DE2658170A1

DE2658170A1 - Arzneimittel zur behandlung der durch den hepatitisvirus b ausgeloesten akuten oder chronischen infektionen

Info

Publication number: DE2658170A1
Application number: DE19762658170
Authority: DE
Inventors: Christian Trepo
Original assignee: Institut Merieux SA
Current assignee: Institut Merieux SA
Priority date: 1975-12-23
Filing date: 1976-12-22
Publication date: 1977-07-07
Also published as: BE849615A; CA1090701A; US4087519A; JPS5290620A; FR2336141B1; GB1569000A; AT360643B; ATA958876A; NL7614367A; FR2336141A1; JPS6053009B2; DE2658170C2

Description

Patentanwälte 3 £658

Dipl. Ing. TI .·:·.·-^τ j···—■·■< T-'üUer Br. rer. π:·£. ·ί;·.·.;.'.·;;·:; !^»andt D8 München 80 Luciia-Giai'.ii-ilraöe 38

INSTITUT MERIEUX 17, rue Bourgelat,F-69002, LYON, Frankreich

Arzneimittel zur Behandlung der durch den Hepatitisvirus B ausgelösten akuten oder chronischen Infektionen

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Arzneimittel, das die Behandlung der akuten oder chronischen Infektionen, die durch den Hepatitisvirus B (der auch als Virus HB oder Virus B bezeichnet wird) verursacht werden, ermöglicht.

Seitdem .im Serum der meisten von der Virus B-Hepatitis befallenen Menschen ein Antigen, das offenbar spezifisch für den Virus B ist, identifiziert wurde, das als Australia-Antigen bezeichnet wird, ist die Verwendung dieses gereinigten und eventuell abgeschwächten Antigens zur Herstellung einer Vakzine gegen die Virus B-Hepatitis vorgeschlagen worden (vgl. die FR-PS 70.3^574).

Das Australia-Antigen stellt nicht den Hepatitisvirus B selbst dar. Tatsächlich ist festgestellt worden, daß der Hauptteil der Blutspender, die asymptomatische

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Träger des Australia-Antigens sind, entweder nur wenig oder keinen in ihrem Serum zirkulierenden Virus aufweisen.

Es ist bekannt, daß das Serum von zahlreichen Personen, die Träger des Australia-Antigens sind, ein anderes Antigen enthält, das als Antigen-e - abgekürzt Ag-e - bezeichnet wird, vgl. hierzu L.O. Magnius und Hke Espmark, Acta path, microbiol. scand., Section B, 80, Seiten 335 bis 337 (1972).

Man bezeichnet mit Antigen-e einen Antigenkomplex, der eine Gemeinschaft von löslichen Proteinen darstellt (die mit e., e₂ ... bezeichnet werden), die normalerweise im menschlichen Serum abwesend sind, jedoch im Serum von gewissen Trägern des Australia-Antigens wiedergefunden werden, insbesondere solchen, die an der chronischen Hepatitis erkrankt sind, und auch noch bei den Personen, die der Hämodialyse oder der Immunosuppression unterworfen sind, sowie bei an Mongolismus leidenden Menschen. Diese verschiedenen Antigen-Determinanten sind immunologisch vom Australia-Antigen deutlich unterschieden.

In der vorliegenden Erfindungsbeschreibung werden mit Antikörpern-Anti-e solche Antikörper bezeichnet, die mit den Proteinen, welche das Antigen-e bilden, reagieren. Diese Antikörper können im Serum von Personen gefunden werden, die mit dem Virus B verseucht sind, insbesondere im Serum von chronischen Trägern des Australia-Antigens, die nicht an Hepatitis-Erkrankungen leiden.

Es ist gefunden worden, daß es durch Verabfolgung von Antigen-e möglich ist, eine Immunreaktion auszulösen, welche die Bildung von Antikörpern-Anti-e zur Folge hat.

Ks ist nun entdeckt worden, daß es durch Verabfolgung von Antikörpern-Anti-e bei Patienten, die an einer akuten oder chronischen Virus B-Infektion leiden, insbesondere möglich ist, die Symptome und die histologischen Schaden der Hepatitis zum Verschwinden zu bringen.

Wie weiter gefunden wurde, ist es durch den Zusatz von Antikörpern-Anti-e zu biologischen Flüssigkeiten, welche Antigene-e und bzw. oder Viren B enthalten, möglich, die Infektiosität dieser Flüssigkeiten zum Verschwinden zu bringen oder sie zumindest weitgehendst zu reduzieren.

Gegenwärtig existiert keine aktive Behandlungsmöglichkeit für die akute Hepatitis und kein therapeutisches Mittel, das imstande wäre, vornehmlich ihre z\m plötzliche^ Tod führende Verschlechterung oder ihre chronische Fortentwicklung zur Zirrhose zu verhindern.

Das gleiche ist der Fall bei chronischen Infektionen durch latente oder nicht-latente Viren HB (chronische Hepatitis, Periarteritis nodosa, Virus HB-Glomerulonepbritis).

Die bei dieser zweiten Gruppe von Krankheiten verwendeten entzündungshemmenden Medikamente (Corticosteroide) und Immunosuppressiva üben nur insofern eine günstige Wirkung aus, als sie die Entzundungsreaktion abschwächen, aber sie sind ohne Einwirkung auf die virale Infektion, die für die Krankheit verantwortlich ist, ja sie fördern im Gegenteil die Fortdauer.

