DE2404265C3 - Verfahren zum Abreichen von Immunglobulinen - Google Patents
Verfahren zum Abreichen von ImmunglobulinenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahrei zum Anreichern von Immunglobulinfraktionen, ins
besondere ein Verfahren zur Gewinnung von Immun
3" globulinkonzentraten, die einerseits weitgehend rei
nes IgG, andererseits neben IgG IgA oder IgM star! angereichert enthalten.
Bei der immunologischen Abwehr des Körpers ge gen Mikroorganismen und deren Stoffwechselpro
r> dukte spielen die Immunglobuline als humoralc Anti
körper eine bedeutende Rolle. Die Immunglobuliiif
sind jedoch nicht einheitlich; sie unterscheiden siel nicht nur hinsichtlich ihres chemischen Aufbaus, ihre:
Molekulargewichts und ihres mengenmäßigen Vor
Ί» kommens im Serum, sondern auch dadurch, daß siel
beispielsweise in der als Immunglobulin A (IgA) be zeichneten Fraktion hohe Antikörperaktivitäten ge
gen bestimmte Viren, z. B. gegen Poliomyelitis, Ma sern und Influenza finden.
■π In der Fraktion der Immunglobulinklasse M (IgM
finden sich vorwiegend die Antikörper gegen gramne gative Erreger, z. B. Antikörper gegen Escherichii
coli, Pseudomonas aeruginosa (bact. pyrocyaneum)
B. proteus, Haemoph. Influenza, H. pertussis, Kleb
w siellen (Klebs. penumoniae), Salmonellen und Shigel
len. Allgemein werden Antikörper gegen Kohlenhy drate vorzugsweise als IgM anzutreffen sein, wahrem
Proteinantigene im wesentlichen die Bildung der Im munglobuline der Klasse G (IgG) induzieren. Darau
•.ί ist zu ersehen, daß eine fortschrittliche Immunthera
pie von bakteriellen und viralen Infektionen eine spe zifische Substitution und eine gezielte Anwendunj
von Immunglobulinen derjenigen Klassen erfordert die bei dem Krankheitsbild eine wesentliche Bedeu
wi tung haben.
Für die Gewinnung der Immunglobuline, aufge trennt nach Klassen, stehen zwei bekannte Verfahrei
zur Verfügung: einerseits das auf Co h η und Oncle\
zurückgehende Fällungsverfahren mit Äthanol, wei
h, terentwickelt in der US-Patentschrift 3597409; an
dererseits die Methode von Heide und Haupt, dii die Kombination von Fällungsschritten mit Acridin
derivaten und Ammoniumsulfat verwenden. Insbe
sondere die letztgenannte Methode erfordert häufig noch elektrophoretische und chromatographische
Schritte zur Auftrennung und Weiterreinigung der angereicherten Immunglobulinfraktionen. Dadurch
ist die Methode verlustreich und führt bei Anwendung im technischen Maßstab zu unbefriedigenden Ausbeuten.
Die nach dem Stand der Technik hergestellten handelsüblichen Immunglobulinpräparate enthalten
hauptsächlich nur IgG, wenig IgA und in Spuren IgM.
Es wurde nun ein Verfahren zur Gewinnung von nach Klassen getrennten Immunglobulinkonzentraten
gefunden, die IgA, IgM und IgG in hoher Reinheit und guter Ausbeute enthalten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Verfahren zur Gewinnung von Immunglobulinfraktionen
bzw. Immunglobulinkonzentraten, die einerseits weitgehend reines IgG, andererseits neben
IgG IgA oder IgM stark angereichert enthalten. Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man
a) aus Serum oder defibriniertem Plasma mit einem primären, mit Wasser mischbaren Alkohol, vorzugsweise
Äthanol, bei einer Konzentration zwischen 18 und 35% in einem pH-Bereich von 5,6
bis 8,5 bei einer Temperatur von 0 bis — 10° C, eine rohe Immunglobulinfraktion ausfällt,
b) die Fällung der Stufe (a) in wäßrige Lösung bringt und daraus die Euglobuline durch Einstellen
einer Leitfähigkeit von 5,OxK)2 bis 8,0 X ΙΟ3 μ$ und eines pH-Wertes von 4,5 bis
6 im Temperaturbereich von 0 bis +20° C ausfällt,
