DE2558537C2

DE2558537C2 - Verfahren zum Isolieren von Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit aus Blut oder Blutbestandteilen von Kälbern oder Schweinen

Info

Publication number: DE2558537C2
Application number: DE2558537A
Authority: DE
Inventors: Hellmut Dr. 8000 München Mittenzwei
Original assignee: Individual
Current assignee: ICN Switzerland AG
Priority date: 1975-12-24
Filing date: 1975-12-24
Publication date: 1984-07-19
Also published as: GR63185B; GB1569167A; ATA948776A; JPS618080B2; AT349134B; DE2558537A1; JPS5282709A; US4085204A; CH634854A5; FR2336137A1; FR2336137B1

Description

Es ist bekannt, daß bestimmte aus dem Blut warmblütiger Tiere gewonnene Substanzen neben anderen Wirkungen, wie einer atmungsstimullerenden Wirkung und einer wachstumsfordernden Wirkung, auch über eine gewisse insulinähnliche Wirksamkeit verfügen. Eine solche insulinähnliche Wirksamkeit, die durch Insulinantikörper nur geringfügig hetnmbar ist, besitzt beispielsweise das in Arzneimittel Forschung 18, 1019 (1968) beschriebene Produkt, das gemäß DE-PS 10 76 888 aus dem Blut oder auch aus Blutbestandteilen vorbehandelter Kälber (oder gemäß DE-PS 10 17 744 auch Schweine) mit hoher RES-Aktlvltät hergestellt und in konfektionierter Form als Arzneimittel angewandt wird. Es Ist ferner bekannt, daß sich durch wiederholte chromatographische Anreicherungsverfahren aus Kälberserum gereinigte wachstumsstimulierende Fraktionen gewinnen lassen, die ebenfalls über eine durch Insulinantikörper praktisch nicht hemmbare insulinähnliche Wirksamkeit verfügen, und hierzu wird beispielsweise auf J. Cell. Physiol. 79, 319 (1972) verwiesen. Gemäß Biochlm. Biophys. Acta 121, 349 (1966) lassen sich aus der Proteinfraktion von Humanplasma durch Extraktion nih Alkohol und chromatographische Anreicherungsverfahren ebenfalls höhermolekulare Substanzen mit Insulinähnlicher Wirksamkeit isolieren, die wiederum von Insulinantikörpern praktisch nicht gehemmt werden können. Weiter Ist aus Acta Endochronologlca 57, 330 bis 352, besonders Seite 330 unter Abstracts und Seite 343, letzter Absatz bis Seite 345, letzter Absatz, bekannt, daß sich Substanzen mit Insulinähnlicher Wirksamkeit im Serum von Ratten aktivieren lassen, wenn man ein solches nicht behandeltes und deshalb neutrales Serum mindestens 3 Stunden bei Raumtemperatur beläßt.

Die bekannten technischen Verfahren zur Herstellung von Substanzen mit Insulinähnlicher Wirksamkeit gehen normalerweise alle von Blut oder Blutbestandteilen von Tieren, wie Schweinen oder Kälbern, Insbesondere Kälbern, aus und erfordern zur Gewinnung der gewünschten Wirkstoffe verhältnismäßig aufwendige Methoden. Selbst der Einsatz von Blut oder Blutbestandteilen entsprechend vorbehandelter Schlachttiere ergibt jedoch nur Lösungen mit einem verhältnismäßig geringen Anteil an Insulinähnlicher Wirksamkeit, so daß solche Lösungen durch geeignete Methoden zur Erhöhung Ihres Wirkstoffgehalts konzentriert werden müssen. Zudem müssen die bei solchen Verfahren nach Gewinnung der Substanzen mit lnsullnahnllcher Wirksamkeit anfallenden Produkte verworfen werden, da sie anscheinend an Substanzen mit Insulinähnlicher Wirksamkeit erschöpft sind.

Wegen der großen Bedeutung der Arzneimittel auf Basis von Substanzen mit Insulinähnlicher Wirksamkeit wird daher bereits seit einer Reihe von Jahren nach Möglichkeiten gesucht, durch die sich die Ausbeute an Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit bei Verfahren der oben angegebenen Art verbessern läßt, ohne daß diesen Bemühungen bisher Erfolg beschieden war.

Aufgabe der Erfindung Ist daher die Schaffung eines neuen Verfahrens zur Isolierung von Substanzen mit Insulinähnlicher Wirksamkeit aus Blut oder Blutbestandteilen, insbesondere von Kälbern oder Schweinen, durch das sich die aktiven Substanzen In erhöhter Konzentration und Insgesamt günstigerer Ausbeute aus dem jeweiligen Ausgangsmaterial gewinnen lassen.

Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß durch das In den Ansprüchen gekennzeichnete Verfahren gelöst. Wie aus dem In der später folgenden Tabelle zusammengefaßten Versuchsmaterlal hervorgeht, läßt sich eine Aktivierung der Substanzen mit lnsullnahnllcher Wirksamkeit bei Blut oder Blutbestandteilen nicht lediglich

durch ein längeres Stehenlassen des Ausgangsmaterlals bei Raumtemperatur oder gegebenenfalls auch bei etwas erhöhter Temperatur einfach Im neutralen pH-Bereich erreichen. Die gewünschte Erhöhung der Ausbeute an

Substanzen mit Insulinähnlicher Wirksamkeit ergibt sich vielmehr eindeutig erst durch die erfindungsgemäße Verschiebung des pH-Wertes In den sauren Bereich unter den im Hauptanspruch sonst noch angegebenen

weiteren Bedingungen.

