DE2404265C3 - Verfahren zum Abreichen von Immunglobulinen - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahrei zum Anreichern von Immunglobulinfraktionen, ins besondere ein Verfahren zur Gewinnung von Immun

3" globulinkonzentraten, die einerseits weitgehend rei nes IgG, andererseits neben IgG IgA oder IgM star! angereichert enthalten.

Bei der immunologischen Abwehr des Körpers ge gen Mikroorganismen und deren Stoffwechselpro

r> dukte spielen die Immunglobuline als humoralc Anti körper eine bedeutende Rolle. Die Immunglobuliiif sind jedoch nicht einheitlich; sie unterscheiden siel nicht nur hinsichtlich ihres chemischen Aufbaus, ihre: Molekulargewichts und ihres mengenmäßigen Vor

Ί» kommens im Serum, sondern auch dadurch, daß siel beispielsweise in der als Immunglobulin A (IgA) be zeichneten Fraktion hohe Antikörperaktivitäten ge gen bestimmte Viren, z. B. gegen Poliomyelitis, Ma sern und Influenza finden.

■π In der Fraktion der Immunglobulinklasse M (IgM finden sich vorwiegend die Antikörper gegen gramne gative Erreger, z. B. Antikörper gegen Escherichii coli, Pseudomonas aeruginosa (bact. pyrocyaneum) B. proteus, Haemoph. Influenza, H. pertussis, Kleb

w siellen (Klebs. penumoniae), Salmonellen und Shigel len. Allgemein werden Antikörper gegen Kohlenhy drate vorzugsweise als IgM anzutreffen sein, wahrem Proteinantigene im wesentlichen die Bildung der Im munglobuline der Klasse G (IgG) induzieren. Darau

•.ί ist zu ersehen, daß eine fortschrittliche Immunthera pie von bakteriellen und viralen Infektionen eine spe zifische Substitution und eine gezielte Anwendunj von Immunglobulinen derjenigen Klassen erfordert die bei dem Krankheitsbild eine wesentliche Bedeu

wi tung haben.

Für die Gewinnung der Immunglobuline, aufge trennt nach Klassen, stehen zwei bekannte Verfahrei zur Verfügung: einerseits das auf Co h η und Oncle\ zurückgehende Fällungsverfahren mit Äthanol, wei

h, terentwickelt in der US-Patentschrift 3597409; an dererseits die Methode von Heide und Haupt, dii die Kombination von Fällungsschritten mit Acridin derivaten und Ammoniumsulfat verwenden. Insbe

sondere die letztgenannte Methode erfordert häufig noch elektrophoretische und chromatographische Schritte zur Auftrennung und Weiterreinigung der angereicherten Immunglobulinfraktionen. Dadurch ist die Methode verlustreich und führt bei Anwendung im technischen Maßstab zu unbefriedigenden Ausbeuten.

Die nach dem Stand der Technik hergestellten handelsüblichen Immunglobulinpräparate enthalten hauptsächlich nur IgG, wenig IgA und in Spuren IgM.

Es wurde nun ein Verfahren zur Gewinnung von nach Klassen getrennten Immunglobulinkonzentraten gefunden, die IgA, IgM und IgG in hoher Reinheit und guter Ausbeute enthalten.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Immunglobulinfraktionen bzw. Immunglobulinkonzentraten, die einerseits weitgehend reines IgG, andererseits neben IgG IgA oder IgM stark angereichert enthalten. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man

a) aus Serum oder defibriniertem Plasma mit einem primären, mit Wasser mischbaren Alkohol, vorzugsweise Äthanol, bei einer Konzentration zwischen 18 und 35% in einem pH-Bereich von 5,6 bis 8,5 bei einer Temperatur von 0 bis — 10° C, eine rohe Immunglobulinfraktion ausfällt,

b) die Fällung der Stufe (a) in wäßrige Lösung bringt und daraus die Euglobuline durch Einstellen einer Leitfähigkeit von 5,OxK)² bis 8,0 X ΙΟ³ μ$ und eines pH-Wertes von 4,5 bis 6 im Temperaturbereich von 0 bis +20° C ausfällt,

c) aus dem Überstand der Stufe (b) durch Adsorption an ein mineralisches Adsorbens auf Basis Silikat oder Attapulgit in einer Menge von 0,3 bis 1% (g.^-v), bei einer Leitfähigkeit von 5,0 X H)² bis 1,0 x H)⁴ \iS, bei pH-Wert 4,5 bis 6,5, die proteolytischen Fermente abtrennt,