c) aus dem Überstand der Stufe (b) durch Adsorption an ein mineralisches Adsorbens auf Basis
Silikat oder Attapulgit in einer Menge von 0,3 bis 1% (g.-v), bei einer Leitfähigkeit von
5,0 X H)2 bis 1,0 x H)4 \iS, bei pH-Wert 4,5 bis
6,5, die proteolytischen Fermente abtrennt,
d) im Überstand der Stufe (c) den überwiegenden Teil des IgM neben anderen Proteinen an ein
in situ hergestelltes Calcium-Phosphat im pH-Bereich 5,8 bis 8,5 adsorbiert und das Adsorbat
abtrennt,
c) aus dem Adsorbat der Stufe (d) durch Behandlung mit dem 5- bis lOfachen Volumen einer auf
pH 4,0 bis 8,0 eingestellten wäßrigen Salzlösung, deren Konzentration 0,8 bis 4% beträgt, oder
einer Aminosäurelösung, deren Konzentration 1 bis 8% beträgt, oder einer wäßrigen Lösung
eines mit Calcium einen Komplex bildenden Agens, in einer Konzentration von 2 bis 7 %, oder
einer geeigneten Kombination von Salz, Aminosäure und Komplexbildner, eine IgM-haltige
Fraktion desorbiert und das IgM nach Einstellung des pH-Wertes auf pH 6,5 bis 7,5 durch
Zugabe eines niedrigen Alkohols, bis zu einer Konzentration von etwa 20 bis 25% anreichert,
f) die Fällung der Stufe (e) durch Zentrifugation oder Filtration abtrennt, in einer wäßrigen Salzlösung
wieder auflöst, den pH-Wert auf 4,5 bis 5,5 einstellt, die Leitfähigkeit durch Zugabe eines
Salzes auf etwa über 1 x 104 μ8 einstellt und
die Verunreinigungen der mit IgM angereicherten Fraktion durch Zusatz von 0,1 bis 0,3% eines
Al(CH)3-GeIs (berechnet als Al2O3) abtrennt,
g) aus dem durch Adsorption von IgM befreiten Überstand der Stufe (d) das IgG und IgA mit
einem mit Wasser mischbaren primären Alkohol bei einer Konzentration von 20 bis 40%, bei pH
6,5 bis 8,0 bei 0 bis -10° C, ausfällt und
h) gewünschtenfalls zur Trennung von IgG und IgA das IgA selektiv an Alumiriiumhydroxyd adsorbiert.
h) gewünschtenfalls zur Trennung von IgG und IgA das IgA selektiv an Alumiriiumhydroxyd adsorbiert.
Die nach dem Verfahren hergestellten, bezüglich IgA, IgM und IgG angereicherten Immunglobulinkonzentrate
sind als Therapeutika und diagnostische Reagenzien verwendbar.
in Die Entfernung des Fibrinogens aus dem als Ausgangsmaterial
dienenden Plasma erfolgt auf an sich bekannte Weise, vorteilhaft als Fällung mit einem niederen
Alkohol oder auch durch Recalcifizierung oder durch Kryopräzipitation.
Ii Die Abscheidung der rohen Immunglobulinfraktionen
in Stufe (a) erfolgt vorzugsweise mittels Äthanol bei einer Konzentration zwischen 18 und 35%,
vorzugsweise 25%, in einem pH-Bereich von 5,6 bis 8,5, vorzugsweise bei 7,7, bei einer Temperatur von
.Ό 0 bis -10° C, vorzugsweise 5° C.
Anstelle von Äthanol kann hier wie auch in den folgenden Verfahrensstufen jeder andere primäre,
aliphatische Alkohol verwendet werden, sofern er mit Wasser hinreichend mischbar ist, z. B. Methanol.
2i Äthanol wird jedoch wegen seiner physiologischen Verträglichkeit bevorzugt.
Entsprechend Stufe (b) wird der Niederschlag der Stufe (a) in der 5- bis 50fachen Menge, vorteilhaft
in der 20fachen Menge des Niederschlagsgewicht, ei-JiI
ner wäßrigen Flüssigkeit, vorzugsweise von destilliertem Wasser, in Lösung gebracht. Dem Wasser können
gewünschtenfalls geeignete Zusätze wie Aminosäuren, vorzugsweise Glycin, in geringer Konzentration
hinzugefügt werden. Sodann wird die Leitfähigkeit j--, durch Zusatz eines Salzes, vorteilhaft Natriumchlorid,
auf 5,0 x H)2 bis 8,0 χ ΙΟ·1 μ5 eingestellt. Durch Ansäuern
auf pH 4,5 bis 6, vorzugsweise auf pH 5,1, werden die Euglobuline im Temperaturbereich von
0 bis -20° C, vorzugsweise bei +5° C ausgefällt.
