DE1293705B

DE1293705B - Verfahren zur Gewinnung eines elastolytisch wirksamen Bauchspeicheldruesen-Praeparates

Info

Publication number: DE1293705B
Application number: DEL48994A
Authority: DE
Inventors: Thuillier Yvonne
Original assignee: ROLLAND LAB A; Laboratoires Albert Rolland SA
Current assignee: ROLLAND LAB A; Laboratoires Albert Rolland SA
Priority date: 1963-10-10
Filing date: 1964-10-09
Publication date: 1969-04-30
Also published as: GB1076776A; US3367836A; FR4076M; FR1590059A

Description

Aus der Bauchspeicheldrüse gewonnene, elastolytisch wirksame Präparate sind bereits bekannt. So ist so einen pH-Wert von 8,7 aufweist; dieser Wert wurde, im Handel ein »Enzyser« genanntes Präparat (nach- wenn notwendig, eingestellt. Es wurden 2,4 cm³ dieser folgend mit »Handels-Elastase« bezeichnet) erhältlich Pufferlösung benutzt, zu der 0,1 cm³ der konzentrierten und weiter ist der britischen Patentschrift 837 444 ein Elastase hinzugefügt wurden. Unter diesen Bedingun-Verfahren zur Herstellung von Elastase zu entnehmen, gen wurde das in F i g. 1 gezeigte Spektrum erhalten, bei dem zunächst ein wäßriger Extrakt von zerkleiner- 35 das durch zwei Maxima ausgezeichnet ist, die etwa bei ter entfetteter Bauchspeicheldrüse vorzugsweise in 2250 bzw. bei etwa 2775 Ä liegen. Gegenwart von 8 % Natriumchlorid hergestellt wird.
Dieser wäßrige Extrakt wird dann mit einem Natriumacetat-Essigsäure-Puffer auf pH 4,5 bis 5 und eine
Ionenstärke von weniger als 0,4 gebracht und bei 30
25°C mit einem schwachen Kationenaustauscher behandelt. Nach Abtrennen und Waschen des Kationenaustauschers wird die' an ihm fixierte »Elastase-Substanz« mit einer wäßrigen Lösung von pH 4,5 bis 5 und

einer Ionenstärke von zumindest 0,4 und vorzugsweise 35 hinzugegeben, daß 18 cm³ erhalten wurden, dabei 0,8 bis 1,5 eluiert. wurden gesteigerte Mengen der erfindungsgemäß ge-

Diese Ionenaustauscherbehandlung kann gegebenen- winnbaren Zusammensetzung für die Untersuchungen falls wiederholt werden, worauf sich dann eine weitere benutzt. Es wurde eine Lösung von 1 mg/cm³ mit Reinigung der im Eluat enthaltenen Elastase durch einem Proteingehalt von etwa 100 Mikrogramm/cm³ Fraktionierung mit Ammoniumsulf at bei über 80°/₀iger 40 verwendet.

Sättigung oder mit Alkohol mit über 65 Volumprozent Die Lösungen der erfindungsgemäß gewinnbaren

Zusammensetzung wurden nach Zugabe des Elastins auf 18 cm³, wie oben angegeben, aufgefüllt; für die Untersuchungen wurden 0,5, 1 und 1,5 cm³ der Lösung der erfindungsgemäß gewinnbaren Zusammensetzung benutzt.

Nach Filtrieren wurden entnommene Proben in ein auf 2800 Ä eingestelltes Spektrophotometer gebracht Die abgelesenen Zahlenwerte entsprechen der Extinkveranschaulichen das Inlösunggehen des

Anschließend wurde die elastolytische Wirksamkeit der erfindungsgemäß gewinnbaren enzymatischen Zusammensetzung gemessen.

Hierzu wurden 18 mg Elastin in kleine Erlenmeyer-Kolben in Gegenwart von Pufferlösung aus Natriumkarbonat und n/100-Salzsäure mit einem pH-Wert von 8,8 eingebracht. Die Lösung der erfindungsgemäß gewinnbaren Zusammensetzung wurde in der Weise

anschließt. Abschließend wird (nach einer gegebenenfalls stattfindenden Dialyse zur Entfernung von Salzen und Lösungsmitteln), getrocknet, vorzugsweise durch Gefriertrocknen.

