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Desaggregiertes Gammaglobulin und
Verfahren zu seiner Herstellung
Die Erfindung bezieht sich auf desaggregierte Gammaglobulin-präparate und ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Gammaglobulinfraktionen des menschlichen Serums haben sich bekanntlich infolge ihres Gehaltes an Antikörpern bei der Prophylaxe und Therapie zahlreicher Infektionskrankheiten ausgezeichnet bewährt. Im Gegensatz zu der bisher aus menschlichem Blutplasma isolierten Gammaglobulinfraktion vermag das gemäss der Erfindung erhaltene desaggregierte Gammaglobulin das Komplementsystem nicht zu inaktivieren. Das neue Gammaglobulin-Präparat kann intravenös angewendet werden, während die amikörperhaltigen Gammaglobulin-Präparate aus menschlichem Plasma bisher nur intramuskulär injiziert werden konnten.
Bei versuchter intravenöser Verabreichung solcher Präparate wurden schwerste Nebener- scheinungen wie Blutdruckabfall, Temperaturanstieg, Kreislaufstörungen u. dgl. beobachtet. Ihre schlechte Verträglichkeit stand demnach ihrer intravenösen Anwendung entgegen. Die genannten Nebenwirkungen wurden auch durch Anwendung von Antihistaminica oder von Serotonin-Antagonisten nicht aufgehoben. Anderseits wird die intravenöse Anwendung von Gammaglobulin angestrebt, weil sie eine Beschleunigung des Wirkungseintrittes der im Gammaglobulin enthaltenen Antikörper, eine bessere Ausnutzung des verabreichten Gammaglobulins und eine rationellere Dosierung des Präparates gewährleistet.
Durch neuere Untersuchungen mit markiertem Gammaglobulin wurde beispielsweise der Nachweis erbracht, dass etwa nur ein Drittel des intramuskulär verabreichten Gammaglobulins innerhalb des ersten Tages humoral nachweisbar ist. Ein zweites Drittel wird nur sehr verzögert an die Blutbahn abgegeben. Da weitere Mengen nicht in den Kreislauf gelangen, darf damit gerechnet werden, dass sie nicht für eine schnelle spezifische Abwehr zur Verfügung stehen.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines desaggregierten, das Komplementsystem nicht beeinflussenden Gammaglobulins gefunden, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die auf bekannte Weise, z. B. durch Ammonsulfatfällung oder Alkoholfällung, gewonnene Gammaglobulinfraktion des Serums bei einem pH-Wert von 1, 5 bis 5, 5 und einer Temperatur von 0 bis 500C 2 h bis 2 Tage lang mit Pepsin, z. B. mit 25 000-200 000 Einheiten Pepsin pro 100 g zu spaltendem Eiweiss, unter laufender Kontrolle der antikomplementären Wirkung und bis zur Beseitigung der Komplement inaktivierenden Wirkung behandelt, das so gewonnene desaggregierte Gammaglobulin auf bekannte Weise, z.
B. durch fraktionierte Fällung mit Neutralsalzen oder organischen Lösungsmitteln oder durch Ultrafiltration, von niedermolekularen Spaltprodukten abtrennt, sterilfiltriert und gegebenenfalls gefriertrocknet. Das Verfahrensprodukt zeigt folgende charakteristische Eigenschaften :
1.