Zur Adsorption von Proteinasen, insbesondere von Plasminogen, wird dem euglobulinfreien Überstand
der Stufe (b) ein mineralisches Adsorbens, besonders vorteilhaft aus der Gruppe der Silikate, z. B. Kaolin
oder das im Handel erhältliche, mit Pharmasorb-Regular bezeichnete Attapulgit, in einer Menge von 0,3
bis 1 %, vorzugsweise 0,7% (g:v), bei einer Leitfähigkeit von 5,0 X 102 bis 1,0 X 10" μ5, vorzugsweise bei
6,0 X 105 μ5, bei pH-Wert 4,5 bis 6,5, vorzugsweise
bei pH 5,5, zugesetzt und 30 Minuten bis 3 Stunden
w einwirken gelassen.
Nach Abtrennung des Adsorbens durch Zentrifugation oder Filtration wird dem Abguß ein wasserlösliches
Calciumsalz und ein wasserlösliches Phosphat zugesetzt, wobei das Calciumsalz gegenüber dem
ν, Phosphat im Überschuß, vorzugsweise in etwa dreifach
molarem Überschuß, vorliegen soll. Vorteilhaft wird sekundäres Natriumphosphat und Calciumacetat
verwendet. Die Konzentration des Calciumsalzes soll etwa 0,025 bis 0,1 molar, vorteilhaft 0,07 molar, sein.
ho Der pH-Wert wird anschließend auf 5,8 bis 8,5, vorzugsweise
auf 7,9, eingestellt, wobei das sich bildende Calciumphosphat das IgM adsorbiert.
Die IgM-haltige adsorbierte Fraktion wird nach Abtrennung des Calciumphosphats durch Zentrifuga-
hi tion oder Filtration durch Behandlung mit dem 5- bis
lOfachen Volumen einer auf pH 4,0 bis 8,0, vorzugsweise auf pH 5,0, eingestellten wäßrigen Salzlösung,
vorteilhaft einer Kochsalzlösung, deren Konzentra-
tion 0,8 bis 4% beträgt, oder einer Aminosäurelösung, vorteilhaft einer Glyzinlösung, deren Konzentration
1 bis 8% beträgt, oder einer wäßrigen Lösung eines mit Calcium einen Komplex bildenden Agens, vorteilhaft
mit Alkalisalzen der Äthyien-Diamin-Tetraessigsäure in einer Konzentration von 2 bis 7%, vorzugsweise
4,5%, oder einer geeigneten Kombination von Salz, Aminosäure und Komplexbildner eluiert.
Aus dem IgM-haltigen Eluat wird das IgM nach
Einstellung des pH-Wertes auf pH 5,0 bis 8,0, vorzugsweise pH 7, durch Zugabe von Äthanol, bis zu
einer Konzentration von etwa 20 bis 25%, ausgefällt.
Die durch Zentrifugation oder Filtration abgetrennte Fällung der Stufe (e) wird in einer möglichst
geringen Menge einer verdünnten wäßrigen Salzlösung, vorzugsweise einer 0,3- bis 0,75 %igen Natriumchlorid'iösung,
wieder aufgelöst, der pH-Wert auf 4,5 bis 5,5 eingestellt, die Leitfähigkeit durch Zugabe eines
Salzes, vorzugsweise Kochsalz, auf etwas über 1 X ΙΟ4 μ5 eingestellt. Sodann werden die Verunreinigungen
der mit IgM angereicherten Fraktion durch ZusatzνοηΟ,Ι bis 0.3% eines Al(OH)3-GeIs (berechnet
als Al2O3) absorbiert und damit nach Abtrennen
des Adsorbens eine IgM-haltige Lösung in guter Ausbeute
erhalten.
Aus dem Überstand der Calciumphosphat-Adsorption der Stufe (d) werden das IgG und das IgA
mit einem primären mit Wasser mischbaren Alkohol, bei einer Konzentration von 20 bis 40%, vorzugsweise
25%, bei pH 6,5 bis 8,0, vorzugsweise 6,8, bei 0 bis )0
— 10° C, vorzugsweise -5° C, ausgefälJ*.
Die Trennung von IgG und IgA nach Auflösung der erhaltenen Äthanolfällung in Wasser oder einer
verdünnten Salzlösung in solcher Menge, daß die Eiweißkonzentration der Lesung etwa 1 % beträgt, geschient
bei pH 4,5 bis 5,5, vorzugsweise pH 5,0 und einer Leitfähigkeit von etwas über 1 x ΙΟ4 μ5 durch
Zusatz von 0,05 bis 0,2%, vorzugsweise 0,1% eines Al(OH)3-GeIs (berechnet als Al2O3). IgA wird unter
diesen Bedingungen adsorbiert, während IgG im Überstand verbleibt. Das im Adsorbat enthaltene IgA
wird nach Abtrennung in an sich bekannter Weise, vorteilhaft mit einer V3 m sekundären Natriumphosphatlösung,
desorbiert.
IgA und IgG können auch auf bekannte Weise A--,
durch Fällungsverfahren, chromatographisch oder durch Zonenelektrophorese voneinander getrennt
werden.