d) im Überstand der Stufe (c) den überwiegenden Teil des IgM neben anderen Proteinen an ein in situ hergestelltes Calcium-Phosphat im pH-Bereich 5,8 bis 8,5 adsorbiert und das Adsorbat abtrennt,

c) aus dem Adsorbat der Stufe (d) durch Behandlung mit dem 5- bis lOfachen Volumen einer auf pH 4,0 bis 8,0 eingestellten wäßrigen Salzlösung, deren Konzentration 0,8 bis 4% beträgt, oder einer Aminosäurelösung, deren Konzentration 1 bis 8% beträgt, oder einer wäßrigen Lösung eines mit Calcium einen Komplex bildenden Agens, in einer Konzentration von 2 bis 7 %, oder einer geeigneten Kombination von Salz, Aminosäure und Komplexbildner, eine IgM-haltige Fraktion desorbiert und das IgM nach Einstellung des pH-Wertes auf pH 6,5 bis 7,5 durch Zugabe eines niedrigen Alkohols, bis zu einer Konzentration von etwa 20 bis 25% anreichert,

f) die Fällung der Stufe (e) durch Zentrifugation oder Filtration abtrennt, in einer wäßrigen Salzlösung wieder auflöst, den pH-Wert auf 4,5 bis 5,5 einstellt, die Leitfähigkeit durch Zugabe eines Salzes auf etwa über 1 x 10⁴ μ8 einstellt und die Verunreinigungen der mit IgM angereicherten Fraktion durch Zusatz von 0,1 bis 0,3% eines Al(CH)₃-GeIs (berechnet als Al₂O₃) abtrennt,

g) aus dem durch Adsorption von IgM befreiten Überstand der Stufe (d) das IgG und IgA mit einem mit Wasser mischbaren primären Alkohol bei einer Konzentration von 20 bis 40%, bei pH 6,5 bis 8,0 bei 0 bis -10° C, ausfällt und
h) gewünschtenfalls zur Trennung von IgG und IgA das IgA selektiv an Alumiriiumhydroxyd adsorbiert.

Die nach dem Verfahren hergestellten, bezüglich IgA, IgM und IgG angereicherten Immunglobulinkonzentrate sind als Therapeutika und diagnostische Reagenzien verwendbar.

in Die Entfernung des Fibrinogens aus dem als Ausgangsmaterial dienenden Plasma erfolgt auf an sich bekannte Weise, vorteilhaft als Fällung mit einem niederen Alkohol oder auch durch Recalcifizierung oder durch Kryopräzipitation.

Ii Die Abscheidung der rohen Immunglobulinfraktionen in Stufe (a) erfolgt vorzugsweise mittels Äthanol bei einer Konzentration zwischen 18 und 35%, vorzugsweise 25%, in einem pH-Bereich von 5,6 bis 8,5, vorzugsweise bei 7,7, bei einer Temperatur von .Ό 0 bis -10° C, vorzugsweise 5° C.

Anstelle von Äthanol kann hier wie auch in den folgenden Verfahrensstufen jeder andere primäre, aliphatische Alkohol verwendet werden, sofern er mit Wasser hinreichend mischbar ist, z. B. Methanol. 2i Äthanol wird jedoch wegen seiner physiologischen Verträglichkeit bevorzugt.

Entsprechend Stufe (b) wird der Niederschlag der Stufe (a) in der 5- bis 50fachen Menge, vorteilhaft in der 20fachen Menge des Niederschlagsgewicht, ei-JiI ner wäßrigen Flüssigkeit, vorzugsweise von destilliertem Wasser, in Lösung gebracht. Dem Wasser können gewünschtenfalls geeignete Zusätze wie Aminosäuren, vorzugsweise Glycin, in geringer Konzentration hinzugefügt werden. Sodann wird die Leitfähigkeit j--, durch Zusatz eines Salzes, vorteilhaft Natriumchlorid, auf 5,0 x H)² bis 8,0 χ ΙΟ·¹ μ5 eingestellt. Durch Ansäuern auf pH 4,5 bis 6, vorzugsweise auf pH 5,1, werden die Euglobuline im Temperaturbereich von 0 bis -20° C, vorzugsweise bei +5° C ausgefällt.

Zur Adsorption von Proteinasen, insbesondere von Plasminogen, wird dem euglobulinfreien Überstand der Stufe (b) ein mineralisches Adsorbens, besonders vorteilhaft aus der Gruppe der Silikate, z. B. Kaolin oder das im Handel erhältliche, mit Pharmasorb-Regular bezeichnete Attapulgit, in einer Menge von 0,3 bis 1 %, vorzugsweise 0,7% (g:v), bei einer Leitfähigkeit von 5,0 X 10² bis 1,0 X 10" μ5, vorzugsweise bei 6,0 X 10⁵ μ5, bei pH-Wert 4,5 bis 6,5, vorzugsweise bei pH 5,5, zugesetzt und 30 Minuten bis 3 Stunden

w einwirken gelassen.