Es wurde nun festgestellt, daß man ein gegenüber den bekannten Elastase-Präparaten erheblich wirksameres Produkt erhält, das, wie weiter unten gezeigt wird, den bekannten Produkten überlegen ist, wenn man nach einem Verfahren arbeitet, das dadurch ge- so tion und kennzeichnet ist, daß man das Pulver mit ¹I₁₀₀VCIoIaTeT Elastins. Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,8 bis 5,0 extrahiert, aus dem Extrakt die elastolytisch wirksamen Stoffe durch Zugabe von 48 bis 55 Gewichtsprozent/Volumprozent Ammoniumsulfat ausfällt, den 55 gewinnbaren Niederschlag abtrennt, im Wasser suspendiert und dia- halten: lysiert, den so gereinigten Rückstand mit Alkohol einer Konzentration von 50 Volumprozent behandelt, die unlöslichen Proteine abfiltriert, im Filtrat mit Alkohol einer Konzentration von 80 Volumprozent einen elastolytisch wirksamen Niederschlag ausfällt und diesen abtrennt, in Vioo^m°lärer Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,8 bis 5,0 löst und lyophilisiert, wobei alle Verfahrensschritte unterhalb von 5⁰C, vorzugsweise —2° C, durchgeführt werden.

Vorzugsweise wird dabei in Gegenwart von Calciumionen gearbeitet, die eine stabilisierende Wirkung auf Unter diesen Bedingungen wurden für eine konstante Elastin-Menge und jeweils 18 cm³ Lösung in Abhängigkeit von der Menge der erfindungsgemäß Zusammensetzung folgende Werte er-

Erfindungsgemäß gewinnbare Zusammensetzung, in
gelöster Form
(100 μg/cm³)

0,5 cm³ 1 cm³ 1,5 cm³ Am Spektrophotometer abgelesene Extinksionswerte nach

Va Sunde | 1 Stunde Jl¹/« Stunden

0,200
0,380
0,490

0,390 0,520 0,595

0,560 0,580 0,620

Da die Zahl der Einheiten der elastolytischen Verbindung eine Funktion der Menge des Elastins ist, wurde eine weitere Untersuchung durchgeführt, bei der die Menge des Elastins bei gleichbleibender Menge

der erfindungsgemäß gewinnbaren Zusammensetzung verändert wurde; dabei wurde für die Bestimmung die UV-Absorption bei 2800 Ä in oben angegebener Weise nach einer Wartezeit mit Elastin bei 37⁰C benutzt.

Bei diesen Untersuchungen wurde von einer Lösung der reinen erfindungsgemäß gewinnbaren Zusammensetzung mit 100μg/cm³ ausgegangen; davon wurden 0,5 cm³ entnommen und mit 12 cm³ Wasser verdünnt. Man erhält eine Lösung mit einer Konzentration von 4 μg/cm³, von der für die Bestimmungen je 1 cm³ be- ίο nutzt wurde. In der nachstehenden Tabelle sind die mit dem Spektrophotometer nach Ablauf von 1,2 oder 3 Stunden erhaltenen Werte in Abhängigkeit von der Elastinmenge angegeben.

Spektrophotometerablesungen (Extinktion) nach Ablauf von 1, 2 oder 3 Stunden

Elastin	1 Stunde	2 Stunden	3 Stunden
0	0,099	0,105	0,095
5 mg	0,155	0,250	0,380
15 mg	0,205	0,335	0,535
20 mg	0,215	0,450	0,600
30 mg	0,295	0,600	0,860

35

20

25

Die erfindungsgemäß gewinnbare elastolytische Zusammensetzung wurde mit einer Elastase-Vergleichsprobe, die im Handel unter dem Namen »Enzyser« vertrieben wird, verglichen. Zum einen wurden die Spektren verglichen; F i g. 2 zeigt die Spektren der beiden Produkte, die Kurve 1 gibt das Spektrum der erfindungsgemäß gewinnbaren Zusammensetzung wieder und die Kurve 2 dasjenige des Handelsproduktes (Wellenlängen in Ä).

