CA1090701A - Medicament permettant de traiter les infections aigues ou chroniques dues au virus de l'hepatite b - Google Patents
Medicament permettant de traiter les infections aigues ou chroniques dues au virus de l'hepatite bInfo
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Abstract
Composition pharmaceutique pour le traitement des infections aiguës ou chroniques dues au virus de l'hépatite B. Cette composition est caractérisée par le fait qu'elle comprend dans un milieu physiologiquement acceptable, une fraction gammaglobulinique contenant des anticorps anti-e, qui est obtenue au départ de sérum ou do plasma sanguin ou au départ d'extraits placentaires contenant des anticorps anti-e. Il a été découvert que l'administration des anticorps anti-e chez des sujets souffrant d'infections aiguës ou chronique dues au virus B permet notamment de faire disparaître les symptômes et les lésions histologiques d'hépatite.
Description
~090701 La présente invention concerne une composition pharmaceutique pour le traitement des infections aigu~s ou chroniques dues au virus de l'hépatite B (également appelé virus HB ou virus B).
Depuis 1 t identification, dans le sérum de la plupart des sujets atteints d'hépatite virale B, d'un an-tigène apparemment spécifique du virus B, appelé antigène Australie, on a proposé
l'utilisation de cet antigène purifié, et éventuellement atténué, pour la préparation d'un vaccin contre l'hépatite à virus B
(voir le brevet français n 70.34574).
~'antigène Australie ne représente pas le virus de l'hépatite B lui-même. En effet, on a constaté que la plupart des donneurs de sang porteurs asymptomatiques de l'antigène Australie n'ont que peu ou pas de virus circulant dans leur sérum.
On sait que le sérum de nombreux sujets porteurs de l'antigène Australie contient un autre antigène qui a éte appelé
antigène-e, en abrégé Ag-e, voir ~Ø Magnius et Ake ~spmark, Acta.
path. microbiol. scand., Section B, 80, 335-337 (1972).
On désigne par antigène-e un complexe antigénique représentant un ensemble de protéines solubles (appelées e1, e2,.,.) normalement absentes du sérum humain mais retrouvées dans le sérum de certains porteurs d'antigène Australie, en particulier ceux qui sont atteints d'hépatite chronique, ou encore chez des sujets hémodialysés, immunodéprimés ou atteints de mongolisme.
Ces différents déterminants antigéniques sont immunologiquement distincts de l'antigène Australie.
Dans la présente demande, on désigne par anticorps anti-e des anticorps réagissant avec les protéines constituant l'antigène-e. Ces anticorps peuvent être trouvés dans le sérum de sujets ayant été contaminés par le virus B, en particulier dans le sérum des porteurs chroni~ues d'antigène Australie ne souffrant 1090~01 p_s de maladies hépatiques.
On a découvert que l'administration d'antigène-e est capable d'entraîner une réponse immunologique, avec formation d'anticorps anti-e.
On a maintenant découvert que l'administration des anticorps anti-e chez des sujets souffrant d'infections aigu~s ou chroniques dues au virus B permet notamment de faire dispa-raître les symptômes et les lésions histologiques d'hépatite.
On a égalernent décou~ert que l'addition d'anticorps anti-e des liquides biologiques contenant des antigènes-e et/ou des virus B permet de faire disparaître l'infectivité de ces liquides ou de la réduire très considérablement.
Il n'existe actuellement aucun traitement actif des hépatites aigu~s ni de thérapeutique susceptible en particulier d'empêcher leur aggravation subite mortelle ou leur eYolution chronique vers la cirrhose.
Il en va de même dans les infections chroniques à
virus HB latentes ou non (hépatite chronique, périartérite noueuse, glomérulonéphrite à virus HB).
Utilisés dans ce second groupe de maladies, les médicaments anti-inflammatoires (corticostéroides) et immunosupres-seurs n'exercent une action bénéfique qu'en diminuant la réaction inflammatoire mais n'ont aucun pouvoir sur l'infection virale responsable de la maladie dont ils favorisent au contraire la persistance.
~a découverte de l'efficacité des anticorps anti-e dans le traitement de l'hépatite à virus B présente un caractère surprenant car jusqu'à present les tentatives d'injecter chez l'homme ou chez le chimpanzé du plasma contenant des anticorps anti-HBs dirigés contre un antigène de surface du virus de l'hépatite B (antigène appelé Ag HBs) dans l'espoir d'a~eliorer une hépatite ou une viré~ie chronique ont toujours échoué. La 1090~01 lnsfusion de plasmas sélectionn-;s en fonction de leur haute teneur en anticorps anti-HBs ne paraît donc pas avoir d'action thérapeutique dans les conditions où on a pu les utiliser;
voir par exemple Reed et al., Lancet, 2, 1347 (1973), C.G. Trepo, The American Journal of the Medical Sciences, 270, 248 (1975) et i'Treatment of Pulminant Hepatitis with Hepatitis B Immune Globulin: a Cooperative Study", Gastroenterology, 66, A 98-752 (1974).
La présente invention a pour objet une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend, dans un milieu physiologiquement acceptable, une fraction gammaglobulinique conten`ant des anticorps anti-e, ladite fraction étant obtenue au départ de sérum ou de plasma sanguin ou au départ d'extraits placentaires contenant des anticorps anti-e.
