DE2529291A1

DE2529291A1 - Biologisch aktiver stoff zur verhinderung und linderung von gehirnfunktionsstoerungen

Info

Publication number: DE2529291A1
Application number: DE19752529291
Authority: DE
Inventors: Shozo Prof Ishii
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1974-07-01
Filing date: 1975-07-01
Publication date: 1976-01-22
Also published as: FR2276831A1; US4067963A; FR2276831B1; GB1477548A; JPS517109A; JPS6046092B2

Description

" Biologisch aktiver Stoff zur Verhinderung und Linderung von Gehirnfunktionsstörungen "

Priorität: 1. Juli 1974, Japan, Nr. 74 303/74

Bei Beobachtungen an Gehirnzellen, die in Folge von Verletzung anschwellen, wurde eine rasch sinkende Aktivität von Adonosintriphosphatase in den Gehirnmitochondrien und davon abhängig eine Schwellung des Gehirngewebes und der Mitochondrien festgestellt. Bei der Untersuchung der Beziehung zwischen dem Anschwellen der Gehirnzellen und der Funktion der Gehirnmitochondrien wurde ferner festgestellt, daß Rinderserumaiburain ebensogut wie ein unmittelbar nach dem Schlachten entnommener Extrakt eines tierischen Gehirns das Anschwellen der
Mitochondrien hemmt, die dinitrophenolabhängige Adenosintriphosphatase (nachstehend als DNP-ATPase bezeichnet) vor Inaktivierung schützt sowie die Gehirnfunktion und insbesondere das Bewußtsein wieder herstellt.

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Diese vorstehend genannten Aktivitäten konnten nicht an Eialbumin, aber überraschenderweise an Hydrolyseprodukten des Eialbumins festgestellt werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, aus Albumin einen biologisch aktiven Stoff zur Verhinderung und Linderung von Gehirnfunktionsstörungen und ein Verfahren zu seiner Herstellung zur Verfügung zu stellen. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung betrifft somit den in den Ansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.

Der erfindungsgemäße Stoff kann Gehirnfunktionsstörungen, besonders Bewußtlosigkeit und celebrale Ödeme, die durch Kopfverletzungen und Gefäßstörungen hervorgerufen werden, verhindern oder lindern.

Im erfindungsgemäßen Verfahren kann als Ausgangssubstanz jedes Albumin, bevorzugt Eialbumin, eingesetzt werden. Das Albumin wird mit einer höheren Fettsäure 2 bis 5 Stunden bei Temperaturen von 30 bis 40°C unter Schütteln, vorzugsweise in Gegenwart einer oberflächenaktiven Verbindung, wie des Natriumsalzes der Desoxycholsäure umgesetzt. Spezielle Beispiele für höhere Fettsäuren sind aliphatische gesättigte oder ungesättigte Fettsäurenmit etwa 15 bis 25, insbesondere 18 bis 20 Kohlenstoffatomen, wie Ölsäure, Linolsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure und Ärachidonsäure.

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Das Reaktionsprodukt, d.h. das mit der höheren Fettsäure umgesetzte Albumin, kann aus dem Reaktionsgemisch in üblicher Weise isoliert werden. Zum Beispiel kann das Reaktionsgemisch gefriergetrocknet, der Rückstand in wenig Wasser suspendiert und die Suspension 15 Minuten bei 15 Ό00 U/min zentrifugiert werden. Der Überstand wird an einer mit Dextran-Gel gefüllten Säule chromatographiert, wobei das umgesetzte Albumin von dem gegebenenfalls vorhandenen Natriumsalz: der Desoxycholsäure und der nicht umgesetzten Fettsäure getrennt wird.

Als Protease zur Hydrolyse des mit der Fettsäure umgesetzten Albumins wird bevorzugt Pronase eingesetzt, die aus Streptomyces griseus gewonnen wird. Die Hydrolyse wird 12 bis 36 Stunden bei Temperaturen von 30 bis 40⁰C in einer Pufferlösung durchgeführt, die auf einen pH-Wert von 7 bis 8 eingestellt ist.

