.

(B) pH-Stabilität

Eine Lösung aus 40 (ig Protein pro ml wurde mit 3 n HCl 35 bzw. 3 n NaOH zur Einstellung des jeweiligen pH-Wertes versetzt und 24 Std. bei 4°C gehalten. Dann wurde die Lösung nach Wiedereinstellung eines neutralen pH-Wertes den Versuchstieren verabreicht und die Veränderungen der insulinse-kretionsfördernden Aktivität untersucht. Die Ergebnisse sind 40 in Tabelle XVII als relative Aktivitäten gegenüber der mit 100 bewerteten Probe mit pH = 7 angegeben.

Kontrollgruppe 6 + 1* 14+1 9 + 2 8 + 1

Versuchsgruppe 6±1 71±9 28 ±8 7 + 1 45 Tabelle XVII

Intravenöse Injektion mit 25 ug/kg Glucagon. Durchschnitt + Standardfehler von 5 Tieren der jeweiligen Gruppe. * jxU/ml

50

pH Relative Aktivität

1 16

2 27

3 43

4 112 7 100 9 120

10 89

11 23

12 0

8. Wirksame Dosis und Verabreichungsweg

Die wirksame Dosis von IAP bei Verwendung für Menschen beträgt 10 ng/kg (Körpergewicht) bis 1 ug/kg (Körpergewicht), und zwar mit der gereinigten Probe. Man kann aber auch in Dosen bis 2 ug/kg Körpergewicht und mehr bei ein- 55 maliger Verabreichung gehen.

Die wirksamste Verabreichungsmethode ist die intravenöse Injektion, doch sind auch andere Verabreichungsformen möglich. Obwohl der Stabilitätsbereich allgemein zwischen pH-

60 Werten von 4 bis 9 liegt, bleibt eine gewisse Aktivität auch in

9. Stabilität der Aktivität Lösungen mit pH-Werten von unter 3 und in solchen mit pH-

Werten von 10 bzw. 11 erhalten.

(A) Thermische Stabilität

Zur Durchführung dieses Tests wurde die Probenlösung 10. Akute Toxizität (40 ug Protein pro ml, pH 7,0) jeweils 15 min verschiedenen 05 Im folgenden sind die akuten Toxizitätswerte LD 50 Temperaturen von 37-100°C ausgesetzt und die Veränderun- (ug/kg Körpergewicht) der gereinigten IAP-Probe beim Test gen der insulinsekretionsfördernden Aktivität untersucht. Als an männlichen und weiblichen Mäusen vom Stamm ddy bei Vergleich diente die bei 4°C gehaltene Probe und die Aktivi- verschiedenen Verabreichungsformen zusammengestellt.

13

640 244

LD 50 (ug/kg, Mäuse ddy)

d

9

Subkutane Injektion

540

580

Intravenöse Injektion

222 •

155

11. Pharmakologische Applikationen io

Wie oben beschrieben, sind die neuen proteinischen aktiven Substanzen gemäss der Erfindung als remediale und präventive Medikamente für Diabetes brauchbar. Die wirksame Dosis bei Anwendung für Humantherapie hängt von der spezifischen Aktivität der aktiven Substanzen ab. Allgemein kön- is nen sie zur Verwendung für die Förderung von Insulinsekretion in Dosen von 10 ng/kg (Körpergewicht) bis zu einigen 10 Ug/kg (Körpergewicht) verabreicht werden.

Als Verabreichungsweg ist die intravenöse Injektion bei allen Anwendungen am wirksamsten, doch können die Stoffe auch in anderer Weise verabreicht werden, z.B. durch intraperitoneale, intramuskuläre oder subkutane Injektion, durch direkte Verabreichung in den Verdauungstrakt oder auf oralem, intrarektalem, sublingualem, nasalbucosalem, intraarteriellem, intralymphangialem oder intratrachealem Wege. Als Konfektionierungsformen können Injektionslösungen, Sup-positorien, enterische und gastrische Schichtungen, Sublingualtabletten und Inhalationsmittel genannt werden. Ein besonders einfaches Beispiel für Injektionslösungen ist eine 1-ml-Mischung mit 10000 Einheiten der insulinsekretorisch aktiven Substanz 9 mg NaCl und sterilem destilliertem Wasser.

Andere Zusatzstoffe, welche die Aktivität der erfindungsgemässen Substanzen nicht beeinträchtigen, können in der für die Herstellung von Medikamenten üblichen Weise zugesetzt werden.

G

4 Blatt Zeichnungen

Claims (6)

640 244

1. Biologisch aktive Substanz, die als Inselaktivierungsprotein bezeichnet wird, für Säuger eine die Insulinsekretion fördernde und die Glucosetoleranz verbessernde Wirkung aufweist und durch folgende Eigenschaften gekennzeichnet ist: Molekulargewicht 77000 ± 6400, bestimmt durch Gelfiltration; chemische Zusammensetzung: Proteingehalt über 95 Gew.-%, bestimmt nach der Methode von Lowry; Kohlehydratgehalt (Glucid): etwa 1 Gew.-%, bestimmt nach der Phe-nol-HkSCh-Methode; Lipidgehalt: niedriger als die Erfassungsgrenze; Aminosäurezusammensetzung des Proteinteiles (Durchschnittsverhältnis, jiM/100 |iM): Asparaginsäure 7,5, Threonin 7,3, Serin 6,4, Glutaminsäure 10,0, Prolin 5,8, Glycin 8,8, Alanin 9,3, Cystin-2 2,5, Valin 6,5, Methionin 2,8, Iso-leucin 4,0, Leucin 7,8, Tyrosin 6,5, Phenylalanin 3,7, Lysin 3,3, Histidin 1,5 und Arginin 6,4; isoelektrischer pH-Wert: 8,4 ± 0,5 und Scheibenelektrophoresebild: die Acrylamid-Schei-benelektrophorese (Polyacrylamid-Konzentration 7,5%, 1 n KOH-Eisessig-Puffer (pH 4,3) der Substanz ergibt auf der Kathodenseite eine sehr scharfe Einzelbande.

2. Verfahren zur Herstellung einer bei Säugern die Insulinsekretion fördernde und die Glucosetoleranz verbessernde Wirkung aufweisenden aktiven Proteinsubstanz, gekennzeichnet durch Züchten eines pathogenen Stammes des Mikroorganismus Bordetella pertussis (Phase I oder Phase II), Abtrennen der überstehenden Kulturbrühe vom Kulturmedium, Reinigen der erhaltenen überstehenden Kulturbrühe nach mindestens einer der folgenden Methoden: Fällung, Chromatografie, Molekularsiebbehandlung, Elektrophorese oder biologische Behandlung, und folgende Dialyse des gereinigten Produktes.

2

PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikroorganismus Bordetella pertussis (Phase I) ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass nach der chromatografischen Methode gearbeitet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, • dass die Säulenchromatografie mit einer Hydroxylapatit-, Carboxymethyl-Sepharose C1-6B- oder ConA-Sepharose-4B-Säule angewendet wird.

6. Pharmazeutische Zubereitung zur Verwendung gegen Diabetes, dadurch gekennzeichnet, dass die Zubereitung die nach dem Verfahren von Anspruch 2 erhaltene aktive Proteinsubstanz als wirksame Komponente und einen pharmakologisch zulässigen Träger enthält.