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"EBsAg-Teilchen und Verfahren zu ihrer Herstellung"
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Die Erfindung betrifft einheitliche, kugelförmige HBsAg - Teilchen,
die die urspriingliche Antigenität von EBsAg aufweisen.
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Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung dieser
Teilchen aus hochgereinigtem HBsAg aus menschlichem Plasma oder anderen HBsAg enthaltenden
Materialien.
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Entsprechend einer Regelung der Weltgesundheitsorganisation wird das
Hepatitis B-Antigen als HBAg bezeichnet. Es wurde jedoch festgestellt, daß das Hepatitis
B-Antigen aus zwei Teilen besteht, von denen der eine infektiös ist und als HBcAg
bezeichnet wird und der andere die äußere Virussohale ohne Infektivität darstellt
und als H3sAg (früher HBAg) bezeichnet ird.
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HBsAg (früher HBAg) steht in Beziehung zum HBV-Hepatitis B-Virus,
der für die Serumhepatitis oder Hepatitisinfektion vom B-Typ verantwortlich ist.
Plasma oder Serum mit einem Gehalt an HBsAg verursachen häufig eine schwere Hepatitis
bei Patienten, denen Infusionen verabfolgt werden, oder bei Ärzten oder anderem
medizinischen Personal, die mit diesen Lösungen in Kontakt kommen.
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Bisher wurde H3sAg in relativ reiner Form aus menschlichem Plasma
oder aus entsprechenden Plasmafraktionen mit einer Dichte von 1,20 bis 1,23 g/cm3,
die durch Dichtegradienten-Ultrazentrifugation hergestellt worden sind, erhalten;
vgl.
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J.B. Gerin, P.V. Holland und R.H. Purcell, Journal of Virology, Bd.
7 (1971), S. 569 bis 576; und N. Sukeno, R. Shirachi, J. Yamaguchi und N. Ishida,
Journal of Virology, Bd. 9 (1972), S. 182 bis 183.
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In letzter Zeit wurde berichtet, daß man durch Affinitätschromatographie
eine gute Reinigung von HBsAg erzielen kann.
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Dieses Verfahren läßt sich etwa folgendermaßen beschreiben: Es können
beliebige Tierarten verwendet werden. Beispielsweise erhält man Ziegen-Anti-HBsAg-Serum
durch Immunisieren von Ziegen mit gereinigtem HBsAg. Dieses Antiserum wird zu menschlichem,
HBsAg-freiem Serum gegeben, um Antikörper gegenüber den Bestandteilen des menschlichen
Serums zu absorbieren und auszufällen. Der Überstand wird anschließend mit Ammoniumsulfat
fraktioniert, wodurch man Anti-HBs-9 -Globulin erhält.
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Das Anti-HBs-g-Globulin wird anschließend an Sepharose 4B (Produkt
der Firma Pharmacia Co., Schweden), das mit Bromcyan aktiviert ist, gekoppelt, um
immobilisiertes anti-HBs herzustellen. Mit diesem immobilisierten anti-HBs wird
eine Säule gepackt.
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Menschliches Serum oder Plasma mit einem Gehalt an HBsAg oder eine
entsprechende klare Lösung wird an der vorgenannten Säule einer üblichen Affinitätschromatographie
unterworfen. Die vorgenannte klare Lösung wird aus einer 0,01 m Phosphatpuffer-Suspension
einer o(- und ß-Globulinfraktion, die nach üblichen --Verfahren, beispielsweise
durch Fraktionierung mit Äthanol, - Ammoniumsulfat oder Acrinol, aus Plasma mit
einem Gehalt an HBsAg hergestellt worden ist, abgetrennt.
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An der Säule haftendes HBsAg wird mit 0,4 m Glycin-HCl-Puffer vom
pH-Wert 2,5 eluiert. Das Eluat wird gegen O,Clm Phosphatpuffer dialysiert.