Es hat keinen Einfluss auf das Komplementsystem des menschlichen Serums ;
2. es besitzt das volle Spektrum der im menschlichen Erwachsenenserum enthaltenen Antikörper ;
3. es erwies sich während einer einjährigen klinischen Prüfung bei etwa 500 intravenösen Applika- tionen als gut verträglich ;
4. es sedimentiert in der Ultrazentrifuge mit der Konstante S = 3, 0-5, 5 ;
5. die Komplementfaktoren C'1, C'2, C'3 und C'4 werden durch das Präparat nicht inaktiviert ;
6. es enthält je nach dem Ausgangsmaterial Antikörper gegen folgende Antigene :
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EMI2.1
<tb>
<tb> Diphtherie <SEP> Streptolysin <SEP> 0
<tb> Tetanus <SEP> Staphylokokken-Toxin
<tb> Typhus <SEP> Poliomyelitis <SEP> Typ <SEP> I-III
<tb> Paratyphus <SEP> Influenza
<tb> . <SEP> Pertussis <SEP> Mumps
<tb> Coli
<tb>
Die gute intravenöse Verträglichkeit des neuen Gammaglobulin-Präparates beruht insbesondere auf seiner Toleranz gegenüber dem Komplementsystem. Es ist bekannt, dass Gammaglobuline verschiedener
Herkunft Komplement, besonders aber den Komplementfaktor C'l des Human- und Meerschweinchen- serums, inaktivieren. Diese Eigenschaft besitzt schon die auf schonende Weise, z. B. durch präparative
Elektrophorese oder durch DEAE-Zellulose-Chromatographie erhältliche Hauptfraktion des antikörper- haltigen Gammaglobulins mit der Sedimentationskonstante S = 7.
In noch stärkerem Masse besitzen diese
Eigenschaften solche Gammaglobulin-Präparate, die auf 40 - 500C erhitzt wurden und deren Eigenschaft,
Komplement zu inaktivieren, mit der in der Ultrazentrifuge nach der Erhitzung der Gammaglobuline nachgewiesenen Aggregation parallel geht. Auch bei der Aufarbeitung z. B. mit Äthanol oder beim La- gern von Gammaglobulinen entstehen Aggregationsprodukte, deren Sedimentationskonstante in der Ultra- zentrifuge S = 8 - 12 beträgt. Am stärksten wird aber das Komplement durch das zum Gammaglobulinkomponentensystem gehörende Gamma-Makroglobulin mit der Sedimentationskonstante von S = 19 und höher als 19 inaktiviert.
Es wird heute allgemein angenommen, dass das Komplementsystem die Ursache immunpathologi- scher Folgereaktionen einer Antigen-Antikörperbindungsreaktion ist. Dabei werden enzymatisch Substan- zen freigelegt, die zu anaphylaktischen Reaktionen führen. Es war daher zu vermuten, dass Antikörper, die das Komplementsystem unbeeinflusst lassen, nicht zu den erwähnten Nebenreaktionen führen. Tatsächlich trifft dies für das nach dem vorliegenden Verfahren hergestellte, desaggregierte, antikörperhaltige Gammaglobulin zu.
Der Wirkungsunterschied verschiedener Gammaglobulin-Präparate und des erfindungsgemäss hergestellten, desaggregierten Gammaglobulins ist zwar schon durch Gesamtkomplement-Bestimmungen nachweisbar, jedoch wird er deutlicher erkennbar, wenn man Einzelkomplementfaktoren, insbesondere den Komplementfaktor C'l nach der von Fritzsche, Fischer, Schwick und Schultze (Klinische Wochenschrift 36 [1958], S. 100) angegebenen Methode bestimmt. Zweckmässig wird so vorgegangen, dass 1 ml Meerschweinchenserum (Komplement) mit einer bestimmten Menge Gammaglobulin, z. B. 5 mg bei 37 C im Wasserbad inkubiert wird und aus diesem Testansatz nach 1 h, 3 h und 5 h Proben zur Bestimmung der Komplementfaktorenaktivität entnommen werden.
Im übrigen wird die Verträglichkeit des neuen Gammaglobulin-Präparates wie folgt geprüft.
Verträglichkeit
1. Pyrogentest :
Die Prüfung auf Vorhandensein pyrogener Substanzen erfolgt am Kaninchen bei einer Dosierung von 10 ml des Präparates intravenös pro kg Körpergewicht.
2. Intravasale Blutdruckmessung :
Die intravenöse injektion von 5 ml des Präparates beim Kaninchen darf nicht zu einer Veränderung des Blutdruckes führen.
3. Verträglichkeit beim Tier :
Meerschweinchen müssen die intravenöse Injektion von 10 ml des Präparates pro 400 g Körpergewicht ohne ernsthaft Symptome tolerieren. Auch im anschliessenden Beobachtungszeitraum von 7 Tagen dürfen keine Krankheitszeichen feststellbar sein.