Wenn dies gewünscht und erforderlich erscheint, können die in Stufe (g) durch Alkoholfällung erhalte- ™
nen Pasten der Immunglobuline IgA und IgG durch Lyophilisation vom Alkohol befreit werden. Die Befreiung
der Immunglobuline vom Fällungsmittel kann auch durch Gelfiltration oder Dialyse der Immunglobulinlösung
erfolgen. ->5
Den Endprodukten kann gewünschtenfalls ein bakteriostatisches Agens zugesetzt werden. IgA und
IgG können in gefriergetrocknetem Zustand aufbewahrt und in der für Immunglobuline bekannten
Weise, beispielsweise in 0,3%iger Kochsalzlösung b0
oder in 2,25%iger Olvzin-Lösung wieder aufgelöst werden.
Die Reinheit und Ausbeute der Immunglobuline wird mit der radialen Immundiffusionstechnik nach
Becker, Rapp, Schwick und Störiko, Z. Klin. ,.-, Chem. 6, 113 (1968) bestimmt.
Die erfindungsgemäß hergestellten IgM-, IgA- und IgG-Präparationen sind nach Kriterien der Elektrophorese
95% reine Immunglobuüne.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird eine native IgM-Präparation in einer Reinheit erhalten, die
bis zu 70% aus IgM und einem Restgehalt von überwiegend IgG und geringen Mengen IgA besteht. Die
Ausbeute beträgt bis zu 30% des ursprünglichen Plasmagehalts an IgM. Wegen der hohen Viskosität der
verfahrensgemäß erhaltenen IgM-Lösungen empfiehlt sich vor der weiteren Verwendung eine Verdünnung
mit einer wäßrigen Lösung eines Plasmaproteins, vorzugsweise einer IgG-haltigen Immunglobulinlösung,
auf einen Gehalt von etwa 20% IgM, bezogen auf den Gesamtproteingehalt. Die vor dem letzten
Trennungsschritt (Ende der Stufe (g)) erhaltene Mischung von IgG und IgA setzt sich aus etwa 85 % IgG
und 15% IgA zusammen. Dabei wird IgA in einer Ausbeute von 604, IgG in einer Ausbeute von 90%
- bezogen auf die im Ausgangsplasma enthaltenen Immunglobulinmengen - wiedergewonnen.
Die erfindungsgemäße Auftrennung von IgG und IgA liefert Konzentrate, die einerseits ca. 40 bis 50%
IgA mit dem Restgehalt an IgG, andererseits ein praktisch reines IgG enthalten. Die Auftiennung von
IgG und IgA nach bekannten Verfahren zur Gewinnung von IgA, beispielsweise durch die wesentlich
aufwendigere Zonenelektrophorese, liefert keine weitergehende Auftrennung als das erfindungsgemäße
Verfahren.
Diese Auftrennung von Immunglobulinen in angereicherte Fraktionen von hoher Reinheit durch Aneinanderreihen
einer großen Zahl von Verfahrensschritten nach dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte nicht erwartet werden.
Die Verfahrensendprodukte fallen frei von Pyrogenen und bei der Verwendung von Australia-Antigenhaltigem
Plasma auch frei von in der Überwanderungselektrophorese nachweisbarem Australia-Antigen
an.
Neben den aufgezeigten Grundzügen des Verfahrens steht es dem Fachmann frei, verschiedene Variationen
einzuführen. Insbesondere ist es nicht unbedingt erforderlich, die erfindungsgemäß zu gewinnenden
IgA, IgM und IgG alle nach dem vorliegenden Verfahren herzustellen. Es kann beispielsweise nur
IgM nach diesem Verfahren isoliert werden, die Auftrennung der übrigen Immunglobuline könnte jedoch
nach anderen Methoden erfolgen, insbesondere wenn man bereit ist, im Interesse einer vereinfachten Aufarbeitung
Ausbeuteverluste in Kauf zu nehmen. Für die Gewinnung des IgM in guter Ausbeute läßt sich
beispielsweise statt der vorgeschlagenen Adsorption der Verunreinigungen mittels Al(OH)3-GeI auch eine
im gleichen Milieu durchzuführende Fällung mit einem niederen Alkohol, vorteilhaft Äthanol, in einer
Konzentration von 10 bis 20%, vorteilhaft von 15%, bei 0 bis -10° C, vorteilhaft bei -5° C anwenden.
Die selektive Desorption kann einerseits durch Erhöhung der Leitfähigkeit der Elutionslösung, andererseits
durch partielle Komplexbildung der Elutionslösung mit dem Adsorbens, oder aber durch sinnvolle
Verknüpfung beider Maßnahmen erfolgen.