Weiter wurde die elastolytische Wirksamkeit des erfindungsgemäß hergestellten Präparates (O) mit derjenigen der Handels-Elastase »Enzyser« (S) und der nach der britischen Patentschrift 837 444 hergestellten Elastase (A) verglichen, und zwar wurde die Auflösung von Elastin unter der Wirkung der verschiedenen elastolytischen Präparate durch Spektrophotometerablesungen (Extinktion) bei 2800 Ä nach Stehenlassen unter Rühren bei 37°C spektrophotometrisch verfolgt.

Zu diesem Zweck wurden in rohrförmige Behälter von 25 · 200 mm 20 mg Elastin, 0,5 ml Phosphatpuffer und die zu prüfende Elastase eingebracht und mit Wasser auf 5 ml aufgefüllt.

Der Phosphatpuffer wurde hergestellt aus 19 ml einer Lösung von 7,8 g NaH₂PO₄ · 2H₂O in 100 ml wäßriger Lösung und 81 ml einer Lösung von 17,9 g Na₂HPO₄ · 12H₂O in 100 ml wäßriger Lösung. Sein pH-Wert liegt bei 7,4.

Die wie angegeben gefüllten rohrförmigen Behälter wurden unter ständigem Rühren 1, 2 oder 3 Stunden lang bei 37° C belassen. Sie wurden dann auf 1°C abgekühlt und der Inhalt (durch Schleicher- und Schüll-Papier 595) filtriert.

Die nachfolgende Tabelle zeigt die für die verschiedenen Präparate erhaltenen Ergebnisse:

Elastasen

A 1 mg
S lmg
O lmg

Spektrophotometerablesungen (Extinktion) nach

1 Stunde I 2 Stunden I 3 Stunden

60

0,055
0,048
0,196

0,085 0,065 0,495

0,106 0,095 0,765

Wie die Tabelle zeigt, verläuft der Angriff des Elastins praktisch linear, und man erkennt die Kinetik der enzymatischen Reaktion.

Diese Ergebnisse zeigen deutlich die überlegene elastolytische Wirksamkeit der erfindungsgemäß hergestellten enzymatischen Zusammensetzung, die unbestreitbar viel höher ist als diejenige der bekannten Elastasen.

Außerdem wurde eine Elektrophorese des erfindungsgemäßen elastolytisch wirksamen Präparates (O) und der Handels-Elastase (S) an Agar-Agar-Schichten durchgeführt.

Dazu wurden Mikrotafeln nach Scheidegger verwendet und in folgendem Milieu bzw. unter folgenden Bedingungen gearbeitet: Zur Herstellung der Agar-Agar-Schichten wurde ein l,5%iger Agar-Agar in Veronalpuffer verwendet; diese Pufferlösung enthält Natriumdiäthylbarbiturat zur Einstellung eines pH-Wertes von 8,2; die Ionenstärke betrug 0,05; die Spannung lag bei 100 Volt, entsprechend etwa 5 Volt/ cm; die Elektrophorese dauerte 60 Minuten.

Die Ergebnisse sind in F i g. 3 (Ziffer 1 bis 3) der Zeichnungen wiedergegeben. Für die elastolytische Zusammensetzung O (Ziffer 3 der F i g. 3) wurden zwei Fraktionen erhalten und für die Handels-Elastase (Ziffer 2 in F i g. 3) fünf Fraktionen.

Im Verhältnis zu den Bestandteilen des normalen menschlichen Serums (Ziffer 1 in F i g. 3), deren Beweglichkeiten bekannt sind, erhält man: Für die elastolytische Zusammensetzung O:

eine Fraktion mit der Beweglichkeit der /31,/32-Globuline und

eine Fraktion mit einer geringeren Beweglichkeit

als die y-Globuline.
Für die Elastase S:

eine Fraktion mit der Beweglichkeit der Albumine und der raschlaufenden Lipoproteine, eine Fraktion mit der Beweglichkeit des «2-Globulins,

eine Fraktion mit der Beweglichkeit der /Sl,/S2-Globuline,

eine Fraktion mit der Beweglichkeit des y-Globulins,

eine Fraktion mit einer geringeren Beweglichkeit als die y-Globuline.