Die Entdeckung der Wirksamkeit der Antikörper-Anti-e bei der Behandlung der Virus B-Hepatitis ist ein äußerst über-

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rpschender Umstand, denn bis zum heutigen Tag sind alle Versuche, beim Menschen oder Schimpansen Plasma zu injizieren, das Antikörper-Anti-HBs enthält, die gegen ein Oberflächenantigen des Hppatitisvirus B gerichtet sind (ein Antigen, das Ag HB^c genannt wird), in der Hoffnung, eine Hepatitis oder eine· chronische Virämie zu bessern, fehlgeschlagen. Die Transfusion von Plasmas, die nach Maßgabe ihres hohen Gehalts an Antikörpern-Anti-HBs ausgewählt sind, ist offensichtlich ohne therapeutische Wirkung geblieben unter den Bedingungen, unter denen man sie anwenden kann; hierzu wird z.B. verwiesen auf Reed und Mitarbeiter, Lancet, 2, Seite 13^7 097?): CG. Trepo, The American Journal of the Medical Sciences, 270, ?UQ (1975) und "Treatment of Fulminant hepatitis with hepatitis B immune globulin : a cooperative studv", Gastroenterology, 66, A Q8 - 7^2 (1974).

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein neues Arzneimittel, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es in einem physiologisch verträglichen Milieu eine γ-Globulinfraktion aufweist, die Antikörper-Anti-e enthält, wobei die besagte Fraktion aus Blutserum oder -plasma oder aus Piazentarextrakten gewonnen wurde.

Es ist bekannt, daß die Antikörper, die von einem Organismus als Reaktion auf die Verabfolgung eines Antigens gebildet werden, eine Familie von Proteinen bilden, die zahlreiche charakteristische gemeinsame Merkmale aufweisen und als T-Globuline bezeichnet werden.

Die γ-Globulinfraktionen, die Antikörper-Anti-e enthalten, können nach den klassischen Methoden der Herstellung von γ-Globulinen aus Seren, Plasmas oder Plazentarextrak-

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ten gewonnen werden, in denen man vorher das Vorhandensein von Antikörpern-Anti-e entdeckt hat. Diese klassischen Methoden sind vornehmlich diejenigen, die beschrieben sind von H. J. Cohn und Mitarbeitern, J.A.C.S., 68, 459 (1946); J. L. Oncley und Mitarbeitern, J.A.C.S., 71., 541 (1949); H. L. Taylor und Mitarbeitern, J.A.C.S., 78, 1356 (1956); J. Horr.isi und R. Smetana, Acta Medica Scandinavia, Vol. CLV, 65 (1956) und P. Kistler und Hs. Nitschmann, Vox Sang., 7, 414 (1962). Die Antikörper-Anti-e können entweder bei den Personen gefunden werden, die spontan diese Antikörper entwickelt haben, oder bei den freiwilligen Versuchspersonen, die mit einem gereinigten und ,iedes Infektionsrisiko ausschließenden Antigen-e-Präparat immunisiert worden sind und als immunologische Antwort Antikörper-Anti-e gebildet haben. Man kann das Vorhandensein von Antikörpern-Anti-e mit einem Reagens, das Antigen-e enthält, entdecken, intern ro^n sie- γ⁵?-·»" Technik der Immunodiffusion oder der Elektro-immunodiffusion oder jeder anderen klassischen serologischen Arbeitstechnik (radio-immunologische Dosierung etc.) bedient.

Um die Bildung von Antikörpern-Anti-e durch eine immunologische Reaktion zu provozieren oder um das Vorhandensein der besagten Antikörper zu entdecken, ist es zweckmäßig, partiell oder völlig gereinigte Antigen-e-Präparate vorzusehen, die z.B. durch Affinitätschromatographie auf einem Immuno-Adsorbens erhalten wurden, das aus einem Träger aus einem porösen Material besteht, dessen Oberfläche mit einem Überzug von Partikeln des Antikörpers-Anti-e ausgekleidet ist, die an den Träger durch Vermittlung eines Kupplungsmittels gebunden sind.

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Der Träger kann z.B. aus Sepharose und das Kupplungsmittel z.B. aus einem Halogencyan bestehen. Man kann insbesondere einen Träger aus Sepharose 4 B benutzen, und als Kupplungsmittel dient vorzugsweise Bromcyan«

Selbstverständlich kann man auch andere poröse Träger, von denen bekannt ist, daß sie für Immuno-Adsorptionsprozesse brauchbar sind, verwenden zusammen mit gleichfalls bekannten Kupplungsmitteln, die aus bifunktionellen Derivaten, z.B. Dialdehyden, bestehen.

Die gereinigten, das Antigen-e enthaltenden Fraktionen können ebenfalls nach einem Verfahren gewonnen werden, das zumindest eine der nachstehenden Stufen umfaßt, und zwar ggf. in Kombination mit der Stufe der Immuno-Adsorption:

die Stufe der Gelfiltration;

die Stufe der Ultrafiltration mittels einer Membran, deren Porendurchmesser so bemessen sind, daß die Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 30 000 zurückgehalten werden;

die Stufe der präparativen Zonen-Ultrazentrifügierung, die z.B. in einem Zuckergradienten durchgeführt wird.

Vornehmlich kann man ein Verfahren anwenden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Säule, welche die Sepharose - an die Antikörper-Anti-e gekoppelt - enthält, mit einem Boratpuffer bei ρ« 8,4 equilibriert, man in die Säule eine Lösung, welche das Antigen-e in dem gleichen Puffer enthält, gibt und diese eine solche Zeit lang, die ausreicht, um eine maximale Adsorption zu begünstigen,

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in Kontakt läßt und man dann das Antigen-e mit einem Phosphätpuffer vom p_H etwa 10,8 bis 10,9 eluiert.

Man sammelt danach die Fraktionen, welche das Antigen-e enthalten, wobei die Anwesenheit von Antigen-e-Proteinen z.B. durch Messen der optischen Dichte bei 280 nm bestimmt wird.

Darauf bringt man die gereinigten Fraktionen des Antigen-e durch Zusatz von Salzsäure auf einen physiologischen p_H-Wert und konzentriert dann gewünschtenfalls diese Fraktionen durch Ultrafiltration, und die Anwesenheit des Ag-e wird durch Immunodiffusion bestätigt.