Das neue Präparat hat die gleichen Indikationen wie das bisher intramuskulär verabreichte Gammaglobulin. Seine Anwendung empfiehlt sich besonders für die Prophylaxe und Mitigierung von durch Viren und Bakterien verursachte Infektionskrankheiten, nämlich
EMI2.2
<tb>
<tb> Masern <SEP> Poliomyelitis
<tb> Hepatitis <SEP> Viruspneumonie
<tb> Varizellen <SEP> Virusencephalitis
<tb> Röteln <SEP> Herpes
<tb> Mumps <SEP> Infektiöse <SEP> Mononucleosis
<tb>
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Da das neue Präparat besonders schnell wirksam wird und intravenös auch in grossen Mengen unbedenklich verabreicht werden kann, ist es bei schweren Sepsisfällen, verursacht durch antibiotikaresistente
EMI3.1
B.lenden Immunstoffe substituieren.
Die therapeutische bzw. prophylaktische Anwendung des neuen Präparates kann mit der Injektions- spritze oder als Dauertropf erfolgen. Als Dosierungen haben sich z. B. die nachfolgenden bei den angege- benen Krankheiten bewährt :
EMI3.2
<tb>
<tb> Krankheit <SEP> Dosierung <SEP> (ml/kg) <SEP> Dauer <SEP> des <SEP> Schutzes
<tb> Hepatitis <SEP> (Prophylaxe) <SEP> 0, <SEP> 02 <SEP> 5-9 <SEP> Monate
<tb> Masern
<tb> Prophylaxe <SEP> 0, <SEP> 2 <SEP> 3-10 <SEP> Wochen
<tb> 4.-7.Tag <SEP> nach <SEP> Exp.
<SEP> 0, <SEP> 2-0, <SEP> 4
<tb> später <SEP> 0, <SEP> 5-1, <SEP> 0
<tb> Masernencephalitis <SEP> 2
<tb> Impfreaktionen <SEP> 0, <SEP> 4-0, <SEP> 6
<tb> Poliomyelitis <SEP> (Prophylaxe) <SEP> 0, <SEP> 3 <SEP> 1 <SEP> - <SEP> 8 <SEP> Wochen
<tb> Bakterielle <SEP> Infekte <SEP> 0, <SEP> 6-1
<tb> Antikörpermangelkrankheiten <SEP> 0, <SEP> 6-1 <SEP>
<tb>
Das Präparat in steriler, pyrogenfreier physiologischer Kochsalzlösung ist bei +4 bis +60C nach über 1 Jahr verwendungsfähig.
Beispiel l : 501 menschliches Serum werden mit destilliertem Wasser auf 851verdünnt, auf den pH-Wert 7, 0 eingestellt und mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung bis zu 45% Sättigung versetzt. Die Fällung, d. h. die Gammaglobulinrohfraktion, wird durch Zentrifugation isoliert, in destilliertem Wasser gelöst und auf 70 l aufgefüllt. Nach der Ermittlung der Komplement-inaktivierenden Wirkung (vgl. Ta-
EMI3.3
proteolytischer Einwirkung unterworfen. Eine Probe des Reaktionsgemisches wird filtriert, das Filtrat auf den pH-Wert 7, 0 eingestellt und erneut auf Komplement inaktivierende Wirkung geprüft (vgl. Tabelle 1).
Die Hauptmenge des Reaktionsgemisches wird nunmehr wie die Probe aufgearbeitet und durch Ultrafiltration von niedermolekularen Spaltprodukten befreit. Nach einer Sterilfiltration wird der Eiweissgehalt auf 5, oxo eingestellt. Die Sedimentationskonstante der Hauptkomponente (85-88%) der so erhaltenen Lösung beträgt S = 5, 3, die einer Nebenkomponente von 12 bis 15% etwa S = 3, 5.
EMI3.4
der im Serum vorhandenen nunmehr das Komplementsystem nicht beeinflussenden Gammaglobuline. Wie aus der folgenden Tabelle hervorgeht, inaktiviert das desaggregierte Gammaglobulin nicht das Komple- mentsystem.