Während Blut oder Blutbestandteile Substanzen mit lnsullnahnllcher Wirksamkeit nur In einer Konzentration von 2,5 bis 8 μΕ/mg Trockensubstanz enthalten, wurde demgegenüber nun erfindungsgemäß gefunden, daß man durch das in den Ansprüchen näher bezeichnete Aktivierungsverfahren ein Produkt erhalten kann, das

über einen hohen Anteil an Substanzen mit Insulinähnllcher Wirksamkeit verfügt, nämlich einen Anteil von etwa 14 bis 40 μΕ/mg Feststoff.

Vor der Einstellung des pH-Wertes auf den erfindungsgemäß vorgeschriebenen Wert von 2 bis 4 soll man das Blut oder die Blutbestandteile - wie angegeben - mit 0,5 bis 4 Volumina eines hydrophilen Lösungsmittels verdünnen. Als Blut oder Blutbestandtelle verwendet man beim vorliegenden Verfahren normalerweise Gesamtblut, Plasma, Serum und Erythrczytensuspenslonen oder Thrombozytensuspensionen. Welter kann man erflndungsgemaß auch den nach Entfernen anorganischer oder organischer Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als SOOO, nämlich den nach bereits erfolgter Gewinnung von Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit, aus Blut oder Blutbestandteilen durch Dialyse erhaltenen Rückstand verwenden. Gleiches gilt auch für einen nach Entfernung anorganischer oder organischer Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger -eis 1000 aus Blut oder Blutbestandteilen durch Ultrafiltration erhaltenen Rückstand.

Die Gewinnung der Substanzen mit insulinähnllcher Wirksamkeit aus dem in der erfindungsgemäßen Weise behandelten Blut oder den Blutbestandteilen erfolgt am besten durch Diaiysieren gegen eine für ein Molekulargewicht mit weniger als 6000 durchlässige Membran als Außendlalysat.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit werden zweckmäßigerweise einem abschließenden Anreicherangsverfahren unterzogen, indem man aus den gewonnenen Substanzen anorganische Salze und niedermolekulare Substanzen entfernt und das Ganze auf ein Produkt mit einer insulinähnlichen Wirksamkeit von etwa 35 μΕ bis etwa 200 μΕ/mg Feststoff anreichert.

Es empfiehlt sich ferner, das gewonnene Produkt zur Bildung einer isotonischen Losung einzuengen oder zu verdünnen, wobei man vorzugsweise auf einen Feststoffgehalt von etwa 2,5 bis 20 mg/ml mit einer insulinähnlichen Wirksamkeit von etwa 500 μΕ/mI einstellt und die Isotonie gegebenenfalls durch Ergänzung mit Glucose oder Kochsalz herstellt.

Die in obiger Weise gewonnenen organopeptldhaltigen Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit haben ein Molekulargewicht von etwa 350 bis 5000, eine durch Antikörper nicht hemmbare Insulinähnliche Wirksamkeit im Fettgewebetest von etwa 35 bis 200 μΕ/mg, eine Löslichkeit in Alkohol, eine Hitzestabilität bei neutralern pH, eine positive Reaktion gegenüber Nlnhydrln und Amldoschwarz G, ein auf die Anwesenheit von Purinderlvaten hinweisendes UV-Maxlmum bei 258 mn, einen durch eine Aminosäurebestimmung nach Hydrolyse ermittelten Peptldgehalt von 25 bis 30» des Trockengewichts der salzfreien Substanzen mit folgenden Aminosäuren: Glutaminsäure, Leucin, Glycin, Serin, Asparaginsäure, Alanin, Isoleucin, Histidin, Valin, Threonin, Lysin, Methionin, Thyrosln, Prolin und Arginin, und eine sich am Einbau von Glucose in Fettzellen, an der Erniedrigung von erhöhtem Blutzucker bei Mensch und Tier, an der Hemmung der Lipolyse und an der Förderung des Wachsturis von Zellkulturen, wie Fibroblasten, zeigende insulinähnliche Wirksamkeit.

Die Insulinähnliche Wirksamkeit der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnenen Substanzen wird am epldldymalen Fettanhang der Ratte In Anlehnung an die in J. Clin. Invest. 39, 1487 bis 1498 (1960) beschriebene Methode bestimmt. Für jeden Fettgewebetest, der aus 24 Einzelbestimmungen besteht, werden bei drei männlichen Ratten mit einem Oewlcht von etwa 180 bis 200 g verwendet. Nach Präparation der beiden Fettkörper der Nebenhoden wird das Fettgewebe zerschnitten und so verteilt, daß man am Schluß In jedem der 24 Reaktionsgefäße je ein Teilstück von einem Vorder-, Mittel- und Hinterlappen aus einem Fettgewebeanhang hat (Insgesamt 80 bis 100 mg Fettgewebe). Jede Bestimmung wird dreifach durchgeführt, wozu jeweils 35 mg der auf eine Insulinähnliche Wirksamkeit hin zu untersuchenden Präparationen abgewogen und V.\ 7 ml Krebs-Rlnger-Blcarbonat-Puffer, der lOO-mg-% Gelatine und 250-mg-% Glucose enthält, gelöst werden. Die für die Untersuchungen verwendete Insulln-Eichkurve verfügt über einen Bereich von 63 bis 252 μΕ Insulin. Die kompletten Ansätze enthalten etwa 100 mg Fettgewebe, 9,5 mg auf ihre Insulinähnliche Wirksamkeit zu untersuchende Substanz (oder auch Leerwerte oder verschiedene Insulinkonzentrationen), 1,9 ml Krebs-Ringer-Blcarbonat-Puffer und 0,1 ml l-¹⁴C-Glucose mit 0,2 \iC. Sie werden 2 Stunden bei 37° C lnkublert.