Wie oben bereits erwähnt, kann die Fraktion, die das Antigen-e enthält, auch durch Zonen-Ultrazentrifugieren in einem Zuckergradienten gewonnen werden. Zu diesem Zweck wird das defibrinierte Ausgangsserum oder -plasma auf das 2- bis 10-fache, vorzugsweise das 5-fache, konzentriert, beispielsweise durch Fällung der Proteine mittels PoIyäthylenglykol und Wiederauflösung in einer gepufferten wäßrigen Lösung. Die so erhaltene Lösung wird auf die Oberfläche von Zentrifugenröhrchen, die einen linearen Zuckergradienten von 10 bis 27 % enthalten, aufgegeben und einer präparativen Zonen-Zentrifugierung bei 19000 bis 22000 Umdrehungen pro Minute und 4 bis 8⁰C 18 bis Stunden lang unterworfen. Man sammelt dann die Fraktionen vom Boden des Röhrchens und vereinigt die Fraktionen, welche das .Antigen-e enthalten. Diese Ultrazentrifugation kann wiederholt werden, um eine noch größere Reinigung zu erzielen, und sie wird durch eine Gelfiltration ergänzt. Man kann danach die vereinigten Ag-e-Fraktionen gegen einen Phosphatpuffer dialysieren. Gewünschtenfalls

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kann man danach mittelseiner Ultraf ft ration unter Ve¹*"-wea^Hui:g eines Filters weiter konzentrieren, das mit einer Membran versehen ist, deren Porendurchmesser so bemessen sind, daß sie die Produkte mit einem Molekulargewicht von über 30000 zurückhalten.

Die erhaltene Lösung kann Menschen auf subkutanem Wege oder intramuskulär verabfolgt werden, nachdem man sie vorsichtshalber einer Behandlung unterworfen hat mit dem Ziel, eine eventuelle restliche Infektiosität mittels konventioneller Verfahrensweisen, wie dem Erhitzen oder der Formolisierung oder der Bestrahlung mit ultravioletten Strahlen oder ,jeder anderen Strahlenart auszuschalten. Man erhält, so eine physiologisch akzeptable Antigen-e-Fraktion.

Zu dem Zweck, bei den -f^eiVrilligen Versuchspersonen eine Antikörper-Antwort zu provozieren, kann die physiologisch akzeptable Antigen-e-Fraktion entweder für pich allein oder in Kombination mit einem Adjuvans, z.B. Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat oder irgendeinem anderen natürlichen oder synthetischen Adjuvans, verabfolgt werden.

Das Ausgangsprodukt für die Herstellung der gereinigten Fraktion, die das Antigen-e enthält, ist eine aus dem Serum oder dem defIbrinierten Plasma stammende Lösung, die mit dem Antikörper-Anti-e eine Fällungsreaktion gibt. Die Veranschaulichung und Isolierung des Antikörpers-Anti-e kann in diesem Fall in der Weise erfolgen, wie es nachstehend angegeben ist.

Das Antigen-e, dessen Vorhandensein von Magnius und Espmprk aufgefunden und nachgewiesen wurde, wie ihre obon zitierte Arbeit belegt, findet sich vorübergehend im Blut von Kranken, die von der Pkuten Hepatitis B befallen sind, und in

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persistenter Form im Blut von zahlreichen Patienten, die der Hämodialyse unterworfen werden oder an der chronischen Hepatitis B leiden, und einer schwankenden Menge anderer Träger des asymptomatischen Australia-Antigens, insbesondere bei gewissen wilden Völkerstämmen oder in bestimmten geographischen Regionen (Asien).

Zur Herstellung einer gereinigten Antigen-e-Fraktion verwendet man also das Serum oder Plasma dieser Spender, eventuell durch Plasmapherese im voraus abgenommen.

Es sei daran erinnert, daß das Vorhandensein des Antigens-e veranschaulicht, werden kann durch Immunodiffusion, wie es Magnius und Espmark in ihrer oben zitierten Arbeit beschrieben haben, oder auch durch Gegenelektrophorese.

Um die Anwesenheit des Antigens-e festzustellen, kann man auch ein Reagens nach einer Methode herstellen, die darin besteht, einem Tier ein gereinigtes Antigen-e-Präparat, wie es oben beschrieben ist, in Kombination mit dem kompletten Freund Adjuvans oder irgendeinem anderen Adjuvans zu verabfolgen, wobei man die Verabfolgung mindestens einmal, vorzugsweise jedoch mehrmals vornimmt, beispielsweise die Verabfolgung durch Injektion ungefähr alle Monate wiederholt, z.B. drei Monate lang. Man verabfolgt jedesmal die Kombination gereinigtes Antigen-e/Freund-Adjuvans. Auf diese Weise provoziert man bei dem Tier die Bildung des Antikörpers-Anti-e.

Man nimmt dann das Blut des Tiers zum Teil oder in seiner Gesamtheit ab und sammelt das Serum. Man tiberzeugt sich davon, daß das Serum normale menschliehe Antiprotein-Antikörper nicht enthält.

Bei der Immunodiffusion ergibt das durch das erhaltene Serum gebildete Reagens eine Fällungslinie mit einem Serum menschlichen Ursprungs, wenn dieses das Antigen-e enthält.

Wenn das getestete Menschenserum eine Fällungslinie mit dem Reagens ergibt, dann ist die Person infiziert und wahrscheinlich von einer persistenten Hepatitis befallen.

Der wiederholte und nach dieser Methode erbrachte Nachweis des Vorhandenseins von Antigen-e während der akuten Phase einer Hepatitis und vor allem die Persistenz des Antigen-e spricht dann dafür, daß die Gefahr der Weiterentwicklung zu einer chronischen Hepatitis gewachsen ist.