Die vorliegende Erfindung verwendet mit Vorteil ungiftige bzw. physiologisch gut verträgliche Agenzien.
So wird Äthanol vorteilhaft gegenüber Methanol verwendet, da letzteres bekanntlich giftig ist. Doch
lassen sich die Anreicherungsfällungen sowohl mit Äthanol wie mit Methanol oder mit Isopropanol
durchführen. Da Kochsalz als Bestandteil von Infu-
sionslösungen seit Jahrzehnten verwendet wird, wird Natriumchlorid bevorzugt zur Erhöhung der Leitfähigkeit
der Lösungen verwendet. Dem Fachmann steht es jedoch frei, zu diesem Zweck ein anderes wasserlösliches
Salz auszuwählen.
Als Ausgangsmaterial dient vorteilhaft frisch gewonnenes, mit Zitronensäure und Glucose (ACD)
oder mit Zitronensäure, Glucose und Phosphat (CPD) stabilisiertes menschliches Plasma, das die Immunglobuline
in einer normalen Verteilung enthält. Es kann jedoch auch Immunplasma verwendet werden, d. h.
Plasma von Spendern, denen zur Erzielung hoher Antikörpertiter bestimmte Antigene verabreicht worden
waren. Neben frischem Plasma kann auch eingefrorenes Plasma verwendet werden. Durch den besonderen
Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die Endprodukte frei von Pyrogenen gewonnen werden,
kann als Ausgangsmaterial auch bereits mikrobiell kontaminiertes, überaltertes Plasma eingesetzt werden.
Antibakterielle Zusätze sind beim Aufarbeitungsgang nicht erforderlich. Wenn vor Anwendung
des Verfahrens geeignete Milieubedingungen geschaffen werden, können auch andersartig gewonnene,
rohe Immunglobulinkonzentrate dem Verfahren unterworfen werden. Serum ist als Ausgangsmaterial
verwendbar, wenn beispielsweise durch Salzzusatz eine einem Plasma entsprechende Isotonie
hergestellt wird. Bedingt durch einen weiteren Vorzug des erfindungsgemäßen Verfahrens, daß die Endprodukte
in der Überwanderungselektrophorese zum Nachweis von Australia-Antigen negativ sind, könnte
auch Australia-Antigen-haltiges Ausgangsplasma in das Verfahren eingesetzt werden.
Die Endprodukte des Verfahrens sind für die klinische Applikation an Menschen als spezifische Immun- κ
prophylaktika und -therapeutika sehr gut geeignet. Im besonderen werden die Präparate beispielsweise zur
prophylaktischen Substitution bei Fehlen oder Verminderung von IgM oder IgM + IgG oder IgA einschließlich
transitorischem Antikörpermangelsyndrom bei Frühgeborenen und jungen Säuglingen, bei
gehäuften Infektionen speziell durch gramnegative Erreger, IgA insbesondere bei einigen Lungenerkrankungen,
bei denen eine Verminderung des IgA-Spiegels beobachtet wurde, ferner zur Therapie bei schweren
bakteriellen Erkrankungen, die durch gramnegative Errger wie E. coli, Pseudomonas aeruginosa, H.
Influenzae und pertussis, B. proteus, Klebsiellen, SaI-monellen
und Shigellen hervorgerufen werden, eingesetzt.
Zur Prophylaxe wird häufig die Verabreichung von 4 bis 8 mg der IrnmunglobuKrie IgA. und IgM und
32 mg IgG pro kg Körpergewicht empfohlen. Dabei sollte die Applikation mit der gleichen Dosis nach 10
bis 14 Tagen, danach in Abständen von jeweils 4 Wochen wiederholt werden.
Zur Therapie werden je nach dem klinischen Bild vorteilhaft 10 bis 20 mg der Immunglobuline Ig und
IgM und 80 mg IgG pro kg Körpergewicht verabreicht. Die Wiederholung der Injektion im Abstand &u
von jeweils 1 Woche bis zum klinisch sichtbaren Erfolg, d. h. bis zur Überwindung der Infektion, wird
angeraten.
Bevorzugt werden die erfindungsgemäß gewonnenen Immunglobuline intramuskulär verabreicht. Sie hs
werden auch nach wiederholter Anwendung gut vertragen.
Das beanspruchte Verfahren liefert die Immunglobuline frei von Australia-Antigen, das in der Über-i
Wanderungselektrophorese nachgewiesen werden' könnte. Da ein Australia-Antigen-freies Präparat
auch als frei von Hepatitisvirus angesehen werden kann, ist hierin ein wesentlicher Fortschritt in der Immunglobulin-Therapie
zu sehen.