Erläuterung zur Tabelle 1
Die in Tabelle 1 angeführten Untersuchungsergebnisse lassen erkennen, dass die geprüfte Gammaglobulin-Rohfraktion in starkem Masse Komplement inaktiviert. Hiebei hängt die Inaktivierung des Komplements von der Inkubationszeit ab. Den stärksten Einfluss hat die Gammaglobulin-Rohfraktion auf den Komplementfaktor C'l und C'4.
Aus derTabelle geht weiter hervor, dass das desaggregierte Gammaglobulin praktisch keine Komplement inaktivierende Wirkung mehr besitzt und dass die Prüfungsergebnisse bei der dem Versuchsansatz entnommenen Probe und der aufgearbeiteten Hauptmenge gut übereinstimmen.
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Tabelle 1
EMI4.1
<tb>
<tb> % <SEP> Komplement-Inaktivierung <SEP> (37 C) <SEP> *
<tb> 1 <SEP> ml <SEP> Meerschweinchenserum
<tb> (Komplement) <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 5 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 5 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 5 <SEP> h <SEP> 1 <SEP> h <SEP> 3 <SEP> h <SEP> 5 <SEP> h
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> y-Globulin
<tb> Rohfraktion <SEP> :
<SEP> 17 <SEP> 65 <SEP> 80 <SEP> 15 <SEP> 30 <SEP> 38 <SEP> 10 <SEP> 25 <SEP> 36 <SEP> 20 <SEP> 37 <SEP> 60
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> desaggregiertes
<tb> y <SEP> -Globulin <SEP> (Probe) <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 7 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 5
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> desaggregiertes
<tb> #-Globulin <SEP> (Hauptmenge) <SEP> : <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 4 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
*) C'I, C'2, C'3 und C'4 sind verschiedene Komplementfaktoren des Meerschweinchenserums
1 h, 3 h und 5 h sind Einwirkungszeiten in Stunden (h).
EMI4.2
Beispiel 2 : 10 1 einer 16'Yoigen Lösung von nach dem Verfahren von J. Horejsi und R. Smetana (Act. med. Scand. 155 [1956], S. 65) mittels 2-Äthoxy-6,9-diamino-acridin gewonnenem Gammaglobulin werden mit physiologischer Kochsalzlösung auf 100 1 verdünnt, mit Essigsäure auf den pH-Wert 5, 0 eingestellt, pro 100 g Eiweiss mit 160 000 Einheiten Pepsin versetzt und 36 h bei 400C dessen proteolytischer Einwirkung unterworfen. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel l.
Die Ausbeute beträgt 19 1 einer 5%igen Lösung von desaggregiertem Gammaglobulin (Prüfungen Tabelle 2), entsprechend etwa 6CJ1/o des im Ausgangsmaterial befindlichen Gammaglobulins.
Tabelle 2
EMI4.3
<tb>
<tb> % <SEP> Komplement-Inaktivierung <SEP> nach <SEP> 3 <SEP> h <SEP> (370C)
<tb> 1 <SEP> ml <SEP> Meerschweinchenserum <SEP> C'1 <SEP> C'2 <SEP> C'3 <SEP> C'4
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> y-GlobulinAusgangsmaterial <SEP> 80 <SEP> 42 <SEP> 40 <SEP> 65
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> desaggregiertes
<tb> #-Globulin <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0
<tb>
Beispiel 3: 10 1 einer 16%igen Lösung von nach dem Verfahren von H. E. Schultze, M. Schönenberger und H. D. Matheka (Behringwerk-Mitteilungen 26 [1952], S. 21) hergestelltem Gammaglobulin werden wie in Beispiel 2 aufgearbeitet.
Die Ausbeute beträgt 19,5 1 einer Steigen Lösung von desaggregiertem Gammaglobulin (Prüfung Tabelle 3) entsprechend etwa 60% des im Ausgangsmaterial befindlichen Gammaglobulins.
