DE2734150A1

DE2734150A1 - Verfahren zur gewinnung von human- lysozym

Info

Publication number: DE2734150A1
Application number: DE19772734150
Authority: DE
Inventors: Eiichi Hasegawa; Toyoaki Inaba; Tsuyoshi Takahashi; Kazuo Takechi
Original assignee: GREEN CROSS CORP; Green Cross Corp Japan
Current assignee: GREEN CROSS CORP; Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1977-02-28
Filing date: 1977-07-28
Publication date: 1978-08-31
Also published as: DE2734150C3; DE2734150B2; US4104125A; JPS5632914B2; FR2381783A1; FR2381783B1; ES461060A1; JPS53107479A

Description

u.Z.: M 290

Case: A 2563-02

THE GREEN CROSS CORPORATION

Osaka, Japan

"Verfahren zur Gewinnung von Human-Lysozym"

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Human-Lysozym aus Albuminfraktionen von menschlichem Blut.

"Lysozym" ist ein allgemeiner Ausdruck für Enzyme, die die Hydrolyse von in Zellwänden von Mikroorganismen auftretenden Mucopolysacchariden katalysieren und diese dabei auflösen. In Albumin aus Geflügeleiern beträgt der Lysozymgehalt 3 Prozent, bezogen auf das Gesamtprotein. Deshalb werden Lysozympräparate vorwiegend aus ELweiss von Hühnereiern hergestellt. Andererseits findet sich Lysozym auch in menschlichen Körperflüssigkeiten, wie Tränen, Nasenschleim, Blut und Urin. Mit Ausnahme der Tränen ist aber dabei der Lysozymgehalt sehr gering. Ein höherer Lysozymgehalt findet sich in Körperflüssigkeiten von Leukämiepatienten. 1967 wurde erstmals Human-Lysozym in kristalliner

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Form aus Urin von Patienten mit monozytärer Leukämie durch Adsorption an Bentonit isoliert; vgl. Osserman, Science, Bd. (1967), S. 1536 bis 1537.

Da aus Hühnereiweiss isoliertes Lysozym für den menschlichen Körper ein heterogenes Protein darstellt, ist dessen Anwendung und Verabreichungsart bei der Verwendung als Arzneistoff in der Humanmedizin Beschränkungen unterworfen. Ausserdem beträgt dessen enzymatische Aktivität nur etwa 1/2 bis 1/3 im Vergleich von Human-Lysozym. Jedoch ist die Menge an Lysozym, die in zur Verfügung stehenden Körperflüssigkeiten oder Geweben von normalen Menschen zur Verfugung steht, sehr gering. Beispielsweise beträgt der Gehalt in normalem menschlichem Blut nur 2 bis 10 ppm. Zur Zeit steht ein wirtschaftlich arbeitendes und in grösserem Massstab durchführbares Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Lysozym aus normalem menschlichem Blut nicht zur Verfügung. Eine Verwendung von Tränen, Nasenschleim oder Urin von Leukämiepatienten als Quelle zur Lysozymgewinnung kommt nicht in Frage.

Aufgabe der Erfindung ist es, ein wirksames Verfahren zur Abtrennung und Reinigung von Lysozym aus menschlichem Blut zur Verfügung zu stellen.

Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass Lysozym in der Albuminfraktion von Blut angereichert werden kann. Erfindungsgemäss lässt sich Lysozym aus der Albuminfraktion nach einem einfachen Verfahren isÄÜecon* _Λ . ,_

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Beim erfindungsgemässen Verfahren zur Gewinnung von Human-Lysozym werden die Komponenten von menschlichem Blut unter Ausnutzung von Löslichkeitsunterschieden fraktioniert. Die dabei erhaltene Albuminfraktion wird mit einem schwach sauren Kationenaustauscher in Kontakt gebracht, wobei das in der Albuminfraktion enthaltene Lysozym adsorbiert wird. Das adsorbierte Lysozym wird sodann desorbiert und gewonnen.