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Die erhaltene Lösung mit einem Gehalt an HBsAg wird anschließend
chromatographiert. Dazu wird eine Säule mit immobilisiertem Pferde-Antihuman-Plasma-J-Globulin
nach dem vorgenannten Verfahren eingesetzt.
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Diese Stufe bewirkt eine Entfernung von in Spurenmengen vorhandenen
Verunreinigungen, die auf der Säule festgehalten werden. HBsAg findet sich dabei
in der erhaltenen Lösung.
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Das auf diese Weise erhaltene HBsAg weist ähnliche elektrophoretische
Eigenschaften wie 7- und ß-Globulin auf. Elektronenmikroskopisch erweist es sich
als ein Gemisch aus drei verschiedenen Teilchenformen. Kleine kugelförmige Teilchen
von etwa 20 nm Durchmesser, röhrchenförmige Teilchen von etwa 20 nm Durchmesser
und große kugelförmige Teilchen von etwa 42 nm Durchmesser mit einem Kern.
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Bei zahlreichen Untersuchungen an Peptiden, die durch verschiedenartige
Spaltung von HBsAg-Teilchen erhalten wurden, wurde festgestellt, daß HBsAg aus mehreren
Polypeptiduntereinhei.ten von unterschiedlichem Molekulargewicht zusammengesetzt
ist.
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Gerin u. Mitarb. (a.a.O.) stellten fest, daß HBsAg aus drei verschiedenen
Polypeptiden mit Molekulargewichten von 26 000, 32 000 bzw. 40 000 zusammengesetzt
ist. Ferner werden folgende Molekulargewichte fiir entsprechende Polypeptiduntereinheiten
angegeben: 25 000 und 32 000, vgl. G.N. Vyas, E.W. Williams, G.G.B. Klaus und H.E.
Bond, Journal of Immunology, Bd. 108 (1972), S.- 1114 bis 1118; 39 000, 32 000,
27 000 und 22 000 und Spurenmengen an Peptiden mit einem Molekulargewicht von 16
000 und 10 000, G.R. Dressmann, F.B. Hollinger, J.R. Suriano, R.S. Fujioka, J.P.
Brunechwig und J.L. Melnik, Journal of Virology, iBd.10 (1972), S. 469 bis 476;
100 000, 65 000, 36 000 und 20 000, vgl. C.R.Howard und A.J. Zuckermann, Hepatitis
Memoranda, H-576, Oktober t97D, V.St.A.; und 25 000,
28 000 und
33 000, vgl. N. Sukeno, S. Aikawa und. Ishida, Hepatitis Memoranda, H-292, April
1972, V.St.A. Zum Nachweis dieser Untereinheiten bedienten sich Sukeno u. Mitarb.
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einem Verfahren zur Spaltung des S3sAg-Moleküls durch Natriumdodecylsulfat
(SDS) in einer Harnstofflösung. Dieses Verfahren wird als "eiektrophoretische Molekulargesichtsbestimmung
an SDS Acrylamidgel" bezeichnet; vgl. Colowick-Kaplan, Methods in Enzymology, Bd.
26, (1972), S. 3 ff.
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Aufgabe der Erfindung ist es, einheitliche und gleichmäßige kugelförmige
HBsAg-Teilchen zur Verfügung zu stellen, die aus gleichen Polypeptiduntereinheiten
bestehen und ihre ursprüngliche Antigenität behalten.
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Die erfindungsgemäßen einheitlichen, kugelförmigen HBsAg-Teilchen
weisen einen Durchmesser von 18 bis 22 nm auf und bzw. einen Kern geringer Dichte
haben einen hohlen Kern/,wie sich e).ektronenmikroskopisch feststellen läßt. Diese
Teilchen besitzen die ursprüngliche Antigenität von HBsAg. Das Molekulargewicht
dieser einheitlichen, kugelförmigen HBsAg-Teilchenwird zu 2 200 000 angenommen.
