JPS58101693A - エラスタ−ゼの精製法 - Google Patents
エラスタ−ゼの精製法Info
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- JPS58101693A JPS58101693A JP56200856A JP20085681A JPS58101693A JP S58101693 A JPS58101693 A JP S58101693A JP 56200856 A JP56200856 A JP 56200856A JP 20085681 A JP20085681 A JP 20085681A JP S58101693 A JPS58101693 A JP S58101693A
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- solution
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6448—Elastases, e.g. pancreatic elastase (3.4.21.36); leukocyte elastase (3.4.31.37)
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- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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- Y10S435/814—Enzyme separation or purification
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はエラスターゼの精製法に関する３３さらに詳し
くは、エラスターゼ含有水溶液からエラスターゼを沈澱
ぜしめてエラスターゼを精製するにあたり、当該水溶液
について、電導度を３ｍ１）／ｃｒｎ以下番こまだｐＨ
を２〜５に調節することを特徴とするエラスターゼの精
製法であり、その目的は電導度およびｐＨを当該規定範
囲内に調節すること１こよりエラスターゼを高活性画分
として収得することである。
くは、エラスターゼ含有水溶液からエラスターゼを沈澱
ぜしめてエラスターゼを精製するにあたり、当該水溶液
について、電導度を３ｍ１）／ｃｒｎ以下番こまだｐＨ
を２〜５に調節することを特徴とするエラスターゼの精
製法であり、その目的は電導度およびｐＨを当該規定範
囲内に調節すること１こよりエラスターゼを高活性画分
として収得することである。
エラスターゼの製造方法として、−・般には、まずブタ
の膵臓を原料として膵臓中に含まれるエラスターゼ前駆
物質を適当な方法により活性化し。
の膵臓を原料として膵臓中に含まれるエラスターゼ前駆
物質を適当な方法により活性化し。
硫安公開処理あるいは有機溶媒処理等をおこなっていっ
たんエラスターゼ含有粗製物を得て１次にここに得られ
たエラスターゼ含有粗製物にリン酸緩衝液等を加えて粗
製物中のエラスターゼを抽出し、硫安分割後に結晶化せ
しめるというごとき方法が従来から知られて米た。しが
しながら、こうした従来方法において特に問題となる点
は主としテエラスターゼ含有粗製物からエラスターゼを
精製する段階にあり２例えば、当段階においては多量の
硫安を使用しなければならないということ。
たんエラスターゼ含有粗製物を得て１次にここに得られ
たエラスターゼ含有粗製物にリン酸緩衝液等を加えて粗
製物中のエラスターゼを抽出し、硫安分割後に結晶化せ
しめるというごとき方法が従来から知られて米た。しが
しながら、こうした従来方法において特に問題となる点
は主としテエラスターゼ含有粗製物からエラスターゼを
精製する段階にあり２例えば、当段階においては多量の
硫安を使用しなければならないということ。
あるいはまた多量の硫安を消費して精製をおこな−２た
割には得られる硫安分画物のエラスターゼ活性は低く、
つまりいまだ多量の夾雑物を含んだまま沈澱していると
いうことなどの諸点が指摘されるのである。従ってエラ
スターゼの精製方法については簡便単純なる操作によっ
て高活性エラスターゼ画分を得る技術が課題として残さ
れているのである。かかる事情にかんがみ２本発明者は
簡便単純なる操作によりエラスターゼを精製する方法に
ついて種々検討をおこない、その結果、結晶化にあたり
、電導度およびｐＨを所定の範囲内に調節することによ
って所期の目的が達成されることを見出し２本発明を完
成した。
割には得られる硫安分画物のエラスターゼ活性は低く、
つまりいまだ多量の夾雑物を含んだまま沈澱していると