On sait que les anticorps formés par un organisme en réponse à l'administration d'un antigène constituent une famille de protéines qui ont de nombreuses caractéristiques com~unes et qui sont appelées gammaglobulines.
~ es fractions gammaglobuliniques contenant des anticorps anti-e peuvent être obtenues selon les procédés classiques de préparation des gammaglobulines au départ de sérums, de plasmas ou d'extraits placentaires dans lesquels on a préalablement détecté la présence d'anticorps anti-e. Ces procédés classiques sont notamment ceux décrlts par E.J. COHN et al, J.~.C.S., 66, 459 (1946); J.L. ONC~EY et al, J.A.C.S., 71, 541 (1949); H.L. TAYLOR et al, J.A.C.S., 78, 1356 (1956);
J. HORHJSI et R. SMETANA, Acta Medica Scandinavia, Vol. CLV, 65 (1956), et P. KISTLER et Hs. NITSC~IM~NN Vox Sang., 7, 414 (1962). I.es anticorps anti-e peuvent être trouves soit chez des sujets ayant spontanément développé ces anticorps, soit chez des sujets volontaires ayant été immunisés avec une preparation d'antigène-e purifiée dénuée de tout risque infectieux, et qui ~090701 t formé par réponse immunologiq~le des anticorps anti-e.
On peut détecter la présence des an-ticorps anti-e notamment à
l'aide d'un réactif contenant de l'antigène-e en utilisant la technique d'immunodiffusion ou d'électroimmunodiffusion ou toute autre technique sérologique classique (dosage radio-immunologique, etc.) Pour provoquer la formation d'anticorps anti-e par réponse immunologique, ou pour détecter la présence desdits anticorps, il convient de disposer de préparations partiellement ou totalement purifiées d'antigène-e qui peuvent être obtenues par exemple par chromatographie d'affinité sur un immuno-adsorbant constitué par un support de matériau poreux dont la surface est tapissée d'un revêtement de particules anticorps anti-e reliées au support par l'intermédiaire d'un agent de couplage.
~ e support est constitué par exemple par d~ Sépharose, et l'agent de couplage est par exemple un halogénure de cyanogène.
On peut utiliser notamment un support de Sépharose 4 B, l'agent de couplage étant de préférence la bromure de cyanogène.
Bien entendu, on peut utiliser d'autres supports poreux déjà connus comme étant utilisables dans des procédés d'immunoadsorption, avec des agents de couplage également connus constitués par des dérivés bi-fonctionnels tels que des dialdéhydes.
~ es fractions purifiées contenant l'antigène-e peuvent également être obtenues par un procédé comportant au moins une des étapes suivantes, éventuellement en combinaison avec l'étape d'immuno-adsorption:
- étape de filtration sur gel;
- étape d'ultra-filt~ation à l'aide d'une membrane dont ~0 la dimension des pores est telle qu'elle retient les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 30.000;
- étape d'ultra-centrifugation zonale préparative, ~lisée par exemple en gradient c'e sucrose.
On peut notamment utiliser un procédé suivant lequel on equilibre une colonne contenant l'antigène-e dans le à l'anticorps anti-c, avec un tampon borate à pH 8,4, on ajoute dans la colonne une solution contenant l'antigène-e dans le même tampon; on laisse en contact pendant un temps suffisant pour favoriser une adsorption maximale, puis on élue l'antigène-e par un tampon phosphate de pH 10,8 - 10,9 environ.
On recueille ensuite les fractions contenant l'antigène-e, la présence des protéines antigène-e étant déter-minée par exemple par mesure de la densité optique à 2~0 nm.
On ramène ensuite les fractions purifiées d'antigène-e à un pH physiologique par addition d'acide chlorhydrique, puis l'on concentre si désiré ces fractions par ultra-filtration, et on confirme la présence d'Ag-e par immunodiffusion.
Comme indiqué ci-dessus, la fraction contenant de l'antigène-e peut égalernent être préparée par ultra-centrifugation zonale en gradient de sucrose. Pour cela, le sérum ou la plasma défibriné de départ est concentré de 2 à 10 fois, de préférence 5 fois, par exemple par précipitation des protéines au polyéthylè-neglycol, et redissolution dans une solution aqueuse tamponnée.
La solution ainsi obtenue est déposée à la surface de tubes contenant un gradient linéaire de sucrose de 10 à 27% et soumis à une centrifugation zonale préparative à 19.000-22.000 tours/minute entre 4 et 8C pendant 18 à 25 heures. 0~ collecte ensuite des fractions à partir du fond du tube et l'on réunit les fractions contenant l'antigène-e. Cette ultra-centrifugation peut être rcpétee pour obtenir une plu5 grande purification et complétée par filtrations sur gel. On peut ensuite dialyser les fractions Ag-e réunies, vis-à-vis de tampon phosphate. On peut ensuite, si désiré, concentrer par ultra-filtration avec un filtre muni d'une membrane dont la dimension des pores est lle qu'elle retient les produit. de poids moleculaire supérieur à 30.000.