Anschließend spritzt man In das Innengefäß des Reaktionskolbens zum Sammeln des ¹⁴CO₂ eine Menge von 0,4 ml Hyamin und dann in das Inkubationsmedium unter Wahrung des geschlossenen Systems mit einer Kanüle 0,25 ml einer 2n-Schwefelsäure zur Freisetzung des ¹⁴CO₂ ein. Nach 0,5stündlger Inkubation der einzelnen Reaktionsgefäße bei einer Temperatur von 37° C wird das Hyamin aus den als Absorptionsgefäße dienenden Kunststoffkappen In dazu passende Fläschchen aus Kunststoff überführt, die als Zählgefäße dienen und mit so 8 ml Toluol-Sclntillatlonslösung gefüllt sind. Die verwendete Sclntlllatlonslösung besteht aus 4 g 2,5-Dlphenyloxazol, 100 mg l,4-Bls-2-(4-methyl-5-phenyloxazolyl)benzol und 11 Toluol. Die Radioaktivität wird In einem Flüsslgkelts-Sclntlllatlonsspektrometer gemessen.

Wird die gleiche Versuchsanordnung unter Zusatz von Insulinantikörpern durchgeführt, kommt es zu keiner oder nur einer geringfügigen Abnahme der Meßwerte. SS

Die Bestimmung einer Stimulation oder Hemmung der Lipolyse in Fettgewebe erfolgt unter Verwendung eines Fettgewebes, bei dem man mit 0,4 μg Adrenalin/ml oder mit 0,1 μg Glucagon/ml eine Lipolyse induziert. Anschließend werden im Medium die Konzentrationsänderungen der freien Fettsäuren und des Glycerins vor und nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen der zu untersuchenden Insulinähnlichen Wirksubstanz bestimmt. Zum Vergleich wird eine Elchkurve mit Insullnlösungen verschiedener Konzentrationen zwischen 1 und 100 μΕ/ml erstellt. Die angewandte Bestimmungsmethode Ist Im einzelnen In Arzneim. Forsch. 18, 1019 g| bis 1021 (1968) beschrieben.

j-;.: Die Wirkung der erfindungsgemäß hergestellten Substanzen auf den Blutzuckerspiegel wird auch durch In-

£?■ vivo Versuche ermittelt. Hierzu verabreicht man 250 g schweren Wlstar-Ratten intravenös 3 g Glucose pro kg.

V_u. Eine Vergleichsgruppe erhält gleichzeitig mit der Glucosegabe 2 mg der nach Beispiel 5 hergestellten erfindungs-

gemäßen Substanz (15 bis 20 μΕ/mg). Die Blutzuckerspiegel steigen bei den Kontrolltieren innerhalb von 15 :" Minuten auf 400-mg-% an und normalisieren sich nach 60 Minuten auf etwa 120-mg-%. Bei den mit dem erfln-

_; . dungsgemäß erhaltenen Wirkstoff behandelten Versuchstieren ergeben sich Im gleichen Zeltraum um etwa 20%

ZJ JO JJ/

niedrigere Glucosesplegel.

Die Injektion des gleichen erfindungsgemäß hergestellten Wirkstoffes bei Alloxan-diabetischen Ratten führt zu einem statistisch signifikanten Blutzuckerabfall im Vergleich zu Alloxan-diabetischen Kontrolltieren, denen man intravenös nur die gleiche Menge physiologische Kochsalzlösung injiziert.

Die In obigen biologischen Versuchen beschriebenen Eigenschaften zeigen, daß die erfindungsgemäß hergestellten Substanzen Interessante Heilmittel sind. Sie eignen sich vor allem als blutzuckererniedrigende Mittel bei hyperglykämischen Warmblütern. Zu einer entsprechenden Behandlung werden diese Heilmittel zweckmäßigerweise in Tagesdosen von etwa 200 bis 500 μΕ/kg Körpergewicht eingesetzt, wobei man diese Wirkstoffmenge . vorzugsweise in mehreren Teildosen zwei- bis dreimal täglich verabreicht. Die Verabfolgung erfolgt vorzugsweise durch Intravenöse Infusion, und daher am besten in Form Injizierbarer Lösungen.

Ein besonderer Vorteil dieser insulinähnlich wirkenden Substanzen ist darin zu sehen, daß sich mit ihnen auch die Spätfolgen einer nach !angzeitiger Behandlung mit Insulin oder oralen Antidiabetika bei Diabetikern auftretenden Gewebsschädlgungen behandeln lassen. Die Wirkstoffe werden daher zweckmäßigerweise am beaten in Ergänzung zur üblichen Behandlung von Diabetikern verabfolgt. Diese besondere Wirkung wird zum einen Teil darauf zurückgeführt, daß in diesem Wirkstoff eine höhere Menge an insullnähnllchen Substanzen, die durch Insulinantikörper nicht hemmbar sind, vorhanden Ist, und zum anderen Teil auch auf in diesem Wirkstoff vorhandene wachstumsförderride Faktoren, die den Heilprozeß begünstigen.