Nach Abtrennung des Adsorbens durch Zentrifugation oder Filtration wird dem Abguß ein wasserlösliches Calciumsalz und ein wasserlösliches Phosphat zugesetzt, wobei das Calciumsalz gegenüber dem

ν, Phosphat im Überschuß, vorzugsweise in etwa dreifach molarem Überschuß, vorliegen soll. Vorteilhaft wird sekundäres Natriumphosphat und Calciumacetat verwendet. Die Konzentration des Calciumsalzes soll etwa 0,025 bis 0,1 molar, vorteilhaft 0,07 molar, sein.

ho Der pH-Wert wird anschließend auf 5,8 bis 8,5, vorzugsweise auf 7,9, eingestellt, wobei das sich bildende Calciumphosphat das IgM adsorbiert.

Die IgM-haltige adsorbierte Fraktion wird nach Abtrennung des Calciumphosphats durch Zentrifuga-

hi tion oder Filtration durch Behandlung mit dem 5- bis lOfachen Volumen einer auf pH 4,0 bis 8,0, vorzugsweise auf pH 5,0, eingestellten wäßrigen Salzlösung, vorteilhaft einer Kochsalzlösung, deren Konzentra-

tion 0,8 bis 4% beträgt, oder einer Aminosäurelösung, vorteilhaft einer Glyzinlösung, deren Konzentration 1 bis 8% beträgt, oder einer wäßrigen Lösung eines mit Calcium einen Komplex bildenden Agens, vorteilhaft mit Alkalisalzen der Äthyien-Diamin-Tetraessigsäure in einer Konzentration von 2 bis 7%, vorzugsweise 4,5%, oder einer geeigneten Kombination von Salz, Aminosäure und Komplexbildner eluiert.

Aus dem IgM-haltigen Eluat wird das IgM nach Einstellung des pH-Wertes auf pH 5,0 bis 8,0, vorzugsweise pH 7, durch Zugabe von Äthanol, bis zu einer Konzentration von etwa 20 bis 25%, ausgefällt.

Die durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennte Fällung der Stufe (e) wird in einer möglichst geringen Menge einer verdünnten wäßrigen Salzlösung, vorzugsweise einer 0,3- bis 0,75 %igen Natriumchlorid'iösung, wieder aufgelöst, der pH-Wert auf 4,5 bis 5,5 eingestellt, die Leitfähigkeit durch Zugabe eines Salzes, vorzugsweise Kochsalz, auf etwas über 1 X ΙΟ⁴ μ5 eingestellt. Sodann werden die Verunreinigungen der mit IgM angereicherten Fraktion durch ZusatzνοηΟ,Ι bis 0.3% eines Al(OH)₃-GeIs (berechnet als Al₂O₃) absorbiert und damit nach Abtrennen des Adsorbens eine IgM-haltige Lösung in guter Ausbeute erhalten.

Aus dem Überstand der Calciumphosphat-Adsorption der Stufe (d) werden das IgG und das IgA mit einem primären mit Wasser mischbaren Alkohol, bei einer Konzentration von 20 bis 40%, vorzugsweise 25%, bei pH 6,5 bis 8,0, vorzugsweise 6,8, bei 0 bis ₎₀ — 10° C, vorzugsweise -5° C, ausgefälJ*.

Die Trennung von IgG und IgA nach Auflösung der erhaltenen Äthanolfällung in Wasser oder einer verdünnten Salzlösung in solcher Menge, daß die Eiweißkonzentration der Lesung etwa 1 % beträgt, geschient bei pH 4,5 bis 5,5, vorzugsweise pH 5,0 und einer Leitfähigkeit von etwas über 1 x ΙΟ⁴ μ5 durch Zusatz von 0,05 bis 0,2%, vorzugsweise 0,1% eines Al(OH)₃-GeIs (berechnet als Al₂O₃). IgA wird unter diesen Bedingungen adsorbiert, während IgG im Überstand verbleibt. Das im Adsorbat enthaltene IgA wird nach Abtrennung in an sich bekannter Weise, vorteilhaft mit einer V₃ m sekundären Natriumphosphatlösung, desorbiert.

IgA und IgG können auch auf bekannte Weise _A--, durch Fällungsverfahren, chromatographisch oder durch Zonenelektrophorese voneinander getrennt werden.