Man kann auf diese Weise die infizierten, eine Ansteckungsgefahr bildenden Personen entdecken und im übrigen frühzeitig und auf einfache Art die Gefahren der Weiterentwicklung zu einer chronischen Hepatitis erkennen.

Der Antikörper-Anti-e, der dazu bestimmt ist, das Vorhandensei.n des Antigens-e offenbar zu machen, kann von einem menschlichen oder einem tierischen Lebewesen stammen. Zur Reinigung des Antigens-e, das für die Herstellung einer Vakzine für den Menschen in Aussicht genommen ist, verwendet man vorzugsweise einen Träger, der mit einem Antikörper-Anti-e menschlichen Ursprungs gekoppelt ist.

Der Nachweis des Antikörpers-Anti-e wird so, wie es Magnius und Espmark in ihrer oben zitierten Arbeit beschrieben haben, oder mit Hilfe irgendeiner anderen serologischen Methode erbracht.

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Der Antikörper-Anti-e kann z.B. durch Zonen-Zentrifugieren eines Serums, in dem vorher das Vorhandensein dieses Antikörpers festgestellt worden ist, erhalten werden, oder vorzugsweise nach den klassischen Methoden der Gewinnung von Y*-Globulinen, wozu auf die oben zitierte Literatur verwiesen wird. Man kann die bekannten Arbeitsmethoden der Fraktionierung mit Äthanol, Ammoniumsulfat und bzw. oder Rivanol anwenden. Man kann z.B* den Antikörper durch Zusatz einer Lösung von Ammoniumsulfat, die zu 40 % gesättigt ist, fällen, die Fällung wieder lösen und sie einer Dialyse unterwerfen, um das Ammoniumsulfat zu eliminieren.

Zur Erläuterung dieser bekannten Methode wird im späteren Versuchsteil ein Beispiel einer Fraktionierung mit Äthanol angeführt, das jedoch in keiner Hinsicht einen einschränkenden Charakter haben soll.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel ist im allgemeinen eine gereinigte Antikörper-Anti-e-Fraktion, wobei die besagte Fraktion von allen anderen normalen Blutprotein-Bestandteilen (die keine γ -Globuline sind) und von allen infektiösen Verunreinigungen befreit worden ist.

Aber das erfindungsgemäße Arzneimittel kann gleichermaßen aus dem gesamten Plasma oder dem gesamten Serum, in dem man das Vorhandensein dieses Antikörpers festgestellt hat, bestehen.

Die γ-Globuline, welche die Antikörper-Anti-e enthalten, die als Wirkstoffe in dem erfindungsgeraäßen Arzneimittel verwendbar sind, können ferner die klassischen Umwandlungen erfahren haben, die es möglich machen, daß die γ-Globuline auf intravenösem Wege verabfolgt werden können. Es ist be-

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kannt, daß diese Behandlungen darin bestehen, die Antikomplementwirkung der γ·-Globuline zu unterdrücken oder zu reduzieren, eine Antikomplementwirkung, die durch die Anwesenheit von Aggregaten zustande kommt, welche das Komplement zu fixieren vermögen, wie es der Antigen-Antikörper-Komplex macht. Es sind verschiedene Verfahrensweisen bekannt, die es ermöglichen, γ -Globuline zu gewinnen, die intravenös injiziert werden können. Diese Verfahrensweisen bestehen z.B. darin, die γ-Globuline einer Inkubation bei ρ_Η 4- oder einer enzymatisehen Digestion durch Pepsin, Papain oder Plasmin zu unterwerfen.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann vornehmlich während der akuten Hepatitis oder Virus B-Infektion verabfolgt werden, um deren Heilung zu beschleunigen und jeder Gefahr einer Weiterentwicklung zu einer chronischen Erkrankung vorzubeugen.

Das Arzneimittel wird intramuskulär oder intravenös injiziert.

Die Behandlung mit den Anti-e- -y*-G3 obu3 inen kann als solche allein oder gemeinschaftlich mit mannigfaltigen antiallergischen, antiinflammatorischen oder anderen Medikationen durchgeführt werden. Je nach den biologischen und serologischen Ergebnissen wird eine oder werden mehrere Injektionen nacheinander verabreicht.

Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann auch im Verlaufe der verschiedenen Hepatitisformen und aller chronischen Virus B-Infektionen verabfolgt werden. Diese Erkrankungen werden nach den üblichen klinischen, biologischen, histologischen und serologischen Methoden, insbesondere anhand

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des Nachweises des Ag-HBs, diagnostiziert.

serologisch

Diese krankhaften Zustände sind im ubrigen„durch das Fehlen einer genügenden Antikörper-Anti-e-Reaktion und sogar am häufigsten durch eine Persistenz des Ag-e gekennzeichnet,

Die aktiven chronischen Hepatitis-Erkrankungen stellen hierunter die schwerste Form dar und müssen auf das energischste mit den Antikörpe^n-Anti-e behandelt werden.

Die Verabfolgung der Antikörper-Anti-e muß zwangsläufig bei den chronischen Formen der Erkrankungen langer fortgesetzt werden, und manchmal wird der Rückgriff auf die intravenöse Verabfolgung erforderlich sein und man wird an Stelle der zur intravenösen Injektion geeigneten T-Globuline ein Plasma, das die Antikörper-Anti-e enthält, verwenden können. In dem Fall, in dem ein Antigen-e in beträchtlicher Menge im Blut kreist, kann man so vorgehen, daß man eine vorherige Eliminierung dieses zirkulierenden Antigens-e vermittels einer vorangehenden Blutaustauschtransfusion oder eine fortlaufende Plasmaphorese durchführt, in deren Verlauf das Plasma, welches das Ag-e enthält, durch ein Isogruppenplasma ersetzt wird, das von Ag-e und dem Australia-Antigen befreit ist, oder es wird das Ag-e auf einem zweckentsprechenden Filter zurückgehalten, das z.B. aus einem porösen Träger, an den Antikörper-Anti-e gekoppelt sind, besteht.