いうことなどの諸点が指摘されるのである。従ってエラ
スターゼの精製方法については簡便単純なる操作によっ
て高活性エラスターゼ画分を得る技術が課題として残さ
れているのである。かかる事情にかんがみ２本発明者は
簡便単純なる操作によりエラスターゼを精製する方法に
ついて種々検討をおこない、その結果、結晶化にあたり
、電導度およびｐＨを所定の範囲内に調節することによ
って所期の目的が達成されることを見出し２本発明を完
成した。
次に本発明を説明する。
本発明に係るエラスターゼ含有水溶液とは、哺乳動物の
膵臓に対し、適当な方法により活性化処理をおこなった
後のものであればいかなる段階における水溶液であって
もよい。例えば、活性化後。
膵臓に対し、適当な方法により活性化処理をおこなった
後のものであればいかなる段階における水溶液であって
もよい。例えば、活性化後。
粗抽出し、有機溶媒処理をおこなって得られたエラスタ
ーゼ含有粗製物に水またはリン酸緩衝液を加えて溶解し
た水溶液、あるいは当該水溶液を清澄１４過して得られ
るｃ液等を挙げることができる。
ーゼ含有粗製物に水またはリン酸緩衝液を加えて溶解し
た水溶液、あるいは当該水溶液を清澄１４過して得られ
るｃ液等を挙げることができる。
本発明方法の一つの要件は電導度を３ｒｎＵ／ｃｎｉ以
Ｆとすることであり、この要件を満足させるために具体
的には限外１過、イオン交換、逆浸透等の操作をおこな
うが、限外濾過がもっとも好適である。
Ｆとすることであり、この要件を満足させるために具体
的には限外１過、イオン交換、逆浸透等の操作をおこな
うが、限外濾過がもっとも好適である。
後記実験結果より明らかなどと（、電導度が３ｍＱ／ｃ
ｍ以上においてはエラスターゼの沈澱生成が悪く、高活
性エラスターゼ画分として生成せしめるのが困難である
。
ｍ以上においてはエラスターゼの沈澱生成が悪く、高活
性エラスターゼ画分として生成せしめるのが困難である
。
本発明方法の他の要件はｐＨを２〜５とすることであり
、この要件を満足させるためにエラスターゼ含有水溶液
に酢酸、塩酸等を加えればよいが、酢酸が特に好ましい
。後記実験結果より明らかなごと＜ ｐＨが５以下にお
いて急速に沈澱生成が進み。
、この要件を満足させるためにエラスターゼ含有水溶液
に酢酸、塩酸等を加えればよいが、酢酸が特に好ましい
。後記実験結果より明らかなごと＜ ｐＨが５以下にお
いて急速に沈澱生成が進み。
特にｐＨが３〜４．５において十分に好ましい結果を与
えることができる。
えることができる。
本発明方法は具体的にはエラスターゼ含有水溶液に対し
限外１過および酢酸添加等をおこない、水溶液について
その電導度およびｐＨを規定の範囲内に設定し、かくし
て水溶液中に存するほとんどのエラスターゼ、例えば９
０％以−ｔｚのものを高活性画分として生成せしめる方
法である。従って本発明を実施した場合には、水溶液中
に依然として残存するエラスターゼは少量となり２例え
ば１０％以下となる。一般に電導度が高い場合には、ｐ
Ｈは低くする必要があり２例えば電導度カ月、 ２ ｍ
ｕ／ｃｍである場合には、 ｐＨは４．８以下であれば
十分であるが。
限外１過および酢酸添加等をおこない、水溶液について
その電導度およびｐＨを規定の範囲内に設定し、かくし
て水溶液中に存するほとんどのエラスターゼ、例えば９
０％以−ｔｚのものを高活性画分として生成せしめる方
法である。従って本発明を実施した場合には、水溶液中
に依然として残存するエラスターゼは少量となり２例え
ば１０％以下となる。一般に電導度が高い場合には、ｐ
Ｈは低くする必要があり２例えば電導度カ月、 ２ ｍ
ｕ／ｃｍである場合には、 ｐＨは４．８以下であれば
十分であるが。
１！導度が２ｍＵ／ｃｍである場合には、 ｐＨは４．
５以下であるのが望ましい。同様に電導度が３ ｍ（Ｊ
／ｃｍである場合には、ｐＨは３以下であるのが望まし
い。
５以下であるのが望ましい。同様に電導度が３ ｍ（Ｊ
／ｃｍである場合には、ｐＨは３以下であるのが望まし
い。
ｐＨが低過ぎる場合にはエラスターゼ自体が変性するの
で、ｐＨは２以上であるのが好ましい。
で、ｐＨは２以上であるのが好ましい。
本発明方法によって得られるエラスターゼ沈澱物はその
ままＰ取し、真空乾燥すれば乾燥物として収得すること
ができる。しかしさらに高純度化したエラスター・ゼ結
晶が求められる場合には１例えば特公昭５０−２１５５
７公報に記載されるごとき方法を実施すればよい。すな
わち２本発明方法によって得りっれるエラスターゼ沈澱
物をｒ取し、再び溶解して例えばｐＨ７の水溶液として
放置し、生成する結晶を遠心分離し凍結乾燥するごとき
操作をおこなえばよい。しかし当該精製方法は高純度エ
ラスターゼが特に要求される場合におこなわれる方法で