Wenn dies gewünscht und erforderlich erscheint, können die in Stufe (g) durch Alkoholfällung erhalte- ™ nen Pasten der Immunglobuline IgA und IgG durch Lyophilisation vom Alkohol befreit werden. Die Befreiung der Immunglobuline vom Fällungsmittel kann auch durch Gelfiltration oder Dialyse der Immunglobulinlösung erfolgen. ->5

Den Endprodukten kann gewünschtenfalls ein bakteriostatisches Agens zugesetzt werden. IgA und IgG können in gefriergetrocknetem Zustand aufbewahrt und in der für Immunglobuline bekannten Weise, beispielsweise in 0,3%iger Kochsalzlösung _b0 oder in 2,25%iger Olvzin-Lösung wieder aufgelöst werden.

Die Reinheit und Ausbeute der Immunglobuline wird mit der radialen Immundiffusionstechnik nach Becker, Rapp, Schwick und Störiko, Z. Klin. ,.-, Chem. 6, 113 (1968) bestimmt.

Die erfindungsgemäß hergestellten IgM-, IgA- und IgG-Präparationen sind nach Kriterien der Elektrophorese 95% reine Immunglobuüne.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine native IgM-Präparation in einer Reinheit erhalten, die bis zu 70% aus IgM und einem Restgehalt von überwiegend IgG und geringen Mengen IgA besteht. Die Ausbeute beträgt bis zu 30% des ursprünglichen Plasmagehalts an IgM. Wegen der hohen Viskosität der verfahrensgemäß erhaltenen IgM-Lösungen empfiehlt sich vor der weiteren Verwendung eine Verdünnung mit einer wäßrigen Lösung eines Plasmaproteins, vorzugsweise einer IgG-haltigen Immunglobulinlösung, auf einen Gehalt von etwa 20% IgM, bezogen auf den Gesamtproteingehalt. Die vor dem letzten Trennungsschritt (Ende der Stufe (g)) erhaltene Mischung von IgG und IgA setzt sich aus etwa 85 % IgG und 15% IgA zusammen. Dabei wird IgA in einer Ausbeute von 604, IgG in einer Ausbeute von 90% - bezogen auf die im Ausgangsplasma enthaltenen Immunglobulinmengen - wiedergewonnen.

Die erfindungsgemäße Auftrennung von IgG und IgA liefert Konzentrate, die einerseits ca. 40 bis 50% IgA mit dem Restgehalt an IgG, andererseits ein praktisch reines IgG enthalten. Die Auftiennung von IgG und IgA nach bekannten Verfahren zur Gewinnung von IgA, beispielsweise durch die wesentlich aufwendigere Zonenelektrophorese, liefert keine weitergehende Auftrennung als das erfindungsgemäße Verfahren.

Diese Auftrennung von Immunglobulinen in angereicherte Fraktionen von hoher Reinheit durch Aneinanderreihen einer großen Zahl von Verfahrensschritten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte nicht erwartet werden.

Die Verfahrensendprodukte fallen frei von Pyrogenen und bei der Verwendung von Australia-Antigenhaltigem Plasma auch frei von in der Überwanderungselektrophorese nachweisbarem Australia-Antigen an.

Neben den aufgezeigten Grundzügen des Verfahrens steht es dem Fachmann frei, verschiedene Variationen einzuführen. Insbesondere ist es nicht unbedingt erforderlich, die erfindungsgemäß zu gewinnenden IgA, IgM und IgG alle nach dem vorliegenden Verfahren herzustellen. Es kann beispielsweise nur IgM nach diesem Verfahren isoliert werden, die Auftrennung der übrigen Immunglobuline könnte jedoch nach anderen Methoden erfolgen, insbesondere wenn man bereit ist, im Interesse einer vereinfachten Aufarbeitung Ausbeuteverluste in Kauf zu nehmen. Für die Gewinnung des IgM in guter Ausbeute läßt sich beispielsweise statt der vorgeschlagenen Adsorption der Verunreinigungen mittels Al(OH)₃-GeI auch eine im gleichen Milieu durchzuführende Fällung mit einem niederen Alkohol, vorteilhaft Äthanol, in einer Konzentration von 10 bis 20%, vorteilhaft von 15%, bei 0 bis -10° C, vorteilhaft bei -5° C anwenden.

Die selektive Desorption kann einerseits durch Erhöhung der Leitfähigkeit der Elutionslösung, andererseits durch partielle Komplexbildung der Elutionslösung mit dem Adsorbens, oder aber durch sinnvolle Verknüpfung beider Maßnahmen erfolgen.