Der biologisch aktive Stoff wird aus dem Hydrolysat in üblicher Weise abgetrennt, wie durch Chromatographieren an einer mit Dextran-Gel gefüllten Säule oder an einem Ionenaustauscherharz mit Sulfonsäuregruppen. Bei der Säulenchromatographie ist der biologisch aktive Stoff in den Fraktionen enthalten, die die Desaktivierung der DNA-ATPase hemmen, die in ähnlicher Weise, wie in der Veröffentlichung von M. Yamaguchi, K. Sato, J. P. Evans und S. Ishii, Experimental Brain Edema, Arch. Neurol., Bd. 22 (1970), S. 521 bis 527 beschrieben, bestimmt wird. Diese Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck oder durch Gefriertrocknung eingeengt.

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Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

5 g Eialbumin werden in 50 ml Wasser gelöst und mit 2,5 g Aktivkohle ("Darco G-60") versetzt. Die Lösung wird durch Zugabe von 0,1 N Salzsäure auf einen pH-Wert von 3,0 eingestellt, 1 Stunde "bei 4°C gerührt und danach zentrifugiert, wobei sich alle unlöslichen Stoffe absetzen. Der Überstand wird mit 0,1 N Natronlauge auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt, wobei eine. 10prozentige wäßrige Eialbuminlösung erhalten wird. 15 ml der wäßrigen Eialbuminlösung werden mit 5 ml einer 0,04 μ Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 und einer wäßrigen Lösung von 50 mg Ölsäure, die 50 mg Natriumsalz der Desoxycholsäure pro 3 ml enthält, versetzt. Die Lösung wird 3 Stunden bei 37°C geschüttelt und danach gefriergetrocknet. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser suspendiert und die Lösung 15 Minuten bei 15 000 U/min zentrifugiert. 3 ml des Überstandes werden an einer mit Sephadex gefüllten Säule (1,7 cm χ 100 cm) chromatographiert. Die Säule wird mit 0,001 M Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 und einer Eluierungsgeschwindigkeit von 2,5 ml/5 Minuten eluiert; die Eluate werden in einem Fraktionssammler gesammelt, wobei die Fraktionen mit den gewünschten Aktivitäten in den Reagenzgläsern von Nr.· 32 bis Nr. 45 enthalten sind. Diese Fraktionen enthalten 142,8 mg Protein bzw. 6,97 Ug Ölsäure. Daraus läßt sich ein Bindungsverhältnis Ölsäure/Eialbumin von 10 : 1 errechnen. Bas Natriumsalz der Desoxycholsäure und nicht umgesetzte ölsäure sind In der Fraktion Nr. 71 und den folgenden

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Fraktionen enthalten und. vollständig von der Ölsäure-Eialbumin-Verbindung getrennt. 34 ml der gesammelten Fraktion, die die Ölsäure-Eialbumin-Verbindung enthalten, werden mit 5 ml einer 0,5 M Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäure-Pufferlösung mit einem pH-V/ert von 7,4, sodann 14 mg Pronase pro 10 ml und 3 ml destilliertem Wasser versetzt und 24 Stunden bei 37°C hydrolysiert. Die Hydrolysate werden mit einem Filter-G-C5T (hergestellt von Bioengeneering Kabushiki Kaisha) ultrafiltriert, wobei die Substanzen mit einem Molekulargewicht unter 5000 abgetrennt werden. Nach dem Gefriertrocknen wird das erhaltene Pulver in 3,4 ml destilliertem V/asser aufgelöst und die Lösung an einer mit Sephadex-G-25 gefüllten Säule (1,7 cm χ 100 cm) chromatographiert. Die Säule wird entwickelt und mit destilliertem V/asser mit einer Geschv/indigkeit von 2,5 nil/5 Minuten eluiert, wobei die Eluate in einem Fraktionssammler gesammelt werden. Durch Messen der DKP-ATPase-Schutzaktivität läßt sich der biologisch aktive Stoff in den Fraktionen N_r.66-79 nachweisen. Ausbeute: Ungefähr 20 % d. Th., bezogen auf das eingesetzte Albumin.

Jedes in einem Reagenzglas enthaltene Eluat wurde auf seine UV-Absorption bei 280 nm und seine Absorption nach der Ninhydrinfarbreaktion, Folin-Chiocalteu-Farbreaktion und Itaya-Ui-Methode (die letztgenannte Methode ist nicht in der Fig. enthalten) untersucht. Die Vierte der gemessenen optischen Dichten sind in Abhängigkeit von den nummerierten Eluaten in Fig. 1-(a) wiedergegeben. Danach wird die Fettsäure in der Fraktion P-III mit den Reagenzglasnummern 62-66 gesondert

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eluiert. Dieser gesonderte Peak, der Fettsäure zuzurechnen ist, tritt nicht bei Eialbumin auf, das ohne Umsetzen mit Fettsäure mit Pronase hydrolysiert wurde (vgl. Fig. 1-(b)).