Es wurde die Charakterisierung der verschiedenen getrennten oben angegebenen Fraktionen vorgenommen : Die Ergebnisse sind in F i g. 4 der Zeichnungen wiedergegeben, in der 1 die erfindungsgemäße Zusammensetzung und 2 die Handels-Elastase »Enzyser« bezeichnet.

a) Durch Esterasen-Untersuchung: Es wurde festgestellt, daß die beiden Fraktionen der elastolytischen Zusammensetzung O eine Wirksamkeit besitzen, insbesondere die Fraktion /Sl, ß2. Die Elastase S zeigt keine Aktivität.

b) Durch Untersuchung der elastolytischen Aktivität: Beide elastolytischen Zusammensetzungen zeigen eine bedeutende Aktivität, die für das Produkt O um den Faktor 3 höher ist, in einer Zone derselben Beweglichkeit, die von der langsamer als die y-Globuline wandernden Fraktion herrührt.

c) Durch Lipoprotein-Charakterisierung: Nur die äußere Zone der Fraktion mit /31,/S2-Beweglichkeit der elastolytischen Zusammensetzung O gibt in ihrem langsamen Teil eine Färbung durch Sudanschwarz.

d) Durch Charakterisierung der Nukleinsäuren: Die äußere Zone der Fraktion ßl, /32 der elastolytischen Zusammensetzung O nimmt das Pyronin an unter Bildung einer Spur, die von der Ausgangszone absteigt bis zu der Zone «2.

Daneben wurde die erfindungsgemäße elastolytische Zusammensetzung durch ihre spezifische immunologische Fällung charakterisiert. Hierzu wurde zu-Darüber hinaus wurden pharmakologische Untersuchungen mit der erfindungsgemäßen elastolytischen Zusammensetzung durchgeführt.

Die Zusammensetzung wurde vollkommen von Kaninchen und Ratten vertragen, denen täglich auf parenteralem Wege eine Menge von 500 γ der reinen Zusammensetzung in wäßriger Lösung pro Kilogramm Körpergewicht verabreicht wurde. Nach einer solchen 10 Tage dauernden Behandlung wurden die

nächst die Bildung von Antiserum bei Kaninchen wie 10 Tiere untersucht und zeigten keine Anomalie. Nach

folgt bewirkt:

Zwei Kaninchen Nr. 59 und 60 erhielten mehrere Reihen-Injektionen der erfindungsgemäßen Zusammensetzung mit Freundschen Adjuvans entsprechend dem in der nachfolgenden Tabelle angegebenen Schema.

Das Kaninchen Nr. 50 erhielt die Handels-Elastase »Enzyser« mit Freundschem Adjuvans.

Nach jeder Injektionsreihe wurde Blut der Kaninchen durch Punktieren entnommen, wie in der nachfolgenden Tabelle angegeben ist.

Nach Immunoelektrophorese auf Agarose beobachtet man, daß die beiden Zusammensetzungen eine verschiedene elektrophoretische Beweglichkeit besitzen und daß sie in stark selektiver Weise mit dem jeweiligen Antiserum nach jeder Injektionsreihe oder am Ende der Injektionen ausfallen, wenn die besagten Zusammensetzungen mit den beim Kaninchen durch Punktieren entnommenen Blutproben zusammengebracht werden, die folglich das jeweilige Antiserum enthalten.

Die Bildung von »Fällungsbögen« wurde durch Anwendung von l,5%ig^em Agar-Agar in Natriumdiäthylbarbituratpuffer von pH 8,2 oder von Agar-Agar nach Michaelis mit pH9 vorgenommen, von Antielastase des Kaninchens mit 0,1 elastolytischen Einheiten pro »Reservoir« bzw. Probe und von 1 mg pro Reservoir der erfindungsgemäßen Zusammensetzung und der Handels-Elastase.

einer erneuten Verabreichungsperiode von 10 Tagen wurden die Tiere getötet und seziert, wobei keines der entnommenen Organe Anzeichen von Entzündung, Schädigung oder Reizung zeigte.

