DE2734150A1 - Verfahren zur gewinnung von human- lysozym - Google Patents
Verfahren zur gewinnung von human- lysozymInfo
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Description
u.Z.: M 290
Case: A 2563-02
THE GREEN CROSS CORPORATION
Osaka, Japan
"Verfahren zur Gewinnung von Human-Lysozym"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Human-Lysozym
aus Albuminfraktionen von menschlichem Blut.
"Lysozym" ist ein allgemeiner Ausdruck für Enzyme, die die
Hydrolyse von in Zellwänden von Mikroorganismen auftretenden Mucopolysacchariden katalysieren und diese dabei auflösen.
In Albumin aus Geflügeleiern beträgt der Lysozymgehalt 3 Prozent, bezogen auf das Gesamtprotein. Deshalb werden Lysozympräparate
vorwiegend aus ELweiss von Hühnereiern hergestellt. Andererseits findet sich Lysozym auch in menschlichen Körperflüssigkeiten,
wie Tränen, Nasenschleim, Blut und Urin. Mit Ausnahme der Tränen ist aber dabei der Lysozymgehalt sehr gering. Ein höherer
Lysozymgehalt findet sich in Körperflüssigkeiten von Leukämiepatienten. 1967 wurde erstmals Human-Lysozym in kristalliner
809835/OtV* OBtGINALlNSPECTBJ
<ο
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Form aus Urin von Patienten mit monozytärer Leukämie durch
Adsorption an Bentonit isoliert; vgl. Osserman, Science, Bd.
(1967), S. 1536 bis 1537.
Da aus Hühnereiweiss isoliertes Lysozym für den menschlichen
Körper ein heterogenes Protein darstellt, ist dessen Anwendung und Verabreichungsart bei der Verwendung als Arzneistoff in der
Humanmedizin Beschränkungen unterworfen. Ausserdem beträgt dessen enzymatische Aktivität nur etwa 1/2 bis 1/3 im Vergleich
von Human-Lysozym. Jedoch ist die Menge an Lysozym, die in zur Verfügung stehenden Körperflüssigkeiten oder Geweben von
normalen Menschen zur Verfugung steht, sehr gering. Beispielsweise
beträgt der Gehalt in normalem menschlichem Blut nur 2 bis 10 ppm. Zur Zeit steht ein wirtschaftlich arbeitendes und
in grösserem Massstab durchführbares Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Lysozym aus normalem menschlichem Blut nicht
zur Verfügung. Eine Verwendung von Tränen, Nasenschleim oder Urin von Leukämiepatienten als Quelle zur Lysozymgewinnung
kommt nicht in Frage.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein wirksames Verfahren zur Abtrennung
und Reinigung von Lysozym aus menschlichem Blut zur Verfügung zu stellen.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass Lysozym in der Albuminfraktion von Blut angereichert werden kann. Erfindungsgemäss
lässt sich Lysozym aus der Albuminfraktion nach einem einfachen Verfahren isÄÜecon* Λ . ,_
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Beim erfindungsgemässen Verfahren zur Gewinnung von Human-Lysozym werden die Komponenten von menschlichem Blut unter
Ausnutzung von Löslichkeitsunterschieden fraktioniert. Die dabei erhaltene Albuminfraktion wird mit einem schwach sauren
Kationenaustauscher in Kontakt gebracht, wobei das in der Albuminfraktion enthaltene Lysozym adsorbiert wird. Das adsorbierte
Lysozym wird sodann desorbiert und gewonnen.
Im erfindungsgemässen Verfahren wird als menschliches Blut vorzugsweise menschliches Normalblut verwendet, wozu auch Blut
in Plazentagewebe und retroplazentales Blut gehört. Es ist bekannt, dass die Albuminfraktion aus derartigem menschlichem
Blut durch Fraktionierung unter Ausnutzung von Löslichkeitsunterschieden abgetrennt werden kann. Als derartige Verfahren
kommen hauptsächlich die Fraktionierung mit Ammoniumsulfat oder die Fraktionierung mit Alkohol bei niedrigen Temperaturen
gemäss Cohn in Frage. Bei der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat
wird die Albuminfraktion im Blut in Form von Niederschlägen gesammelt, die sich bei einer Sättigung mit Ammoniumsulfat
in einem Konzentrationsbereich von 45 bis 75 Prozent bilden.