Ein weiteres Anwendungsgebiet der Produkte gemäß der Erfindung liegt im Bereich der klinischen
Diagnostik. Die Substanzen eignen sich besonders als Standardpräparate bei der Bestimmung der Immunglobuline
IgA, IgG und IgM. Die Immunglobuline sind zur Herstellung von gegen sie gerichteten Antiseren
verwendbar, die zum Nachweis und zur Bestimmung der Immunglobuline in der Diagnostik eingesetzt
werden können.
Die Erfindung wird durch das nachfolgend aufgeführte Beispiel erläutert.
20 1 menschliches Mischplasma von pH-Wert 7,6 werden bei -2° C mit 1,82 1 Äthanol (96%ig) versetzt
und zur Abtrennung des ausgefällten Fibrinogens bei -2°C zentrifugiert.
Der Überstand wird erneut mit 5,15 1 Äthanol (96 %ig) bei - 5 ° C versetzt und der Niederschlag bei
-50C in einer Zentrifuge abgetrennt.
Die als Rückstand erhaltene Paste wird in 18 1 einer
l%igen wäßrigen Glycin-Lösung aufgenommen und nach Einstellung der Leitfähigkeit auf 1 X ΙΟ3 μ5 mit
gesättigter Kochsalzlösung durch Zugabe von 86 ml 1 η HCl auf pH 6,1 eingestellt. Das danach auftretende
Präzipitat wird abzentrifugiert.
Der Überstand wird mit gesättigter Kochsalzlösung auf eine Leitfähigkeit von 6,0 x 103 μ5 gebracht und
mit 131 gPharmasorb (Chemie-Mineralien-Bremen) versetzt. Der pH-Wert wird mit 1 η HCl auf pH 5,5
nachreguliert und das Adsorbens abfiltriert.
Zu dem 22 1 betragenden Filtrat werden 1640 ml 1-molarer Calcium-Acetat-Lösung und 1640 ml V3-molarer
Dinatriumhydrogenphosphat-Lösung unter Rühren zugegeben. Der pH-Wert wird mit 2 η NaOH
auf pH 7,9 eingestellt und das Ganze sodann 12 Stunden sich selbst überlassen. Danach wird das Adsorbens
durch Zentrifugation gewonnen. Der Überstand enthält IgG und IgA. Seine Aufarbeitung wird weiter
unten beschrieben.
Der erhaltene Calciumphosphat-Niederschlag wird in 3,7 1 einer 0,85%igen Kochsalzlösung suspendiert
und bis zu einer Endkonzentration von 4,5% mit Äthylen-Diamin-Tetraessigsäure-di-Natrium-SaIz
versetzt. Mit 2 η Natronlauge wird der pH-Wert auf 5,0 gehalten. Die Temperatur beträgt +50C.
Nach 24 Stunden wird der verbleibende CaI-ciumphosphat-Rückstand abzentrifugiert und verworfen.
Der Überstand wird auf —5° C abgekühlt und der
pH-Wert durch Zugabe von 2 η NaOH und 2 % Äthylendiamintetraessigsäure-di-Natriumsalz
auf 7,0 eingestellt. Die so erhaltene klare Lösung (4,15 1) wird mit 1460 ml Äthanol (96%ig), entsprechend 25%
versetzt und 2 Stunden stehengelassen.
Sodann wird der Niederschlag durch Zentrifugation gewonnen und in einer wäßrigen Lösung von 0,3 %
Kochsalz und 1 % Glycin aufgelöst, wobei soviel der wäßrigen Lösung genommen wird, daß der Eiweißgehalt
1 % beträgt. Die Leitfähigkeit wird durch Verdünnen auf 1,5 X 104 uS und der pH-Wert auf 4,8 gebracht.
Bei 5° C wird sodann 146 ml entsprechend
10% (ν:ν) einer Suspension eines Al(OH)3-GeIs
(Gehalt: 2 %ig berechnet als Al2O3) hinzugefügt. Nach
1 Stunde wird das Al(OH)3 durch Zentrifugation von der IgM-Lösiing abgetrennt. Die erhaltene Lösung
kann vor ihrer Verwendung nach üblichen Verfahren dialysiert und/oder beispielsweise mittels eines Ultrafilters auf einen Eiweißgehalt von 10% konzentriert
werden. Für die parenteral Applikation wird das IgM-Konzentrat auf einen Gehalt von 20% IgM und
80% IgG eingestellt und nach Ergänzung des Salzgehaltes auf 0,3% NaCl (g:v) und 2,25% Glycin (g:v)
keimfrei filtriert.