Der biologisch aktive Stoff wird in der Fraktion P-IV entsprechend den Reagenzglasnummern 66-79 eluiert, während das nicht umgesetzte Eialburain in den Fraktionen P-II und III (vgl. Fig. 1-(b)) enthalten ist. Der biologisch aktive Stoff zeigt in der Dünnschichtchromatographie nur einen einzigen Flocken, während die Substanz, die nicht mit Fettsäure behandelt wurde, viele Flecken aufweist. Die Ergebnisse zeigen, daß die Substanz des Kontrollversuchs ein Gemisch vieler Komponenten ist. In ähnlicherWeise ist die Fraktion TV der Fig. 1-(b), die mit der den biologisch aktiven Stoff enthaltenden Fraktion P-IY von Fig. 1-(a) vergleichbar ist, ein Gemisch vieler Komponenten . \

Die DNP-ATPase-Schutz-Aktivität wird mit Hilfe des biologisch aktiven Stoffes (Fraktion P-IV) und den anderen Substanzen (Fraktionen P-II und III, vgl. Fig. 1-(b)) gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 gezeigt. Aus Fig. 2 ist ersichtlich, daß der erfindungsgemäße Stoff der Fraktion P-IV in einer Menge von 0,1 mg die DNP-ATPase vor Inaktivierung völlig schützt, während wenigstens 5 mg des Stoffes P-II und III des Kontrollversuchs (vgl. Fig. 1-(b)) eingesetzt werden müssen.

Wird der erfindungsgemäße Stoff lyophilisiert, so kann er lange ohne Wirkungsverlust aufbewahrt werden. Zur Herstellung

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von Injektionspräparaten kann der getrocknete Stoff in einem Lösungsmittel bis zu einer gewünschten Konzentration aufgelöst werden.

Beispiel· 2 DNP-ATPase-Schutz-Aktivität

Gehirngewebe von zwei Ratten'wird unmittelbar nach der Entnahme in 20 ml eines Lösungsmittels homogenisiert, das 0,3 M Mannit und 0,1 M Äthylendiamintetraessigsäure enthält und einen pH-Wert von 7,4 hat. Es wird eine wäßrige Mitochondrienlösung mit einem Gehalt von ungefähr 800 ug Protein pro ml nach der Methode gemäß Ozawa et al. hergestellt; vgl. K. Ozawa, K. Seta, H. Takeda und C. Araki, "Zur Isolierung von Mitochondrien mit hoher Respirationskontrolle aus Rattengehirn", J. Biochem., Bd. 59 (1966), S. 501 bis 509. 0,1 ml der Mitochondrienlösung werden entweder mit 0,9 ml des vorstehend genannten Lösungsmittels (Kontrollversuch) oder 0,9 ml eines Lösungsmittels versetzt, das den erfindungsgemäßen Stoff (vgl. Fig. 1-(a), Fraktion IV) oder die Substanz gemäß Fraktion II und III (vgl. Fig. 1-(b)) enthält. Das Gemisch wird 0, 5, 10 und 20 Minuten bei 20⁰C inkubiert. Danach wird die DNP-ATPase-Aktivität bestimmt.

Eine Substratpufferlösung wird durch Mischen von 2 ml einer wäßrigen 2,5 M Kaliumchloridlösung^iO ml einer wäßrigen 0,5 M Trishydroxymethylaminomethan-Salzsäure-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4, 2 ml einer wäßrigen 10 mM Dinitrophenollösung und 3 al einer wäßrigen 0,2 M Adenosintriphosphatlö-

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sung mit 3 ml Wasser zur Bestimmung der Enzymaktivität hergestellt. 0,2 ml der Substratlösi.mg werden mit 0,7 ml destilliertem Wasser und 0,1 ml der Enzymlösung versetzt. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 30⁰C umgesetzt. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 0,1 ml einer wäßrigen 15prozentigen Trichloressigsäurelösung beendet; sofort danach wird das Reaktionsgemisch zentrifugiert. Der anorganische Phosphor wird im proteinfreien Überstand quantitativ nach der Methode von Fiske-Subbarow bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Fig, 2 gezeigt.