あり９本発明により得られるエラスターゼ沈澱物によっ
ても使用目的が十分に満足され得るような場合には必要
のない方法となる。従って９本発明は当該精製方法によ
って限定されるものではない。
ままＰ取し、真空乾燥すれば乾燥物として収得すること
ができる。しかしさらに高純度化したエラスター・ゼ結
晶が求められる場合には１例えば特公昭５０−２１５５
７公報に記載されるごとき方法を実施すればよい。すな
わち２本発明方法によって得りっれるエラスターゼ沈澱
物をｒ取し、再び溶解して例えばｐＨ７の水溶液として
放置し、生成する結晶を遠心分離し凍結乾燥するごとき
操作をおこなえばよい。しかし当該精製方法は高純度エ
ラスターゼが特に要求される場合におこなわれる方法で
あり９本発明により得られるエラスターゼ沈澱物によっ
ても使用目的が十分に満足され得るような場合には必要
のない方法となる。従って９本発明は当該精製方法によ
って限定されるものではない。
以下に記載する実験例をもって本発明の詳細な説明する
。
。
実験例
試料および方法
実施例１記載のごとくにして得られたエラスターゼ含有
粗製物に１０倍容の水を加えて溶解し。
粗製物に１０倍容の水を加えて溶解し。
清澄濾過したものをエラスターゼ含有水溶液の試料とし
た。試料について電導度が５ ｍＵ／ｃｍ。
た。試料について電導度が５ ｍＵ／ｃｍ。
３ｍＵ／ｃｍ、 ２ｍｔＪ／ｃｍ、 １２ｍてＪ／
ｃｍとなるように限外濾過をおこないさらに濃酢酸を加
えて数種類のｐＨに調節し、試料および調節後１時間経
過後における水溶液についてエラスターぜ活性を測定し
、活性残存率を求めた。
ｃｍとなるように限外濾過をおこないさらに濃酢酸を加
えて数種類のｐＨに調節し、試料および調節後１時間経
過後における水溶液についてエラスターぜ活性を測定し
、活性残存率を求めた。
結果
結果を図１に示す。図１はｐＨと活性残存率との関係を
示すグラフであり、Ｏ印線は電導度が５ｍ７Ｊ／ａｍで
ある場合、■印線は同３ｍＵ／ｃｍである場合、・印線
は同２ｍ（Ｊ／ｃｍである場合、△印線は同１．２ｍ（
４ｃｍである場合における関係を示す。図１よりエラス
ターゼ含有水溶液について電導度を３ｍＵ／ｃｍ以下に
調節し、 ｐＨを５以下。
示すグラフであり、Ｏ印線は電導度が５ｍ７Ｊ／ａｍで
ある場合、■印線は同３ｍＵ／ｃｍである場合、・印線
は同２ｍ（Ｊ／ｃｍである場合、△印線は同１．２ｍ（
４ｃｍである場合における関係を示す。図１よりエラス
ターゼ含有水溶液について電導度を３ｍＵ／ｃｍ以下に
調節し、 ｐＨを５以下。
望ましくは４．５以下に調節することによって。
水溶液中のエラスターゼの沈澱生成が進み、沈澱物とし
て収得することができることが判明する。
て収得することができることが判明する。
以下に記載する実施例をもって本発明をさらに詳細に説
明する。
明する。
実施例１
ブタの膵臓１ｋｇをミンチし、 ２００ｍ１の水と７ｇ
のバンクレアチンを加え、さらに５ｍｌの４０％水酸化
す） ＩＪウム水溶液を加えて激しく撹拌した後。
のバンクレアチンを加え、さらに５ｍｌの４０％水酸化
す） ＩＪウム水溶液を加えて激しく撹拌した後。
１７°Ｃに２時間放置して活性化した。これにアセトン
を加えて７０ Ｖ／Ｖ％とし１時間撹拌した。アセトン
層を除き、沈澱物に１．２ｅの水を加えて２時間４’ｌ
拌シ、次いで１０ｇのハイフロス−パーセルラ加え、粗
ｆ’過した。ト液１，８ｅを得て、これにアセトンを加
えて５０ＶＮ％とし、生じた沈澱物をｆ１取した。沈澱
物はさらに１．５１のアセトンで３回洗浄し、真空乾燥
し、エラスターゼ含有粗製物を得た。
を加えて７０ Ｖ／Ｖ％とし１時間撹拌した。アセトン
層を除き、沈澱物に１．２ｅの水を加えて２時間４’ｌ
拌シ、次いで１０ｇのハイフロス−パーセルラ加え、粗
ｆ’過した。ト液１，８ｅを得て、これにアセトンを加
えて５０ＶＮ％とし、生じた沈澱物をｆ１取した。沈澱
物はさらに１．５１のアセトンで３回洗浄し、真空乾燥
し、エラスターゼ含有粗製物を得た。
エラスターゼ含有粗製物５［’Ｊｇに水５００ｍ１を加
えて２時間経過後、清澄ｅ過し、エラスターゼ含有水溶
液５００ ｍｌを得た。これをさらに限外を過し分子量
１０，０００以下のものを除去して濃縮液１００ｍ１を
得た。これに水を加えて５００ｍ１とした。このものの
電導度は１．６ ｍＯ／ｃｍであり、濃酢酸１．Ｑｍｌ
を加えてｐＨ４，５に調節した。１時間放置後、生成し
た沈澱を１取し、再びｐＨ７，Ｏの水溶液として３日間
放置し、生成した結晶を遠心分離し、さらに凍結乾燥し
て結晶１２ｇを得た。エラスチン分解油゛ｒト１５０単
位／ｍｇ。
えて２時間経過後、清澄ｅ過し、エラスターゼ含有水溶
液５００ ｍｌを得た。これをさらに限外を過し分子量