Die vorliegende Erfindung verwendet mit Vorteil ungiftige bzw. physiologisch gut verträgliche Agenzien. So wird Äthanol vorteilhaft gegenüber Methanol verwendet, da letzteres bekanntlich giftig ist. Doch lassen sich die Anreicherungsfällungen sowohl mit Äthanol wie mit Methanol oder mit Isopropanol durchführen. Da Kochsalz als Bestandteil von Infu-

sionslösungen seit Jahrzehnten verwendet wird, wird Natriumchlorid bevorzugt zur Erhöhung der Leitfähigkeit der Lösungen verwendet. Dem Fachmann steht es jedoch frei, zu diesem Zweck ein anderes wasserlösliches Salz auszuwählen.

Als Ausgangsmaterial dient vorteilhaft frisch gewonnenes, mit Zitronensäure und Glucose (ACD) oder mit Zitronensäure, Glucose und Phosphat (CPD) stabilisiertes menschliches Plasma, das die Immunglobuline in einer normalen Verteilung enthält. Es kann jedoch auch Immunplasma verwendet werden, d. h. Plasma von Spendern, denen zur Erzielung hoher Antikörpertiter bestimmte Antigene verabreicht worden waren. Neben frischem Plasma kann auch eingefrorenes Plasma verwendet werden. Durch den besonderen Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die Endprodukte frei von Pyrogenen gewonnen werden, kann als Ausgangsmaterial auch bereits mikrobiell kontaminiertes, überaltertes Plasma eingesetzt werden. Antibakterielle Zusätze sind beim Aufarbeitungsgang nicht erforderlich. Wenn vor Anwendung des Verfahrens geeignete Milieubedingungen geschaffen werden, können auch andersartig gewonnene, rohe Immunglobulinkonzentrate dem Verfahren unterworfen werden. Serum ist als Ausgangsmaterial verwendbar, wenn beispielsweise durch Salzzusatz eine einem Plasma entsprechende Isotonie hergestellt wird. Bedingt durch einen weiteren Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die Endprodukte in der Überwanderungselektrophorese zum Nachweis von Australia-Antigen negativ sind, könnte auch Australia-Antigen-haltiges Ausgangsplasma in das Verfahren eingesetzt werden.

Die Endprodukte des Verfahrens sind für die klinische Applikation an Menschen als spezifische Immun- κ prophylaktika und -therapeutika sehr gut geeignet. Im besonderen werden die Präparate beispielsweise zur prophylaktischen Substitution bei Fehlen oder Verminderung von IgM oder IgM + IgG oder IgA einschließlich transitorischem Antikörpermangelsyndrom bei Frühgeborenen und jungen Säuglingen, bei gehäuften Infektionen speziell durch gramnegative Erreger, IgA insbesondere bei einigen Lungenerkrankungen, bei denen eine Verminderung des IgA-Spiegels beobachtet wurde, ferner zur Therapie bei schweren bakteriellen Erkrankungen, die durch gramnegative Errger wie E. coli, Pseudomonas aeruginosa, H. Influenzae und pertussis, B. proteus, Klebsiellen, SaI-monellen und Shigellen hervorgerufen werden, eingesetzt.

Zur Prophylaxe wird häufig die Verabreichung von 4 bis 8 mg der IrnmunglobuKrie IgA. und IgM und 32 mg IgG pro kg Körpergewicht empfohlen. Dabei sollte die Applikation mit der gleichen Dosis nach 10 bis 14 Tagen, danach in Abständen von jeweils 4 Wochen wiederholt werden.

Zur Therapie werden je nach dem klinischen Bild vorteilhaft 10 bis 20 mg der Immunglobuline Ig und IgM und 80 mg IgG pro kg Körpergewicht verabreicht. Die Wiederholung der Injektion im Abstand &u von jeweils 1 Woche bis zum klinisch sichtbaren Erfolg, d. h. bis zur Überwindung der Infektion, wird angeraten.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäß gewonnenen Immunglobuline intramuskulär verabreicht. Sie hs werden auch nach wiederholter Anwendung gut vertragen.

Das beanspruchte Verfahren liefert die Immunglobuline frei von Australia-Antigen, das in der Über-i Wanderungselektrophorese nachgewiesen werden' könnte. Da ein Australia-Antigen-freies Präparat auch als frei von Hepatitisvirus angesehen werden kann, ist hierin ein wesentlicher Fortschritt in der Immunglobulin-Therapie zu sehen.