Beispiel 3

Normalisierungseffekt im anormalen Hochspannungselektroencephalogramm (EEG) und Wiedergewinnung des Bewußtseins nach Störung

In diesem Versuch werden vier Ratten eingesetzt. Ein Gummischlauch wird durch einen Auslaß mit einem luftdichten Behälter verbunden^ der eine Tür und einen Einlaß hat, der mit einer Stickstoffgaszuleitung verbunden ist. Der Gummischlauch ist verzweigt, die Jeweiligen¹ Endstücke der zwei Wege werden jeweils mit einer Ratte, die mit Gallamintriäthyljodid gelähmt ist, durch ein Tracheotomierohr verbunden, wobei das Gas, gleich in Zusammensetzung und Druck wie in dem Behälter, gleichzeitig in den Körper der zwei Ratten geleitet wird. Weiter wird eine Elektrode für das EEG auf der Kopfspitze einer jeden Ratte befestigt, um gleichzeitig das EEG zu registrieren.

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Wenn das EEG der Ratten sich wieder normalisiert hat, wird der einen Ratte durch eine Schwanzvene intravenös physiologische Kochsalzlösung und der anderen Ratte die in Beispiel 1 hergestellte Lösung des biologisch aktiven Stoffes eingespritzt. Gleichzeitig v/erden zwei Ratten, denen entweder eine physiologische Kochsalzlösung oder eine den biologisch aktiven Stoff enthaltende Lösung eingespritzt wurde, in den luftdichten Behälter gesetzt. Danach wird die Tür des Behälters geschlossen. Unmittelbar nach Schließen der Kastentür wird Stickstoff in den Behälter geleitet, wobei der Partialdruck des Sauerstoffs im Behälter allmählich erniedrigt wird. Das Verhalten der Ratten in dem Behälter wird beobachtet und das EEG der Ratten, die durch Gallamintriäthyljodid gelähmt wurden, gleichzeitig registriert. Wenn der Sauerstoffpartialdruck im Behälter unter den Wert für ischämische Bedingungen fällt und die Ratten auf ihrem Rücken liegen, wird die Tür geöffnet, um sofort Luft zutreten zu lassen. Die Erholung der Ratten wird hinsichtlich der Symptome und der Veränderungen des EEG's (vgl. Fig. 3) beobachtet. In Tabelle I sind die Ergebnisse des Versuchs zusammengefaßt,, bei dem der Zeitraum der Wiederkehr des Aufrichtereflexes, als Erholungsindex der Gehirnfunktion gemessen wird. Andere Symptome v/erden beobachtet und auf einem Registrierstreifen aufgenommen.

Durch die Ergebnisse wird bestätigt, daß der Stoff, der in der Fraktion IV (vgl. Fig. 1-(a)) enthalten ist, eine beschleunigende Wirkung auf die Erholung der Gehirnfunktion nach einer durch Anoxie hervorgerufenen Störung besitzt und daß bei den Ratten.,

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denen der erfindungsgemäße Stoff injiziert wurde, der Zeitpunkt, bei dem während einer Anoxie Cyanose auftritt, verzögert wurde.

Die vorstehend beschriebenen Versuche wurden wiederholt mit der Ausnahme, daß die Testsubstanz den Ratten nach dem Herausnehmen aus dem Behälter intravenös durch eine Schwanzvene injiziert wurde. Dabei wird geprüft, ob eine ähnliche beschleunigende Wirkung auf die Erholung der Gehirnfunktion nach Störung zu beobachten ist.