Im erfindungsgemässen Verfahren wird als menschliches Blut vorzugsweise menschliches Normalblut verwendet, wozu auch Blut in Plazentagewebe und retroplazentales Blut gehört. Es ist bekannt, dass die Albuminfraktion aus derartigem menschlichem Blut durch Fraktionierung unter Ausnutzung von Löslichkeitsunterschieden abgetrennt werden kann. Als derartige Verfahren kommen hauptsächlich die Fraktionierung mit Ammoniumsulfat oder die Fraktionierung mit Alkohol bei niedrigen Temperaturen gemäss Cohn in Frage. Bei der Fraktionierung mit Ammoniumsulfat wird die Albuminfraktion im Blut in Form von Niederschlägen gesammelt, die sich bei einer Sättigung mit Ammoniumsulfat in einem Konzentrationsbereich von 45 bis 75 Prozent bilden. Bei der Alkoholfällung bei niedrigen Temperaturen gemäss Cohn wird die Albuminfraktion im Blut in den Fraktionen IV-1 und V gewonnen. Diese Fraktionen werden gereinigt und als Albuminpräparate auf den Markt gebracht. In der Literatur sind eine Anzahl von Verfahren beschrieben, die eine Modifikation oder Verbesserung dieser Fraktionierungs- und Reinigungsverfahren betreffen. Hier sei auf folgende Literaturstellen verwiesen:

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(1) Aus Plasma oder Serum:

Verfahren, bei dem der Überstand der Fraktion IV-1 gemäss Cohn nochmals der Fraktionierung mit Äthanol bei einer Konzentration von 25 bis 38 Prozent unterzogen wird (vgl. US-PS 2 958 628); Verfahren, bei dem Proteinverunreinigungen, wie Lipoprotein, aus der Fraktion IV-1 unter Verwendung von organischen Säuren und Acrinol entfernt werden (vgl. US-PS 4- 017 470); Verfahren, bei dem Albumin aus dem Niederschlag der Fraktion IV-4- gewonnen wird (vgl. US-PS 3 850 903); Verfahren, bei dem eine wässrige Lösung mit einem Gehalt an Albumin mit einer Fettsäure versetzt wird, das erhaltene Gemisch erwärmt wird und anschliessend gereinigtes Albumin gewonnen wild (vgl. US-PSen 2 765 299 und 2 705 230).

(2) Aus Plazenta:

Ein Verfahren, bei dem ein flüssiger Plazentaextrakt zur Entfernung von Verunreinigungen nacheinander mit Citronensäure, Phenol und Natriumcarbonat extrahiert und anschliessend Albumin gewonnen wird (vgl. JA-AS 7762/1973); ein Verfahren, bei dem ein flüssiger Plazentaextrakt mit Ammoniumsulfat fraktioniert wird, diese Fraktion mit Buttersäure versetzt und erhitzt wird und anschliessend das Albumin aus dem überstand gewonnen wird (vgl. JA-AS 16041/1968); Verfahren, bei dem im letztgenannten Verfahren anstelle von Buttersäure Alkohol und ein Salz einer Fettsäure verwendet wird (vgl. US-PS 3 926 939); Verfahren, bei dem statt dessen Mandelsäure oder Capronsäure und Äthylendiamintetraessigsäure verwendet werden (vgl. JA-OS 88621/1976); Verfahren,

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bei dem statt dessen Mandelsäure verwendet wird (vgl. JA-AS 40132/1976); Verfahren, bei dem statt dessen Caprylsäure und Chloroform verwendet wird (vgl. GB-PS 1 441 752).

Sämtliche vorerwähnten Verfahren lassen sich erfindungsgemäss zur Herstellung der Albuminfraktion anwenden. Bei Verwendung von Plasma oder Serum als Rohmaterial werden vorzugsweise die Verfahren der US-PSen 4 017 470 und 2 958 628 angewendet. Bei Verwendung von Plazenta ist es empfehlenswert, ein Verfahren anzuwenden, bei dem die Albuminfraktion aus Plazenta zur Eatfernung von Proteinverunreinigungen in Gegenwart einer organischen Säure mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen erhitzt wird. Vorstehend sind Literaturstellen für derartige Verfahren angegeben.