Eine besonders vorteilhafte Verfahrensvariante für die Gewinnung von reinem IgM läßt sich im letzten
Schritt der Gewinnung dieses Proteins einfügen, indem statt der Adsorption der Verunreinigungen mittels
Al(OH)3 eine abermalige Fällung mit Äthanol durchgeführt wird. Hierzu wird statt der Zugabe des
Al(OH)3 zu der auf 1 % Protein eingestellten Lösung bei pH 7,0 und einer Leitfähigkeit von etwas über
1 X ΙΟ4 μέ Äthanol bis zu einer Konzentration von
15% bei einer Temperatur vor -5° C zugesetzt. Der dabei auftretende Niederschlag enthält IgM in hoher
Reinheit und kann wie oben ausgeführt weiterverarbeitet werden.
Die Immunglobuline IgG und IgA werden aus dem
Überstand der Calciumphosphat-Adsorption, dessen Volumen 25 1 beträgt, nach Einstellung des pH-Wertes
mit 1 η HCl auf 6,8 durch Zugabe von 9000 ml Äthanol (96%ig) bei -50C ausgefällt. Die durch
Zentrifugation gewonnene Paste wird durch Gefriertrocknung vom Fällungsmittel befreit. Wenn dies gewünscht
oder erforderlich ist, können die hier nebeneinander vorliegenden Immunglobuline IgA und IgG
nach Auflösung in geeigneten Lösungsmitteln und ei- r> ner keimfreien Filtration ohne weitere Aufarbeitung
als Therapeutikum oder Prophylaktikum angewandt werden.
IgA und IgG können aber auch getrennt werden vorteilhaft durch spezifische Adsorption und Desorp- 4u
tion des IgA von dem in Lösung verbleibenden IgG. Hierzu werden 360 g der durch Zentrifugation gewonnenen,
noch alkoholfeuchten Paste mit 14 1 einer 0,3%igen Kochsalzlösung bei +50C aufgelöst. Der
Eiweißgehalt beträgt 1%, der pH-Wert wird durch Zugabe von 30 ml 1 η HCl auf pH 5 eingestellt und
die Leitfähigkeit durch Zusatz von 345 ml einer gesättigten Kochsalzlösung auf 1,5 X ΙΟ4 μ$ eingestellt.
Den so erhaltenen 14,4 I der Lösung, die IgA und IgG enthält, werden unter Rühren bei 5° C 720 ml
eines 2%igen Al(OH)3-GeIs zugesetzt und die Suspension
1 Stunde gerührt. Danach wird bei 5° C das A1(OH)3-Adsorbens abzentrifugiert.
Zur Desorption der IgA-angereicherten Fraktion vom A1(OH)3-Adsorbens wird der A1(OH)3-Niederschlag
bei Zimmertemperatur zweimal mit 1,8 I einer V3 M Lösung von sekundärem Natriumphosphat jeweils
1 Stunde lang gerührt und anschließend zur Gewinnung der Überstände zentrifugiert. Die vereinigten
Überstände (3600 ml) werden bei -50C mit
1640 ml Äthanol versetzt. Dabei wird die IgA-angereicherte Fraktion im Niederschlag gewonnen. Nach
Abtrennen des Niederschlags und dessen Wiederauflösen in destilliertem Wasser läßt sich das Protein nach
bekannten Methoden entsalzen und beispielsweise mit Hilfe eines Ultrafilters konzentrieren. Statt Äthanol
läßt sich für die Präzipitation beispielsweise auch eine gesättigte Ammoniumsulfatlösung einsetzen, die bei
den oben gezeigten Volumenverhältnissen nach Zusatz von 1940 ml die IgA-haltige Proteinfraktion optimal
zu präzipitieren vermag. In beiden Fällen beträgt der Anteil des IgA etwa 43%, der des IgG etwa 57%
der vorhandenen Proteinmenge.
Für die Gewinnung des IgG aus dem Überstand der AI(OH)3-Adsorption, von dem bei der Zentrifugation
14,6 I gewonnen wurden, wird vorteilhaft eine Präzipitation mit Äthanol vorgenommen. Dazu wird
die IgG-Lösung unter Rühren mit 2 η Natronlauge bis zu einem pH-Wert von 6,8 versetzt und anschließend
auf 0° C abgekühlt. Während einer weiteren Abkühlung der Lösung auf -50C werden 5200 ml
96%igen Äthanols unter Rühren zugegeben. Die sich ausbildende Fällung wird durch Zentrifugation abgetrennt
und lyophilisiert. Das erhaltene Produkt ist weitgehend reines IgG.
Ähnlich gute Ergebnisse werden erhalten, wenn IgA und IgG durch Zonenelektrophorese und Fällung
mit ZnSO4 entsprechend Progr. immunobiol. Standard, Vol. 4, S. 86 bis 91 (Karger, Basel/München/
New York 1970) voneinander getrennt und spezifischen Erfordernissen der Therapie entsprechend
gesondert eingesetzt werden.