Aus der folgenden Tabelle geht der Einfluß des pH-Wertes auf die Gewinnung von Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit hervor. Wie ersichtlich, ergibt das erfindungsgemäße Arbeiten Im pH-Bereich von 2 bis 4 gegenüber einer Behandlung in nur neutralem pH-Bereich eine besonders hohe Gesamtausbeute an Substanzen mit insulinähnlicher Wirksamkeit.

Tabelle

Einfluß des pH-Wertes auf die Gewinnung von Substanzen
mit insulinähnlicher Wirksamkeit

Beispiel Eingesetztes Ausgangs-Nr. material und pH-Werte bei

seiner Behandlung

Ausbeute in g Insulinähnliche
Trockensubstanz/ Wirksamkeit
100 ml μΕ/mg

Gesamte insulinähnliche Wirksamkeit mE/100 ml

1 la	Kälberblut	pH 3,5 pH 7	1,6 1,2
2 2a	Plasma von Kälberblut	pH 3 pH 7	2,7 1,8
3	Plasma von Schweineblut	pH 2,5	1,8
4 4a	Erythrozyten- sediment	pH 2,5-3,0 pH 7	2,8 0,09
5	Vordialysiertes Kälberblut	PH3_V5	2,5
6 6a		pH 4 pH 7	1,8 0,3
•Ί t 7a	Vordialysiertes Plasma von Käiberblut	pH 3,5 pH 7	1,2 0,2
8	Ultrafiltriertes Käiberblut	pH 3,5	0,3

pH 7

15,3
11,0
14,7

6,5
14,0

5,3

9,0
15

16,0
16,0
27

9,5
25,0

10

24,4 13,2

39,7

11,7 25,2

14,8

0,81 38

28,0

5,0

31,5

1,9

7,5

2,0

Beispiel 1 (Erfindung)
Verwendung von Blut von Schlachtkälbw

31 frisch entnommenes Blut von Schlachtkälbern werden mit 300 ml einer 3,8%lgen Natrlumeltratlösung und mit 20 g Phenol mechanisch vermischt und auf 4° C gekühlt. Nach Verdünnen mit 900 ml demlnerallsiertem Wasser wird der pH-Wert durch Zugabe von etwa 100 ml 6-n-Salzsäure auf 3,5 eingestellt und der gesamte Ansatz unter Rühren 24 Stunden auf 35 bis 40° C erwärmt. Sodann wird wieder auf 4° C abgekühlt, worauf man das Ganze In Dialyslerschläuchen mit einer Molekulargewlchtsausschlußgreni.·¹; von etwa 5000 bis 6000 Dalton gegen destilliertes Wasser, das 0,296 Phenol enthält, dlalyslert. Das Verhältnis von Innen- zu Außendlalysat beträgt etwa 1:5 bi? 1:10. Die Dialyseschläuche werden zur Optimierung des Dialyseeffektes mechanisch

bewegt. Nach 24 Stunden wird das Dlalysat gewechselt, und nach weiteren 24 Stunden wird dieser Wechsel nochmals wiederholt. (Das Innendlalysat wird gegebenenfalls nach Beispiel 5 weiterverarbeitet). Die vereinigten Außendialysate werden in einem Vakuumplattenumlaufverdampfer bei maximal 35° C auf 2 I eingeengt und mit 2-n-Ammonlaklösung auf pH 7,0 eingestellt. Anschließend wird welter auf 200 ml eingeengt, ein eventuell entstandener Niederschlag abzentrlfugiert und die klare Lösung gefriergetrocknet. Man erhält 48 g eines Substanzgemisches (Trockensubstanz) mit einer insuiinähniichen Wirksamkeil von 15,3 μΕ/mg, entsprechend 1,6 g Trockensubstanz mit 24,4 mE/100 ml Ausgangsmaterlal.

Beispiel la (Vergleich)

10 Verwendung von Blut von Schlachtkalbern

Das In Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird Im einzelnen wiederholt, wobei man das hämolyslerte Blut jedoch nicht mit Salzsaure während der angegebenen Zeltdauer bei der genannten Temperatur behandelt, sondern gleich der beschriebenen Dialyse unterzieht. Hierbei erhält man auf jeweils 100 ml Blut als Ausgangsmaterial jeweils durchschnittlich 1,2 g eines Substanzgemisches (Trockensubstanz) mit einer Insulinähnlichen Wirksamkeit von 11,0 μΕ/mg und einer gesamten Insulinähnlichen Wirksamkeit von 13.2 mE.

Beispiel 2 (Erfindung) Verwendung von Blutplasma von Schlachtkälbern

Das In Beispiel 1 beschriebene citrathaltlge frische Kälberblut (3 1) wird in Zentrifugenflaschen zu 500 ml abgefällt und bei 4° C In einer Zentrifuge 30 Minuten bei 3400 U/Mln zentrifugiert. Aus 1 1 Blut erhält man 0,6 bis 0,75 1 überstehendes Plasma, das man abplpettlert und sammelt. Das Eryhtrozytensedlment (0,30 bis 0,45 I) wird mit O,536igem Phenolwasser Im Verhältnis 1 : 1 verdünnt und für die weitere Verarbeitung ebenfalls gesammelt (siehe Beispiel 4). 1 ! des oben erhaltenen überstehenden Plasmas wird mit 200 ml destilliertem Wasser, das 0,5% Phenol enthält, verdünnt und mit 6-n-Salzsäure auf pH 3,0 eingestellt. Die weitere Wärmebehandlung, Dialyse, Konzentration und Lyophlllslerung werden wie In Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Hierdurch erhält man aus 1 I Plasma 27 g Trockensubstanz mit einer Insuiinähniichen Wirksamkeit von 14,7 μΕ/mg, entsprechend einer gesamten Insuiinähniichen Wirksamkeit von 39,7 mE/100 ml.