Nachstehend wird eine Zusammenfassung der Verfahren der US-PSen 4 017 47Ο und 2 958 628 gegeben:

"Verfahren zur Herstellung von wärmestabilen Plasmaproteinlösungen ohne blutdrucksenkende Wirkung, wobei destilliertes Wasser zu dem Brei- IV-1, einer bei der Fraktionierung von Plasma mit kaltem Äthanol gemäss Cohn erhaltenen Fraktion, zur Extraktion von wasserlöslichen Proteinen aus diesem Brei versetzt und die im Gemisch enthaltenen Feststoffe durch Zentrifugieren unter Bildung eines Extrakts mit einem Gehalt an wasserlöslichen Proteinen zentrifugiert, den erhaltenen Extrakt bei einem pH-Wert von 4,5 bis 5i5 bei 50 bis 65⁰C mit einer organischen Säure mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen bis zu einer Endkonzentration der organischen Säure von 2 bis 6 Prozent (Gewicht/Volumen)

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behandelt, durch Filtrieren oder Zentrifugieren im Extrakt erhaltene Lipo- und Glycoproteine als Niederschläge entfernt, den erhaltenen Überstand mit 0,2 bis 3»0 g pro Liter Überstand 2-Äthoxy-6,9-diaminoacridin-lactat versetzt, das Gemisch bei Eaumtemperatur oder niedrigeren Temperaturen stehenlässt und die restlichen Lipoproteine durch Fällung, wobei eine Trübung des Überstands entsteht, entfernt, und anschliessend im erhaltenen Überstand enthaltene blutdrucksenkende Substanzen durch Adsorption mit einem anorganischen Adsorptionsmittel oder einem Kationenaustauscher entfernt".

" Verfahren zur Fraktionierung von menschlichem Plasmaprotein durch fraktionierende Fällung mit kaltem Äthanol nach vorheriger Entfernung von sämtlichen koagulierenden Bestandteilen und dem gesamten jT-Globulin, wobei ein Gemisch aus Albumin, α-Globulin und ß-Globulin bei einer Temperatur zwischen -2°C und dem Gefrierpunkt der Lösung, einer Ionenstärke von weniger als 0,12 und einer Proteinkonzentration von mehr als 2,2 Prozent bei

einer Äthanolkonzentration von 25 bis 38 Prozent bei einem pH-Wert von 4,3 bis 4,7 gefällt wird".

Als Beispiel für ein bevorzugtes Verfahren bei der Verwendung von Plazenta wird nachstehend eine Zusammenfassung des Verfahrens der JA-AS 40 132/76 gegeben:

" Verfahren zur Gewinnung von wärmestabilem, menschlichem Plasmaprotein aus Plazenta oder retroplazentalem Blut des Menschen, dadurch gekennzeichnet, dass man als Rohmaterial Plazenta oder retroplazentales Blut vom Menschen verwendet,

die bzw. das unmittelbar nach seiner Gewinnung gefroren oder verschlossen worden ist, aus einer aus dem Rohmaterial fraktionierten Lösung von Blutbestandteilen das Jf-Globulin unter Gewinnung eines Überstands abtrennt, den Überstand mit fester Mandelsäure oder einer Lösung derselben bis zu einer Säurekonzentration von 2,5 bis 5»0 Prozent versetzt, den pH-Wert der Reaktionslösung im Bereich von 4,5 bis 5»5 hält, die Lösung auf 58 bis 62°C erwärmt, sämtliche gebildete Niederschläge entfernt und die gewünschte Substanz aus dem Überstand gewinnt".

Im erfindungsgemässen Verfahren können mit Erfolg die vorerwähnten Albuminfraktionen oder daraus hergestellte gereinigte Präparate eingesetzt werden. Es geht auf den erfindungsgemässen Befund zurück, dass während der gesamten Fraktionierung des Bluts aufgrund von Löslichkeitsunterschieden das Lysozym sich wie Albumin verhält und somit beide Bestandteile in den Albuminfraktionen angereichert werden. Dieses Verhalten von Lysozym wurde bisher nicht beschrieben. Das angereicherte Lysozym wurde bisher als Verunreinigung in Albuminpräparaten übersehen.

Das erfindungsgemässe Verfahren zur Gewinnung von Lysozym umfasst die Fraktionierung von menschlichem Plasma, menschlichem Serum oder Blut aus menschlicher Plazenta, wie ein Extrakt aus menschlicher Plazenta oder menschliches retroplazentales Blut, um Albuminfraktionen daraus unter Ausnutzung von Löslichkeit sunterschieden zu isolieren. Die isolierten Albuminfraktionen werden sodann, wie bereits erwähnt, mit einem schwach sauren

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Kationenaustauscher in Kontakt gebracht, wobei das Lysozym am Austauscher adsorbiert wird. Schliesslich wird das adsorbierte Lysozym desorbiert und gewonnen.