Ein weiteres Anwendungsgebiet der Produkte gemäß der Erfindung liegt im Bereich der klinischen Diagnostik. Die Substanzen eignen sich besonders als Standardpräparate bei der Bestimmung der Immunglobuline IgA, IgG und IgM. Die Immunglobuline sind zur Herstellung von gegen sie gerichteten Antiseren verwendbar, die zum Nachweis und zur Bestimmung der Immunglobuline in der Diagnostik eingesetzt werden können.

Die Erfindung wird durch das nachfolgend aufgeführte Beispiel erläutert.

Beispiel

20 1 menschliches Mischplasma von pH-Wert 7,6 werden bei -2° C mit 1,82 1 Äthanol (96%ig) versetzt und zur Abtrennung des ausgefällten Fibrinogens bei -2°C zentrifugiert.

Der Überstand wird erneut mit 5,15 1 Äthanol (96 %ig) bei - 5 ° C versetzt und der Niederschlag bei -5⁰C in einer Zentrifuge abgetrennt.

Die als Rückstand erhaltene Paste wird in 18 1 einer l%igen wäßrigen Glycin-Lösung aufgenommen und nach Einstellung der Leitfähigkeit auf 1 X ΙΟ³ μ5 mit gesättigter Kochsalzlösung durch Zugabe von 86 ml 1 η HCl auf pH 6,1 eingestellt. Das danach auftretende Präzipitat wird abzentrifugiert.

Der Überstand wird mit gesättigter Kochsalzlösung auf eine Leitfähigkeit von 6,0 x 10³ μ5 gebracht und mit 131 gPharmasorb (Chemie-Mineralien-Bremen) versetzt. Der pH-Wert wird mit 1 η HCl auf pH 5,5 nachreguliert und das Adsorbens abfiltriert.

Zu dem 22 1 betragenden Filtrat werden 1640 ml 1-molarer Calcium-Acetat-Lösung und 1640 ml V₃-molarer Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung unter Rühren zugegeben. Der pH-Wert wird mit 2 η NaOH auf pH 7,9 eingestellt und das Ganze sodann 12 Stunden sich selbst überlassen. Danach wird das Adsorbens durch Zentrifugation gewonnen. Der Überstand enthält IgG und IgA. Seine Aufarbeitung wird weiter unten beschrieben.

Der erhaltene Calciumphosphat-Niederschlag wird in 3,7 1 einer 0,85%igen Kochsalzlösung suspendiert und bis zu einer Endkonzentration von 4,5% mit Äthylen-Diamin-Tetraessigsäure-di-Natrium-SaIz versetzt. Mit 2 η Natronlauge wird der pH-Wert auf 5,0 gehalten. Die Temperatur beträgt +5⁰C. Nach 24 Stunden wird der verbleibende CaI-ciumphosphat-Rückstand abzentrifugiert und verworfen.

Der Überstand wird auf —5° C abgekühlt und der pH-Wert durch Zugabe von 2 η NaOH und 2 % Äthylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz auf 7,0 eingestellt. Die so erhaltene klare Lösung (4,15 1) wird mit 1460 ml Äthanol (96%ig), entsprechend 25% versetzt und 2 Stunden stehengelassen.

Sodann wird der Niederschlag durch Zentrifugation gewonnen und in einer wäßrigen Lösung von 0,3 % Kochsalz und 1 % Glycin aufgelöst, wobei soviel der wäßrigen Lösung genommen wird, daß der Eiweißgehalt 1 % beträgt. Die Leitfähigkeit wird durch Verdünnen auf 1,5 X 10⁴ uS und der pH-Wert auf 4,8 gebracht. Bei 5° C wird sodann 146 ml entsprechend

10% (ν:ν) einer Suspension eines Al(OH)₃-GeIs (Gehalt: 2 %ig berechnet als Al₂O₃) hinzugefügt. Nach 1 Stunde wird das Al(OH)₃ durch Zentrifugation von der IgM-Lösiing abgetrennt. Die erhaltene Lösung kann vor ihrer Verwendung nach üblichen Verfahren dialysiert und/oder beispielsweise mittels eines Ultrafilters auf einen Eiweißgehalt von 10% konzentriert werden. Für die parenteral Applikation wird das IgM-Konzentrat auf einen Gehalt von 20% IgM und 80% IgG eingestellt und nach Ergänzung des Salzgehaltes auf 0,3% NaCl (g:v) und 2,25% Glycin (g:v) keimfrei filtriert.