Beispiel 2a (Vergleich) Verwendung von Blutplasma von Schlachtkälbern

Unter praktischer Befolgung des in Beispiel 2 beschriebenen Verfahrens verrührt man 21 Kälberblut mit 20Om! 3,8£!gem Ciiratpuffer und zentrifugiert das Ganze dann, wodurch man zu 1,2! Blutplasma gelangt. Dieses wird mit 0,5% Phenol versetzt und dann der beschriebenen Dialyse (ohne vorherige Behandlung mit Salzsäure) unterworfen. Nach Einengung der dabei erhaltenen vereinigten Außendialysate auf 485 ml mit « 44,5 mg Trockensubstanz/ml und einer Insulinähnlichen Wirksamkeit von 290 μΕ/ml, entsprechend 6,5 μΕ/mg Trockensubstanz, erhält man insgesamt 1,8 g Trockensubstanz mit 11,7 mE auf 100 ml Ausgangsmaterlal.

Beispiel 3 (Erfindung) (nachgereicht)

45 Verwendung von Blutplasma von Schlachtkälbern

0,8 1 eines Cltratplasmas von Schweineblut, das analog zu Beispiel 2 gewonnen worden ist, werden unter Zusatz von 0,4 1 Ethylalkohol und 120 ml 6%Iger Phenollösung unter Rühren mit 6-n-Salzsäure auf pH 2,5 eingestellt und unter weiterem Rühren 48 Stunden auf 15 bis 18° C gehalten. Danach wird auf 5° C abgekühlt, der pH-Wert mit 10-n-Natronlauge auf 6,5 rückgestellt und das so behandelte Plasma der oben beschriebenen Dialyse gegen die etwa 3- bis 4fache Menge an 0,2% Phenol enthaltenden destilliertem Wasser unterworfen. Nach 24 Stunden wird der DlaJysevorgang noch zweimal wiederholt. Die Außendialysate werden vereinigt, unter Vakuum bei maximal 35" C auf 80 ml eingeengt und auf pH 7 eingestellt. Der nach Lagerung In der Kälte anfallende geringe Niederschlag wird abfiltriert und die so erhaltene klare Lösung untersucht. Das Konzentrat weist eine Insulinähnliche Wirksamkeit von 2560 μΕ/ml und ein Trockensubstanzgewicht von 183 mg/ml auf. Dies entspricht 14,0 μΕ/mg. Auf je 100 ml Plasma entspricht dies einer Ausbeute von 25,2 mE in 1,8 g Trokkensubstanz.

Beispiel 4 (Erfindung) (nachgereicht)

Verwendung von Erythrozytensedlment von KSlberbiut

1,2 L Erythrozytensedlmeni von Beispiel 2 werden mit 0,5%iger wäßriger Phenollösung im Verhältnis 1:1 verdünnt und unter Rühren mit 6-n-Salzsäure auf pH 2,5 bis 3,0 gebracht. Zur Verringerung der Viskosität werden gleichzeitig insgesamt 2,11 an 60*igem Ethanol zugegeben. Das Reaktionsgemiseh wird unter Rühren 5 Stunden auf 35° C erwärmt und dann 48 Stunden bei etwa 18° C (Raumtemperatur) gehalten und anschließend mit verdünnter Natronlauge auf pH 6,5 eingestellt, wodurch sich eine Lösung mit einem Gesamtvolumen von

4,5 I ergibt. Die Lösung wird dreimal jeweils 24 Stunden gegen die 5fache Menge an 0,2%lgem Phenolwasser bei ',■"■!

5° C bis 10⁰C dlalyslert. £j

Die gesammelten Außendlalysate werden vereinigt, auf etwa 1 I eingeengt, auf pH 7,0 eingestellt und auf ■;.

235 ml konzentriert. Nach Stehenlassen über einige Tage bei 4° C bis 10° C wird der Niederschlag abzentrlfuglert '|

und die Lösung steril filtriert. Der Phenolgehalt beträgt noch 0,3%. In 235 ml Konzentrat sind 260 mg Trocken- Wj

substanz enthalten, die Insulinähnliche Wirksamkeit beträgt 1400 μΕ/ml, was 5,3 μΕ/mg entspricht. Die j|

gesamte Insulinähnliche Wirksamkeit beträgt 325 mE für 2,2 I Erythrozytensedlment. Für 100 ml errechnen sich |?

2.8 g Trockensubstanz mit 14,8 mE.

Beispiel 4a (Vergleich) | Verwendung von Erythrozytensedlment von Kälberblut

Eine aus cltrathaltlgem Kälberblut durch Zentrifugieren abgetrennte Erythrozytenfraktlon (0,72 1) wird mit der gleichen Menge destilliertem Wasser und mit 7,2 g Phenol versetzt. Die so hämolyslerte Lösung wird 24 Stunden auf 20° C gehalten und dann bei 4° C der zweimaligen Dialyse gegen eine etwa 3- bis 5fache Menge an 0,2% Phenol enthaltendem Wasser unterworfen. Die vereinigten Außendlalysate (pH 7,2) werden vorsichtig konzentriert und gefriergetrocknet. Aus 100 ml Erythrozytensedlment erhält man durchschnittlich 0,09 g Trockensubstanzgewicht mit einer Insulinähnlichen Wirksamkeit von 9,0 μΕ/mg. Die gesamte Insulinähnliche Wirksamkeit beträgt Q S mE.