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Tabelle 3
EMI5.1
<tb>
<tb> ja <SEP> Komplement-Inaktivierung <SEP> nach <SEP> 3 <SEP> h <SEP> (37 C)
<tb> 1 <SEP> ml <SEP> Meerschweinchenserum <SEP> C'1 <SEP> C'2 <SEP> C'3 <SEP> C'4
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> y-GlobulinAusgangsmaterial <SEP> 65 <SEP> 38 <SEP> 35 <SEP> 50
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> desaggregiertes
<tb> y-Globulin <SEP> 0 <SEP> U <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Beispiel 4 : 10 1 einer 16% gen Lösung von nach dem Verfahren von E. J. Cohn und Mitarbeiter (J. Amer. Chem.
Soe. 68 [1946], S. 459) durch Fraktionierung mit Alkohol gewonnenem Gammaglobulin werden mit physiologischer Kochsalzlösung auf 70 1 verdünnt, mit Essigsäure auf den pH-Wert 4, 5 eingestellt, pro 100 g Eiweiss mit 200000 Einheiten Pepsin versetzt und 24 h lang bei 400C dessen proteolytischer Einwirkung unterworfen. Die weitere Aufarbeitung erfolgt wie in Beispiel 2.
Die Ausbeute beträgt 20,5 1 einer 5% igen Losung von desaggregiertem Gammaglobulin (Prüfung Tabelle 4), entsprechend etwa 64% des im Ausgangsmaterial befindlichen Gammaglobulins.
Tabelle 4
EMI5.2
<tb>
<tb> % <SEP> Komplement-Inaktivierung <SEP> nach <SEP> 3 <SEP> h <SEP> (370C)
<tb> 1 <SEP> ml <SEP> Meerschweinchenserum <SEP> C'l <SEP> C'2 <SEP> C'3 <SEP> C'4 <SEP>
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> y-GlobulinAusgangsmaterial <SEP> 75 <SEP> 42 <SEP> 39 <SEP> 67
<tb> + <SEP> 0, <SEP> 1 <SEP> ml <SEP> = <SEP> 5 <SEP> mg <SEP> desaggregiertes
<tb> #-Globulin <SEP> 2 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 1
<tb>
Beispiel 5 : 10 l 16loige, nach dem Verfahren von H. E. Schultze, M. Schönenberger und H. D.
Matheka (Behringwerk-Mitteilungen 26 [1952], S. 21) hergestellte Gammaglobulinlösung werden mit physiologischer Kochsalzlösung auf 80 l verdünnt, mit Essigsäure auf den pH-Wert 4, 5 eingestellt, mit 120 000 Einheiten Pepsin pro 100 g Eiweiss versetzt und 28 h bei 400C zur Reaktion gebracht. Das Reaktionsgemisch wird filtriert, auf den PH-Wert 7, 0 eingestellt und durch Ultrafiltration von niedermolekularen Anteilen befreit. Nach einer Sterilfiltration wird die Gammaglobulinlösung (52 l 2% ige Lösung) an der Gefriertrocknungs-Apparatur lyophilisiert.
Ausbeute : 1, 48 kg Trockenprodukt mit 70, 3% desaggregiertem Gammaglobulin (Rest NaCl), somit 697o Ausbeute an Gammaglobulin. Prüfung auf Komplementbeeinflussung in Tabelle 5.
Tabelle 5
EMI5.3
<tb>
<tb> 0/0 <SEP> Komplement-Inaktivierung <SEP> nach <SEP> 3 <SEP> h <SEP> (37 C)
<tb> 1 <SEP> ml <SEP> Meerschweinchenserum <SEP> C'l <SEP> C'2 <SEP> C'3 <SEP> C'4 <SEP>
<tb> 5 <SEP> mg <SEP> y-Globulin <SEP> Ausgangsmaterial <SEP> 65 <SEP> 38 <SEP> 35 <SEP> 50
<tb> 5 <SEP> mg <SEP> desaggregiertes <SEP> y-Globulin
<tb> vor <SEP> Lyophilisierung <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> 5 <SEP> mg <SEP> desaggregiertes <SEP> y-Globulin
<tb> nach <SEP> Lyophilisierung <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb>