DE1667908C

DE1667908C - Polyvalenter Impfstoff gegen Pseudo monas aeruginosa Infektionen

Info

Publication number: DE1667908C
Authority: DE
Inventors: Myron Wolf Bloomfield Hills Hanessian Stephen Ann Arbor Mich Fisher (V St A)
Original assignee: Parke, Davis & Co , Detroit, Mich (V St A)
Publication date: 1971-07-08

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue, für die Immunisierung gegen lnl'ek;ionen mit Pscudomonas tieruginosn bruuehbure polyvalenle Antigenproduktc und polyvnlcnte Globiilinprodukte, In der vorliegenden Beschreibung bezeichnet der Begriff »polyvalent« das Vorhandensein von zwei oder mehreren Antigcnen oder Antikörpern mit nicht identischen Immunisierungseigensuhaften, die durch Slandardschutzversuche unter Belastung mit verschiedenen Stämmen der zu untersuchenden Mikroorganismen oder durch entsprechende serologische Standardversuche voneinander unterschieden werden können,

Die erfindungsgemäßen polyvalenten Anligenproduktc werden hergestellt, indem die von bestimmten einzelnen Stämmen von Pseudomonas aeruginosa erhaltenen immunisierenden Antigene kombiniert werden. Die einzelnen Stämme von Pseudomonas aeruginosa, die bei der Herstellung der neuen erfindungsgemäßen polyvalenten Antigenprodukte die besten Ergebnisse liefern, wurden ausgewählt, indem zahlreiche Pseudomonas aeruginosa Stämme aus weit auseinander liegenden Standorten geprüft und untersucht wurden, Von jedem dieser einzelnen Pseudomonas aeruginosa Stämme wurden Kulturen in der Kullurensammlung der Fa. Parke, Davis & Company in Detroit, Michigan und der Northern Utilization Research and Development Division, U. S. Department of Agriculture, in Peoria, Illinois unter den in der folgenden Aufstellung angeführten Nummern hinterlegt.

Parke, Davis & Company	Northern Utilization Research
Nr.	and Development Division Nr.
05074	NRRL-B-3198
05139	NRRL-B-3200
05140	NRRL-B-3201
05141	NRRL-B-3202
05142	NRRL-B-3203
05143	NRRL-B-3223
05144	NRRL-B-3224

Die NRRL-Bezeichnungen der obigen Tabelle kennzeichnen Mikroorganismen, die die charakteristischen Eigenschaften aufweisen und nicht nur individuelle Kulturen, die in einer spezifischen Kulturensammlung gehalten werden. Jeder der oben aufgeführten Stämme unterscheidet sich von anderen Pseudomonas aeruginosa Stämmen hauptsächlich dadurch, daß jeder Stamm einen anderen immunologischen Typus darstellt. So identifiziert das aus dem Stamm NRRL-B-3198 erhaltene immunisierende Antigen den Stamm NRRL-B-3198 und unterscheidet ihn von anderen Pseudomonas-aeruginosa-Stämmen.

Die crfintliingsgemäßen polyvalenten Antigcnprodukle werden durch Kombinieren der immunisierenden Antigene aus den Pscudomonas-aeruginosa-Stämmen NRRL-B-3198 und NRRL-B-3200 hergestellt. Sie können wahlweise auch ein oder mehrere zusätzlich immunisierende Antigene aus einem der Stämme NRRL-B-3201, NRRL-B-3202, NRRL-B-3203. NRRL-B-3223 und NRRL-B-3224 einhalten. Lin bevorzugtes erfindungsgemälks poly^alentes Anligenprodukl enthält immunisierende Antigene aus mindestens sechs, vorzugsweise allen sieben angegebenen Stämmen. Die pnlyvalcnlen Anligcnprodiikte können durch Gewinnen und Kombinieren der einzelnen Aniline, durch unmittelbares Gewinnen eines Misch.-Antigens aus einer Kombination von mindestens zwei Stämmen oder durch Abwandlungen dieser Arbeitsweisen, bei denen das gewünschte Antigengemisch im Endprodukt erscheint, hergestellt werden, Die polyvalenten Antigenprodukte können Gemische der rohen Antigene, teilweise gereinigte Antigene oder hochreine Antigene sein,

Das Wesen der Erfindung, die ja die polyvalenten Antigenprodukte betrifft, liegt in der Kombination

ίο von immunisierenden Antigenen aus entsprechend ausgewählten Stämmen von Pseudomonas aeruginosa, weniger in der exakten Arbeitsweise, nach der jedes Antigen gewonnen wird Das Antigen kann z. D. aus der Zellmasse des ausgewählten Stammes mit einer

is ganzen Reihe von Lösungsmitteln extrahiert werden. Brauchbare Lösungsmittel sind wäßrige Lösungen von Trichloressigsäure, Phenol, Lithiumbromid, Lithiumbromid-Guanidinhydrochlorid, Perchlorsäure, Salzsäure, Natronlauge oder Kalilauge. Ein bevorzugtes

ao Extraktionsmittel ist wäßrige Trichloressigsäure. Gemäß einer Methode zur Gewinnung wird die feuchte Zellmasse zunächst einmal oder mehrere Male mit destilliertem Wasser suspendiert, die Suspension gut gemischt und mit einer wäßrigen Trichloressigsäure-

lösung vermischt. Das Volumen wird mit kaltem destilliertem Wasser auf eine Endkonzentration an Trichloressigsäure vun 8 bis 16°/₀, vorzugsweise 10 bis 12°/o (Gew.-/Vol.), eingestellt. Die Suspension wird 12 bis 20 Stunden bei 0 bis 5° C gerührt und dann zentrifugiert. Die überstehende wäßrige Lösung wird abdekantiert der feste Rückstand mit Wasser gewaschen und die Waschwässer mit der wäßrigen Lösung vereinigt. Die wäßrige Lösung wird mit einem organischen Lösungsmittel, z. B. mit Äther oder Äthyl- acetat neutral oder schwach sauer gewaschen, kurz durchlüftet, um das restliche organische Lösungsmittel zu entfernen, und dann gegen kaltes destilliertes Wasser dialysiert und lyophylisiert Man erhält ein rohes Pseudomonas aeruginosa Antigen, das für den ver wendeten Stamm oder die verwendeten Stämme cha rakteristisch ist. Das Extraktionsverfahren kann mit der Zellmasse eines einzelnen Stammes oder mit der kombinierten Zellmasse von zwei oder mehreren Stämmen durchgeführt werden. Es kann auch mit einem beliebigen der zahlreichen anderen genannten Lösungsmittel durchgeführt werden.

Die extrahierten Antigene werden einzeln oder im Gemisch miteinander auf beliebig bekannte Weise gereinigt, z. B. durch Wiederausfällen aus einer wäß rigen Lösung durch Zugabe eines niederen Alkohols. Hierzu wird beispielsweise das rohe Antigen oder Antigengemisch in O,ln-Natriumacetatlösung gelöst, die Lösung auf 0 bis 5°C gekühlt und langsam mit etwa 6 Volumina eines mit Wasser mischbaren niederen Alkanols wie Methanol oder Äthanol versetzt. Das ausgefällte Antigen oder Antigengemisch wird gesammelt und in Wasser gelöst und die Lösung gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophylisiert, um das teilweise gereinigte Antigen oder Antigengemisch zu

e.i erhalten. Gemäß einem anderen Reinigungsverfahren wird die wäßrige Lösung des Antigens oder Antigengemisches auf einer geeigneten Gclfillrations- oder lonenauslauscherkolonne fraktioniert. Die Kolonne kann mit beliebigen bekannten Gelliltrations- oder loneiKiustauscherstoffen gefüllt werden. Geeignete (jelliltraiionssloffc sind vernetzte Polysaccharide wie Dextran oder Polyacrylamide; geeignete Λ η ionenaustauscher werden durch [Einführen von Diälhylamino-

3 4

,thylgriippen in durch Vernetzen von Dextran erhaltene ED₆₀ kann in ng/kg Maus angegeben, werden, wobei icle oder in Cellulose erhalten Wenn zur Reinigung ein ng definiert, ist als 0,001 μ§.
Jelhltrutionsstonc Verwendung finden, werden solche Die als Ausgangsmaterinl bei der Gewinnung der Kjvorzugt, die einen geeigneten Porendurchmesser erundungsgemillkn polyvalenien Antigene und Vucmben, um Teilchen mit einem mittleren Molekular- 5 eine verwendeten Kulturen vom Pseudomomts aeruicwicht über etwu 100 000 bis 200 000 nicht zu adsor- ginosa können unter Anwendung von aseptischen bieren. Unter diesen Bedingungen durchlaufen die Arbeitsweisen folgendermaßen erhalten werden. Eine gercinigtun Antigene die Kolonne schnell, während Schrägkultur des gewühlten Stammes auf einem entdie Bcgleitstoffe mit niederem Molekulargewicht zu- sprechenden Agar-Medium wird bei 35 bis 3S⁰C 12 nickgehalten bzw. verzögert abgegeben werden. io bis 24 Stunden oder bis zum Auftreten eines sicht-So wird z, B, ein rohes Antigen oder Antigen- baren Wachstums gezüchtet. Darauf werden die gemisch in einem Mindestvolumen Phosphatpuffer Organismen von der Oberfläche des Schrägagars gevom pH-Wert 7 gelöst. Diese Lösung wird einer zuvor sammelt und in sterilem'destilliertem Wasser suspenmit dem Phosphatpuffer äquilibrierten Gelfiltrations- ' diert. Diese Zcllsuspension wird dann auf eine Schüttelkolonne der obengenannten Art aufgegeben und die 15 flasche, die ein geeignetes flüssiges Nährmedium ent-Elulion mit zusätzlichen kleinen Anteilen Phosphat- hält, überimpft und die Schüttelfiasche 8 bis 18 Stunpuffer fortgesetzt. Das aus der Kolonne ausströmende den bei 35 bis 38⁰C mechanisch geschüttelt Diese Eluat wird portionsweise aufgefangen, um das gerei- zweite Vorkultur wird auf Fermenter überimpft, die nigte Antigen oder Antigengemisch wiederzugewinnen. ein geeignetes flüssiges Nährmedium enthalten. Das Die Lage des Antigens kann mit Hilfe eines koiori- so beimpfte Medium wird bei 35 bis 38° C gehalten und metrischen Testes für Kohlehydrate unter Verwendung 8 bis 18 Stunden mit einer Geschwindigkeit von 1 von Phenol-Schwefelsäure-Reagens in Verbindung bis 2 Volumina Luft/Volumen Medium in der Minute mit dem beobachteten Auftreten und Verschwinden belüftet. In regelmäßigen Abständen werden Proben einer Opahszenz in dem ausströmenden Eluat ver- entnommer, um die Lebensfähigkeit und Reinheit zu folgt werden. Das gereinigte Antigen ist auch durch 25 prüfen; das Wachstum wird durch Trübungsmessung seine geringe oder gar nicht vorhandene selektive verfolgt.

UV-Absorption gekennzeichnet, während ausströ- Nach der oben angegebenen Zeit wird gewöhnlich mende Eluatfraktionen mit starker UV-Absorption die Kultur auf beliebig gebräuchliche Weise, bei der nukleinsäureartige Verbindungen enthalten und im die Antigenaktivität nicht zerstört wird, abgetötet, allgemeinen eine viel geringere Antigenaktivität auf- 30 Bevorzugt wird die Zellkultur durch Zugabe von weisen. Das antigenhaltige Eluat wird gegen destillier- Phenol bis zu einer Konzentration von l°/₀ (Gew./ les Wasser dialysiert und lyophylisiert, um das gereinigte Vol.), mechanisches Rühren mit Phenol behandelten Antigen oder Antigengemisch als Pulver zu erhalten. Kultur während 30 bis 60 Minuten und Stehenlassen Vorzugsweise wird das ursprünglich rohe Antigen bei 35 bis 38⁰C während 2 bis 5 Stunden abgetötet, zur Reinigung zunächst mit einem niederen Alkanol 35 Die mit Phenol abgetöteten Zellen werden abzentriausgefällt und dann auf eineir Gelfiltrationskolonne fugiert. Die feuchte Zellmasse kann unmittelbar verfraktioniert, wendet oder im gefrorenen Zustand gelagert und unmit-Die erfindungsgemäßen polyvalenten Impfstoffe telbar vor der Verwendung aufgetaut werden. In werden aus den oben beschriebenen polyvalenten zufriedenstellender Weise kann das Antigen auch aus Antigenen hergestellt, indem diese in einem für paren- 40 lebenden Zellen mit geeigneten Lösungsmitteln extraterale Verabfolgung geeigneten wäßrigen Medium hiert werden; in diesem Falle können das Abtöten gelöst werden. Hierzu wird eine Lösung des gewählten der Zellen und die Antigenextraktion nebeneinander polyvalenten Antigens in einem sterilen wäßrigen erfolgen.

Medium vom pH-Wert etwa 6 bis 8 bereitet. Das Die erfindungsgemäßen polyvalenten Antigene und

polyvalente Antigen wird z. B, unter sterilen Bedin- 45 Impfstoffe stimulieren die Bildung von schützenden

gungen in physiologischer Kochsalzlösung, gepuffert Antikörpern. Bei parenteraler Verabreichung bewirken

auf pH-Wert 7,0 bis 7,5, bis zur geeigneten Antigen- sie eine Immunität nicht nur gegenüber den zu ihrer

konzentration gelöst, die für jedes einzelne vorliegende Herstellung verwendeten Stämm;n von Pseudomonas

Antigen z. B. 0,05 bis 0,50 mglcm³ beträgt. Dann wird aeruginosa, sondern auch gegenüber der Infektion

ein Konservierungsmittel zugegeben. Ein geeignetes 50 durch zahlreiche andere Pseudomonas aeruginosa

Konservierungsmittel ist z. B. Thiomersal in einer Stämme.

Endkonzentration von 0,01 °/₀(Gew./Vol.). Die Lösung Der gramnegative Bazillus Pseudomonas aeruginosa wird gegebenenfalls zur Klärung zentrifugiert und verursacht schwere und manchmal tödliche Infektionen, dann sterilisiert. Nach den üblichen Wertbestim- Es stehen nur sehr wenige Arzneimittel oder Antimungen und Sterilitätskontrollen steht sie als Impf- 55 biotica zur Behandlung dieser Infektionen zur Verstoff zur Verfügung. fügung, und manchmal wirken die zur Verfügung Bei der Werlbestiinmung wird verschiedenen Grup- stehenden Mittel nicht mehr gegen bereits fortgeschritpcn von Mäusen jeweils eine subkutane Injektion des tene Infektionen. Außerdem konnten bisher keine polyvalenien Antigens oder Vaccins in physiologischer zufriedenstellenden vorbeugenden spezifischen Schutz-Kochsalzlösung in abgestuften Mengen verabfolgt. 60 maßnahmen gegen Infektionen durch Pseudomonas 3 bis 7 Tage später werden die Mäuse intraperitoneal acruginosa entwickelt werden Die schweren Pscudomit etwa dem lOOfachen der mittleren letalen Dosis monas-acruginosa-Infeklionen tret:n beim Menschen (100LDr₁₀) von Kulturen verschiedener Stämme von sowohl als primäre Krankheit als auch als kompli-Pseudom'onas aeruginosa in 0,5 cm^a 5°/_oigen Mucin zierender Faktor bei anderen Krankheiten auf.
belastet. Für den Augenspiegel wird die Zahl der nach 65 Bisher konnte ein aus einem beliebigen einzelnen 7 Tagen überlebenden Tiere bestimmt und der Schul/.- Stamm von Pseudomonas aeruginosa gewonnenes wert als Effektive Dosis 50 (ED,,,,), das ist die Dosis, Antigen keine allgemeine Immunität gegen l'seudo-Hi-i der 50"/,, der Tiere überleben, ausgedrückt. Die monas aeriiginosa hervorrufen. Die Erklärung hierfür

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τ mm

liegt darin, duß Pseudomonas aeruginosn in eine terale Injektion eines erfindungsgemäßen polyyalenten

unbekannte Anzahl von Antigen-Serotypen zerfällt. Antigens bzw. Impfstoffs das (der) die immunisierenden

Die Zahl der Serotypen oder Untergruppen von Pseu- Antigene der Stämme NRRL-B-3198 und NRRL-

domonus aeruginosa wurde verschiedentlich mit 2, B-3200 sowie gegebenenfalls immunisierende Anti-

4, 14, 25 und 29 angegeben. 5 gene aus einem oder mehreren der Stumme NRRL-

Ks war daher Überraschend, daß die erfindungs- B-3201, NRRL-B-3202, NRRL-B-3203. NRRL-gemäßcn polyvalcnten Anligcnc und Impfstoffe, die B-3223 und NRRL-B-3224 enthält. Gegebenenfalls eine relativ kleine Anzahl Antigene bestimmter Stämme können den Spendern auch die im polyvalenlen von Pseudomonas aeruginosa enthalten, Immunität Antigen enthaltenen Antigene einzeln verabfolgt wergegenübcr sehr vielen der wahllos angetroffenen Stäm- xo dsn. Das polyvalente Antigen wird in einem gebrauchmen von Pseudomonas aeruginosa bewirken. Ein liehen wäßrigen Medium gegebenenfalls in Gegenwart erliiulungsgcmäßes bivalentes Antigen bzw, der ent- eines Zusatzmittels wie Aluminiumphosphal zur Versprechende Impfstoff bewirkt Schutz gegen die In- Wendung bereitgestellt. Die Injektion erfolgt am fektion durch mehr als die Hälfte der willkürlich besten intramuskulär oder subkutan mit einem geeigaiiBctroffencn Stämme. Ein crfindungsgemäßcs hexa- »5 neten Volumen, z. B. 0,1 bis 1,0 cmA Zwar kann auch valentcs Antigen bzw, der entsprechende Impfstoff eine einzige Injektion verabfolgt werden, bevorzugt bewirkt Schutz gegen Infektion durch mehr als 80°/₀ wird jedoch eine Reihe von lnjjktionen, z. B. drei der wahllos angetroffenen Stämme, und ein erfindungs- Injektionen oder mshr in Abständen von mehreren gemäßes heptavalentes Antigen bzw. der entsprechende Tagen bis zu mehreren Wochen, gegebenenfalls gefolgt Impfstoff bewirkt Schutz gegen Infektion durch mehr ao von einer »auffrischenden« Injsktion zu einem späteren als 95°/₀ wahllos angetroffener Stämme. Wo eine Zeitpunkt. Die Höhe der Dosis ist von Bedeutung; Schutzwirkung beobachtet wird, schwankt das Aus- es wird um so mshr Immunglobulin produziert, je maß des Schutzes etwas je nach dem zur Infektion größer die Gesamtmenge an injizisrtem Antigen ist. verwendeten Stamm. Im allgemeinen beträgt die Gesamtmenge an verab-

Erlindungsgemäß werden auch polyvalente Pseudo- as folgtem polyvalentem Antigen 0,1 bis 10,0 m% pro

monas Immunglobulinstoffe hergestellt, indem die Individuum, verabfolgt während eines Zeitraums von

polyvalenten Antigene bzw, die polyvalenten Impf- 7 Tagen bis zu 1 Jahr.

stoffe nach der Erfindung geeigneten Wirten verab- Nach der Immunisierung wird den Spendern das

folgt und nach einer gewissen Zeitspanne die Immun- Blut zur weiteren Verarbeitung abgenommen. Der

globuline aus den Wirten gewonnen werden. Die 30 Zeitpunkt der Blutentnahme ist wesentlich bei der

Pseudomonas-lmmunglobuline können als gereinigte Herstellung eines Immunglobulinproduktes mit

)'-Globulinfraktionen oder als Gesamtblut Immun- hohem Antikörperspiegel. Für gewöhnlich läßt man

stoffe, Immunplasmen oder Immunsera, erhalten wer- mindestens 7 Tage, im allgemeinen eine längere Zeit

den. Diese erfindungsgemäß gewonnenen Produkte vergehen, bevor das Blut abginomtun wird. Ganz

sind sogenannte »Hyperimmun«-Produkte, weil sie 35 allgemein wird das Blut vorzugsweise dann abgenom-

eine größere Menge Antikörper enthalten, als im men, wenn es möglichst viel sogenannte 7S- oder

Gesaintblut, Plasma, Serum oder einer gereinigten IgG-Globuline und weniger 19S- oder IgM-Globuline

Globulinfraktion eines unbehandelten Spenders ent- enthält. Die 7S-Globuline haben ein relativ niederes

halten sind. Molekulargewicht als die 19S-Globuline und werden

Das Verfahren, Spendern Blut abzunehmen und 40. im allgemeinen zu einem etwas späteren Zeitpunkt

nach verschiedenen Arbeitsweisen zu einem Gesamt- der Immunglobulinreaktion gebildet. Ein hoher An-

blut Immunprodukt, einem Immunplasma, Immun- teil an 7S-Globulin wird deshalb bevorzugt, weil es

serum oder einem gereinigten Immunglobulin aufzu- a) ziemlich gleichmäßig im ganzen Körper verteilt ist,

arbeiten, ist dem Fachmann geläufig. Die erfindungs- b) eine längere »Halbwertszeit« aufweist, c) überwiegend

gemäße Verbesserung dieses Verfahrens liegt darin, 45 antibakterielle Antikörper enthält und d) während

daß den Spendern vor der Blutentnahme eine oder der Schwangerschaft leichter vom mütterlichen Orga-

mehrere Dosen eines polyvalenten Pseudomonas- nismus in den Embryo übergeht. Dieser letztere Um-

acruginosa-Antigens parenteral verabfolgt werden, das stand ist deshalb bedeutsam, weil Frühgeburten sehr

die immunisierenden Antigene der Stämme NRRL- anfällig für Pseudomonas-Infektionen sind. Im all-

B-3198 und NRRL-B-3200 und gegebenenfalls min- 50 gemeinen werden ein hoher Antikörpjrspiegel und ein

destens ein weiteres immunisierendes Antigen der hoher A.nteil an 7S-Globulin erzielt, wsnn." mit dir

Stämme NRRL-B-3201, NRRL-B-3202, NRRL- Blulabnahme einige Wochen nach der Immunisierung

B-3203, NRRL-B-3223 und NRRL-B-3224 enthält. begonnen wird. Die bevorzugten Zeiten können jedoch

Als Wirte für die Verabfolgung des polyvalenten noch enger dadurch bestimmt werden, daß von Zeit

Antigens und darauffolgende Gewinnung eines Im- 55 zu Zeit kleine Blutproben entnommen und serologisch

munglobulinproduktes kommen Pferde, Kühe, HQh- auf Pseudomonas Antikörper und 7S- und 19S-GIo-

ner, Kaninchen und andere Tiere in Frage. Die Ver- buline untersucht werden. Der Test hinsichtlich 7S-

wendung dieser Wirte ist jedoch mit gewissen Nach- und 19S-Globulin ist ein bekannter Haemaggluti-

teilen verbunden. So kann z. B. nach der Injektion nationstest, der auf der Vorbehandlung des Serums

von Pferde-Immunserum Serumkrankheit auftreten. 60 mit 2-Mercaptoäthanol beruht. Das 2-Mercaptoätha-

Der Mensch wird daher als Wirt bei dem erfindungs- nol zerstört das 19S-Globulin und läßt das 7 S-Globulin

gemäßen Verfahren stark bevorzugt, und die nach- relativ intakt.

folgende Beschreibung bezieht sich darauf, daß als Die Blutentnahme erfolgt auf beliebig bekannte

Blutspender Menschen zur Verfugung standen. Weise. Eines der geeigneten Verfahren ist die Plasmi-

Bei der Durchführung des Verfahrens werden die 65 pheresis, bei der die Blutzcllen abgetrennt und dem

vorgesehenen Blutspender, vorzugsweise gesunde Spender wieder zugeführt werden.

Erwachsene für ein Immunisierungsschema ausge- Das von den Spendern abgenommene und gesam-

sucht. Jeder Spender erhält mindestens eine parcn- melte Blut wird in bekannter Weise zu einem Immun-

globulin entweder in der Form einer gereinigten GIobulinfraktion oder in der Form cinesGesamtblutimmunproduktes, zu einem Immunplasma oder zu einem Immunserum wcilerverarbeilet. Die gereinigte y-Globulinfraktion wird im allgemeinen durch Fällung mil kaltem Alkohol nach Colin erhalten (Encyclopedia of Chemical Technology, Bd. 2, S. 556 bis 584 [1948]). Es können auch andere bekannte Verfahren angewandt werden, so z. B. die Fällung mit Ammoniumsulfat, elektrophoretisch^ Verfahren, chromatographische Verfahren Gelfiltration. Eine bevorzugte Form des Produktes ist eine sterile wäßrige Lösung des gereinigten y-G'obulins. Diese Lösung enthält etwa 165 mg/cm³ gereiuigles Globulin, gelöst in einer 2,25°/_oigen Glycinlösung und enthaltend 0,2°/₀Natriumchlorid und 0,01 °/₀ Thimerosal als Konservierungsmittel, eingestellt auf pH 6,8 mit Natriumacetatpuffer. Bei der Antipseudomonastherapie kann dieses Produkt in einer Dosierung von etwa 0,01 bis 0,5 cm³ je 454 g Körpergesvicht injiziert werden. Bevorzugt wird intramuskulär injiziert.

Die erfindungsgemäßen polyvalehten Immunglobulinprodukte sowie die zu ihrer Herstillung verwendeten poiyvalenten Antigene und Impfstoffe immunisieren gegen einen unerwartet hohen Anteil der willkürlich auftretenden Stämme von Pseudomonas aeruginosa.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher beschrieben.

Beispiel 1

90 g feuchte Zcllmassedes Pseudomonas-aeruginosa-Stamms NRRL-B-3203 wurde zweimal mit Wasser gewaschen und dann in 150 cm³ kaltem destilliertem Wasser suspendiert. Die Suspension wurde gemischt, mit einer Lösung von 60 gTrichloressigsäure in 150 cm³ Wasser versetzt und erneut gemischt. Die Suspension wurde mit destilliertem Wasser auf 550 cm^a verdünnt und 16 Stunden bei 0⁰C gerührt. Hierauf wurde die Suspension zentrifugiert, die überstehende wäßrige Lösung abdckanliert, der Rückstand zweimal mit jeweils 100 cnv' Wasser gewaschen und die Waschwässer mit der wiiBi iycn Lösung vereinigt. Die wäßrige Lösung wurde mehrere Mule mit jeweils 150 cm³ Äther gewaschen, bis sie nur noch schwach sauer war. Dann wurde sie kurze Zeit belüftet, um den restlichen Äther /u entfernen. Die Lösung wurde gegen kaltes destilliertes ViisMM dialvsierl und dann lyophylisicrt. Man erhicli dasruhcl'saidomonas-acruginosa-NRRI -B-32O3-Λιιϋμοη.

in gleicher Weise wurden die rohen Antigene der Stämme NRR1.-H-1198, NRRL-B-32OO, NRRL-B-3201. NRR1.-B-32O2 und NRRL-B-3224 von Pseudomonas acnigmosa gewonnen.

Die 1 leinentaranalysc ergab C 37 bis 43°/₀; H 6 bis 7ⁿ/„; N S bis 8°/₀; P 3 bis 5ⁿ/₀; S 0.5 bis 0.9"/,,; Asche IO bis 15°/₀.

Das UV-Spcklrum in einem Phospluitpuffer vom pi I -Wcrl 7 zeigte ein Absorptionsmaximum bei 258 ιημ; H! 50 bis 80.

Das rohe Antigen aus den Stämmen NRRL-B-32OO und NRRL-H-3224 wurde jeweils wie folgt weiter verarbeitet: Dns rohe Antigen wurde in 0.1 normalem willkigcm Nalriumacetut i'.u einer U)ⁿ/_Oigcn Lösung ((ii:w./Vol.) gelöst. Die Lösung wurde uuf OC itbgekühlt und langsam mil den» sechsfachen Volumen uh-Kolutcn Äthanol versetzt, um du·. Antigen uus/ufllllen. Das l'ra/ipilat wurde iilvcnlriftigicrt und in Wasser gelöst. Dk wilWrigc Lösung wurde gegen tlcKiilliorles Wasser dialysiert und lyophylisiert. Man erhielt das teilweise gereinigle Antigen.

Jeweils 25 mg nahes Antigen der Stämme NRRL-B-319S. NRRL-B-3201. NRRL-B-3202 und NRRL-B-3203 und des teilweise gereinimen Antigens der Stämme NRRL-B-3200 und NRRL-B-3224 wurden kombiniert und in dem Mindeslvolinnen eines Phosphatpuffers (0,02m NaH₂PO₄ und 0.20m NaCl, mit verdünnter NaOH-Lösung auf pH 7,0 eingestellt) gelöst. Die Lösung wurde einer 1,5-cm · 25-cm-Kolonne aufgegeben, die ein mit demselben Puffer äquilibrierles vernetztes Dextran polymer enthielt. Das verwendete Polymer soll mit entsprechender Porengröße so gewählt sein, daß Teilchen mit einem ungefähren Molckulargewicht über etwa 200 000 nicht adsorbiert werden. Vernetztes Dextran und die in der britischen Patentschrift 854 715 und der USA.-Patentschrift 3 105 012 beschriebenen Produkte mit ähnlichen Eigenschaften können hierfür Anwendung finden. Die Kolonne wurde mit zusätzlichen kleinen Anteilen Phosphatpuffer eluiert und das die gemischten Antigene enthaltende Eluat aufgefangen. Das Eluat wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und lyophylisiert und ergab ein Gemisch der sechs gereinigten Antigene in Form eines weißen Pulvers. Das Produkt wurde dadurch charakterisiert, daß es in gepufferter Lösung im Bereich 240 bis 303 mu nicht oder nur wenig UV absorbierte.

Um den Wirkungsbereich des oben hergestellten hexavalcüien Antigens als Schutz gegen Pseudomonasacruginosa-Infcktionen aufzuzeigen, wurde Mäusen jeweils eine einzelne subkutane Dosis von 10 ag gereinigtem hexavalenten Antigen gelöst in 0,25 cm³ physiologischer Kochsalzlösung verabfolgt. 1 Woche spüler wurden die Mäuse durch intraperitoiieale Injektion mit Slammkulturcn von Pseudomonas aeruginosa in 0,5 cm³ 5°/_oigem M.ucin in der geschützten H)J-LD-,,-Dosis infiziert, insgesamt wurde mit 315 Sliimnen von Pseudomonas aeruginosa infiziert. Alle Kulturen waren menschlicher Herkunft und stammten aus verschiedencn, in den USA. weit auseinander liegenden Institutionen. Ausgesprochener Infektionsschutz wurde gegenüber 242 (77"'_O) der infizierenden Stamm:, ein geringerer Schutz, gegenüber 2+ (7,6° „) und kein Schutz gegenüber 49 (15.5" „) der infizierenden Stiinru: erzielt Zur Wcrtbcslimmung erhielten CF-I- weibliche Mäuse jeweils eine einzige subkutane Injektion des hc\avalcnlen Antigens gelost in 0,25 cm¹' p'i\ siolu-jisc'ici Kochsalzlösung in verschiedener Konzentration; ic weils 15 Mause erhielten die gleiche Dosierung. 2 l'agi später wurden die Mäuse mit Kulturen von jedem de sechs Pseudomonas. aeruginosa Stämme, aus denei das hcxa\alente Antigen gewonnen worden war. μ der gcschiit/icn 10l)-LD._v,-Dosis infiziert. Fs wurdet inlr.ipcriloneal jeweils 0,5 cm³ in 5°,, Muein inji/ierl F.s wurden folgende 1 igebnisse erhalten:

I nil/ici I nut Stamm NKKI

H-3198
B-3200
B-3201
11-3202
B-3203
11-3224

1 O„. ng kp Maus

35
15
25
10
l\
10

Γίη Impfstoff wunle unter aseptischen IWdingungc mil sterilen Reagenzien und sterilen Yomchtungi

0 0.71 109 628/21

wie folgt hergestellt: Das wie ohen hergestellte hex J-valenle Antigen wurde in mit Phosphat auf pH-Wert 7.2 gepufferte Kochsablösung zu einer Konzentration \on 0.5 mg,cm³ gelöst. Thiomersal wurde zu einer Endkonzentration von 0.01 °,₀ (Gew. Vo!.) zugegeben. Die Lösung wurde leicht zentrifugiert, um etwa vorhandene Begleitstoffe zu entfernen und dann 60 Minuten auf 60°C erhitzt. Die erhaltene Lösung war nach den üblichen Wertbestimmungs- und Sterilitätskontrollen als Impfstoff geeignet.

Die Ausgangsmaierialien, d. h. die feuchten Zellmassen der Pseudomonas-aeruginosa-Stämme NRRL-B-3198, NRRL-B-3200, NRRL-B-3201. NRRL-B-3202, NRRL-B-3203 und NRRL-B-3224 wurden wie folgt erhalten.

Eine Schrägkultur des jeweiligen Stammes wurde 16 Stunden bei 37C auf einem Agarnährboden gezüchtet, der durch Auflösen von 15 g Casein-Pankreasaufschluß, 5 g Sojamehl-Papainaufschluß, 5 g Natriumchlorid und 15 g Agar in 1000 cm³ destilliertem Wasser und Erhitzen der Lösung im Autoklav bereitet worden war. Es kann z. B. ein Handelsprodukt wie Trspticase Soy Agar (Baltimore Biological Laboratory. Inc.) verwendet werden. Die Organismen wurden von der Oberfläche des Schrägagars gewonnen und in sterilem destilliertem Wasser suspendiert. Mit dieser Zellsuspension wurde eine Sc'.iüUelflasche beimpft, die 600 cm³ Nährbrühe enthielt, hergestellt durch Auflösen von 17 g Casein-Pankreasaufschluß. 3 g Sojamehl-Papainaufschluß, 5 g NaCl. 2.5 g Κ,ΗΡΟ, und 2,5 g Dextrose in 1000 cm³ destilliertem Wasser und Erhitzen der Lösung im Autoklav. Es kann auch ein Handelsprodukt wie Trspiicase Soy Broth (Baltimore Biological Laboratory, Inc.) verwendet werden. Die Schültelflasche wurde 12 Stunden bei 37 C geschüttelt. Die erhaltene Keimkultur wurde auf 16 1 wie oben hergestellte Nährbrühe überimpft. Die Kultur wurde 12 Stunden bei 37' C gehalten und belüftet (1,5 Volumen Luft Volum-Nährbrühe Min.). Periodisch wurden Kulturproben entnommen, um die Lebensfähigkeil und die Reinheit zu prüfen; das Wachstum wurde nephdometriseh verfolgt. Am Hilde tier Kulturpcriodc wurden 166 g Phenol /upesel/.t, das Gemisch 30 Minuten gerührt und dann 4 Stunden bei 37 Γ stehengelassen. Die Zellmasse wurde ab/enirifugiert und konnte unmittelbar 'verwendet werden oder im gefrorenen Zustand gelagert und vor der Verwendung aufgetaut werden.

Beispiel 2

( .ιm.ill Hcispiel 1 wurden die feuchten Zcllmassen der PseudoiiMnas-.ieiuginosa Stamme NRKl -11-31¹JK. NKKI -B12lK>.\RIU -H-32O1.NKRI -B-32O2.NRRI IMZtH. NUKI U-322"» und NRRl -»-3224 jeweils mn wäßriger I riihlnressigsüure eur.ilnert und der I \irakt aufgearbeitci Jedes der sieben rohen Antigene wurde, wie im Hcispiel I beschrieben, durch Auflösen in 0.1-iioi nuilini walJrigem Natrmmaeel.il /u einer IU" „igen (Cieu Sei.) lösung. Abkühlen der l.i.stiiij· .iiif (J C und Ausfallen des Antigen*, durch langsames Zugeben des (ifachen Volumens absoluten Äthanols teilweise gereinigt.

Dann wurde jedes der sieben leilweisen gereinigten Antigene ein/ein wie folgt gereinigt: 5(K) mg teilweise gciciniglcs Antigen wurde in dem Mindeslvolurncn· phosphalpiiffer (0,()2m NuIIjPO₁, 0.2f)m Nu(¹I. mit veriliinnter NaOlI aul pH 7.0 eingestellt) gelöst. Die Lösung wurde einer 3-cm · 25-cm-Kolonne aufgegeben· die ein mit demselben Puffer äquilibriertes Pohacryiamid enthielt. Hierfür sind Polyacrylamide mit einer Porenweite geeignet, die Teilchen mit einem Molekiilar-S gewich? über 100 000 nicht adsorbieren. Zunächst wurden 25 cm³ Vorlauf aufgefangen und verworfen: dann wurde die durch ihre Opaleszens kenntliche Lösung des Antigens so lange aufgefangen, bis das Eluat nicht mehr opaleszierte und die noch in der Kolonne

ίο verbliebenen Restanteile Antigen mit zusätzlichen kleinen Mengen Phosphalpuffer ausgewaschen. Das antigenhaltige Eluat wurde gegen destilliertes Wasser dialysiert und dann lyophyiisiert. Man erhielt das gereinigte Antigen als weißes Pulver. Es zeigte in Pufferlösung wenig oder gar keine UV-Absorption im Bereich von 240 bis 300 πια. Gleiche Gewichtsteile jedes der sieben gereinigten Antigene wurden zu einem heptavalenten Antigen kombiniert.

Der Wirkungsbereich des Heptavalenten Antigens ais Schutzmittel gegen Infektionen mit Pseudomonas aeruginosa wurde wie im Beispiel 1 nachgewiesen: Mäuse wurden mit einer einzelnen subkutanen Dosis von 10 ug gereinigtem heptavalentem Antigen gelöst in 0,25 cm³ physiologischer Kochsalzlösung behandelt.

1 Woche später wurden die Mäuse mit Stammkulturen von Pseudomonas aeruginosa infiziert. Es wurden jeweils 0.5 cm³ 5°/_oiges Muein mit dem geschätzten 100-LD_;,₀-Spiegel intraperiloneal injiziert. Insgesamt wurde mn 342 Stämmen infiziert. Alle Kulturen waren menschlicher Herkunft und kamen aus verschiedener weit auseinander liegenden Institutionen der USA. Gegenüber 300 (87,7°/„) der infizierenden Stämme wurde sehr guter Schulz erzielt, gegenüber 33 (9.6⁰Z₀) Stämmen em «entleerer Schutz und kein Schutz gegenübei

9 (2.6%f Stämmen.

L'nter Anwendung aseptischer Arbeitsweise mit sie riler Rcagenticn und Vorrichtungen wurde, wie :n Beispie! ! beschrieben, eine hepta\ulentc Impfstoff lösung lu-rgestelli.

Die Ausgangsmatenahen. d. h. die feuchten /eil massen der sieben Pscudomonas-aeruginos.i-Stämir.i wv.iden gemäß dem im Beispiel 1 beschriebenen Vcr fahren gewonnen.