Beispiel 5 (Erfindung) Verwendung von vordlalysiertem Kälberblut

Das Im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei mnn jedoch ein durch Dialyse von Kälberblut bei neutralem pH-Wert als Innendialysat erhaltenes Ausgangsprodukt verwendet. Hierzu werden 100 1 eines neutralen Innendialysators von defrlblnlertem Kälberblut mit 6n Salzsäure unter Rahren auf pH 3,5 gebracht. Der erhaltene Ansatz wird zur Viskositätserniedrigung mit 100 I 50volumenprozentlgem Ethanol versetzt und dann unter Zusatz von 0,5% Phenol und Rühren 24 bis 48 Stunden bei 20° C bis 30° C Inkubiert. Nach Abkühlen auf 4° C werden die 200 I Gesamtlosung erneut gegen 0,2%lges Phenolwasser dlalyslert. Hierdurch kommt es z^ einer starken Quellung des Innendlalysats, die man durch Rühren In Grenzen hält. Das Volumenverhältnis von Innendialysat zu Außendlalysat Hegt bei 1:2 bis 1 :5. Nach jeweils 24 Stunden wird das Außendlalysat Insgesamt viermal gewechselt und erneuert. Die dabei gesammelten Außendlalysate (etwa 2200 1 vom pH 3,5) werden unter Vakuum auf 25 I eingeengt, mit 5n Ammoniak neutralisiert, von Trübungen abfiltriert und auf 3,5 1 weiterkonzentriert. Die Lösung läßt man dann eine Woche bei 4° C stehen, worauf man den gebildeten Niederschlag abnitriert und die Restlösung nach Korrektur des pH-Wertes auf 6,9 bis 7,0 lyophlllsiert. Aus 100 1 Innendialysat (entsprechend etwa 85 I Blut) erhält man etwa 2500 g Trockensubstanz mit einer Insulinähnlichen Wirksamkeit von 15 μΕ/mg. Das Trockensubstanzgewicht beträgt 2,5 g/100 ml mit einer gesamten insulinähn liehen Wirksamkeit von etwa 38 mE.

Beispiel 6 (Erfindung) (nachgereicht) Verwendung von vordlalysiertem Kälberblut

3 1 eines neutralen Innendlalysats aus deflbrinlertem und hämolyslertem Kälberblut werden mit 6n Salzsäure unter Rühren auf pH 4,0 gebracht. Zur Viskositätserniedrigung gibt man 3 1 50%iges Ethanol zu und Inkubiert unter 0,5%igem Phenolzusatz 24 Stunden bei 20° C. Nach Abkühlen auf 4° C wird das Reaktionsgemisch erneut dreimal gegen 0,2%lges Phenolwasser dlalyslert. Das Volumenverhältnis von Innendialysat und Außendialysat liegt bei 1 :5. Die gesammelten Außendlalysate werden auf 1,2 1 eingeengt. Die klare Losung vom pH 3,75 wird mit Ammoniak auf pH 7 neutralisiert. Der entstandene Niederschlag wird abflltriert und die Lösung welter schonend auf 710 ml eingeengt. Sie verfügt dann über ein Trockensubstanzgewicht von 26,0 mg und eine gesamte insulinähnliche Wirksamkeit von 1216 μΕ/ml, was zu einer Wirksamkeit von 16,0 μΕ/mg entspricht. Für 100 ml Innendialysat ergibt sich ein Trockensubstanzgewicht von 1,8 g mit einer gesamten Insulinähnlichen

Wirksamkeit von 28 mE.

Beispiel 6 a (Vergleich) Verwandung von vordialyslertem Kälberblut

Das nach Beispiel 1 a zurückgebliebene fast salzfreie Innendialysat aus Blut wird ohne Änderung des neutralen pH-Wertes erneut zwei- bis dreimal einer erschöpfenden Dialyse gegen 0,2% Phenol enthaltendes Wasser unterworfen, die vereinigten Außendlalysate werden konzentriert und gefriergetrocknet. Auf je 100 ml ursprünglich eingesetztes Kälberblut erhält man noch 0,3 g Trockensubstanz mit 16,0 μΕ/mg und insgesamt 5,0 mE insulinähnlicher Wirksamkeit gegenüber 13,2 mE aus den ersten Dialysaten nach Beispiel 1 a.

Beispiel 7 (Erfindung) Verwendung von vordlalyslertem Kälberblut

Ein aus Cltratblut gewonnenes Plasma (720 ml) wird Im neutralen Bereich !n üblicher Welse der dreimaligen Dialyse gegen 0,2% Phenol enthaltendes Wasser unterworfen. Das erhaltene fast salzfreie Innendlalysat (etwa 800 ml) wird mit 6n Chlorwasserstoffsäure unter Rühren auf pH 3,5 eingestellt, zur Viskositätserniedrigung mit 800 ml 60%lgem Ethanol versetzt, unter Phenolschutz (0,5%) und Rühren mindestens 4 Stunden bei 37° C inkubiert und dann noch 20 bis 24 Stunden bei Raumtemperatur unter Rühren stehengelassen. Nach Abkühlen unter 1O⁰C wird das Reaktionsprodukt erneut gegen 0,2% Phenol enthaltendes Wasser dlalyslert und das Außendlalysat (etwa im Verhältnis 1 :5) dreimal ausgetauscht. Die gesammelten Außendlalysate werden schonend eingeengt, neutralisiert und lyophlllslert. Man erhält 9,4 g Trockensubstanz mit einer Insulinähnllchen Wirksamkeit von 27 μΕ/mg, was 1,2 g Trockensubstanz und einer gesamten Insulinähnllchen Wirksamkeit von 31,5 mE/100 ml entspricht.