Am Schluß der Behandlung wird man eine Plasmafraktion des Kranken durch ein Plasma ersetzen, das reich an Antikörpern-Anti-e ist, oder irgendeine andere Lösung von menschlichem Protein (Albumin ...) oder irgendeine andere Lösung, die Ύ-Globuline-Anti-e, die für eine

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intravenöse Verabfolgung behandelt worden sind, enthält. Durch die Verabfolgung von antiallergischen und antiinflammatorischen Medikamenten (Corticosteroide, Antihistamine etc.) unterbindet man jede unangenehme Reaktion während dieser Behandlung, die im Falle des Versagens wiederholt und außerdem vor allem durch eine Behandlung mit Y-Globulinen-Anti-e komplettiert werden kann.

Diese Therapie kann mit unterstützenden Begleitbehandlungen aller Art, chemotherapeutischen und immunotherapeutischen Mitteln verbunden werden.

Die Indikation für die Behandlung der chronischen Hepatitis-Erkrankungen mit den Antikörpern-Anti-e in irgendeiner ihrer Formen, sei es durch intravenöse oder intramuskuläre Verabfolgung, mit oder ohne Blutaustauschtransfusion, isoliert oder mit anderen Behandlungen wird letztlich durch das Ergebnis einer klinischen und immunobiologischen Generaluntersuchung des Erkrankten bestimmt.

Das Vorhandensein des Virus HB und seiner Partikel und assoziierten Antigene (Australia-Ag, Ag-HBC, Ag-e) im Serum und in der Leber des Erkrankten wird genau bestimmt durch serologische Untersuchungen und durch Untersuchung der Leberbiopsien mittels der Immunofluoreszenz oder Elektronenmikroskopie.

Die Untersuchung der humoralen und zellulären Immunantworten, die gegen diese drei Antigene gerichtet sind, kann überprüft bzw. bestätigt oder ergänzt werden durch die serologische Titration der Antikörper und durch Hypersensibilitäts-Tests, die gegenüber diesen gleichen Antigenen verlangsamt sind (Inhibierung der Migration der

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Leukozyten und eventuell Intradermoreaktlon mit rten drei Antlgenen Australia~Äntlgen, HBC und e_r gereinigt* nichtinfektiös).

Die Ergebnisse all dieser Tests und ebenso derjenigen, welche den Stand der globalen Immunantworten des Kranken sorgfältig erforschen, dienen als Unterlage für die Entscheidung bezüglich des anzuwendenden Behandlungstyps, wobei die Änwendungsbedlngungen im einzelnen bestimmt werden von den üblichen therapeutischen Bestlmmungsmethoden bei Behandlungen mit Hilfe von γ-Globulinen.

Die ^*-Globuline Äntl-e können In zweckentsprechenden Dosen für die Präventivbehandlung von spontanen, post— transfusionellen und anderen Virus HB-Infektionen verwendet werden, indem sie entweder den gefährdeten Personen injiziert werden oder dem Blut und seinen Derivaten vor oder nach der eventuellen Fraktionierung für die injektive Verabfolgung an Menschen zugesetzt werden, um den Virus HB zu neutralisieren.

Wie bereits oben bemerkt wurde, handelt es sich bei dem Antigen-e in Wirklichkeit um einen Antigenkomplex, der eine Gemeinschaft von Proteinen repräsentiert. Zwei dieser Proteine sind mit Ag-e^ und Ag-e^ bezeichnet worden, und zwar von Williams Allan und Georges Le Bouvier auf dem "Symposium International sur les sous-types de 1*antigene HBs", das im "Centre National de Transfusion Sanguine" in Paris in der Zeit vom 14. bis 18. April 1975 stattfand und worüber in der "Bibliotheca Hematologica", 42, Seiten 65 bis 70 (1976) berichtet wurde.

Es existieren auch noch andere, die z.B. mit e-, ... etc. bezeichnet werden können. Es ist festgestellt worden, daß

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bei den Antigen-e-TrPgera die relativen Mengenverhältnisse der verschiedenen Antigene~e schwenken. In gleicher Weise sind auch die relativen Mengenverhältnisse der verschiedenen Antikörper-Anti-e^,. Anti-e^ ... usw. variabel. Wenn man Personen mit einem Äg-e-Präparat immunisiert» das reich BXi einem der Bestandteile des Antigenkomplexes ist, oder wenn man die Plasmas von Personen, die bereits träger von Anti-e-Antlkörpem und reich an einem der entsprechenden Antikörper sind_f selektioniert, so kann man γ-Globulinfraktionen gewinnen, die reich an einem dieser Antikörper sind.

Die Erfindung umfaßt auch solche -Tf-G-labulinfraktionen, die reich z.B. an Antikörpern-Anti-e^. oder Anti-e_?. sind.