Die Verträglichkeit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wurde bei Kaninchen der gewöhnlichen Rasse beiderlei Geschlechts untersucht. Diese Tiere wurden vor jeder Behandlung 10 Tage lang klinisch beobachtet (Wiegen und Temperaturmessung

ao alle 48 Stunden).

Die Tiere, deren Wachstum normal befunden wurde, wurden in vier Gruppen von Tieren mit einem mittleren Gewicht von 3 kg eingeteilt:

Gruppe a ... 10 Kaninchen weiblich
Gruppe b ... 10 Kaninchen weiblich zum Vergleich Gruppe c ... 10 Kaninchen männlich
Gruppe d ... 10 Kaninchen männlich zum Vergleich

Immunisierung mit Freundschem Adjuvans

	Erfindun Zusamm Kani Nr. 59	gsgemäße snsetzung nchen Nr. 60	Handels- Elastase Kaninchen Nr. 50	Zahl der Tage
ID	1mg lmg lmg lmg 5 cm³	lmg lmg lmg lmg 5 cm³	lmg lmg lmg lmg 5 cm³	0 19 20 21 26
SC	lmg lmg lmg 5 cm³	lmg lmg lmg 5 cm³	lmg lmg lmg 5 cm³	39 40 41 47
IV	lmg lmg lmg 5 cm³	lmg lmg lmg 5 cm³	lmg lmg lmg 5 cm³	61 62 63 69
IV	I 10 mg	10 mg	10 mg
PS
SC
IV
IV
PS
SC
IV
IV
PS
Gesamtmenge der injizierten Zusammen setzung

Bemerkung:
ID = intradermal,
SC = subcutan,
IV = intravenös,
PS == durch Punktieren entnommene Blutproben.

Nach der Beobachtungsperiode erhielten die Kaninchen der Gruppen a und c 8 Wochen lang täglich Elastase in zweiparenteralen Verabreichungen in einer Menge von 2000 elastolytischen Einheiten (E. E.) pro Kilogramm. Diese Dosis liegt um den Faktor 10 über der pro Kilogramm berechneten Dosis für den Menschen. Die Dosis wurde in Form einer wäßrigen Suspension verabreicht mit einem Gehalt von 6000E.E./ml.

Die Kaninchen der Vergleichsgruppen b und d erhielten in derselben Weise und während derselben Zeitdauer ein entsprechendes Volumen Wasser.
Nach Beendigung der Behandlung wurde die Verabreichung des Produktes gestoppt und die Tiere während einer Dauer von 10 Tagen wie vorher klinisch beobachtet.

Nach dieser erneuten Beobachtungszeit wurden die Kaninchen getötet und seziert. Von Proben der Leber, Niere, Darm, Magen, Herz und Lunge wurden histologische Schnittproben nach Einschließen in Paraffin angefertigt.

Während der gesamten Dauer dieser Experimente wurden alle Tiere in gleicher Weise ernährt.

Es wurde festgestellt, daß das Produkt gut vertragen wird. In der Tat verlief das Wachstum der Tiere normal, und es wurden darüber hinaus bei der Autopsie keine Anzeichen von Entzündung, Schädigung oder Reizung festgestellt.

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Untersuchungen lassen die folgenden Betrachtungen und Feststellungen über die Art der erfindungsgemäßen enzymatischen Zusammensetzung mit elastolytischer Aktivität zu:

65

1. Die Bauchspeicheldrüse von Diabetikern, die gegenüber Arteriosklerose sehr empfindlich sind, enthält wenig elastolytische Fermente.

2. Untersuchungen mit S³⁵ markierten Substanzen bestätigen, daß mit fortschreitendem Alter eine Abnahme aller Elemente des Systems (Elastase-Elastin) im menschlichen Organismus eintritt.

3. Wenn sich das Enzym im Blutkreislauf befindet, so ist sein Gehalt dort gering.

4. Es existiert im Plasma ein Inhibitor des Serums für die elastolytische Zusammensetzung.

Die erfindungsgemäß gewinnbare elastolytische Zusammensetzung kann in injizierbarer Form angewandt werden, dargeboten beispielsweise als lyophilisierter Inhalt einer Ampulle. Sie kann zur Regulierung der proteidolipidischen Umlagerung im Bereich des Gewebes der Arterien und der verschiedenen Organe, wie der Leber, benutzt werden. Sie wirkt auf den Lipidgehalt des Serums und auf die Glycoproteinwerte ein.