15 Beispiel 7 a (Vergleich)

Verwendung von vordlalysiertem Plasma von Kälberblut

Gemäß Beispiel 2 a verbleibt nach dreifacher Dialyse im Neutralbereich aus 1.2 I Cltratplasma ein fast salzfreies Innendialysat, das dann noch zweimal dlalyslert wird. Diese vierten und fünften Dlalysate werden in der gezeigten Welse schonend eingeengt und gefriergetrocknet. Aus je 100 ml ursprünglich eingesetztem Blutplasma erhält man noch 0,2 g Trockensubstanz mit einer Insulinähnllchen Wirksamkeit von 9,5 μΕ/mg, was einer gesamten insulinähnllchen Wirksamkeit von 1,9 mE entspricht.

Beispiel 8 (Erfindung) Verwendung von ultrafiltriertem Kälberblut

10 1 frisch entnommenes Kalberblut nach Beispiel 1 werden mit 1000 ml 3,8%iger Natrlumcltratlösung und 60 g Phenol mechanisch vermischt, auf 4° C gekühlt und mit 2 1 demlneralisiertem Wasser verdünnt. Die erhaltene Lösung wird zunächst mittels einer Zentrifuge geklärt und dann durch Ultrafiltrationsmembranen auf Basis von Acetylcellulose mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Dalton unter einem Druck von etwa 6 bar filtriert. Hierbei werden anorganische und organische Bestandteile mit einem Molekulargewicht unter etwa 800 bis 1200 Dalton eliminiert, und es bleibt ein dickflüssiger Brei zurück, den man In 2 1 destilliertem Wasser aufnimmt. Die auf diese Weise erhaltene Suspension wird dann nach Beispiel 1 durch Ansäuern weiterbehandelt. Das Ansäuern mit 6n Salzsäure auf pH 3 führt zu einer weiteren Verdickung der Reaktionsmasse, die durch Zugabe von 50%lgem Ethanol (etwa 3 bis 4 1) ausgeglichen wird. Unter Rühren erwärmt man dann 4 bis 6 Stunden auf 40° C und hält das dickflüssige Produkt dann unter weiterem Rohren noch 24 bis 48 Stunden auf Raumtemperatur (15° C bis 18° C). Hierauf wird bei Temperaturen unter 10⁰C gegen destilliertes Wasser, das 0,2% Phenol enthält, Insgesamt dreimal dlalyslert. Die so gewonnenen, gesammelten, neutralisierten, eingeengten und lyophliisierten Außendlalysate enthalten 25 bis 30 g Trockensubstanz einer durchschnittlichen lnsulinähnltchen Wirksamkeit von 25,0 μΕ/mg. Auf je 100 ml ultraflltriertes Blut gewinnt man etwa 7,5 mE Insulinähnlicher Wirksamkeit.

45 Beispiel 8 a (Vergleich)

Verwendung von ultrafiltriertem Kalberblut

Der nach Ultrafiltration durch Acetylcellulosemembranen zurückbleibende Blutbrei von Beispiel 8 wird im so Verhältnis 2:1 mit 0,2% Phenol enthaltendem Wasser gut verrührt und bei 18° C ohne pH-Änderung 24 bis 48 Stunden gegen 0,2% Phenol enthaltendes Wasser dialyslert. Nach Wiederholung des Dialysevorganges werden die gesammelten Außendialysate bei maximal 35° C eingeengt und gefriergetrocknet. Aus je 100 ml ursprünglich eingesetztem Blut erhält man 0,2 g Trockensubstanzgewicht mit einer Insulinähnllchen Wirksamkeit von 10 μΕ/mg, was einer gesamten insulinähnllchen Wirksamkeit von 2,0 mE entspricht.

Beispiel 9 (Erfindung) Fraktionierung des Produkts von Beispiel 5

4,5 g des nach Beispiel 5 erhaltenen Produktes mit 15 bis 20 μΕ/mg werden in 25 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung bringt man auf eine Säule (K50 χ 100), die mit einem stark vernetzten Dextrangel mit einem Fraktlonierungsbereich bis 700 Dalton (wie Sephadex G 10, Korngröße 40 bis 120 μΐη) gefüllt ist. Die Säule wird mit 0,1η Essigsäure mit einer Geschwindigkeit von 60 ml/Stunde elulert. Es werden Fraktionen von je 12,4 ml entnommen, die man in einem UV-Durchfluß-Photometer bei 206 und 254 nm mißt und dabei drei Hauptpeaks (Fraktionen Nr. 49 bis 79; 80 bis 119 und 120 bis .540) herausschneidet. Die Hauptmenge der inaktiven Salze befindet sind in Fraktion Π. Die Fraktion I mit einer Ausbeute von 115 mg enthält den salzfreien Hauptanteil der Substanz mit Insulinähnlicher Wirksamkeit mit 60 μΕ/mg. Die Fraktion ΠΙ enthält im wesentlichen nieder-

molekulare Inaktive organische Substanzen.