1a solution obtenue peut être administrée à des humains par voie sous-cutanée ou intramusculaire après avoir été
soumise par précaution à un traitement destiné à éliminer un résidu d'infectiosité éventuel par les procédés conventionnels de chauffage, ou de formolisation, ou d'irradiation par rayonne~ents ultra-violets ou par toute autre irradiation~ On obtient ainsi une fraction d'antigène-e physiologiquement acceptable.
Dans le but de provoquer une réponse anticorps chez des volontai.res, la fraction d'antigène-e p~lysiologiquement acceptable peut être administrée soit seule soit en combinaison avec un adjuvant tel que l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium ou tout autre adjuvant naturel ou synthétique.
I.e produit de départ, pour la préparation de la fraction purifiee contenant de l'antigène-e, est une solution provenant soit de sérum, soit de plasma défibriné, donnant une réaction de précipitation avec l'anticorps anti-e. ~a mise en évidence et l'isolement de l'anticorps anti-e sont effectués dans ce cas comme il sera indiqué ci-après.
~ 'antigène-e, mis en évidence par Magnius et Espmark, article cité, se rencontre transitoirement dans le sang des malades atteints d'hépatite B aigu~ et de façon persistante dans le sal~g de nombreux sujets hémodialysés ou souffrant d'hépatite B
chronique et d'une proportion variable d'autres porteurs d'Ag-Australie asymptomatiques en particulier dans certaines ethnies ou dans certaines régions géographiques (Asie).
Pour préparer une fraction purifiée d'antigène-e, on utilise donc le sérum ou le plasma de ces donneurs, éventuellement prélevé par plasmaphérèse.
On rappelle que la présence d'antigène-e peut être mise en évidence par immunodiffusion, comme décrit par Magnius 10'9~01 Espmark dans l'ar-ticle cité ci dessus, ou encore par contre-electrophorèse.
Pour dctecter la présence d'antigène-e on peut également prcparer un réactif selon une methode consistant à
administrer à un animal une préparation d'antigène-c purifiée, telle que décrite ci-dessus, en combinaison avec de l'adjuvant de Freund complet, ou tout autre adjuvant, en effectllant au moins une administration et de préférence plusieurs, l'administra-tion par injection étant alors répétée tous les mois environ, par exemple pendant trois mois. On administre chaque fois la combinaison antigène-e purifiée/adjuvant de Freund. On provoque ainsi chez l'animal la formation d'anticorps anti-e.
On prélève alors le sang de l'animal, partiellement ou en totalité et on recueille le sérum. On s'assure que ce sérum ne contient pas d'anticorps anti-protéines humaines normales.
En immunodiffusion, le réactif constitué par le sc~um obtenu donnera une ligne de précipitation avec un sérum d'origine humaine, si celui-ci contient de l'antigène-e.
Si le serum humain testé donne une ligne de précipi-tation avec ce réactif, le sujet est infecté et probablement atteint d'une hépatite persistante.
La mise en évidence répétée, selon cette méthode, de la présence d'antigène-e pendant la phase aigu~ d'une hépatite, et surtout la persistance de l'antigène-e, suggère un risque accru d'évolution vers l'hépatite chronique.
On peut ainsi déceler les sujets infectés contagieux et en outre deccler précocement ct de façon simp]c les risqucs d'évolution vers l'hepatite chronique.
L'anticorps anti-e dcstiné à mettre en évidence la présence d'antigène-e peut provenir soit d'un être humain, ~qoit d'un animal. Pour la purification d'antigène-e destiné à la ~090~701 ~ paration de vaccin pour l'homm~, on utilise de préference un support couplé avec un anticorps anti-e d'origine humaine.
~ a mise en évidence de l'anticorps anti-e est effectuée comme signalée par Magnius et Espmark, article cité, ou par toute autre méthode serologique.
~ 'anticorps anti-e peut être obtenu par exemple par centrifugation zonale d'un sérum dans lequel on a préalablement détecté la présence de cet anticorps, ou~ de préférence, selon les méthodes classiques de préparation des gammaglobulines; voir les références rappelées ci-dessus. On peut utiliser les techniques connues de fractionnement à l'éthanol, au sulfate d'ammonium et/ou au Rivanol. On peut par exernple précipiter l'anticorps par addition d'une solution de sulfate d'ammonium à
40% de saturation, redissoudre le précipité et le soumettre à une dialyse pour eliminer le sulfate d'ammonium.
A titre d'illustration non limitative de ces méthodes connues on donne dans la partie expérimentale ci-après un exemple de fractionnement à l'éthanol.
~ a composition pharmaceutique selon l'invention est généralement une fraction purifiée d'anticorps anti-e, ladite fraction ayant été débarassée de tous autres constituants protéiques sanguins normaux (autres que des gammaglobulines) et de tous contaminants infectieux.
Mais la composition pharmaceutique selon l'invention peut etre également constituée par la plasma entier ou le sérum entier dans lequel on a reconnu 'a présence de cet anticorps.