Tabelle I

Zeit zur Wiederherstellung des Aufrichtereflexes

	1	4l	[min.)	40 (	se
	2	2	Il	50	Il
	3	1	Il	20	Il
Kontrollversuch	4	4	Il	15	It
	5	3	Il	55	Il
	6	3	Il	05	It
	Mittel wert	3	Il	42	Il
	1 ,			40	Il
	2 '	1	Il	03	Il
Zugabe des erfindungs- 3 gemäßen Stoffes λ (Fraktion IV) 5	1	Il	15 50 40	ti Il Il
			55	It
			54
6
Mittel wert

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Legenden der Fi^. 1 bis

Fig. 1-(a) Eluierungskurven der mit der Fettsäure behandelten Eialbumine Fig. 1-(b) Eluierungskurven der ohne -Fettsäure behandelten Eialbumine

In den Fig. 1-(a) und 1-(b) sind die Kurven wie folgt definiert;

-.- ο -.- : O.D. bei 570 nm (Ninhydrinreaktion)

x _: o.D. bei 650 nm (Folin-Ciocalteu-Reaktion)

ο : O.D. bei 280 nm.

Fig. 2 DNP-ATPase-Schutz-Aktivität in Abhängigkeit vom zugegebenen Stoff und der Inkubationszeit der Mitochondrien im Rattengehirn.

Die Kurven haben folgende Bedeutung:

: Zugabe des erfindungsgemäßen Stoffs

(Fraktion PIV) in eine Menge von 0,1 mg

: Zugabe der Fraktionen P II und III in eine Menge von 5,0 mg

: Zugabe der Fraktionen P II und P III in eine Menge von 0,1 mg

ι Kontrollversuch.

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Fig. 3-(a) Elektroencephalogramm von Ratten, denen der erfindungsgemäße Stoff intervenös gegeben wurde

Fig· 3-(b) Elektroencephalogramm von Ratten, denen physiologi sche Kochsalzlösung als Kontrolle intravenös gegeben wurde.

In den Figuren 3-(a) und 3-(b) sind die Encephalogramme wie folgt unter folgenden Bedingungen gemessen worden:

a) Normalbedingung

b) Stickstoff mit 10 % Sauerstoffgehalt

c) Stickstoff mit 4 % Sauerstoffgehalt

d) 1 Minute nach Zutritt von Luft

e) 5 Minuten nach Zutritt von Luft

f) 10 Minuten nach Zutritt von Luft.

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Claims

Patentansprüche

Biologisch aktiver Stoff zur Verhinderung und Linderung von Gehirnfunktionsstörungen:

(1) Aussehen und Eigen- färb- und geruchlos schäften:

(2) Löslichkeit: leicht löslich in V/asser, schwer

löslich in Alkohol, Aceton und Diäthyläther

Stabil bei Raumtemperatur, beim Einfrieren und Auftauen (4) UV-Absorptionsspektrum: Absorptionsmaximum bei 280 nm

(3) Stabilität:

(5) Molekulargewicht:

(6) Farbreaktion:

(7) Dünnschichtchromatographie:

1000 bis 3000 (bestimmt durch Gelfiltration)

positive Ninhydrin-, Folin-ciocalteu- und Biuretreaktionen; negative Anthron-, Orcin- und Elson-Morgan-Reaktionen R_f = 0,355 + 0,075

Platte: mikrokristalline Cellulose Laufmittel: n-Butanol : Essigsäure : Wasser =3:1 : 1 Entv/icklungsbedingung: Raumtemperatur
Farbreaktion: Ninhydrin.

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2. Verfahren zur Herstellung des biologisch aktiven Stoffes, gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Albumin mit einer höheren Fettsäure umsetzt, das Umsetzungsprodukt mit einer Protease hydrolysiert und das Hydrolysat in üblicher Wei se fraktioniert, wobei man die Fraktion abtrennt, die die dini tr ophenolabhängi ge Adenosintriphosphata«*eaktivität schützt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Albumin Eialbumin verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als höhere Fettsäure Ölsäure, Linolsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure und Arachidonsäure verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Albumin mit der Fettsäure ungefähr 2 bis 5 Stunden bei Temperaturen von 30 bis 40⁰C unter Schütteln umsetzt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Umsetzung in Gegenwart des Natriumsalzes der Desoxycholsäure durchführt.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Protease Pronase verwendet.
8. Verfahren nach Anspruch 2 uiid 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die Hydrolyse 12 bis 36 Stunden mit Pronase bei Temperatüren von 30 bis 40 C in einem Puffer durchführt, der

. auf einen pH-Wert vom 7 bis 8 eingestellt ist. _

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9· Arzneimittel, bestehend aus dem biologisch aktiven Stoff gemäß Anspruch 1 und üblichen Trägerstoffen und/oder Verdünnungsmitteln und/oder Hilfsstoffen.

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