Bei der Kombination des erfindungsgemässen Verfahrens mit einem Verfahren zur Herstellung von Albuminpräparaten lässt sich Lysozym zusammen mit einem weiter gereinigten Albumin erhalten. Demgemäss wird als Ausgangsmaterial vorzugsweise eine gereinigte Lösung einer Albuminfraktion verwendet, die noch nicht sterilisiert, filtriert, getrocknet und zu einem Präparat verarbeitet worden ist. Die Lösung enthält Albumin mit einem Reinheitsgrad von 50 bis 97 Prozent, bezogen auf das Gesamtprotein.

Als schwach saurer Kationenaustauscher wird vorzugsweise Carboxymethylcellulose (CM-Cellulose), Phosphocellulose (p-Cellulose) und Carboxymethyl-Sephadex (CM-Sephadex, dlh. vernetztes Dextran mit Carboxymethylgruppen der Firma Pharmacia Co., Schweden) verwendet. Die Lösung wird mit dem Kationenaustauscher bei einem pH-Wert von 5 bis 10 und vorzugsweise von 5 bis 9 in Kontakt gebracht. Die pH-Werte der Lösung mit

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der Albuminfraktion und des Kationenaustauschers werden vorzugsweise unter Verwendung eines Puffers, beispielsweise 0,02 m Phosphatpuffer, auf den vorerwähnten Bereich eingestellt. Der Kontakt kann durchgeführt werden, indem man entweder die Bestandteile einfach vermischt oder die Lösung mit der Albuminfraktion über eine mit dem Kationenaustauscherharz gepackte Säule gibt. Dabei wird das Lysozym in der Lösung vollständig am

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KationenauRtauscher adsorbiert, während das Albumin in weiter gereinigtem Zustand in der Lösung verbleibt. Der Kationenaustauscher mit dem adsorbierten Lysozym wird vorzugsweise mit dem vorstehend erwähnten Puffer gewaschen, wonach das Lysozym vom Kationenaustauscher auf übliche Weise mit einem ELutionsmittel, wie einer alkalischen Lösung (pH-Wert 10 bis 12), einer hochkonzentrierten Lösung eines anorganischen neutralen Salzes (beispielsweise eine etwa 5 bis 15prozentige Lösung von Natriumchlorid) oder einer wässrigen Lösung eines anorganischen neutralen Salzes mit einer Konzentration von etwa 5 bis 15 Prozent und einem pH-Wert von 8 bis 10, eluiert wird.

Mit Ausnahme der vorerwähnten Bedingungen bestehen bei der Adsorption und Desorption keine speziellen Beschränkungen. Die Temperatur kann im Bereich der Umgebungstemperatur von 3 bis 20⁰C liegen. Die Menge des schwach sauren Kationenaustauschers beträgt im allgemeinen etwa 30 bis 100 ml pro 1 Liter Ausgangslösung mit einem Gehalt an 3 bis 10 Prozent (Gewicht/ Volumen) Albumin.

Die Lysozymkonzentration im ELuat wird durch Messen der Proteinkonzentration bei 280 nm oder turbidimetrisch (vgl. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., Bd. 119 (1965), S. 384 bis 386) unter Berücksichtigung des Lysozymtiters bestimmt. Das ELuat wird 10 bis 20 Stunden gegen Wasser dialysiert, bis die anorganischen Salze praktisch ganz entfernt sind. Anschliessend wird der pH-Wert auf 5,0 bis 6,0 eingestellt. Gegebenenfalls wird

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10 Stunden auf 6O⁰C erhitzt, um Hepatitisviren zu inaktivieren. Lysozym ist bei erhöhten Temperaturen dieser Grössenordnung beständig. Anschliessend wird sterilisiert und filtriert. Man erhält eine Lösung eines injizierbaren Lysozympräparats. Schliesslich kann die Lösung zu einem festen Vorratspräparat von Lysozym gefriergetrocknet werden.

Das auf diese Weise erhaltene Lysozympräparat weist eine Reinheit von 60 Prozent oder mehr auf und kann direkt zur intravenösen, intraarteriellen oder intramuskulären Injektion verwendet werden. Selbstverständlich kann das Präparat dem menschlichen Körper auch in Form eines Collyriums, eines Aerosols oder eines oralen Präparats verabfolgt werden. Es kann zu beliebigen Zeitpunkten ohne Auftreten von allergischen Reaktionen in Dosen von 0,1 bis 20 mg Titer/kg Körpergewicht bei Verwendung als Injektionspräparat und in Dosen von 0,2 bis 10 mg Titer/ml, bei Verwendung"als künstliche Tränen'oder Collyrium verabfolgt werden.