~ es gammaglobulines contenant les anticorps anti-e utilisables co~mc ingredient3 actifs dans la compo~i-tion pharmaceutique de l'invention peuvent également avoir subi les transformations classiques permettant d'administrer les gamma-globulines par voie intraveineuse. On sait que ces traitements consistent à suppri~er ou à réduire le pouvoir anti-complémentaire s gammaglobulines, pouvoir anti!omplémentaire dû à la présence d'agregats qui peuvent fixer le complérnent comme le fait le coinple~e antigène-anticorps. On connait différents procédés qui permettent d'obtenir des gammaglobulines injectables par voie intraveineuse. Ces procédés consistent par exemple à sou-mettre la garnmaglobuline soit à une incubation à pH 4, soit à
une digestion enzymatique par la pepsine, la papaine ou la plasmine.
~a composition pharmaceutique selon l'invention peut être administrée notamment au cours des hepaties ou infections à virus B aigu~s afin de hâter leur guérison et de prévenir tout risque d'évolution chronique.
La composition pharmaceutique est injectée par voie intramusculaire, ou par voie intraveineuse.
I,e traitement par les gammaglobulines anti-e pourra 8tre utilisé seul ou en association avec des médications variées anti-allergiques, anti-inflammatoires ou autres. Une ou plusieurs injections successives seront effectuées en fonction des résultats biologiques et sérologiques.
~a composition pharmaceutique de l'invention peut aussi être administrée au cours des diverses hepatites et de toutes infections chroniques à virus B. Ces maladies sont diagnostiquées par les méthodes cliniques, biologiq`~es,histologiques et sérologiques habituelles, en particulier par la détection de l'Ag-HBs.
Ces affections seront caractérisées en outre sérologiquement par l'absence de réponse anticorps anti-e satisfaisante et mêlne Le plus souvent par une persistance de l'Ag-e.
~es hépatites chroniques actives en représentent la forme la plus grave, et doivent impérieusement être traitées par des anticorps anti-e.
- lOgO701 ~ 'administration d'an icorps anti-e sera nécessaire-ment plus prolongée dans ces formes de maladies chroniques, le recours à la voie intraveineuse sera parfois nécessaire et du plasma contenant des anticorps anti-e pourra être utilisé à la place des gammaglobulines adaptées à la voie intraveineuse. En cas d'antigène-e circulant en quantité importante, on pourra procéder à une élimination préalable de cet antigène-e circulant par une exsanguino-transfusion préalable, ou une plasmaphérèse continue au cours de laquelle le plasma contenant l'Ag-e sera remplacé par du plasma iso-groupe dépourvue d'Ag-e et d'antigène Australie, ou l'Ag-e sera retenu sur un filtre convenable par exemple un support poreux couplé à des anticorps anti-e.
En fin d'opération, on remplacera une fraction du plasma du malade par du plasma riche en anticorps anti-e ou toute autre solution protéiniques humaine (albumine...) ou autre contenant des gammaglobulines anti-e traitées pour l'administration intraveineuse. ~'administration de médications anti-allergiques et anti-inflammatoires (corticostéro'Jdes, antihistaminiques, etc) évitera toute réaction fâcheuse durant cette opération qui pourra être répétée en cas d'échec et surtout complétée par un traitement avec des gammaglobulines anti-e ultérieur.
Cette thérapeutique pourra être associée à des traitements adjuvants de toute autre nature, chimiothérapie ou immunothérapie.
~ 'indication du traitement des hépatites chroniques par les anticorps anti-e, sous ltune quelconque de ses formes:
intraveineux ou intramusculaire, avec ou sans exsanguino-transfusion, isole ou associé à d'autres traitements sera décid~-e sur le résultat d'un bilan clinique et immunobiologique complet du malade.
~ a présence, dans le sérum et le foie du malade, du virus IIB et de ses particules et antigènes associes (Ag-Australie, 109070~
~ 3C, ~g-e) sera précisée par d~s examens sérologiques, et par des études des biopsies hépatiques en immunofluorescence ou en microscopie électronique.
~ 'étude des réponses immunes humorales et cellulaires dirigées contre ces trois antigènes pourra être appréciée par la titration serologique des anticorps et par des tests d'hypersensibilité retardés vis-à-vis de ces mêmes antigènes (inhibition de la migration des leucocytes et éventuellement intradermoréaction avec les trois antigènes ~ustralie, ~BC et e purifiée non infectieux).
~ es résultats de tous ces tests ainsi que de ceux explorant l'état des réponses immunitaires globales du malade servent à décider du type de traitement adopté, la posologie étant déterminée selon les méthodes habituelles de détermination de la posologie pour les traitements à l'aide de gammaglobulines.
Les gammaglobulines anti-e pourront à doses conve-nables être utilisées comme traitement préventif des infections à virus HB spontanés, post-trans~usionnelles ou autres, en étant soit injectées au sujets exposés soit ajoutées au sang et à
ses dérivés, avant ou après ~ractionnement éventuel pour injection à l'hornme, afin de neutraliser le virus HB.
Comme cela a été indiqué ci-dessus l'antigène-e est en réalité un complexe antigénique représentant un ensemble de protéines. Deux de ces protéines ont été désignées par Ag-e1 et Ag-e2 par Williams A~IAN et Georges ~E BOUVIER, Symposium International sur les sous-types de l'antigène ~IBs tenu au Centre National de transfusion Sanguine à Paris, 14-18 avril 1975, compte-rendu par dans Bibliotheca llematologica, ~, 65-70 (1976).