Auf diese Weise ist die erfindungsgemäß gewinnbare elastolytische Zusammensetzung besonders dazu geeig- so net, den enzymatischen Mangelzustand im Organismus von Arteriosklerotikern zu beheben.

Es folgt ein Beispiel für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens; alle beschriebenen Operationen wurden bei Temperaturen unter 5°C und vorzugsweise in der Gegend von —2° C ausgeführt.

10 kg zerkleinerte Bauchspeicheldrüse wurden in einem Extraktor im Gegenstrom mit Äther (oder Aceton) behandelt. Man saugt bzw. schleudert das so vorgereinigte Produkt ab und erhält nach dem Entwässern durch Gefriertrocknen 1,6 kg eines trockenen Pulvers entfetteter Bauchspeicheldrüse. Die abgetrennten Fettanteile werden in bekannter Weise zur Kontrolle in dem aus dem Extraktor entfernten Äther (bzw. Aceton) bestimmt.

Das so erhaltene Pulver wird dann in 101 M/100-Natriumacetatpuffer mit einem pH-Wert zwischen 4,8 und 5 in Suspension gebracht. Diese Suspension wird etwa 6 Stunden lang bei einer Temperatur in der Gegend von —2 bis +4⁰C umgewälzt bzw. gerührt.

In diesem Acetatpufferextrakt werden dann etwa 5,5 kg Ammoniumsulfat zur Erzielung einer Konzentration zwischen 48 und 55 Gewicht/Volumprozent gelöst. Der ausgefällte Anteil wird durch Zentrifugieren bei —2 bis +4°C abgetrennt und erneut in Wasser suspendiert. Die so erhaltene Suspension wird unter Verwendung einer üblichen Dialysemembran dialysiert. Auf diese Weise kann das infolge Übersättigung in den Niederschlag gelangte Ammoniumsulfat entfernt werden. Man erhält 0,260 kg (Trockengewicht nach Vertreiben der Wasserreste unter vermindertem Druck) einer entmineralisierten Fraktion.

Zu dieser werden 1,51 50volumprozentiger Alkohol zugegeben. Der unlösliche Anteil wird durch Filtrieren abgetrennt. Man erhält 1,321 Filtrat, das mit 1,321 80volumprozentigem Alkohol versetzt wird. Man gelangt so zu 1,3 g eines Produktes mit elastolytischer Wirksamkeit, das man durch Zentrifugieren bei einer Temperatur von —2 bis +4⁰C abtrennt.

Das erhaltene Produkt wird in einem M/100-Natriumacetatpuffer von pH 4,8 bis 5 wieder aufgelöst und die Lösung einer Gefriertrocknung unterworfen. Man erhält etwa 0,9 g gereinigtes lyophilisiertes Endprodukt mit elastolytischer Wirksamkeit.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Gewinnung eines elastolytisch wirksamen Präparates aus einem Pulver der entfetteten Bauchspeicheldrüse, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pulver mit 7₁₀₀molarer Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,8 bis 5,0 extrahiert, aus dem Extrakt die elastolytisch wirksamen Stoffe durch Zugabe von 48 bis 55 Gewichtsprozent/Volumprozent Ammoniumsulfat ausfällt, den Niederschlag abtrennt, im Wasser suspendiert und dialysiert, den so gereinigten Rückstand mit Alkohol einer Konzentration von 50 Volumprozent behandelt, die unlöslichen Proteine abfiltriert, im Filtrat mit Alkohol einer Konzentration von 80 Volumprozent einen elastolytisch wirksamen Niederschlag ausfällt und diesen abtrennt, in ¹J₁₀^oIaTeT Natriumacetat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 4,8 bis 5,0 löst und lyophilisiert, wobei alle Verfahrensschritte unterhalb von 5°C, vorzugsweise —2°C, durchgeführt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in Gegenwart von Calciumionen arbeitet.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen 909518/353