Die Teilchen sind aus einzelnen Polypeptiduntereinheiten mit einem Molekulargewicht
von etwa 55 000 zusammengesetzt. Diese einheitlichen, kugelförmigen H3sAg-Teilchen
der Erfindung werden im folgenden als HBsAg55 bezeichnet.
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Erfindungsgemäß werden auch Lösungen mit einem Gehalt an derartigen
HBsAg-Teilchen, die aus einzelnen Polypeptiduntereinheiten
mit
einem Molekulargewicht von etwa 55 000 zusammengesetzt sind , eine Kugelform von
18 bis 22 nm Durchmesser und einen hohlen Kern aufweisen und deren Molekulargewicht
etwa 2 200 000 (HBsAg55) beträgt, hergestellt.
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Erfindungsgemäß lassen sich Lösungen von HBsAg55 herstellen, indem
man HBsAg in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die ein grenzflächenaktives
Mittel enthält, das zur Delipidierung in der Lage ist, erhitzt.
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HBsAg-Katerial, das im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird,
kann aus Serum oder Plasma in relativ reiner Form nach den vorerwähnten bekannten
Verfahren erhalten werden. Am zweckmäßigsten ist es jedoch, als Ausgangsmaterial
die Fraktion der i- und ß-Globuline zu verwenden, beispielsweise die Fraktion IV-1
gemäß der Cohnschen Äthanolfraktionierung. Das auf diese Weise erhaltene HBsAg wird
direkt oder vorzugsweise nach weiterer Reinigung verwendet.
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Es- ist empfehlenswert, aus dem gemäß den bekannten Verfahren erhaltenen
KBsAg niedermolekulare Verunreinigungen durch Gelfiltration unter Verwendung von
hydrophilen Gelen zur Abtrennung von Produkten mit einem Molekulargewicht von 3
000 bis 150 000 zu entfernen. Beispiele für entsprechende Gele sind Dextrangel,
wie Sephadex G-200 der Firma Farmacia Co., Schweden, Polyacrylamidgel, wie Biogel
P-300 der Firma Bio-Rad Co., und Agarosegel, wie Sepharose 6B der Firma Farmacia
Co., Schweden. Die Gelfiltration wird mit isotonischer Kochsalzlösung
bei
einem pH-Wert von 6 bis 8 durchgeführt.
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Beispiele für grenzflächenaktive Mittel, die erfindungsgemäß zur Delipidierung
verwendet werden, sind anionische grenzflächenaktive Mittel vom Carbonsäure-Typ,
wie Alkalimetallsalze von Gallensäuren oder von Lauroylsarcosinsäure, wie die Natriumsalze
von Desoxycholsäure, Glycocholsäure, Taurocholsäure, Dehydrocholsäure oder Lauroylsarcosinsäure,
grenzflächenaktive Mittel vom Polyoxyäthylenalkylphenol-Typ mit durchschnittlich
7 bis 10 Oxyäthylen-Molekülen, wie Polyoxy äthylenoctylphenol, und grenzflächenaktive
Mittel vom Polyoxyäthylensorbitanmonoalkylester-Typ mit durchschnittlich 20 Oxyäthylen-Molekülen,
wie Polyoxyäthylensorbitanmonooleat.
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Zur Durchfahrung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine Lösung
von HbsAg in einer isotonischen Natriumchloridlösung mit einem pH-Wert von 5 bis
9, vorzugsweise 7,2, die 0,05 bis 5 Prozent, vorzugsweise in den meisten Fällen
0,5 Prozent, eines grenzflächenaktiven Mittels enthält, 5 bis 120 Minuten, vorzugsweise
30 Minuten, auf 40 bis 800C, vorzugsweise 60°C, erhitzt. In der Praxis wird eine
isotonische, gepufferte Kochsalzlösung mit einem bestimmten pH-Wert, die HBsAg enthält,
mit einer entsprechenden Menge eines grenzflächenaktiven Mittels versetzt. Der pH-Wert
der gemischten Lösung wird gegebenenfalls eingestellt. Diese Lösung wird sodann
eine bestimmte Zeit auf eine bestimmte Temperatur erwärmt. Durch diese Behandlung
wird das HBsAg-Molekül unter Bildung eines einheitlichen HBsAg55
Moleküls
modifiziert.