Il en existe d'autres qui peuvent être par exemple désignées par e3...etc. On a constaté que chez les porteurs d'antigène-e, les proportions respectives des divers antigènes-e lO~Oi rient. De la meme fa~on, les F oportions relative3 des divers anticorps anti-e1, anti-e2,...etc sont variables. h~ immunisant des sujets avec une préparation d'Ag-e riche en l'un des cons-tituants du complexe antigeniqu~, ou en sélectionnant des plasmas de sujets déjà porteurs d'anticorps anti-e riche en l'un des anticorps correspondants, on peut obtenir des fractions gammaglobuliniques riches en l'un de ces an-ticorps.
L'invention s'étend à de telles fractions gamma-globuliniques riches par exemple en anticorps anti-e1 ou 10 anti-e2 .
Une autre application des fractions gammaglobuliniques contenant des anticorps anti-e est l'élimination des virus HB
complets infectieux et des antigènes-e de tous liquides biologiques les contenant ou susceptibles de les contenir, par agglutination et/ou neutralisation réalisée par mise en contact avec des anti~
corps anti-e, par exemple en ajoutant les anticorps anti-e auxdits liquides. Par exemple, on peut ajouter la fraction gammaglobulinique contenant des anticorps anti-e dans des flacons de sang ou de plasma ou de tout autre liquide biologique à perfuser en urgence et dont on n'a pas le temps de vérifier l'innocuité, c'est-à-dire, dans le cas présent, l'absence de virus HB. On peut aussi faire passer lesdits liquides biologiques sur un immunoadsorbant dont la surface est revetue par des particules anticorps anti-e. Pour cela, on peut par exemple effectuer une chromatographie d'affinité analogue à celle qui est mentionnée ci-dessus à propos de l'obtention de préparations partiellement ou totalement purifiées d'antigène-e, c'est-à-dire une chromatographie sur un support poreux couple i de~ anticorps anti-e. La régéneration du support, par élution de l'antigène ~0 adsorbé, permet en outre l'obtention de préparations d'Ag-e dont l'utilité a été rappelée ci-dessus.
Dans ce cas, la composition pharmaceutique de nvention est constituce par le sang, le plasma ou par tout autre liquide biologique à perfuser, dans lequel on a ajouté la fraction gammaglobulinique contenant des anticorps anti-e, ou que l'on a fait passer sur un immuno-adsorbant tapissé de particules anticorps anti-e.
Bien entendu, les fractions gaMmaglobuliniques ajoutées aux liquides biologiques, ont subi un traitement permettant l'administration par voie intraveineuse.
~ es exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
~MPLE 1 : Purification de l'antigène-e par ultra-centrifugation ~onale On sélectionne, comme décrit ci-dessus, le plasma de sujets porteurs de l'antigène-e, par exemple par réaction d'identité en im~unodiffusion vis-àvis d'antigène-e de preférence.
On ajoute au plasma du chlorure de calciurn et laisse reposer 24 heures afin d'éliminer la fibrine. On ajoute du polyéthylène glycol de poids moléculaire compris entre 6.000 et 7.500 (CAR~O~AX 6000) jusqu'à 13% de concentration finale (poids/volume) dans un tampon phosphate disodique 0,02% à pH 7.
~ près 24 heures à + 4C le précipite est séparé du surnageant par décantation soigneuse. On se débarasse ensuite de la plus grande partie du polyéthylèneglycol en ajustant le pH du précipite à 5 dans un tampon acétate de sodium 0.25 M. On sépare le précipité, après 24 heures à + 4C, par une centrifugation à
4.000 tours/minute. ~e surnageant qui contient l'Ag-e est disposé sur une colonne de Sephadex G200 et les fractions sont co]lectées.
~ es fractions trouvees positives pour l'Ag-c, par immunodiffusion et/ou électroimmunodiffusion sont réunies et concentrées par ultrafiltration sur Amicon équipé de filtre PM ~0.000.
105~0701 I.a solution ainsi con entrée est deposee à la sur~ace de trois tu~es contenant un gradient linéaire de sucrose de lO à
30% (P/P en tampon phosphate de pH 7,4 et soumis à une centri-fugation zonale préparative à 20.000 tours/minute à 4C pendant 18 heures. Des fractions de ~ ml sont collectées à partir du fond du tube. Les fractions positives pour l'antigène-c (par exemple par le test d'immunodiffusion) sont réunies. On peut répéter la centrifugation de fa~con analogue sur ces fractions positives pour l'Ag-e afin d'augmenter la purification. On dialyse ensuite vis-à-vis de tampon phosphate de pH 7,~ pendant 24 heures puis concentrées par ultra-filtration avec un filtre muni d'une membrane dont la dimension des pores est telle qu'elle retient les molécules de poids moléculaire supérieur à 30.000.
~ a solution d'antigène-e obtenue peut être utilisée pour susciter la ~ormation d'AC anti-e après avoir été soumise par précaution à une atténuation par action de la chaleur, du formol, de la bêta-propiolactone ou des rayonnements ultra-violets, dosés et associés de façon à éliminer tout résidu d'infectiosité
éventuel, sans abolir l'antigénicité.