B e i s ρ i e 1 3

Gemäß Beispiel 2 wurden aus den IVuJonion.is acruginosa-Siäminen NRRl-B-31'lS und NRRl H 32l«'dic rohen Antigens gewonnen und wie beschriebt

jo teilweise und \i llst.iinlig gereinigt tilciche Gcwnhts teile di.¹!' gewonnenen beulen leinen Antigens wuu'.e¹ /u ement unalenlen Antigen kombiniert

Dei W 11 ktingsbereii h des div.ilenien Antigens «urdi wie im Beispiel 2 hc-chnebcn. m \ ersuchen mit Mäuse bestimmt. Insgesamt winde mn Π willkürlich eewahi ten IViiuiiinonavaenigiin'sa-St.iiniiien inli/iert. 1 in starke Schut/wirkun-i winde gegenüber loSt.imnu' (5').2" „ler/ieli

Wie /u\or Ivsihneben, winde unter Anweiulun asepüscher Arbeitsweise und stenlei Keageniien un Vorrichtungen eine divalenii· linplstofTlösung hergc stellt

Itivalenlc, i|uiulii\alenle. pentavalente und hex; \iilenIe Antigene und Impfstoffe wurden erhalten, wen ein oder mehrere aus den Stummen NRRl-B-320 NRRL.-B-32O2. NRRI-1M2O3. NRRl-H-3223 un NRRl-!>-3224 gewonnene Antigene dem itiwilcttlc Antigen und tuler Impfstoff /upi'srt/t wurden.

B e i s ρ i ι; 1 4

Gemäß der bereits beschriebeneu Arbeitsweise wurde ein heptavalentes Antigen in Form eines Impfstoffes hergestellt, der die immunisierenden Antigene in foltienden Konzentrationen enthielt:

gruppen A, B. C und I) im Mäuseversuch bei Belastung mit 100 LD-,, der Stamme NRRL-B-31% oder MtRL-B-3201 erhallen wurden.

Antigen aus Stamm NRRL	mg/cm·¹
B-3198	0,1.0 0,10
B-32OO	0,15 0,15 0,10 O',10 Oi 15
B-3201
B-3202
B-3203
B-3223
B-3224

Normale, d. h. gesunde erwachsene Versuchspersonen wurden in Blutspendergruppen A, B, C und D eingeteilt und erhielten gemiäß dem nachfolgenden Schema intramuskuläre Injektionen des heptavalenten Antigens. Die angegebenen Gewichte sind das Antigen·· gesamtgewicht.

Jede Versuchsperson der Gruppe A erhielt zu Beginn der Behandlung 0,4 mg Antigen und 7 Tage später nochmals 0,4 mg Antigen.

Jede Versuchsperson der Gruppe B erhielt 0,4 mg Antigen 211 Beginn der Behandlung, 0,4 mg Antigen 7 Tage später und nochmals 0,4 g Antigen nach weiteren 7 Tagen.

Jede Versuchsperson der Gruppe C erhielt 0,6 mg Antigen 2:u Beginn der Behandlung, 0,6 mg Antigen nach 7 Tagen und nochmals 0,6 mg Antigen nach weiteren 7 Tagen.

Jede Versuchsperson der Giuppe D erhielt zu Beginn der Behandlung 0,8 mg Antigen, nach 7 Tagen erneut 0,8 mg Antigen und nach weiteren 7 Tagen nochmals 0,8 mg Antigen.

Jedem Blutspender wurde am 7. Tag und weiter jeweils nach 7 Tagen Blut abgenommen, um ein Gesamtblutimmunproclukt zu erhalten. Der flüssige Anteil wurde für das Immunplasma abgetrennt. Man ließ das Plasma gerinnen und trennte die klare Flüssigkeit als Immunserum ab. Der Pseudomonas-Antikörpergehalt des Serums wurde im Mäuseversuch oder in einem Hacmagglutinationstest bestimmt.

Im Miiuscversuehwurdenden Mäusen jeweils 100LD-,₀ eines infizierenden Pseudonionas aeruginosa Stamms suspendiert in 0,3 cm' 5° _oigem Schweinemagenmuein intraperitoneal injiziert. Innerhalb von 30 Minuten nach der infizierenden Injektion wurde den Mäusen jeweils insgesamt 0.25 cm¹ Serum oder Serum abgestuft verdünnt mit Kochsalzlösung intraperitoneal injiziert. Hie bei jeder Serumverdünnung nach 7 Tagen überlebenden 1 lere wurden ausgezählt. Die Frgchnisse wurden gegen die jeweilige Verdünnung aufgetragen und graphisch die Serumverdünnung ermittelt, bei der 5O¹V₀ der Tiere überleben. Dieser Wert wird als »cffekti\e Dosis 50c oder I D_ftn bezeichnet und kann entweder unmittelbar als Verdünnung (z. H. I : IM) oder 1 : 320) oder als der entsprechende reziproke Verdünnungstiter (160 oder 320) angegeben werden. Die reziproken Vcr· dünnungstitcv können auch als geometrischer Mittelwert für die jeweilige behnmlcllo Gruppe nnRcgeben werden.

lnderfolgendenTabellesinddieErgcbnissezusiimnienacstollt, 'J ie mit Soru.dor obengenannten Bclutndlungs-

	Tag der	l'seudoiiitiniis Antikörper	iiiier'⁵	19	NRIU.-H-.120I
Grup	Blutentnahme	Serin	helnstet mil Stamm	93
pe		NRRL-B-.irXS	135	54
	vor der	■	170	105
A	Injektion	161	327
	7	125	224
	14		227
	21	19	199
	28	73
	35	225	33
	vor der	184	104
B	Injektion	214	285
	7	232	365
	14	213	389
	21		398
	28	3	345
	35	24
	42	55	40
	vor der	53	186
C	Injektion	60	307
	7	68	310
	14	35	335
	21		]()!
	28	8	193
	35	65
	42	87	46
	vor der	128	103
D	Injektion	89
	7	92	?.65
	14	162	:i6K
	21	;i22
	28	343
	35
	42

* Geometrisches Mittel der reziproken Veriliiiinuiigstiler (reziproke FiD₃₁₁). Der Wert ist direkt pmpor.inrul dem Antikörpergehalt.

Die Sera der Behandlungsgruppen A-, H, C und D enthalten in ähnlicher Weise zunehmende Anlikörpertilcr gegen die Belastung mit jedem der Stämme NRRL-B-32OO,NRRl.-B-32O2,NRRL-B-32O3.NRRI B-3223 und NRRI.-B-3224. Die Sera der Behandliings gruppen Λ. B. C und D zeigen auch zunehmende Antikörpertiier gegen Belastung mit dem überwiegender Anteil wahllos angetroffener Stämme \on Pseudo monas aeruginosa. Die erhöhten Antikörperliler kön ncn im Haemaggluiinationsvcisuch und im Mäuse schutzversuch nachgewiesen werden.