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Das auf diese Weise hergestellte HBsAg55 wird anschließend von anderen
Proteinen isoliert. Dies wird nach üblichen Verfahren zur Abtrennung von Proteinen
eines bestimmten Molekulargewichts aus Gemischen durchgeführt, beispielsweise durch
Ionenaustauschchromatographie oder fraktionierte Fällung.
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Gelfiltrationsverfahren sind besonders empfehlenswert, da sie besonders
einfach durchzuführen sind und zu guten Ergebnissen fahren. Es können beliebige
Gele verwendet werden, die sich zur Abtrennung von Proteinen mit einem Molekulargewicht
von 3 000 bis 150 000 eignen. Das Gel wird mit dem gleichen Lösungsmittel, wie es
ftir das ABsAg55 verwendet wird, äquilibriert und in eine Säule gepackt. Anschließend
wird die HBsAg55-Lösung über diese Säule gegeben. HBsAg55 erscheint im Eluat ohne
Verzögerung.
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Die HBsAg55 enthaltende Lösung wird gegebenenfalls eingeengt.
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Eine hochgereinigte HbsAg55-Lösung erhält man nach Entfernen des grenzflächenaktiven
Mittels durch Dialyse gegen eine isotonische, gepufferte Kochsalzlösung oder durch
Gelfiltration an einem entsprechenden Gel zur Abtrennung von niedermolekularen Produkten,
wie Sephadex G50.
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HBsAg55 weist im Vergleich zum Ausgangsprodukt eine genügende Antigenität
auf. HBsAg55 besteht aus einheitlichen und gleichmäßigen, kugelförmigen Teilchen
mit 18 bis 22 nm Durchmesser,
deren Inneres bei elektronenmikroskopischer
Betrachtung siöh als hohl bzw. von geringer Dichte erweist.
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HBsAg55 wird nach der eingangs erwähnten "telektrophoretischen Molekulargewichtsbestimmung
an SDS-Acrylamidgel" (a.a.O.) weiter analysiert.
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Ein Volumteil einer Lösung von HBsAg55 in 0,01 m Phosphatpuffer vom
pH-Wert 7,0 und 9 Volumteile 0,OlmPhosphatpuffer vom pH-Wert 7,0, die jeweils 1
Prozent SDS und 2-Mercaptoäthanol enthalten, werden vermischt und 2 Minuten auf
1000C erhitzt. Die BsAg55-Eonzentration wird durch die optische Dichte bei 280 nm
(E280 zm) zu 1 bis 10 bestimmt. Die auf diese Weise behandelte Lösung wird der Elektrophorese
an SDS-Polyacrylamidgel unterzogen. Dabei wird ein 7,5 prozenti-ges Polyacrylamidgel
in 0,1 m Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,6 mit einem Gehalt an 0,1 Prozent SDS und
4 m Harnstoff verwendet.
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As Eichsubstanzen werden Serumalbumin (Molekulargewicht 68 000), Katalase
(Molekulargewicht 58 000), Ovalbumin (Molekulargewicht 43 000) und Eiweiß-Lysozym
(Molekulargewicht 14 300) verwendet. HBsAg55 zeigt dabei eine einzige Komponente
mit einem Molekulargewicht von etwa 55 000.
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Dies läßt darauf schließen, daß HBsAg55 aus 40 einzelnen Untereinheiten
mit einem Molekulargewicht von etwa 55 000 zusammengesetzt ist. Diese Berechnung
beruht auf dem vorgeschlagenen Molekulargewicht für kugelförmige 20 nm HBsAg-Teilchen
von
2 200 000.