Eine andere Anwendung der Y-Globulinfraktionen, die Antikörper- Anti-e enthalten, ist die Eliminierung der kompletten, infektiösen Viren HB und eier Antigene-e aus allen diese enthaltenden biologischen Flüssigkeiten oder allen Flüssigkeiten, die einem Gehalt daran zugänglich sind, und zwar durch Agglutination und bzw. oder Neutralisation, die dur^h das Inkontaktbringen mit den Antikörpern-Anti-e herbeigeführt wird, indem man z.B. Antikörper-Anti-e den besagten Flüssigkeiten zusetzt. So kann man z.B. die f-Globulinfraktion, welche die Antikörper-Anti-e enthält, den Blut- oder Plasmaflaschen oder jeder anderen im Notfall zur Perfusion bestimmten biologischen Flüssigkeit zusetzen, wenn die Zeit zur Prüfung der Unschädlichkeit, d.h. im vorliegenden Fall zur Prüfung auf die Abwesenheit des Virus HB, fehlt. Man kann auch die genannten biologischen Flüssigkeiten über ein Immuno-Adsorbens laufen lassen, dessen Oberfläche mit Antikörper-Anti-e—Partikeln überzogen ist. Hierzu kann man z.B. eine Affinitätschromatographie durchführen, die jener analog ist, die oben im

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Zuge der Erläuterung der Gewinnung von partiell oder vollständig gereinigten Antigen-e-Präparaten angeführt ist, d.h. eine Chromatographie auf einem porösen Träger der an Antikörper-Anti-e gekuppelt ist. Die Regeneration des Trägers durch Elution des adsorbierten Antigens ermöglicht im übrigen die Gewinnung von Ag-e-Präparaten, deren Verwendbarkeit oben erwähnt ist.

In diesem Fall, wird das erfindungsgemäße Arzneimittel aus dem Blut, dem Plasma oder irgendeiner anderen, zu perfundierenden biologischen Flüssigkeit gebildet, der man die γ -Globulinfraktion zugesetzt hat, welche die Antikörper-Anti-e enthält, oder die man über ein Immuno-Adsorbens, das mit Antikörper-Anti-e-Partikeln beschichtet ist, hat laufen lassen.

Selbstverständlich haben die V"G1obulinfraktionen, die den biologischen Flüssigkeiten zugesetzt worden sind, eine Behandlung durchgemacht, die ihre Verabfolgung auf intravenösem Wege gestattet.

Zum Gegenstand der Erfindung gehört auch ein Verfahren zur Behandlung der Hepatitis-Erkrankungen und der chronischen Virus B-Infektionen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man dem infizierten Organismus intramuskulär oder intravenös ein Arzneimittel, wie es oben definiert ist, verabfolgt .

Die nachstehenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern, sie jedoch in keiner Weise beschränken.

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Beispiel 1 Reinigung des Antigens-e durch Zonen-Ultrazentrifugierung

Man selektioniert in der oben angegebenen Weise das Plasma von Personen, die Träger des Antigens-e sind, z.B. vorzugsweise durch eine Identitätsreaktion bei der Immunodiffusion gegen das Antigen-e.

Man gibt zum Plasma Calciumchlorid und läßt das Ganze 24 Stunden stehen, um das Fibrin zu eliminieren. Danach setzt man Polyäthylenglykol von einem Molekulargewicht zwischen 6000 und 7500 ("Carbowax 6000") bis zu einer Endkonzentration von 13 % (Gewicht/Volumen) in einem Dinatriumphosphat-Puffer, 0,02 %, bei p„ 7 zu.

Nach 24-stündigem Stehen bei + 4°C wird die Fällung durch sorgfältiges Abdekantieren von der überstehenden Flüssigkeit getrennt. Man entledigt sich dann des größten Teils des Polyäthylenglykols, indem man das -p„ der Fällung in einem Natriumacetat-Puffer, 0,25 M, auf 5 einstellt. Man trennt die Fällung nach 24-stündigem Stehen bei + 4°C vermittels einer Zentrifugation mit 4000 Umdrehungen pro Minute ab. Die überstehende Flüssigkeit, die das Ag-e enthält, wird auf eine mit "Sephadex G200" gefüllte Säule gegeben» und die Fraktionen werden gesammelt.

Die Fraktionen, die sich in bezug auf das Ag-e als positiv erwiesen haben, und zwar entweder anhand der Immunodiffusion und bzw. oder der Elektro-Immunodiffusion, werden miteinander vereinigt und durch Ultrafiltration auf "Amicon", das mit dem Filter PM 30 000 versehen ist, konzentriert.

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Die so konzentrierte Lösung wird auf die Oberfläche von 3 Zentrifugenröhrchen gegeben, die einen linearer Sacr.harose-Gradienten von 10 bis 30 % (Gew./Gev/.) in einem Phopphatpiiffer vom p_H 7,4 enthalten, und 18 Stunden lang bei. 4⁰C einer präparativen Zonen-Zentrifugation bei 20 000 Umdrehungen pro Minute unterworfer.. Es werden Fraktionen von 3 ml vom Boden des Röhrchens aus gesammelt. Die Fraktionen, die sich als positiv in bezug auf das Antigen-e erweisen (z.B. anhand des Immunodiffusionstests) werden miteinander vereinigt. Man kann das Zentrifugieren in analoger Weise mit diesen Fraktionen, die sich eis positiv in bezug auf das Ag-e erwiesen haben, wiederholen, um den Reinigungsgrad zu erhöhen. Man dialysiert dann 24 Stunden lang gegen einen Phosphatpuffer vom p„ 7,4 und konzentriert danach vermittels Ultrafiltration mittels eines Filters, das eine Membran aufweist, deren Porengröße so bemessen ist, daß sie Moleküle mit einem Molekulargewicht von über 30 000 zurückhält.

Die erhaltene Antigen-e-Lösung kann zur Auslösung der Bildung des Ag-Anti-e verwendet werden, nachdem sie vorsichtshalber einer Abschwächung durch Einwirkung von Wärmp, Formol, ß-Propiolacton oder Ultraviolettstrahlung unterworfen wurde, die so dosiert und abgestimmt ist, daß jede eventuell vorhandene restliche Infektiosität eliminiert ist, ohne die Antigenizität zu beseitigen.

Beispiel 2

Reinigung des Antigens-e durch Affinitätschromatographie (^a) Herstellung eines Immuno-Adsorbens Sepharose/Anti-e Es wird die γ -Globulinfraktion eines Serums, das sich

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als anti-e-positiv erwiesen bat, -Jurch Fällung mi.t Ammoniumaul fat bei ρ,, 7 und einer Errikonzentration von 40 % gewonnen. Die Fällung wird in einem 0,1 M NaHCO₇-FUffer wieder gelöst und gegen eine 0,5 M MaTl - 0,1 M FaHCO₇₅-Lösung dialysiert.

Die T -Globuline Anti-e werden en Sepharose 4 B, die mit Bromcyan (Pharmacia-Fine, Upsaln, Schweden) aktiviert ist, gemäß dem Verfahren, das von Or-trecas und Afinsen in "Ann. Rev. Biochem." 40, --9 (1^ci7'i) beschrieben ist, gekuppelt.

7 g mit BrCN aktivierte Sepharose 4 B werden zum Quellen gebracht und auf einem Glasfilter 30 Minuten lang mit 0,001 M HCl gewaschen. Unmittelbar nach dem taschen wird das Gel mit 200 mg Y-Globulinen Anti-e in Bicarbonatlösung gemischt und das Ganze 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt.

Das Gel wird danach mit 600 ml einer 0,1 M NaHCO,-Lösur.g, die 0,5 M NaCl enthält, gewaschen und mit 50 ml einer 1 M Äthanol am inlö sung, ρ™ β, 2 Stunden bei 25°C behandelt. Die so gekuppelte Sepharose wird hernach abwechselnd mit einem 1 M NaCl - 0,1 M Acetat-Puffer, o„ 4,0, und einem 1 M NaCl - 0,1 M Borat-Puffer, p_H 8,4, gewaschen.

Das letzte Väschen wird mit einem 0,1 M Borat-Puffer, P_H 8,4, der 0,5 M NaCl und 0,005 M EDTA enthält, durchgeführt.

(b) Isolierung des Antigens-e

Es wird eine Säule von 2x11 cm verwendet, die mit Sepharose, die an Anti-e gekuppelt ist, gefüllt ist, Die Säule

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wird mit dem Puffer bei Raumtemperatur equilibriert. Man gibt 25 ml der das Antigen-e enthaltenden ^Tösung, nach Beispiel 1 erhalten und zur Hälfte mit dem Puffer verdünnt, zu land beläßt das Ganze 1 Stunde bei 37⁰C, um eine maximale Adsorption zu begünstigen. Die Säule wird dann auf 4°C gebracht und mit dem Borat-Puffer gewaschen, bis die optische Dichte der Fraktionen Null wird. Das Antigen-e wird aus der Säule mit einem 0,1 M Phosphat-Puffer, p„ 10,8, eluiert, Die Fraktionen, die das Antigen-e enthalten - bestimmt durch Messen der optischen Dichte bei 280 nm -, werden unmittelbar durch Zusatz von 2 N HCl auf ein physiologisches Pt, gebracht.

Man vereinigt alle diese Fraktionen unc* konzentriert durch Ultrafiltration auf dem Filter "Amicon PM 30".

Die durchgeführten Versuche zeigen, daß das erhaltene Produkt kein Australia-Antigen enthält.

Vorsichtshalber kann das Ag-e-Präparat eine-r Abschwächung durch Formol, ß-Propiolacton oder Ultraviolettbestrahlung unterworfen werden, um eine eventuelle restliche Infektiosität zu eliminieren, ohne die Antigenizität zu beseitigen.

Das Fehlen einer Infektionskraft und die Wirksamkeit dieses Präparats sind durch Versuche am Schimpansen bewiesen worden. Diese Versuche umfassen vornehmlich die Untersuchung einer viralen Replikation durch Bestimmung des Australia-Antigens und des Antikörpers-Anti-HBC, die Untersuchung der Transaminasen und die histologische Überwachung durch Leberbiopsie.

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Die Verabfolgung dieses Präparats ermöglicht, es, die Antikörper-Anti-e bei den freiwilligen Spendern in Erscheinung treten zu lassen, und das Blut, das von diesen Spendern stammt, kann das Ausgangsprodukt bilden für die Gewinnung von gereinigten Fraktionen, welche die Antikörper-Anti-e enthalten, wie es nachstehend in Beispiel 3 erläutert ist.

Beispiel 5

Herstellung einer Antikörper-Anti-e aufweisenden V -Globu

linfraktion

Als Ausgangsprodukt dient ein defibriniertes Plasma, das durch Plasmapherese erhalten wurde und von ausgewählten Spendern stammt, deren Blut Antikörper-Anti-e enthält. Man versetzt das Plasma mit Äthanol bis zu einer Konzentration von 19 % bei p_H 5,85 und einer Temperatur von - 5⁰C, wobei die Volumina so gewählt werden, daß eine Endkonzentration an Proteinen von ungefähr 5 % erhalten wird. Man führt eine Zentrifugation durch und isoliert eine Fällung, die sämtliche ·γ*-Globuline und einen Teil der öC- und ß-Globuline enthält.

Die Fällung wird in Wasser von O⁰C suspendiert, und zwar in einem Verhältnis von 10 Liter Wasser auf jedes kg Fällung. Man stellt das p_H auf 4,6 durch Zugabe eines Puffergemischs vom ρ_Η 4, das durch Vermischen eines Volumens 0,05 M Na₂HPO^ mit 6 Volumina 0,05 M Essigsäure erhalten wurde.

Man gibt danach einen Puffer vom p_H 4,8 zu, der sich aus einem Volumen 0,05 M Na₂HPO^ und 1,65 Volumina Essigsäure zusammensetzt, wobei die Essigsäure 0,05-molar ist, um

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insgesamt die Ionenstärke zu erhöhen. Man muß ungefähr 2,35 Liter des Puffers bis zum p_H 4 zusetzen.

Dann stellt man das ρ_Η auf 5,1, indem man ungefähr 4.,5 Liter eines Puffers zugibt, der erhalten wurde durch Vermischen von einem Volumen 0,05 M Na₂HPO. mit 0,83 Volumina 0,05 M Essigsäure, wobei ständig die Temperatur auf 5⁰C gehalten wird.