Claims (4)
1. Verfahren zum Anreichern der Immunglobulinfraktionen
InG, IgA und IgM und gegebenenfalls Abtrennen der IgG-Fraktion davon aus
menschlichem Serum oder Plasma, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) aus Serum oder defibriniertem Plasma mit einem primären, mit Wasser mischbaren Alkohol,
vorzugsweise Äthanol, bei einer Konzentration zwischen 18 und 35% in einem pH-Bereich von 5,6 bis 8,5 bei einer Temperatur
von 0 bis —10° C, eine rohe Immunglobulinfraktion
ausfällt,
b) die Fälung der Stufe (a) in wäßrige Lösung bringt und daraus die Euglobuline durch
Einstellen einer Leitfähigkeit von 5,0 X 102 bis 8,0 X ΙΟ3 μ5 und eines pH-Wertes von
4,5 bis 6 im Temperaturbereich von 0 bis + 200C ausfällt,
c) aus dem Überstand der Stufe (b) durch Adsorption an ein mineralisches Adsorbens auf
Basis Silikat oder Attapulgit in einer Menge von 0,3 bis 1 % (g: v), bei einer Leitfähigkeit
von 5,0 X 102 bis 1,0 X 104 uS, bei pH-Wert
4,5 bis 6,5, die proteolytischen Fermente abtrennt,
d) im überstand der Stufe (c) den überwiegenden Teil des IgM neben anderen Proteinen
an ein in situ hergestelltes Calcium-Phosphat im pH-Bereich von 5,8 bis 8,5 adsorbiert und
das Adsorbat abtrennt,
e) aus dem Adsorbat der Stufe (d) durch Behandlung mit dem 5- bis lOfachen Volumen
einer auf pH 4,0 bis 8,0 eingestellten wäßrigen Salzlösung, deren Konzentration 0,8 bis
4% beträgt, oder einer Aminosäurelösung, deren Konzentration 1 bis 8% beträgt, oder
einer wäßrigen Lösung eines mit Calcium einen Komplex bildenden Agens, in einer
Konzentration von 2 bis 7%, oder einer geeigneten Kombination von Salz, Aminosäure
und Komplexbildner, eine IgM-haltige Fraktion desorbiert und das IgM nach Einstellung
des pH-Wertes auf pH 6,5 bis 7,5 durch Zugabe eines niedrigen Alkohols, bis zu einer
Konzentration von etwa 20 bis 25% anreichert,
f) die Fällung der Stufe (e) durch Zentrifugation oder Filtration abtrennt, in einer wäßrigen
Salzlösung wieder auflöst, den pH-Wert auf 4,5 bis 5,5 einstellt, die Leitfähigkeit
durch Zugabe eines Salzes auf etwa über 1 X 104 ^S einstellt und die Verunreinigungen
der mit IgM angereicherten Fraktion durch Zusatz von 0,1 bis 0,3% eines Al(OH)j-Gels (berechnet als Al2O3) abtrennt,
g) aus dem durch Adsorption von IgM befreiten Überstand der Stufe (d) das IgG und IgA mit
einem mit Wasser mischbaren primären Alkohol bei einer Konzentration von 20 bis 40%, bei pH 6,5 bis 8,0 bei 0 bis -10° C
ausfällt und
h) gewünschtenfalls zur Trennung von IgG und IgA das IgA selektiv an Aluminiumhydroxyd
adsorbiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß zur Herstellung des Calcium
phosphats ein wasserlösliches Calciumsalz und eir wasserlösliches Phosphat der IgM-haltigen Ei
weißlösung zugesetzt werden, wobei das Calciumsalz in etwa dreifach molarem Überschuß vorliegt
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die IgG und IgA enthaltendf
Fällung der Stufe (g) bis zu einer Eiweißkonzen tration von etwa 1 % aufgelöst wird, daß zu diesel
Lösung bei pH 4,5 bis 5,5, einer Leitfähigkeit vor etwas über 1 X ΙΟ4 μδ 0,05 bis 0,?% eine:
Al(OH)3-GeIs (berechnet als Al2O3) zugesetz
und daß das IgA nach Abtrennung des Adsorben: mit ener etwa V3 M sekundären Natriumphos
phatlösung desorbiert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge kennzeichnet, daß die Desorption des IgM von
Phosphat in Stufe (e) mit einer 4,5%igen Lösunj von Äthylen-Diamin-Tetraessigsäure-di-Natriun
bei pH 5,0 durchgeführt wird.
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DE3927111C3 (de) * | 1989-08-17 | 1994-09-01 | Biotest Pharma Gmbh | Verfahren zur Herstellung nicht modifizierter intravenös verabreichbarer IgM- und/oderIgA-haltiger Immunglobulinpräparate |
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