Die Molekulargewichtsbestimmung der Substanz aus Fraktion I (115 mg) erfolgt an einer geeichten Gelflltratlonssäule (K.26 χ 100), die mit vernetzten! Dextrangel (wie Sephadex G 25, Korngröße 50 bis 150 μπι) gefüllt Ist. Die Elutlon mit In Essigsäure (16 ml/Stunde) zeigt einen Hauptteil von etwa 9996 mit einem Molekulargewicht unter 1000 Dalton. Die Vorfraktion (35 mg, das sind 7,2% des gesamten organischen Anteils der Fraktion) liegt Im Bereich von 350 bis 5000 Dalton und zeigt die gesamte Insullnähnllche Wirksamkeit von 150 μΕ/mg.

Eine Aminosäurenanalyse der gewonnenen Fraktion I zeigt vor und nach Hydrolyse (unter Stlck..iof? mit 6n Chlorwasserstoffsäure bei einer Temperatur von 110° C über eine Zeltdauer von 24 Stunden) iolgende Werte In Prozent:

Ornithin und Lysin (12,23; 22,25), Histidin (1,30; 2,89), Arginin (Spuren; 0,47), Asparaginsäure (0,71; 2,42), Threonin (0,61; 1,13), Serin (0,39; 1,85), Glutaminsäure (0,20; 2,16), Prolin (1,38; 1,93). Glycin (0,15; 1,35), Alanin (1,54; 3,99), Cystein (0,06; 0,08), Valin (1,12; 2,41), Methionin (0,17; 0,25), Isoleucin (0,14; 0,36), Leucin (0,16; 1,67), Tyrosin (0,52; 1,15) und Phenylalanin (Spuren; 0,10).

Beispiel 10 (Erfindung)
Elektrophorese des Produkts von Beispiel 1

Ir eine Apparatur zur trägerfreien Elektrophorese nach Hanisch, die eine Fraktionierung In 90 Fraktionen gestattet, werden Innerhalb von 5 Stunden 3 g des nach Beispiel 1 erhaltenen Produktes mit 15,3 μΕ/mg In Form einer Lösung In 15 ml Wasser eingetragen. Die Lösung wird 1 : 1 mit Kammerpuffer verdünnt, der aus einem 1 ■ 3 verdünnten Elektrodenpuffer besteht. Der verwendete Elektrodenpuffer vom pH 4,9 Ist eine Mischung aus 100 ml Pyrldln und 80 ml Eisessig, die mit Wasser auf 9000 ml aufgefüllt Ist. Die Elektrophorese wird bei einer Spannung von 1800 bis 1500 Volt, einer Stromstärke von 150 bis 165 mA und einer Temperatur von 5° C durchgeführt. Die Pufferpumpe fördert 10 ml/Stunde und die Doslerpumpe 1,5 ml/Stunde, was 0,7i ml der aktiven Lösung entspricht. Es werden neun Fraktionen geschnitten, wobei der Fraktion 6 (Röhrchen 41 bis 44), die Fraktion 7 (Röhrchen 45 bis 48) und die Fraktion 9 (Röhrchen 53 bis 55) Insullnähnllche Wirksamkeit aufweisen. Diese Fraktionen werden lyophillsiert. Die Fraktion 6 ergibt 16 mg einer Substanz mit einer Insulinähnlichen Wirksamkeit mit 60 μΕ/mg, die Fraktion 7 ergibt 12,8 mg mit 150 μΕ/mg und die Fraktion 9 ergibt 9,6 mg mit 190 μΕ/mg. AHe drei Fraktionen zeigen positive Reaktionen gegenüber Nlnhydrln und Amldoschwarz G.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Isolieren von Substanzen mit Insulinähnlicher Wirksamkeit aus Blut oder Blutbestandteilen von Kälbern oder Schweinen durch Dialyse gegen eine für ein Molekulargewicht von 5000 bis 6000

s durchlässige Membran von enteiweißtem Blut oder Blutbestandteilen und anschließendes Einengen und Trocknen des Dlalysats, dadurch gekennzeichnet, daß man Blut oder Blutbestandteile von Kälbern oder Schweinen in Gegenwart von Konservierungsmitteln nach Verdünnung mit 0,5 bis 4 Volumina eines hydrophilen Lösungsmittels auf einen pH-Wert von 2 bis 4 einstellt und für eine Zeitspanne von wenigstens 4 Stunden auf einer Temperatur von 15 bis 40° C hält, das derart inkubierte Material auf Temperaturen unter

ίο 10¹¹C abkühlt, wiederholt gegen destilliertes Wasser dialysiert und aus den vereinigten Außendlalysaten durch Neutralisation, Einengung unter Vakuum und Lyophllisierung ein Substanzgemisch mit einem Molekulargewicht von 350 bis 5000 isoliert, das eine Insullnähnliche Aktivität von 14 bis 40 ug/mg Feststoff aufweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Blut oder Blutbestandteile das durch Dialyse gegen eine für ein Molekulargewicht von 5000 bis 6000 durchlässige Membran von Blut oder Blutbestandteilen bei neutralem pH-Wert erhaltene Innendialysat einsetzt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Blut oder Blutbestandteile den durch Ultrafiltration gegen eine Membran mit einer Ausschlußgrenze von 1000 Dalton erhaltenen Rückstand einsetzt.