EXEMP~E 2 : Purification de l'antigène-e par chromatographie d'affinité
a) Préparation d'un immuno-adsorbant Sépharose/anti-e ~ a fraction gammaglobulinique d'un sérum trouvé anti-e positif est préparée par précipitation avec du sulfate d'ammonium pH 7 à 40~ de concentration finale. ~e précipité est redissous en tampon 0.1 M NaHC03 et dialysé vis-à-vis d'une solution 0,5 M
NaCl - 0,1 M Nal~CO~..
Les gammaglobulines anti-e sont couplées à du Sépharose 4 ~ activite; au brolnure de cyanogène (PHARMACIA-l~'INE UPSAL~, Suède) selon le procédé décrit par CUA~RECAS et AFINSEN dans ANN REV BIOCHEM 40 : 259, 1971.
7 g de Sépha-rose 4 B activé au CN~r sont mis à gonfler ~090701 . lavés sur un filtre en verre a ec 0,001 M ~iCl pen~ant 30 minutes. Immédiatement après lavage, le gel est loélange avec 200 mg de gammaglobulines anti-e en solution bicarbonatée et on agite pendant 2 heures à température ambiante.
~ e gel est ensuite lavé avec 600 ml de la solution 0.1 M Naf~C03 contenant 0,5 M NaCl et traitee avec 50 ml d'une solution d'éthanolamine 1 M, pH 8, pendant 2 heures à 25~C. ~e Sépharose ainsi couplé est ultérieurement lavé alternativement avec un tampon 1 M NaCl - 0,1 M acétate pH 4,0 et un tampon 1 M
NaCl - 0,1 M borate, p~I 8,4.
Le dernier lavage est fait en tampon 0,1 M borate pH 8,4 contenant 0,5 M de NaCl et 0,0005 M d'EDlA.
b) Isolement de l'antigène-e Une colonne de 2 x 11 cm de Sépharose couplée à l'anti-e est utilisée. ~a colonne est équilibrée avec le tampon à tempé-rature ambiante. On ajoute 25 ml de la solution contenant l'antigène-e obtenue à l'exemple 1 et diluée au 1/2 avec le tampon et on laisse une heure à ~7C pour favoriser une adsorption maximale. La colonne est ensuite placée à 4C et lavée avec le tampon boraté jusqu'à ce que la densité optique des fractions devienne nulle. I,'antigène-e est élué de la colonne par un tampon phosphaté 0,1 M, pH 10,8, ~es fractions contenant l'antigène-e déterminees par mesure de la densité optique à 280 nm sont immédiatement ramenees à un pH physiologique par addition d'HCl
Depuis 1 t identification, dans le sérum de la plupart des sujets atteints d'hépatite virale B, d'un an-tigène apparemment spécifique du virus B, appelé antigène Australie, on a proposé
l'utilisation de cet antigène purifié, et éventuellement atténué, pour la préparation d'un vaccin contre l'hépatite à virus B
(voir le brevet français n 70.34574).
~'antigène Australie ne représente pas le virus de l'hépatite B lui-même. En effet, on a constaté que la plupart des donneurs de sang porteurs asymptomatiques de l'antigène Australie n'ont que peu ou pas de virus circulant dans leur sérum.
On sait que le sérum de nombreux sujets porteurs de l'antigène Australie contient un autre antigène qui a éte appelé
antigène-e, en abrégé Ag-e, voir ~Ø Magnius et Ake ~spmark, Acta.
path. microbiol. scand., Section B, 80, 335-337 (1972).
On désigne par antigène-e un complexe antigénique représentant un ensemble de protéines solubles (appelées e1, e2,.,.) normalement absentes du sérum humain mais retrouvées dans le sérum de certains porteurs d'antigène Australie, en particulier ceux qui sont atteints d'hépatite chronique, ou encore chez des sujets hémodialysés, immunodéprimés ou atteints de mongolisme.
Ces différents déterminants antigéniques sont immunologiquement distincts de l'antigène Australie.
Dans la présente demande, on désigne par anticorps anti-e des anticorps réagissant avec les protéines constituant l'antigène-e. Ces anticorps peuvent être trouvés dans le sérum de sujets ayant été contaminés par le virus B, en particulier dans le sérum des porteurs chroni~ues d'antigène Australie ne souffrant 1090~01 p_s de maladies hépatiques.
On a découvert que l'administration d'antigène-e est capable d'entraîner une réponse immunologique, avec formation d'anticorps anti-e.
On a maintenant découvert que l'administration des anticorps anti-e chez des sujets souffrant d'infections aigu~s ou chroniques dues au virus B permet notamment de faire dispa-raître les symptômes et les lésions histologiques d'hépatite.
On a égalernent décou~ert que l'addition d'anticorps anti-e des liquides biologiques contenant des antigènes-e et/ou des virus B permet de faire disparaître l'infectivité de ces liquides ou de la réduire très considérablement.
Il n'existe actuellement aucun traitement actif des hépatites aigu~s ni de thérapeutique susceptible en particulier d'empêcher leur aggravation subite mortelle ou leur eYolution chronique vers la cirrhose.
Il en va de même dans les infections chroniques à
virus HB latentes ou non (hépatite chronique, périartérite noueuse, glomérulonéphrite à virus HB).