Man stellt die Ionenstärke ein vermittels Zusatz von 0,4 Lif'^r eines Puffers vom p^ 5,1, der sich zusammensetzt aus einem Volumen 0,05 M Na^HPO^ und 1,25 Volumina Essigsäure .

Die Suspension wird dann in 9,7 Liter Wasser verdünnt.

Man hat dann ein Gesamtlösungsvolumen von 19,45 Liter für jedes kg der Fällung.

Man gibt Äthanol zu bis zum Erreichen einer Äthanolkonzentration von 12 %.

Nun wird zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit gesammelt. Man setzt Natriumchlorid zu, bis eine Ionenstärke zwischen 0,03 und 0,04 erreicht ist. Danach stellt man das Pu auf 7,2 ein und setzt Äthanol zu bis zu einer Konzentration von 25 % bei einer Temperatur von -7⁰C. Man erhält eine Fällung von γ-Globulinen, die man durch Zentrifugieren sammelt. Man stellt dann das fertige Arzneimittel nach den üblichen Methoden her, d.h. durch Inlösungbringen, Klären und Gefriertrocknen und danach Herstellung einer wäßrigen Lösung von 16 %. Um eine isotonische Lösung zu gewinnen, die eine bessere Löslichkeit und eine bessere Stabilität herbeiführt, gibt man

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0,3 Mol/Liter Glycin zu. Als Konservierungsmittel setzt man gleichfalls 0,1 g/Liter Merthiolat zu.

Die ergänzenden Behandlungen zweck? Gewinnung von Antravenös injizierbaren T -Globulineri können gemäß den üblichen Prozeduren durchgeführt werden.

Beispiel 4

Herstellung einer T -Globulinfr\aktlon, die reich an Anti-

körpern-Anti-e. ist

Arbeitet man wie in Beispiel 3, geht Jedoch von Plasmas aus, die wegen ihres Reichtums an Antikörpe^n-Anti-e.« ausgewählt wurden, so erhält man eine Y-GlobuTinfraktion, die reich an Antikörpern-Anti-e,. ist und die man in gefriergetrockneter Form aufbewahrt.

Beispiel 5

Herstellung einer Y-Globulinfraktion, die reich an Anti-

körpern-Anti-βρ ist

Arbeitet man wie in Beispiel 3, geht jedoch von Plasmas aus, die wegen ihres Reichtums an AntikÖrpern-Anti-ep ausgewählt wurden, so erhält man eine γ -Globulinfraktion, die reich an Antikörpern-Anti-e^ ist und die man in gefriergetrockneter Form aufbewahrt.

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Claims

P a t ρ ώ t a η

1. Arzneimittel, dadur\~h gekennzeichnet, daß rs in einem physiologisch verträglichen Milieu eine γ -Globulinfraktion aufweist, die Antikörper-Ar.ti-e enthält und "us dem Sοrum ode~ Blutplasma oder Plazent^r^xtrakten, die einen Gehalt an Antikörpern-Anti-e aufweisen, gev/onnen worden ist.

.?. Arzneimittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einer gereinigten Fraktion von Antikörpern-Anti-e besteht und die besagte Fraktion von allen anderen normalen Blutprotein-Bestandteilen (außer den γ Globulinen) und von allen infektiösen Verunreinigungen befreit worden ist.

^. Arzneimittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus einem ganzen Plasma ode^ ganzen Serum, in dem das Vorhandensein von Antikörperr-Anti-e festgestellt ist, besteht.

4. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die ·γ -Globuline zwecks Ermöglichimg ihrer intravenösen Verabfolgung einer Behandlung zur Unterdrückung oder Herabsetzung der Antikomplementwirkung unterworfen worden sind.

5. Arzneimittel gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es aus Blut, Plasma oder irgendeiner anderen biologischen Flüssigkeit besteht, dem bzw. der man eine γ-Globulinfraktion , die Antikörper-Anti-e enthält, zugesetzt hat, wobei die genannte γ -Globulinfrakti^n vorher einer Behandlung zwecks Unterdrückung oder Herab-

^lNSPECTED

sitzung 6er Antikomplementwirkunr imterv/orfen worden \St."

6. Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte -γ* -Globul infrakt.ion reich a;_p,orn ']ΡΓ A^"til'·'"' ^"~\~ ■■"— \τ + X— -· ?. '~.t .

7. Arzneimittel gemäß Anspruch 6, -ipdurch gekennzeichnet, daß die genannte γ -Globulinfra^-hicm reich an einem der

p^ und Anti-e_o .ist.

P-. Verfahren zur Eliminierxing oder fier.^bsetzung der Infektiosität von biologischen Flüssiffkei+Hr·, die Viren HB oder Antigene-e enthalten oder für einen Gehalt an diesen Stofferempfänglich sind, dadurch gekennzeichnet, daß men die genannten Flüssigkeiten mit elr.er --f-Globulinfraktion, wie sie in irgendeinem r[ar .Ansprüche 1 bis 7 definiert ist und die eine ausreichende Menge der Antikörper-Anti-e enthält, in Kontakt bringt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man den genannten Flüssigkeiten die ^f-Globulinfraktion, velche Antikörper-Anti-e enthält, zusetzt.

10. Verfahren gemäß Anspruch P>, dadurch gekennzeichnet _r daß man die genannten Flüssigkeiten über ein Immuno-Adsorbens laufen läßt, dessen Oberfläche mit AntikÖrpern-Anti-e beschichtet ist,

11. Verfahren zur Behandlung von Hepatitis-Erkrankungen und bzw. oder-akuten oder chronischen Virus B-Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man dem infizierten Organismus intramuskulär oder intravenös ein Arzneimittel, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 7 definiert ist, verabfolgt.

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