Durch zusätzliche Reinigung des auf die vorstehende Weise erhaltenen Lysozympräparats ist es möglich, kristallines Lyso-

Lysozymlösung zym zu erhalten. Dabei wird die/der Gelfiltration an vernetztem Dextran, beispielsweise Sephadex G-50 der Firma Pharmacia Co., Schweden, bei einem pH-Wert von 5 bis 6 unterworfen, wodurch die Reinheit des Lysozyms bis auf 90 Prozent erhöht wird. Anschliessend wird die gereinigte Lösung gegen Natriumchloridlösung (pH-Wert 4 bis 5) dialysiert. Die dialysierte Lösung

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wird schließlich eingeengt. Fig. 1 zeigt eine photographische Abbildung in 400-facher Vergrösserung eines auf diese Weise erhaltenen Kristalls.

Nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestelltes Human-Lysozym kann, auf oralem Wege an Patienten verabfolgt werden, die an Krankheiten leiden, die mit herkömmlichen Lysozympräparaten aus Hühnereiweiss behandelt werden können. Ferner kann das erfindungsgemäss hergestellte Lysozympräparat auch durch Injektion verabfolgt werden. Somit weisen die erfindungsgemässen Präparate einen vergrösserten Anwendungsbereich auf. Beispielsweise kann man das Lysozym auf einen bakteriellen Eiterherd einwirken lassen, indem man es direkt in den Herd oder über die Arterie injiziert. Ferner ist es möglich, dass asthmatische Patienten die erfindungsgemässen Lysozympräparate in hohen Konzentrationen inhalieren, um Sputum, das bei einem Asthmaanfall die Bronchiolen verstopft, zu beseitigen. Bei einem derartigen Anfall kann eine Besserung ohne allergische Reaktionen erzielt werden. Gelegentlich können Patienten sogar vor dem Tode bewahrt werden.

Erfindungsgemäss lassen sich Human-Lysozympräparate, die.bisher auf dem Markt nicht zur Verfügung standen, in hoher Reinheit herstellen, indem man, wie bereits erwähnt, eine Blutfraktionierung unter Ausnutzung von Loslichkeitsunterschieden anwendet. Dies stellt auch die grundlegende Verfahrensmassnahme von herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von Human-Albuminprä-

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paraten dar. Ein Nebeneffekt des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass eine Albuminfraktion in weiter gereinigter Form erhalten werden kann. Aus diesen Gründen ist das erfindungsgemässe Verfahren vom wirtschaftlichen Standpunkt aus wertvoll.

Die Angabe "Prozent" (Gewicht/Volumen) in der Beschreibung und in den Ansprüchen bedeutet, dass die Konzentration eines gelösten Stoffes in einer Lösung als Verhältnis des Gewichts des gelösten Stoffes pro Volumeneinheit der Lösung angegeben ist.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

10 Liter einer thermisch stabilen Plasmaproteinlösung (Proteingehalt 600 g; chemische Zusammensetzung des Proteins: Albumin 95 Prozent, α- und ß-Globuline 4- Prozent, Proteine, die von der ^-Region zur Kathode wandern,1 Prozent), die aus Plazentablut gemäss dem Verfahren der JA-AS 40132/1976 erhalten worden ist, wird mit 1 η NaOH-Lösung auf den pH-Wert 7,0 + 0,05 eingestellt. Diese Lösung des thermisch stabilen Plasmaproteins wird über eine mit 100 g CM-Cellulose (Produkt der Firma Seikagaku Kogyo K.K.) gepackte Säule, die vorher gründlich gewaschen und auf einen pH-Wert von 7*0 + 0,05 eingestellt worden ist, gegeben. Man erhält eine Albuminfraktion, deren optische Dichte bei 280 nm bestimmt wird. Sie weist nahezu den gleichen Proteingehalt wie die vorher auf die Säule aufgesetzte Lösung auf, so dass mehr als 99 Prozent des Proteins an der Säule nicht adsorbiert