Eine besonders vorteilhafte Verfahrensvariante für die Gewinnung von reinem IgM läßt sich im letzten Schritt der Gewinnung dieses Proteins einfügen, indem statt der Adsorption der Verunreinigungen mittels Al(OH)₃ eine abermalige Fällung mit Äthanol durchgeführt wird. Hierzu wird statt der Zugabe des Al(OH)₃ zu der auf 1 % Protein eingestellten Lösung bei pH 7,0 und einer Leitfähigkeit von etwas über 1 X ΙΟ⁴ μέ Äthanol bis zu einer Konzentration von 15% bei einer Temperatur vor -5° C zugesetzt. Der dabei auftretende Niederschlag enthält IgM in hoher Reinheit und kann wie oben ausgeführt weiterverarbeitet werden.

Die Immunglobuline IgG und IgA werden aus dem Überstand der Calciumphosphat-Adsorption, dessen Volumen 25 1 beträgt, nach Einstellung des pH-Wertes mit 1 η HCl auf 6,8 durch Zugabe von 9000 ml Äthanol (96%ig) bei -5⁰C ausgefällt. Die durch Zentrifugation gewonnene Paste wird durch Gefriertrocknung vom Fällungsmittel befreit. Wenn dies gewünscht oder erforderlich ist, können die hier nebeneinander vorliegenden Immunglobuline IgA und IgG nach Auflösung in geeigneten Lösungsmitteln und ei- r> ner keimfreien Filtration ohne weitere Aufarbeitung als Therapeutikum oder Prophylaktikum angewandt werden.

IgA und IgG können aber auch getrennt werden vorteilhaft durch spezifische Adsorption und Desorp- 4u tion des IgA von dem in Lösung verbleibenden IgG. Hierzu werden 360 g der durch Zentrifugation gewonnenen, noch alkoholfeuchten Paste mit 14 1 einer 0,3%igen Kochsalzlösung bei +5⁰C aufgelöst. Der Eiweißgehalt beträgt 1%, der pH-Wert wird durch Zugabe von 30 ml 1 η HCl auf pH 5 eingestellt und die Leitfähigkeit durch Zusatz von 345 ml einer gesättigten Kochsalzlösung auf 1,5 X ΙΟ⁴ μ$ eingestellt. Den so erhaltenen 14,4 I der Lösung, die IgA und IgG enthält, werden unter Rühren bei 5° C 720 ml eines 2%igen Al(OH)₃-GeIs zugesetzt und die Suspension 1 Stunde gerührt. Danach wird bei 5° C das A1(OH)₃-Adsorbens abzentrifugiert.

Zur Desorption der IgA-angereicherten Fraktion vom A1(OH)₃-Adsorbens wird der A1(OH)₃-Niederschlag bei Zimmertemperatur zweimal mit 1,8 I einer V₃ M Lösung von sekundärem Natriumphosphat jeweils 1 Stunde lang gerührt und anschließend zur Gewinnung der Überstände zentrifugiert. Die vereinigten Überstände (3600 ml) werden bei -5⁰C mit 1640 ml Äthanol versetzt. Dabei wird die IgA-angereicherte Fraktion im Niederschlag gewonnen. Nach Abtrennen des Niederschlags und dessen Wiederauflösen in destilliertem Wasser läßt sich das Protein nach bekannten Methoden entsalzen und beispielsweise mit Hilfe eines Ultrafilters konzentrieren. Statt Äthanol läßt sich für die Präzipitation beispielsweise auch eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung einsetzen, die bei den oben gezeigten Volumenverhältnissen nach Zusatz von 1940 ml die IgA-haltige Proteinfraktion optimal zu präzipitieren vermag. In beiden Fällen beträgt der Anteil des IgA etwa 43%, der des IgG etwa 57% der vorhandenen Proteinmenge.

Für die Gewinnung des IgG aus dem Überstand der AI(OH)₃-Adsorption, von dem bei der Zentrifugation 14,6 I gewonnen wurden, wird vorteilhaft eine Präzipitation mit Äthanol vorgenommen. Dazu wird die IgG-Lösung unter Rühren mit 2 η Natronlauge bis zu einem pH-Wert von 6,8 versetzt und anschließend auf 0° C abgekühlt. Während einer weiteren Abkühlung der Lösung auf -5⁰C werden 5200 ml 96%igen Äthanols unter Rühren zugegeben. Die sich ausbildende Fällung wird durch Zentrifugation abgetrennt und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt ist weitgehend reines IgG.

Ähnlich gute Ergebnisse werden erhalten, wenn IgA und IgG durch Zonenelektrophorese und Fällung mit ZnSO₄ entsprechend Progr. immunobiol. Standard, Vol. 4, S. 86 bis 91 (Karger, Basel/München/ New York 1970) voneinander getrennt und spezifischen Erfordernissen der Therapie entsprechend gesondert eingesetzt werden.