１０，０００以下のものを除去して濃縮液１００ｍ１を
得た。これに水を加えて５００ｍ１とした。このものの
電導度は１．６ ｍＯ／ｃｍであり、濃酢酸１．Ｑｍｌ
を加えてｐＨ４，５に調節した。１時間放置後、生成し
た沈澱を１取し、再びｐＨ７，Ｏの水溶液として３日間
放置し、生成した結晶を遠心分離し、さらに凍結乾燥し
て結晶１２ｇを得た。エラスチン分解油゛ｒト１５０単
位／ｍｇ。
実施例２
ブタの膵臓１０ｋｇをミンチし、１０ｅの水と７０ｇの
パンクレアチンを加え、さらに５０ｍ１の４０９６水酸
化す） ＩＪウム水溶液を加えて撹拌した後、 ３５’
Ｃで２時間放置して活性化した。次いでアセトンを加え
て３０ＶＮ％にした後、 １００ｇのハイフロス−パ
ー七ルを加えて粗ｄ４過した。相ｅ過液にアセトンを加
えて６０Ｖ＃％にし、生じた沈澱物をｆ取した。
パンクレアチンを加え、さらに５０ｍ１の４０９６水酸
化す） ＩＪウム水溶液を加えて撹拌した後、 ３５’
Ｃで２時間放置して活性化した。次いでアセトンを加え
て３０ＶＮ％にした後、 １００ｇのハイフロス−パ
ー七ルを加えて粗ｄ４過した。相ｅ過液にアセトンを加
えて６０Ｖ＃％にし、生じた沈澱物をｆ取した。
沈澱物はさらに１５１のアセトンで３回洗い、真空乾燥
し、エラスターゼ含有粗製物を得た。エラスターゼ含有
粗製物１００ｇに１ｅの水を加えて２時間経過後、？ｌ
Ｉ澄１過し、エラスターゼ含有水溶液１ｅを得た。限外
ｒ過し２分子量１０，０００以下を除去して濃縮液１５
０ｍ１を得た。これに水を加えてｌ’とした。このもの
の電導度は１．２ ｍｕ／ｃｍであり。
し、エラスターゼ含有粗製物を得た。エラスターゼ含有
粗製物１００ｇに１ｅの水を加えて２時間経過後、？ｌ
Ｉ澄１過し、エラスターゼ含有水溶液１ｅを得た。限外
ｒ過し２分子量１０，０００以下を除去して濃縮液１５
０ｍ１を得た。これに水を加えてｌ’とした。このもの
の電導度は１．２ ｍｕ／ｃｍであり。
濃酢酸２ ｍｌを加えてｐＨ４，５に調節した。１時間
経過後、生成した沈澱を１取し、再びｐＨ７，０の水溶
液として３日間放置し、生成した結晶を遠心分離し、さ
らに凍結乾燥して結晶２．５ｇを得た。エラスチン分解
活性１５０単位／ｍｇ０
経過後、生成した沈澱を１取し、再びｐＨ７，０の水溶
液として３日間放置し、生成した結晶を遠心分離し、さ
らに凍結乾燥して結晶２．５ｇを得た。エラスチン分解
活性１５０単位／ｍｇ０
図１は実験例の結果の項に記載の図１に相応し。
ｐＨとエラスターゼ活性残存率との関係を四段階に異な
る電導度の場合について示したグラフである。 特許出願人 工−ザイ株式倉社
る電導度の場合について示したグラフである。 特許出願人 工−ザイ株式倉社
Claims (2)
- （１）エラスターゼ含有水溶液からエラスターゼを沈澱
せしめてエラスターゼを精製するにあたり、当該水溶液
について電導度を３ｍＱ／ ｃｍ以下にまたｐＨを２〜
５に調節することを特徴とするエラスターゼの精製法 - （２）限外ｉｌ″Ｉ過により電導度を３．ｍ？Ｊ／ａｍ
以下に調節する特許請求の範囲第１項記載のエラスター
ゼの精製法
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56200856A JPS58101693A (ja) | 1981-12-15 | 1981-12-15 | エラスタ−ゼの精製法 |
| US06/446,079 US4458018A (en) | 1981-12-15 | 1982-12-01 | Process for purifying elastase |
| KR8205414A KR880001120B1 (ko) | 1981-12-15 | 1982-12-03 | 엘라스타제의 정제 방법(Elastase의 精製方法) |
| AT82111494T ATE18777T1 (de) | 1981-12-15 | 1982-12-10 | Verfahren zum reinigen von elastase. |
| DE8282111494T DE3270177D1 (en) | 1981-12-15 | 1982-12-10 | Process for purifying elastase |
| EP82111494A EP0081831B1 (en) | 1981-12-15 | 1982-12-10 | Process for purifying elastase |
| CA000417621A CA1190495A (en) | 1981-12-15 | 1982-12-14 | Process for purifying elastase |