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Die beigefügte Potografie zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme
von HBsAg55-eilchen der Erfindung. Jedes Teilchen (mit 1 bezeichnet) stellt ein
HBsAg55-Teilchen dar. Der dunkle Bereich in der Mitte des Teilchens ist der hohle
Kern.
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Bei HBsAg55 handelt es sich um eine modifizierte und hochgereinigte
Form von HBsAg, die die ursprüngliche Antigenität von HBsAg behält. Wenn das Präparat
noch infektiös ist oder mit Spurenmengen von infektiösem Hepatitis B-Virus kontaminiert
ist, kann es doch als ausgezeichnete Vaccine von geringer Toxizität verwendet werden,
sofern ein einfaches, bekanntes Verfahren zur Inaktivierung von Hepatitis B-Virus
durch Hitzebehandlung durchgeführt wird.
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HBsAg55 ist ferner ein ausgezeichnetes Ausgangsmaterial zur Herstellung
von Hapten durch enzymatische (vgl. J.M.Steward, J.D. Young und I.E. Benjamin, Biochemistry,
Bd. 5 (1966), S. 3396) oder chemische Spaltung des Moleküls, da das HBsAg55-Molekül
aus einzelnen Untereinheiten besteht.
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Selbstverständlich ist HBsAg55 ein wertvolles Standardreagenz zum
Testen von HBsAg und dem Antikörper (anti-HBs), ferner kann es aufgrund seiner Reinheit
und der Zusammensetzung aus einzelnen Untereinheiten als Antigen zur Immunisierung
von Tieren zur Herstellung von Antiseren gegen Hepatitis verwendet werden.
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Die Beispiele erläutern die Erfindung.
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Beispiel 1 Aus 1 Liter gesammeltem, HBsAg-positivem Plasma wird durch
Ultrazentrifugation ein gereinigtes HbsAg-Präparat hergestellt.
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Der HBsAg-Titer dieses Präparats beträgt 1:4096/0,1 mg N, gemäß dem
Komplementfixierungs-Test (cd). Dieses Präparat weist bei der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
drei verschiedene Polypeptiduntereinheiten mit Molekulargewichten von 25 000, 28
000 bzw. 33 000 auf.
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.5 ml der gereinigten HBsAg-Lösung in 0,01 m Tris-HCl-Puffer vom pH-Wert
7,5 mit einem Gehalt an 0,15 m Natriumchlorid werden an einer mit Sephadex G200
beschickten Säule der Abmessungen 2,5 x 45 cm der Gelfiltration unterworfen. Eine
erste Fraktion von 17 ml, die HBsAg enthält, wird aufgefangen.
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Nach dem Einengen der Lösung auf 6 ml wird Natriumdesoxycholat (NaDOC)
bis zu einer Endkonzentration von 0,5 Prozent zugegeben. Die Lösung wird sodann
30 Minuten auf 600C erwärmt.
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Nach der Wärmebehandlung wird die Lösung mit 0,01 m Tris-HC1-Puffer
vom pH-Wert 8,0 mit einem Gehalt an 0,15 m Natriumchlorid und 0,01 m NaDOC äquilibriert
und an einer mit Sephadex G200 beschickten Säule der Abmessungen 2,5 x 45 cm der
Gelfiltration unterworfen. Die erste Praktion von 20 ml, die HBsAg (liBsAg55) enthält,
wird aufgefangen und zur Entfernung von NaDOC an einer mit Sephadex G50 beschickten
Säule der Abmessungen 1,5 x 60 cm weiter fraktioniert. Die Lösung wird anschließend
durch Vakuumdialyse auf 2 ml eingeengt.
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Mikroskopisch läßt sich zeigen, daß das in dieser T;P»hg enthaltene
HBsAg55 in Form von kugelförmigen Teilchen von 18 bis 22 nm Durchmesser mit einem
hohlen Kern vorliegt. Durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese lassen sich einzelne
Polypeptide mit einem Molekulargewicht von 55 000 feststellen.