Bei der Alkoholfällung bei niedrigen Temperaturen gemäss Cohn wird die Albuminfraktion im Blut in den Fraktionen IV-1 und V
gewonnen. Diese Fraktionen werden gereinigt und als Albuminpräparate auf den Markt gebracht. In der Literatur sind eine
Anzahl von Verfahren beschrieben, die eine Modifikation oder Verbesserung dieser Fraktionierungs- und Reinigungsverfahren
betreffen. Hier sei auf folgende Literaturstellen verwiesen:
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(1) Aus Plasma oder Serum:
Verfahren, bei dem der Überstand der Fraktion IV-1 gemäss Cohn nochmals der Fraktionierung mit Äthanol bei einer
Konzentration von 25 bis 38 Prozent unterzogen wird (vgl. US-PS 2 958 628); Verfahren, bei dem Proteinverunreinigungen,
wie Lipoprotein, aus der Fraktion IV-1 unter Verwendung von organischen Säuren und Acrinol entfernt werden (vgl.
US-PS 4- 017 470); Verfahren, bei dem Albumin aus dem Niederschlag
der Fraktion IV-4- gewonnen wird (vgl. US-PS 3 850 903);
Verfahren, bei dem eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an Albumin mit einer Fettsäure versetzt wird, das erhaltene
Gemisch erwärmt wird und anschliessend gereinigtes Albumin
gewonnen wild (vgl. US-PSen 2 765 299 und 2 705 230).
(2) Aus Plazenta:
Ein Verfahren, bei dem ein flüssiger Plazentaextrakt zur Entfernung von Verunreinigungen nacheinander mit Citronensäure,
Phenol und Natriumcarbonat extrahiert und anschliessend Albumin gewonnen wird (vgl. JA-AS 7762/1973); ein Verfahren,
bei dem ein flüssiger Plazentaextrakt mit Ammoniumsulfat fraktioniert wird, diese Fraktion mit Buttersäure versetzt
und erhitzt wird und anschliessend das Albumin aus dem überstand gewonnen wird (vgl. JA-AS 16041/1968); Verfahren,
bei dem im letztgenannten Verfahren anstelle von Buttersäure Alkohol und ein Salz einer Fettsäure verwendet wird
(vgl. US-PS 3 926 939); Verfahren, bei dem statt dessen Mandelsäure oder Capronsäure und Äthylendiamintetraessigsäure
verwendet werden (vgl. JA-OS 88621/1976); Verfahren,
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bei dem statt dessen Mandelsäure verwendet wird (vgl. JA-AS 40132/1976); Verfahren, bei dem statt dessen Caprylsäure
und Chloroform verwendet wird (vgl. GB-PS 1 441 752).
Sämtliche vorerwähnten Verfahren lassen sich erfindungsgemäss
zur Herstellung der Albuminfraktion anwenden. Bei Verwendung von Plasma oder Serum als Rohmaterial werden vorzugsweise die
Verfahren der US-PSen 4 017 470 und 2 958 628 angewendet. Bei Verwendung von Plazenta ist es empfehlenswert, ein Verfahren
anzuwenden, bei dem die Albuminfraktion aus Plazenta zur Eatfernung
von Proteinverunreinigungen in Gegenwart einer organischen Säure mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen erhitzt wird. Vorstehend
sind Literaturstellen für derartige Verfahren angegeben.
Nachstehend wird eine Zusammenfassung der Verfahren der US-PSen 4 017 47Ο und 2 958 628 gegeben:
"Verfahren zur Herstellung von wärmestabilen Plasmaproteinlösungen
ohne blutdrucksenkende Wirkung, wobei destilliertes Wasser zu dem Brei- IV-1, einer bei der Fraktionierung von
Plasma mit kaltem Äthanol gemäss Cohn erhaltenen Fraktion, zur
Extraktion von wasserlöslichen Proteinen aus diesem Brei versetzt und die im Gemisch enthaltenen Feststoffe durch Zentrifugieren
unter Bildung eines Extrakts mit einem Gehalt an wasserlöslichen Proteinen zentrifugiert, den erhaltenen Extrakt bei einem pH-Wert
von 4,5 bis 5i5 bei 50 bis 650C mit einer organischen
Säure mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen bis zu einer Endkonzentration der organischen Säure von 2 bis 6 Prozent (Gewicht/Volumen)
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behandelt, durch Filtrieren oder Zentrifugieren im Extrakt
erhaltene Lipo- und Glycoproteine als Niederschläge entfernt, den erhaltenen Überstand mit 0,2 bis 3»0 g pro Liter Überstand
2-Äthoxy-6,9-diaminoacridin-lactat versetzt, das Gemisch bei Eaumtemperatur oder niedrigeren Temperaturen stehenlässt
und die restlichen Lipoproteine durch Fällung, wobei eine Trübung des Überstands entsteht, entfernt, und anschliessend
im erhaltenen Überstand enthaltene blutdrucksenkende Substanzen durch Adsorption mit einem anorganischen Adsorptionsmittel oder
einem Kationenaustauscher entfernt".
" Verfahren zur Fraktionierung von menschlichem Plasmaprotein durch fraktionierende Fällung mit kaltem Äthanol nach vorheriger
Entfernung von sämtlichen koagulierenden Bestandteilen und dem gesamten jT-Globulin, wobei ein Gemisch aus Albumin, α-Globulin
und ß-Globulin bei einer Temperatur zwischen -2°C und dem
Gefrierpunkt der Lösung, einer Ionenstärke von weniger als 0,12 und einer Proteinkonzentration von mehr als 2,2 Prozent bei
einer Äthanolkonzentration von 25 bis 38 Prozent bei einem pH-Wert
von 4,3 bis 4,7 gefällt wird".
Als Beispiel für ein bevorzugtes Verfahren bei der Verwendung von Plazenta wird nachstehend eine Zusammenfassung des Verfahrens
der JA-AS 40 132/76 gegeben:
" Verfahren zur Gewinnung von wärmestabilem, menschlichem Plasmaprotein aus Plazenta oder retroplazentalem Blut des
Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass man als Rohmaterial Plazenta oder retroplazentales Blut vom Menschen verwendet,
die bzw. das unmittelbar nach seiner Gewinnung gefroren oder verschlossen worden ist, aus einer aus dem Rohmaterial fraktionierten
Lösung von Blutbestandteilen das Jf-Globulin unter
Gewinnung eines Überstands abtrennt, den Überstand mit fester Mandelsäure oder einer Lösung derselben bis zu einer Säurekonzentration
von 2,5 bis 5»0 Prozent versetzt, den pH-Wert
der Reaktionslösung im Bereich von 4,5 bis 5»5 hält, die
Lösung auf 58 bis 62°C erwärmt, sämtliche gebildete Niederschläge entfernt und die gewünschte Substanz aus dem Überstand
gewinnt".
Im erfindungsgemässen Verfahren können mit Erfolg die vorerwähnten
Albuminfraktionen oder daraus hergestellte gereinigte Präparate eingesetzt werden. Es geht auf den erfindungsgemässen
Befund zurück, dass während der gesamten Fraktionierung des Bluts aufgrund von Löslichkeitsunterschieden das Lysozym sich
wie Albumin verhält und somit beide Bestandteile in den Albuminfraktionen angereichert werden. Dieses Verhalten von Lysozym
wurde bisher nicht beschrieben. Das angereicherte Lysozym wurde bisher als Verunreinigung in Albuminpräparaten übersehen.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von Lysozym
umfasst die Fraktionierung von menschlichem Plasma, menschlichem Serum oder Blut aus menschlicher Plazenta, wie ein Extrakt
aus menschlicher Plazenta oder menschliches retroplazentales Blut, um Albuminfraktionen daraus unter Ausnutzung von Löslichkeit
sunterschieden zu isolieren. Die isolierten Albuminfraktionen
werden sodann, wie bereits erwähnt, mit einem schwach sauren
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Kationenaustauscher in Kontakt gebracht, wobei das Lysozym am
Austauscher adsorbiert wird. Schliesslich wird das adsorbierte Lysozym desorbiert und gewonnen.
Bei der Kombination des erfindungsgemässen Verfahrens mit einem
Verfahren zur Herstellung von Albuminpräparaten lässt sich Lysozym zusammen mit einem weiter gereinigten Albumin erhalten.
Demgemäss wird als Ausgangsmaterial vorzugsweise eine gereinigte Lösung einer Albuminfraktion verwendet, die noch nicht sterilisiert,
filtriert, getrocknet und zu einem Präparat verarbeitet worden ist. Die Lösung enthält Albumin mit einem Reinheitsgrad
von 50 bis 97 Prozent, bezogen auf das Gesamtprotein.
Als schwach saurer Kationenaustauscher wird vorzugsweise Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose), Phosphocellulose
(p-Cellulose) und Carboxymethyl-Sephadex (CM-Sephadex, dlh.
vernetztes Dextran mit Carboxymethylgruppen der Firma Pharmacia Co., Schweden) verwendet. Die Lösung wird mit dem Kationenaustauscher bei einem pH-Wert von 5 bis 10 und vorzugsweise
von 5 bis 9 in Kontakt gebracht. Die pH-Werte der Lösung mit
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der Albuminfraktion und des Kationenaustauschers werden vorzugsweise
unter Verwendung eines Puffers, beispielsweise 0,02 m Phosphatpuffer, auf den vorerwähnten Bereich eingestellt.
Der Kontakt kann durchgeführt werden, indem man entweder die Bestandteile einfach vermischt oder die Lösung mit der Albuminfraktion
über eine mit dem Kationenaustauscherharz gepackte Säule gibt. Dabei wird das Lysozym in der Lösung vollständig am
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KationenauRtauscher adsorbiert, während das Albumin in weiter gereinigtem Zustand in der Lösung verbleibt. Der Kationenaustauscher mit dem adsorbierten Lysozym wird vorzugsweise
mit dem vorstehend erwähnten Puffer gewaschen, wonach das Lysozym vom Kationenaustauscher auf übliche Weise mit einem
ELutionsmittel, wie einer alkalischen Lösung (pH-Wert 10 bis 12),
einer hochkonzentrierten Lösung eines anorganischen neutralen Salzes (beispielsweise eine etwa 5 bis 15prozentige Lösung
von Natriumchlorid) oder einer wässrigen Lösung eines anorganischen neutralen Salzes mit einer Konzentration von etwa
5 bis 15 Prozent und einem pH-Wert von 8 bis 10, eluiert wird.
Mit Ausnahme der vorerwähnten Bedingungen bestehen bei der Adsorption und Desorption keine speziellen Beschränkungen.
Die Temperatur kann im Bereich der Umgebungstemperatur von 3 bis 200C liegen. Die Menge des schwach sauren Kationenaustauschers
beträgt im allgemeinen etwa 30 bis 100 ml pro 1 Liter
Ausgangslösung mit einem Gehalt an 3 bis 10 Prozent (Gewicht/
Volumen) Albumin.
Die Lysozymkonzentration im ELuat wird durch Messen der Proteinkonzentration
bei 280 nm oder turbidimetrisch (vgl. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Bd. 119 (1965), S. 384 bis 386) unter
Berücksichtigung des Lysozymtiters bestimmt. Das ELuat wird 10 bis 20 Stunden gegen Wasser dialysiert, bis die anorganischen
Salze praktisch ganz entfernt sind. Anschliessend wird der pH-Wert auf 5,0 bis 6,0 eingestellt. Gegebenenfalls wird
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10 Stunden auf 6O0C erhitzt, um Hepatitisviren zu inaktivieren.
Lysozym ist bei erhöhten Temperaturen dieser Grössenordnung
beständig. Anschliessend wird sterilisiert und filtriert. Man erhält eine Lösung eines injizierbaren Lysozympräparats.
Schliesslich kann die Lösung zu einem festen Vorratspräparat von Lysozym gefriergetrocknet werden.
Das auf diese Weise erhaltene Lysozympräparat weist eine Reinheit von 60 Prozent oder mehr auf und kann direkt zur
intravenösen, intraarteriellen oder intramuskulären Injektion verwendet werden. Selbstverständlich kann das Präparat dem
menschlichen Körper auch in Form eines Collyriums, eines Aerosols oder eines oralen Präparats verabfolgt werden. Es kann
zu beliebigen Zeitpunkten ohne Auftreten von allergischen Reaktionen in Dosen von 0,1 bis 20 mg Titer/kg Körpergewicht bei
Verwendung als Injektionspräparat und in Dosen von 0,2 bis 10 mg Titer/ml, bei Verwendung"als künstliche Tränen'oder Collyrium verabfolgt
werden.
Durch zusätzliche Reinigung des auf die vorstehende Weise erhaltenen
Lysozympräparats ist es möglich, kristallines Lyso-
Lysozymlösung zym zu erhalten. Dabei wird die/der Gelfiltration an vernetztem
Dextran, beispielsweise Sephadex G-50 der Firma Pharmacia Co., Schweden, bei einem pH-Wert von 5 bis 6 unterworfen, wodurch
die Reinheit des Lysozyms bis auf 90 Prozent erhöht wird.
Anschliessend wird die gereinigte Lösung gegen Natriumchloridlösung (pH-Wert 4 bis 5) dialysiert. Die dialysierte Lösung
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wird schließlich eingeengt. Fig. 1 zeigt eine photographische Abbildung in 400-facher Vergrösserung eines auf diese Weise
erhaltenen Kristalls.
Nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestelltes Human-Lysozym
kann, auf oralem Wege an Patienten verabfolgt werden, die an Krankheiten leiden, die mit herkömmlichen Lysozympräparaten
aus Hühnereiweiss behandelt werden können. Ferner kann das erfindungsgemäss hergestellte Lysozympräparat auch durch
Injektion verabfolgt werden. Somit weisen die erfindungsgemässen Präparate einen vergrösserten Anwendungsbereich auf. Beispielsweise
kann man das Lysozym auf einen bakteriellen Eiterherd einwirken lassen, indem man es direkt in den Herd oder über
die Arterie injiziert. Ferner ist es möglich, dass asthmatische Patienten die erfindungsgemässen Lysozympräparate in hohen
Konzentrationen inhalieren, um Sputum, das bei einem Asthmaanfall die Bronchiolen verstopft, zu beseitigen. Bei einem
derartigen Anfall kann eine Besserung ohne allergische Reaktionen erzielt werden. Gelegentlich können Patienten sogar vor dem
Tode bewahrt werden.
Erfindungsgemäss lassen sich Human-Lysozympräparate, die.bisher
auf dem Markt nicht zur Verfügung standen, in hoher Reinheit herstellen, indem man, wie bereits erwähnt, eine Blutfraktionierung
unter Ausnutzung von Loslichkeitsunterschieden anwendet.
Dies stellt auch die grundlegende Verfahrensmassnahme von herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Human-Albuminprä-
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paraten dar. Ein Nebeneffekt des erfindungsgemässen Verfahrens
besteht darin, dass eine Albuminfraktion in weiter gereinigter Form erhalten werden kann. Aus diesen Gründen ist das erfindungsgemässe
Verfahren vom wirtschaftlichen Standpunkt aus wertvoll.
Die Angabe "Prozent" (Gewicht/Volumen) in der Beschreibung und
in den Ansprüchen bedeutet, dass die Konzentration eines gelösten Stoffes in einer Lösung als Verhältnis des Gewichts
des gelösten Stoffes pro Volumeneinheit der Lösung angegeben ist.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
10 Liter einer thermisch stabilen Plasmaproteinlösung (Proteingehalt
600 g; chemische Zusammensetzung des Proteins: Albumin 95 Prozent, α- und ß-Globuline 4- Prozent, Proteine, die von der
^-Region zur Kathode wandern,1 Prozent), die aus Plazentablut
gemäss dem Verfahren der JA-AS 40132/1976 erhalten worden ist,
wird mit 1 η NaOH-Lösung auf den pH-Wert 7,0 + 0,05 eingestellt.
Diese Lösung des thermisch stabilen Plasmaproteins wird über eine mit 100 g CM-Cellulose (Produkt der Firma Seikagaku Kogyo
K.K.) gepackte Säule, die vorher gründlich gewaschen und auf einen pH-Wert von 7*0 + 0,05 eingestellt worden ist, gegeben.