Utilisés dans ce second groupe de maladies, les médicaments anti-inflammatoires (corticostéroides) et immunosupres-seurs n'exercent une action bénéfique qu'en diminuant la réaction inflammatoire mais n'ont aucun pouvoir sur l'infection virale responsable de la maladie dont ils favorisent au contraire la persistance.
~a découverte de l'efficacité des anticorps anti-e dans le traitement de l'hépatite à virus B présente un caractère surprenant car jusqu'à present les tentatives d'injecter chez l'homme ou chez le chimpanzé du plasma contenant des anticorps anti-HBs dirigés contre un antigène de surface du virus de l'hépatite B (antigène appelé Ag HBs) dans l'espoir d'a~eliorer une hépatite ou une viré~ie chronique ont toujours échoué. La 1090~01 lnsfusion de plasmas sélectionn-;s en fonction de leur haute teneur en anticorps anti-HBs ne paraît donc pas avoir d'action thérapeutique dans les conditions où on a pu les utiliser;
voir par exemple Reed et al., Lancet, 2, 1347 (1973), C.G. Trepo, The American Journal of the Medical Sciences, 270, 248 (1975) et i'Treatment of Pulminant Hepatitis with Hepatitis B Immune Globulin: a Cooperative Study", Gastroenterology, 66, A 98-752 (1974).
La présente invention a pour objet une composition pharmaceutique caractérisée par le fait qu'elle comprend, dans un milieu physiologiquement acceptable, une fraction gammaglobulinique conten`ant des anticorps anti-e, ladite fraction étant obtenue au départ de sérum ou de plasma sanguin ou au départ d'extraits placentaires contenant des anticorps anti-e.
On sait que les anticorps formés par un organisme en réponse à l'administration d'un antigène constituent une famille de protéines qui ont de nombreuses caractéristiques com~unes et qui sont appelées gammaglobulines.
~ es fractions gammaglobuliniques contenant des anticorps anti-e peuvent être obtenues selon les procédés classiques de préparation des gammaglobulines au départ de sérums, de plasmas ou d'extraits placentaires dans lesquels on a préalablement détecté la présence d'anticorps anti-e. Ces procédés classiques sont notamment ceux décrlts par E.J. COHN et al, J.~.C.S., 66, 459 (1946); J.L. ONC~EY et al, J.A.C.S., 71, 541 (1949); H.L. TAYLOR et al, J.A.C.S., 78, 1356 (1956);
J. HORHJSI et R. SMETANA, Acta Medica Scandinavia, Vol. CLV, 65 (1956), et P. KISTLER et Hs. NITSC~IM~NN Vox Sang., 7, 414 (1962). I.es anticorps anti-e peuvent être trouves soit chez des sujets ayant spontanément développé ces anticorps, soit chez des sujets volontaires ayant été immunisés avec une preparation d'antigène-e purifiée dénuée de tout risque infectieux, et qui ~090701 t formé par réponse immunologiq~le des anticorps anti-e.
On peut détecter la présence des an-ticorps anti-e notamment à
l'aide d'un réactif contenant de l'antigène-e en utilisant la technique d'immunodiffusion ou d'électroimmunodiffusion ou toute autre technique sérologique classique (dosage radio-immunologique, etc.) Pour provoquer la formation d'anticorps anti-e par réponse immunologique, ou pour détecter la présence desdits anticorps, il convient de disposer de préparations partiellement ou totalement purifiées d'antigène-e qui peuvent être obtenues par exemple par chromatographie d'affinité sur un immuno-adsorbant constitué par un support de matériau poreux dont la surface est tapissée d'un revêtement de particules anticorps anti-e reliées au support par l'intermédiaire d'un agent de couplage.
~ e support est constitué par exemple par d~ Sépharose, et l'agent de couplage est par exemple un halogénure de cyanogène.
On peut utiliser notamment un support de Sépharose 4 B, l'agent de couplage étant de préférence la bromure de cyanogène.
Bien entendu, on peut utiliser d'autres supports poreux déjà connus comme étant utilisables dans des procédés d'immunoadsorption, avec des agents de couplage également connus constitués par des dérivés bi-fonctionnels tels que des dialdéhydes.
~ es fractions purifiées contenant l'antigène-e peuvent également être obtenues par un procédé comportant au moins une des étapes suivantes, éventuellement en combinaison avec l'étape d'immuno-adsorption:
- étape de filtration sur gel;
- étape d'ultra-filt~ation à l'aide d'une membrane dont ~0 la dimension des pores est telle qu'elle retient les molécules ayant un poids moléculaire supérieur à 30.000;
- étape d'ultra-centrifugation zonale préparative, ~lisée par exemple en gradient c'e sucrose.
On peut notamment utiliser un procédé suivant lequel on equilibre une colonne contenant l'antigène-e dans le à l'anticorps anti-c, avec un tampon borate à pH 8,4, on ajoute dans la colonne une solution contenant l'antigène-e dans le même tampon; on laisse en contact pendant un temps suffisant pour favoriser une adsorption maximale, puis on élue l'antigène-e par un tampon phosphate de pH 10,8 - 10,9 environ.
On recueille ensuite les fractions contenant l'antigène-e, la présence des protéines antigène-e étant déter-minée par exemple par mesure de la densité optique à 2~0 nm.