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werden. Die erhaltene Fraktion enthält überhaupt kein Lysozyra, was anzeigt, dass das Lysozym vollständig durch die CM-Cellulose adsorbiert worden ist. Um das auf der Säule verbliebene Albumin zu entfernen, wird die Säule mit 1000 ml 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure (pH-Wert 9,0) und anschliessend mit 1000 ml 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-3alzsäure mit einem Gehalt an 0,13 m NaCl (pH-Wert 9,0) gewaschen. Sodann wird zur Elution des adsorbierten Lysozyms 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure mit einem Gehalt an 15 Prozent NaCl (pH-Wert 9,0) über die Säule gegeben. Das eluierte Lysozym weist einen Reinheitsgrad von etwa 80 Prozent auf. Das Eluat wird gegen fliessendes Wasser dialysiert, sterilisiert, filtriert, in Ampullen gegeben und gefriergetrocknet. Die auf diese Weise in Ampullen verpackten Lysozympräparate weisen eine spezifische Aktivität von 3,2 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt von 1,6 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt 208 mg..

Beispiel 2

10 Liter thermisch stabiles Plasmaprotein (Proteingehalt 500 g; chemische Zusammensetzung des Proteins: Albumin 87,0 Prozent, α-Globulin 8,4 Prozent, ß-Globulin 3,6 Prozent, andere Proteine, die von der f-Region zur Kathode wandern,1 Prozent), das aus dem Cohn-Überstand der Fraktion IV-1 aus menschlichem Plasma gemäss dem Verfahren der US-PS 2 958 628 erhalten worden ist, wird mit 1 α NaOH-Lösung auf den pH-Wert 7,0 + 0,05 eingestellt. Ferner werden 600 ml p-Cellulose (Produkt der Firma Seikagaku Kogyo K.K.), das gründlich mit Wasser gewaschen und mit 0,02 m

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Phosphatpuffer auf den pH-Wert 7»0 + 0,05 eingestellt worden ist, in eine Säule gepackt. Über diese Säule wird die vorstehend erwähnte thermisch stabile Plasmaproteinlösung gegeben. Das in dieser Lösung enthaltene Albumin passiert die Säule ohne adsorbiert zu werden. Anschliessend wird die Säule mit dem gleichen Puffer, wie er zur Äquilibrierung verwendet worden ist, gerwaschen und sodann zur vollständigen Entfernung des Albumins von der Säule mit 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure mit einem Gehalt an 0,13 m NaC]. gewaschen. Anschliessend wird zur Elution des adsorbierten Lysozyms 0,02 m Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan-Salzsäure mit einem Gehalt an 8 Prozent NaCl (pH-Wert 8,5) über die Säule gegeben. Das Eluat wird gesammelt, gegen laufendes Wasser dialysiert, sterilisiert, filtriert, in Ampullen gegeben und gefriergetrocknet. Das auf diese Weise in Ampullen verpackte Lysozympräparat weist einen Reinheitsgrad von 60 Prozent, eine spezifische Aktivität von 2,4 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt von 2,1 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt 30 mg.

Beispiel 3

Aus 10 Liter Plasmaprotein, das Albumin als Hauptbestandteil enthält (chemische Zusammensetzung des Proteins: Albumin 95 Prozent, α- und ß-Globuline 4 Prozent, andere Proteine, die von der ^-Region zur Kathode wandern,1 Prozent) und das aus dem Niederschlag der Cohn-Fraktion IV-1 gemäss dem Verfahren von Beispiel 1 der US-PS 4 017 470 erhalten word ist, wird Lysozym gemäss Beispiel 1 gewonnen. Das in Ampullen verpackte Lysozym-

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präparat weist einen Reinheitsgrad von 65 Prozent, eine spezifische Aktivität von 2,6 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt von 1,9 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt 28 mg.

Beispiel 4

Aus 10 Liter thermisch stabilem Plasmaprotein wird gemäss Beispiel 1 Lysozym gewonnen. Das thermisch stabile Plasmaprotein ist gemäss Beispiel 1 der JA-OS 88621/1976 durch 1-stündiges Erwärmen der aus .Plazentablut erhaltenen Fraktion auf 60⁰C bei einem pH-Wert von 4,8 in Gegenwart von 4- Prozent (Gewicht/ Volumen) Mandelsäure und 1 millimolar EDTA erhalten worden, wobei ein Niederschlag mit einem Gehalt an Hämoglobin und alkalischer Phosphatase entfernt worden ist. Die chemische Zusammensetzung des Ausgangsproteins ist nachstehend angegeben: Albumin 95 Prozent, α- und ß-Globuline 4- Prozent, andere Proteine, die von der ^-Region zur Kathode wandern,1 Prozent. Das in Ampullen verpackte Lysozympräparat weist einen Reinheitsgrad von 70 Prozent, eine spezifische Aktivität von 2,8 mg Titer/mg und einen Gesamtproteingehalt von 1,8 mg auf. Die Gesamtausbeute beträgt I50 mg.