In gleicher Weise können auch Ciesamtblutprodiikle Immunplasmen und Immunsera von Blutspende) gruppen erhalten werden, die mit poKtalcnteii Pseudomonas aeruginosa Antigen behandelt wurdcr das die immunisierenden Antigene der Stamm NRRl .IM108 und NRRl ·ΙΜ?00 und neeebenenl'aH ein oiler mehrere immunisierende Antigene der Stan mc NRRL-B-3201. NRRl Il 3202. NRRl.-H.J20: NRRL-H-3223 und NRRl-B-3224 enthalten

Hin heplavulcntes Pscudotnonas-ncruymosu-Anlig«; wurde in Form eines Impfstoffes mit den im Ik

spiel 4 angegebenen Anligenkonzcnlralionen hergestellt und eine Cinippe erwachsener Blutspender nach folgendem Schema damit immunisiert. Jede Versuchsperson erhielt durch intramuskuläre Injektion zu Beginn der Behandlung 1.0 mg Gesaintantigcn. 7 Tage später wiederum 1.0 mg Gesamlanligen und weitere 7 Tage später noehmal 1.0 mg Gesamiantigen. Das Blut der Spender wurde jeweils nach der 1.. 2.. 3.. 4., 5. und fi. Weiche nach Ikhandlungsbcginn abgenommen. Einzelne Serumproben wurden abgesondert und ihr Antikörpergchall im Haemagglulinalionsiest bestimmt.

Bei der Durchführung dieses Testes wurden rote Blutkörperchen (im allgemeinen vom Schaf) mit Antigen beschichtet, indem eine 10°'„ige Suspension roter Blutkörperchen mit einer Lösung von 0,1 mg Antigen/cm³ 30 Minuten bei 37°C behandelt wurden. Das zu untersuchendeSerum wurde inProberöhrchen stufenweise in Kochsalzlösung verdünnt. Jedem Röhrchen wurde ein gleiches Volumen mit Antigen beschichteter roter blutkörperchen zugegeben und das Serum darauf einwirken gelassen. Die Anwesenheit von Antikörper wird durch das Absetzen der roten Blutkörperchen angezeigt. Die stärkste Serumverdünnung, die noch eine deutliche 1 laemagglutination bewirkt, ist der Antikörpertiter. Dieser Titer kann unmittelbar als Verdünnung (/. B. 1: 160 oder 1 : 320) oder als der entsprechende reziproke Verdünnungstiter (160 oder 320) angegeben werden. Der Haemagglutrnationstest wird in g!ei;her Weise ηιϊΐ Plasmen oder gereinigten Globulinfrakli.inen, die in abgestuften Verdünnungen eingesetzt weiden, durchgeführt. Der mit Antigene» von einzelnen I'seudomonas-aeruginosa-Stämmen durchgeführte I laeinagglutina tion slest entspricht insofern dein Schutzversuch mit Mäusen, bei dem mit denselben Pscudomonas-aeruginosa-Stiimmen belastet wird, als der relative Anli'körperspicgd im Gesamtblutimmunprodukt, Immunplasnia, Immunseruin oder gereinigtem Iminunglolmlin bestimmt wird.

Das Verhälinis von 7S-Anlikörperspiegcl zu 19S-Aniikörpcrspiigel in den Sicra der obengenannten Blulspeiulergruppc wird bestimmt, indem der Haemagglutm.uionsiev mit Serumproben vor und nach dem Behandeln mit 2-Mereaptoäthanol durchgeführt wird. Das 2-Mereaploälhunol zerstört das l^l)S-Globulin, läl.U aber das 7S-Globulin relativ intakt. Nach diesem Verfahren wurde ermittelt, daß die kombinierten 7S-unil 19S-CiIObUUiIe bis zu elwa 20"',, 7S-Globulin enthalten.

Die von dieser Blutspendergruppe erhaltenen Sera werden nach der Methode von Cohn der Ausfällung mit kaltem Äthanol fraktioniert, um ein gereinigtes Immimglobulin zu erhallen. Mil diesem gereiniglen Globulin wird eine sterile wäßrige Lösung bcieitet. die 165 mg cm³ gereinigtes Globulin enthält, gelöst in 2,25°/„iger Glycinlösung. und die 0.2ⁿ/₍₁ NaCI und 0,01 "/ο Thiomersal als Konservierungsmittel enthält und mit Natriumacetatpuffer auf pH-Wert 6,8 einge-

ίο stellt wurde. Der oben beschriebene Hacmagglutinationstest ergibt, daß dieses Produkt reziproke Anti· körpervcrdünnimgstiter von 2560 bis 20 000 enthält gemessen gegen einzelne Antigene der Pseudomonas· aeruginosa-Stämme NRRL-B-3198, NRRL-B-3200 NRRL-B-3201,NRRL-B-32O2,NRRL-B-3203,NRRL-B-3223 und NRRL-B-3224. Das Produkt hat auch hohe Titer gegenüber den meisten willkürlich angetroffener Pseudomonas-aeruginosa-Stämmen. Regulär verfügbare j'-Globulinpräparate, die von unbehandelter Blutspendern gewonnen und als 16°/_nigc wäßrige Lösungen bereitet werden, haben Anlikörpertiter von etws 40, bestimmt durch denselben Haemagglutinationstes: gegenüber verschiedenen Pseudomonas -aeruginosa Stämmen.

Gemäß dem allgemeinen Verfahren dieses Beispiel· können auch gereinigte Immunglobuline von Blut spendergruppen gewonnen werden, die mit polyvalen tem Pssudomonas-aeruginosa-Antigen behandelt wur den, das die immunisierenden Antigene der Stammt NRRL-B-3198undNRRL-B-3200sowiegegcbcnenfaIl! ein od;r mehrere immunisierende Antigene der Stamm« NRRL-B-3201,NRRL-B-3202,NRRL-B-3203,NRRL B-3223 und NRRL-B-3224 enthält.

Claims

Patentanspruch:

Polyvalcntcr Impfstoff gegen Pscudomonas-aeru ginosa-lnfektionen, dadurch ge ken n zeichnet, daß er eine Kombination der immu nisierenden Antigene der Stämme NRRL-B-319! und NRRL-B-3200 und gegebenenfalls zusätzlicl ein oder mehrere immunisierende Antigene de Stämme NRRL-B-320', NRRL-ll-3202, NRRL B-3203, NRRl-B-3223, und NRRL-B-3224 voi Pseudomonas aeruginosa enthält oder daß er eil gereinigtes Immimglobulin aus dem Scrum cine vor der Blutentnahme mit den Antigene» behandel ten Spenders enthält.