Man erhält eine Albuminfraktion, deren optische Dichte bei 280 nm bestimmt wird. Sie weist nahezu den gleichen Proteingehalt
wie die vorher auf die Säule aufgesetzte Lösung auf, so dass mehr als 99 Prozent des Proteins an der Säule nicht adsorbiert
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werden. Die erhaltene Fraktion enthält überhaupt kein Lysozyra,
was anzeigt, dass das Lysozym vollständig durch die CM-Cellulose
adsorbiert worden ist. Um das auf der Säule verbliebene Albumin zu entfernen, wird die Säule mit 1000 ml 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure
(pH-Wert 9,0) und anschliessend mit 1000 ml 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-3alzsäure
mit einem Gehalt an 0,13 m NaCl (pH-Wert 9,0) gewaschen.
Sodann wird zur Elution des adsorbierten Lysozyms 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure
mit einem Gehalt an 15 Prozent NaCl (pH-Wert 9,0) über die Säule gegeben. Das eluierte
Lysozym weist einen Reinheitsgrad von etwa 80 Prozent auf. Das Eluat wird gegen fliessendes Wasser dialysiert, sterilisiert,
filtriert, in Ampullen gegeben und gefriergetrocknet. Die auf diese Weise in Ampullen verpackten Lysozympräparate weisen eine
spezifische Aktivität von 3,2 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt von 1,6 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt 208 mg..
10 Liter thermisch stabiles Plasmaprotein (Proteingehalt 500 g; chemische Zusammensetzung des Proteins: Albumin 87,0 Prozent,
α-Globulin 8,4 Prozent, ß-Globulin 3,6 Prozent, andere Proteine,
die von der f-Region zur Kathode wandern,1 Prozent), das aus
dem Cohn-Überstand der Fraktion IV-1 aus menschlichem Plasma
gemäss dem Verfahren der US-PS 2 958 628 erhalten worden ist,
wird mit 1 α NaOH-Lösung auf den pH-Wert 7,0 + 0,05 eingestellt.
Ferner werden 600 ml p-Cellulose (Produkt der Firma Seikagaku
Kogyo K.K.), das gründlich mit Wasser gewaschen und mit 0,02 m
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Phosphatpuffer auf den pH-Wert 7»0 + 0,05 eingestellt worden
ist, in eine Säule gepackt. Über diese Säule wird die vorstehend erwähnte thermisch stabile Plasmaproteinlösung gegeben.
Das in dieser Lösung enthaltene Albumin passiert die Säule ohne adsorbiert zu werden. Anschliessend wird die Säule
mit dem gleichen Puffer, wie er zur Äquilibrierung verwendet worden ist, gerwaschen und sodann zur vollständigen Entfernung
des Albumins von der Säule mit 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure
mit einem Gehalt an 0,13 m NaC]. gewaschen. Anschliessend wird zur Elution des adsorbierten Lysozyms 0,02 m
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure mit einem Gehalt an
8 Prozent NaCl (pH-Wert 8,5) über die Säule gegeben. Das Eluat
wird gesammelt, gegen laufendes Wasser dialysiert, sterilisiert, filtriert, in Ampullen gegeben und gefriergetrocknet. Das auf
diese Weise in Ampullen verpackte Lysozympräparat weist einen Reinheitsgrad von 60 Prozent, eine spezifische Aktivität von
2,4 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt von 2,1 mg auf.
Die Gesamtausbeute beträgt 30 mg.
Aus 10 Liter Plasmaprotein, das Albumin als Hauptbestandteil enthält (chemische Zusammensetzung des Proteins: Albumin 95
Prozent, α- und ß-Globuline 4 Prozent, andere Proteine, die
von der ^-Region zur Kathode wandern,1 Prozent) und das aus dem
Niederschlag der Cohn-Fraktion IV-1 gemäss dem Verfahren von
Beispiel 1 der US-PS 4 017 470 erhalten word ist, wird Lysozym
gemäss Beispiel 1 gewonnen. Das in Ampullen verpackte Lysozym-
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präparat weist einen Reinheitsgrad von 65 Prozent, eine spezifische Aktivität von 2,6 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt
von 1,9 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt 28 mg.