Beispiel 5

Eine 5prozentige wässrige Lysozymlösung, die gemäss Beispiel 1 erhalten worden ist (spezifische Aktivität 3»2 mg Titer/mg, Gesamtproteingehalt 208 mg) wird an Sephadex G-50 bei einem pH-Wert von 5»5 eier Gelfiltration unterworfen. Das Filtrat wird eingeengt und gegen eine 5prozentige wässrige NaCl-Lösung

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vom pH-Wert 4,5 dialysiert. Auf diese Weise erhält man Lysozym in kristalliner Form. Fig. 1 zeigt eine photographische Abbildung in 400-facher Vergrösserung des erhaltenen Kristalls.

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Claims

VOSSIUS · VOSSIUS HILTL PATENTA*"W/>\'_TE SlEBERTSTFtASSE 4 ■ ΘΟΟΟ MÜNCHEN ββ ■ PHONE: (Οθβ) 47 4O 7β -CABLE: BENZOLPATENT MÜNCHEN · TELEX 6-20*53 VOPAT D u.Z.: M 290 28. Juli 1977 Case: A 2363-02 THE GHEEN CBOSS CORPORATION Osaka, Japan 'Verfahren zur Gewinnung von Human-Lysozym" Priorität: 28. Februar 1977, Japan, Nr. 20984/1977 Patentansprüche

1. Verfahren zur Gewinnung von Human-Lysczympräparaten, dadurch gekennzeichnet, dass man menschliches Blut zur Isolierung einer Albuainfraktion unter Ausnutzung von Löslichkeitsunterschieden fraktioniert, die Albuminfraktion zur Adsorption des darin enthaltenen Lysozyms mit einem schwach sauren Kationenaustauscher in Eontakt bringt und das adsorbierte Lysozym desorbiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, dass man die Albuminfraktion aus menschlichem

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Plasma, menschlichem Serum oder menschlichem Plazentablut gewinnt,

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Albuminfraktion Albumin mit einer Reinheit von 50 bis 97 Prozent, bezogen auf das Gesamtprotein, enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Albuminfraktion die Cohn-Fraktion IV-1 verwendet.

5· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fraktionierung gemäss dem Verfahren der US-PS 4 017 470 durchführt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Fraktionierung gemäss dem Verfahren der US-PS 2 958 628 durchführt.

7. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, dass man die Fraktionierung durchführt, indem man eine aus Plazenta gewonnene Albuminfraktion in Gegenwart einer organischen Säure mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen erhitzt, um Proteinverunreinigungen zu fällen und zu entfernen.

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8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als schwach sauren Kationenaustauscher Carboxymethylcellulose, Fhosphocellulose Oder carboxymethylvernetztes Dextran verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Albuminfraktion bei einem pH-Wert von 5 tis 10 mit dem Kationenaustauscher in Kontakt bringt.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Albuminfraktion bei einem pH-Wert von 7 bis 9 mit dem Kationenaustauscher in Kontakt bringt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Desorbtion bei einem pH-Wert von etwa 10 bis 12 durchführt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Desorption in einer wässrigen Lösung eines anorganischen neutralen Salzes mit einer Konzentration von etwa 5 bis 15 Prozent durchführt.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn?-

z e i chnet, dass man die Desorption in einer wässrigen Lösung eines anorganischen neutralen Salzes mit einer Konzentration von etwa 5 bis I5 Prozent und einem pH-Wert

von 8 bis 10 durchführt.

14. Verfahren nach Anspruch 1,dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung des desorbierten Materials 10 Stunden auf 60⁰C erwärmt.

15· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Lösung des desorbierten Materials der Gelfiltration unterwirft und einengt, um das darin enthaltene Lysozym zu kristallisieren.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass man zur Gelfiltration vernetztes Dextran verwendet.

17· Human-Lysozympräparat, dadurch gekennzeichnet, dass es gemäss Anspruch 1 erhältlich ist.

18. Kristallines Human-Lysozympräparat, dadurch gekennzeichnet, dass es gemäss Anspruch 15 erhältlich ist.

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