| MX10196082U MX7445E (es) | 1981-12-15 | 1982-12-15 | Procedimiento biotecnologico para la purificacion de elastasa |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56200856A JPS58101693A (ja) | 1981-12-15 | 1981-12-15 | エラスタ−ゼの精製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS58101693A true JPS58101693A (ja) | 1983-06-16 |
| JPS6356798B2 JPS6356798B2 (ja) | 1988-11-09 |
Family
ID=16431354
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56200856A Granted JPS58101693A (ja) | 1981-12-15 | 1981-12-15 | エラスタ−ゼの精製法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4458018A (ja) |
| EP (1) | EP0081831B1 (ja) |
| JP (1) | JPS58101693A (ja) |
| KR (1) | KR880001120B1 (ja) |
| AT (1) | ATE18777T1 (ja) |
| CA (1) | CA1190495A (ja) |
| DE (1) | DE3270177D1 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60207583A (ja) * | 1984-03-29 | 1985-10-19 | Sankyo Co Ltd | ブタ・膵臓エラスタ−ゼ |
| JPH0673456B2 (ja) * | 1986-04-26 | 1994-09-21 | 三共株式会社 | ヒト・膵臓エラスタ−ゼ▲ｉ▼ |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE546811A (ja) * | ||||
| GB1076776A (en) * | 1963-10-10 | 1967-07-19 | Rolland Lab A | Process for the extraction of elastase |
| JPS5261287A (en) * | 1975-11-08 | 1977-05-20 | Eisai Co Ltd | Preparation of pancreatic elastase |
-
1981
- 1981-12-15 JP JP56200856A patent/JPS58101693A/ja active Granted
-
1982
- 1982-12-01 US US06/446,079 patent/US4458018A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-12-03 KR KR8205414A patent/KR880001120B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1982-12-10 EP EP82111494A patent/EP0081831B1/en not_active Expired
- 1982-12-10 DE DE8282111494T patent/DE3270177D1/de not_active Expired
- 1982-12-10 AT AT82111494T patent/ATE18777T1/de not_active IP Right Cessation
- 1982-12-14 CA CA000417621A patent/CA1190495A/en not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0081831A2 (en) | 1983-06-22 |
| JPS6356798B2 (ja) | 1988-11-09 |
| EP0081831B1 (en) | 1986-03-26 |
| EP0081831A3 (en) | 1984-08-08 |
| DE3270177D1 (en) | 1986-04-30 |
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