Aus 10 Liter thermisch stabilem Plasmaprotein wird gemäss Beispiel
1 Lysozym gewonnen. Das thermisch stabile Plasmaprotein
ist gemäss Beispiel 1 der JA-OS 88621/1976 durch 1-stündiges
Erwärmen der aus .Plazentablut erhaltenen Fraktion auf 600C
bei einem pH-Wert von 4,8 in Gegenwart von 4- Prozent (Gewicht/
Volumen) Mandelsäure und 1 millimolar EDTA erhalten worden, wobei ein Niederschlag mit einem Gehalt an Hämoglobin und
alkalischer Phosphatase entfernt worden ist. Die chemische Zusammensetzung des Ausgangsproteins ist nachstehend angegeben:
Albumin 95 Prozent, α- und ß-Globuline 4- Prozent, andere Proteine,
die von der ^-Region zur Kathode wandern,1 Prozent. Das
in Ampullen verpackte Lysozympräparat weist einen Reinheitsgrad
von 70 Prozent, eine spezifische Aktivität von 2,8 mg Titer/mg
und einen Gesamtproteingehalt von 1,8 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt I50 mg.
Eine 5prozentige wässrige Lysozymlösung, die gemäss Beispiel 1
erhalten worden ist (spezifische Aktivität 3»2 mg Titer/mg,
Gesamtproteingehalt 208 mg) wird an Sephadex G-50 bei einem
pH-Wert von 5»5 eier Gelfiltration unterworfen. Das Filtrat
wird eingeengt und gegen eine 5prozentige wässrige NaCl-Lösung
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vom pH-Wert 4,5 dialysiert. Auf diese Weise erhält man
Lysozym in kristalliner Form. Fig. 1 zeigt eine photographische Abbildung in 400-facher Vergrösserung des erhaltenen Kristalls.
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Claims (18)
1. Verfahren zur Gewinnung von Human-Lysczympräparaten,
dadurch gekennzeichnet, dass man menschliches Blut zur Isolierung einer Albuainfraktion unter Ausnutzung
von Löslichkeitsunterschieden fraktioniert, die Albuminfraktion zur Adsorption des darin enthaltenen Lysozyms
mit einem schwach sauren Kationenaustauscher in Eontakt
bringt und das adsorbierte Lysozym desorbiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet,
dass man die Albuminfraktion aus menschlichem
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OWQlNAL INSPECTED
-S-
Plasma, menschlichem Serum oder menschlichem Plazentablut gewinnt,
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass die Albuminfraktion Albumin mit einer Reinheit von 50 bis 97 Prozent, bezogen auf das Gesamtprotein,
enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man als Albuminfraktion die Cohn-Fraktion IV-1 verwendet.
5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Fraktionierung gemäss dem Verfahren der US-PS 4 017 470 durchführt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Fraktionierung gemäss dem Verfahren der US-PS 2 958 628 durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet,
dass man die Fraktionierung durchführt, indem man eine aus Plazenta gewonnene Albuminfraktion in
Gegenwart einer organischen Säure mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen erhitzt, um Proteinverunreinigungen zu fällen und zu
entfernen.
809835/0474
8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man als schwach sauren Kationenaustauscher Carboxymethylcellulose, Fhosphocellulose Oder
carboxymethylvernetztes Dextran verwendet.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Albuminfraktion bei einem pH-Wert von 5 tis 10 mit dem Kationenaustauscher in Kontakt
bringt.
10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Albuminfraktion bei einem pH-Wert von 7 bis 9 mit dem Kationenaustauscher in Kontakt bringt.
11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Desorbtion bei einem pH-Wert
von etwa 10 bis 12 durchführt.
12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Desorption in einer wässrigen
Lösung eines anorganischen neutralen Salzes mit einer Konzentration von etwa 5 bis 15 Prozent durchführt.
13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn?-
z e i chnet, dass man die Desorption in einer wässrigen Lösung eines anorganischen neutralen Salzes mit einer
Konzentration von etwa 5 bis I5 Prozent und einem pH-Wert
von 8 bis 10 durchführt.
14. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet,
dass man die Lösung des desorbierten Materials 10 Stunden auf 600C erwärmt.
15· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
dass man die Lösung des desorbierten Materials der Gelfiltration unterwirft und einengt, um das
darin enthaltene Lysozym zu kristallisieren.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet,
dass man zur Gelfiltration vernetztes Dextran verwendet.
17· Human-Lysozympräparat, dadurch gekennzeichnet,
dass es gemäss Anspruch 1 erhältlich ist.
18. Kristallines Human-Lysozympräparat, dadurch gekennzeichnet,
dass es gemäss Anspruch 15 erhältlich ist.
809836/0474
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