Claims (4)

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Anreichern der Immunglobulinfraktionen InG, IgA und IgM und gegebenenfalls Abtrennen der IgG-Fraktion davon aus menschlichem Serum oder Plasma, dadurch gekennzeichnet, daß man

a) aus Serum oder defibriniertem Plasma mit einem primären, mit Wasser mischbaren Alkohol, vorzugsweise Äthanol, bei einer Konzentration zwischen 18 und 35% in einem pH-Bereich von 5,6 bis 8,5 bei einer Temperatur von 0 bis —10° C, eine rohe Immunglobulinfraktion ausfällt,

b) die Fälung der Stufe (a) in wäßrige Lösung bringt und daraus die Euglobuline durch Einstellen einer Leitfähigkeit von 5,0 X 10² bis 8,0 X ΙΟ³ μ5 und eines pH-Wertes von 4,5 bis 6 im Temperaturbereich von 0 bis + 20⁰C ausfällt,

c) aus dem Überstand der Stufe (b) durch Adsorption an ein mineralisches Adsorbens auf Basis Silikat oder Attapulgit in einer Menge von 0,3 bis 1 % (g: v), bei einer Leitfähigkeit von 5,0 X 10² bis 1,0 X 10⁴ uS, bei pH-Wert 4,5 bis 6,5, die proteolytischen Fermente abtrennt,

d) im überstand der Stufe (c) den überwiegenden Teil des IgM neben anderen Proteinen an ein in situ hergestelltes Calcium-Phosphat im pH-Bereich von 5,8 bis 8,5 adsorbiert und das Adsorbat abtrennt,

e) aus dem Adsorbat der Stufe (d) durch Behandlung mit dem 5- bis lOfachen Volumen einer auf pH 4,0 bis 8,0 eingestellten wäßrigen Salzlösung, deren Konzentration 0,8 bis 4% beträgt, oder einer Aminosäurelösung, deren Konzentration 1 bis 8% beträgt, oder einer wäßrigen Lösung eines mit Calcium einen Komplex bildenden Agens, in einer Konzentration von 2 bis 7%, oder einer geeigneten Kombination von Salz, Aminosäure und Komplexbildner, eine IgM-haltige Fraktion desorbiert und das IgM nach Einstellung des pH-Wertes auf pH 6,5 bis 7,5 durch Zugabe eines niedrigen Alkohols, bis zu einer Konzentration von etwa 20 bis 25% anreichert,

f) die Fällung der Stufe (e) durch Zentrifugation oder Filtration abtrennt, in einer wäßrigen Salzlösung wieder auflöst, den pH-Wert auf 4,5 bis 5,5 einstellt, die Leitfähigkeit durch Zugabe eines Salzes auf etwa über 1 X 10⁴ ^S einstellt und die Verunreinigungen der mit IgM angereicherten Fraktion durch Zusatz von 0,1 bis 0,3% eines Al(OH)j-Gels (berechnet als Al₂O₃) abtrennt,

g) aus dem durch Adsorption von IgM befreiten Überstand der Stufe (d) das IgG und IgA mit einem mit Wasser mischbaren primären Alkohol bei einer Konzentration von 20 bis 40%, bei pH 6,5 bis 8,0 bei 0 bis -10° C ausfällt und

h) gewünschtenfalls zur Trennung von IgG und IgA das IgA selektiv an Aluminiumhydroxyd adsorbiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß zur Herstellung des Calcium phosphats ein wasserlösliches Calciumsalz und eir wasserlösliches Phosphat der IgM-haltigen Ei weißlösung zugesetzt werden, wobei das Calciumsalz in etwa dreifach molarem Überschuß vorliegt

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die IgG und IgA enthaltendf Fällung der Stufe (g) bis zu einer Eiweißkonzen tration von etwa 1 % aufgelöst wird, daß zu diesel Lösung bei pH 4,5 bis 5,5, einer Leitfähigkeit vor etwas über 1 X ΙΟ⁴ μδ 0,05 bis 0,?% eine: Al(OH)₃-GeIs (berechnet als Al₂O₃) zugesetz und daß das IgA nach Abtrennung des Adsorben: mit ener etwa V₃ M sekundären Natriumphos phatlösung desorbiert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die Desorption des IgM von Phosphat in Stufe (e) mit einer 4,5%igen Lösunj von Äthylen-Diamin-Tetraessigsäure-di-Natriun bei pH 5,0 durchgeführt wird.