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Der HBsAg-CF-Titer beträgt 1:8192/0,1 mg N und die Ausbeute auf der
Basis von E280 nm beträgt 6,4 Prozent.
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Beispiel 2 Aus 10 Liter gesammeltem, HBsAg-positivem Plasma wird
durch Affinitätschromatographie ein gereinigtes HBsAg-Präparat hergestellt. Der
HBsAg-CF-Titer beträgt 1:2048/0,1 mg N.
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Das Präparat weist sieben verschiedene Polypeptiduntereinheiten mit
Molekulargewichten von 17 000, 25 000, 28 000, 33 000, 40 000, 52 000 und 60 000
auf, wie sich durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese feststellen läßt.
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30 ml der gereinigten HBsAg-l;ösung in 0,05 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung
vom pH-Wert 7,2 werden an einer mit Biogel P-300 beschickten Säule der Abmessungen
5 x 90 cm der Gelfiltration unterworfen. Die erste Fraktion von 150 ml, die HBsAg
enthält, wird aufgefangen. Nach dem Einengen der Lösung auf 16 ml wird Polyoxyäthylen-(9)-octylphenol
bis zu einer Endkonzentration von 1 Prozent zugegeben. Die erhaltene Lösung wird
20 Minuten auf 700C erwärmt.
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Die dieser Wärmebehandlung unterzogene Lösung wird mit 0,05 m Phosphatpuffer-Kochsalzlösung
vom pH-Wert 7,2 mit einem Gehalt
an 0,02 m Polyoxyäthylen-(9)-octylphenol
äquilibriertt und an einer mit Sepharose 6B beschickten Säule der Abmessungen 3,5
x 90 cm der Gelfiltration unterworfen. Die erste Fraktion von 42 ml, die KBsAg (HEsAg55)
enthält, wird aufgefangen und gegen eine isotonische Kochsalzlösung der Vakaumdialyse
unterworfen. Man erhält 10 ml HBsAg55-Lösung. Elektronenmikroskopisch läßt sich
feststellen, daß das HBsAg55 dieser Lösung aus kugelförmigen Teilchen von 18 bis
22 nm Durchmesser mit einem hohlen Kern besteht. Durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese
lassen sich einzelne Polypeptide mit einem Molekulargewicht von 55 OCO feststellen.
Der HBsAg-CF-Titer beträgt 1:4096/0,1 mg N. Die Ausbeute auf der Basis von E280
= beträgt 5,8 Prozent.
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Beispiel 3 Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Abänderung, daß anstelle
von 0,5 Prozent Natriumdesoxycholat 0,5 Prozent Natriumlauroylsarcosinat verwendet
wird und die Wärmebehandlung anstelle von 30 Minuten bei 600C, 1CO Minuten bei 450C
durchgefahrt wird.
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Das auf diese Weise erhaltene gereinigte HBsAg55 weist die gleichen
Eigenschaften wie das Produkt von Beispiel 1 auf.
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Die Ausbeute beträgt 4,2 Prozent und der HBsAg-CF-Titer 1:4096/ 0,1
mg N.
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Beispiel 4 Beispiel 1 wird wiederholt, mit der Abänderung, daß anstelle
von 0,5 Prozent Natriuiadesoxycholat 1,2 Prozent Polyoxyä-tnylen-(20)-sorbitanmonooleat
verwendet werden und daE die Hitzebehandlung
anstelle von 30 Minuten
bei 60 0C 60 Minuten bei 60 0C durchgefuhrt wird. Das auf diese Weise erhaltene
gereinigte HBsAg55 weist die selben Eigenschaften wie das Produkt in Beispiel 1
auf. Die Ausbeute beträgt 4,0 Prozent und der HBsAg-C2-Titer 1:4096/0,1 mg N.
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L e e r s e i t e