On ramène ensuite les fractions purifiées d'antigène-e à un pH physiologique par addition d'acide chlorhydrique, puis l'on concentre si désiré ces fractions par ultra-filtration, et on confirme la présence d'Ag-e par immunodiffusion.
Comme indiqué ci-dessus, la fraction contenant de l'antigène-e peut égalernent être préparée par ultra-centrifugation zonale en gradient de sucrose. Pour cela, le sérum ou la plasma défibriné de départ est concentré de 2 à 10 fois, de préférence 5 fois, par exemple par précipitation des protéines au polyéthylè-neglycol, et redissolution dans une solution aqueuse tamponnée.
La solution ainsi obtenue est déposée à la surface de tubes contenant un gradient linéaire de sucrose de 10 à 27% et soumis à une centrifugation zonale préparative à 19.000-22.000 tours/minute entre 4 et 8C pendant 18 à 25 heures. 0~ collecte ensuite des fractions à partir du fond du tube et l'on réunit les fractions contenant l'antigène-e. Cette ultra-centrifugation peut être rcpétee pour obtenir une plu5 grande purification et complétée par filtrations sur gel. On peut ensuite dialyser les fractions Ag-e réunies, vis-à-vis de tampon phosphate. On peut ensuite, si désiré, concentrer par ultra-filtration avec un filtre muni d'une membrane dont la dimension des pores est lle qu'elle retient les produit. de poids moleculaire supérieur à 30.000.
1a solution obtenue peut être administrée à des humains par voie sous-cutanée ou intramusculaire après avoir été
soumise par précaution à un traitement destiné à éliminer un résidu d'infectiosité éventuel par les procédés conventionnels de chauffage, ou de formolisation, ou d'irradiation par rayonne~ents ultra-violets ou par toute autre irradiation~ On obtient ainsi une fraction d'antigène-e physiologiquement acceptable.
Dans le but de provoquer une réponse anticorps chez des volontai.res, la fraction d'antigène-e p~lysiologiquement acceptable peut être administrée soit seule soit en combinaison avec un adjuvant tel que l'hydroxyde d'aluminium, le phosphate d'aluminium ou tout autre adjuvant naturel ou synthétique.
I.e produit de départ, pour la préparation de la fraction purifiee contenant de l'antigène-e, est une solution provenant soit de sérum, soit de plasma défibriné, donnant une réaction de précipitation avec l'anticorps anti-e. ~a mise en évidence et l'isolement de l'anticorps anti-e sont effectués dans ce cas comme il sera indiqué ci-après.
~ 'antigène-e, mis en évidence par Magnius et Espmark, article cité, se rencontre transitoirement dans le sang des malades atteints d'hépatite B aigu~ et de façon persistante dans le sal~g de nombreux sujets hémodialysés ou souffrant d'hépatite B
chronique et d'une proportion variable d'autres porteurs d'Ag-Australie asymptomatiques en particulier dans certaines ethnies ou dans certaines régions géographiques (Asie).
Pour préparer une fraction purifiée d'antigène-e, on utilise donc le sérum ou le plasma de ces donneurs, éventuellement prélevé par plasmaphérèse.
On rappelle que la présence d'antigène-e peut être mise en évidence par immunodiffusion, comme décrit par Magnius 10'9~01 Espmark dans l'ar-ticle cité ci dessus, ou encore par contre-electrophorèse.
Pour dctecter la présence d'antigène-e on peut également prcparer un réactif selon une methode consistant à
administrer à un animal une préparation d'antigène-c purifiée, telle que décrite ci-dessus, en combinaison avec de l'adjuvant de Freund complet, ou tout autre adjuvant, en effectllant au moins une administration et de préférence plusieurs, l'administra-tion par injection étant alors répétée tous les mois environ, par exemple pendant trois mois. On administre chaque fois la combinaison antigène-e purifiée/adjuvant de Freund. On provoque ainsi chez l'animal la formation d'anticorps anti-e.
On prélève alors le sang de l'animal, partiellement ou en totalité et on recueille le sérum. On s'assure que ce sérum ne contient pas d'anticorps anti-protéines humaines normales.
En immunodiffusion, le réactif constitué par le sc~um obtenu donnera une ligne de précipitation avec un sérum d'origine humaine, si celui-ci contient de l'antigène-e.
Si le serum humain testé donne une ligne de précipi-tation avec ce réactif, le sujet est infecté et probablement atteint d'une hépatite persistante.
La mise en évidence répétée, selon cette méthode, de la présence d'antigène-e pendant la phase aigu~ d'une hépatite, et surtout la persistance de l'antigène-e, suggère un risque accru d'évolution vers l'hépatite chronique.
On peut ainsi déceler les sujets infectés contagieux et en outre deccler précocement ct de façon simp]c les risqucs d'évolution vers l'hepatite chronique.
L'anticorps anti-e dcstiné à mettre en évidence la présence d'antigène-e peut provenir soit d'un être humain, ~qoit d'un animal. Pour la purification d'antigène-e destiné à la ~090~701 ~ paration de vaccin pour l'homm~, on utilise de préference un support couplé avec un anticorps anti-e d'origine humaine.
~ a mise en évidence de l'anticorps anti-e est effectuée comme signalée par Magnius et Espmark, article cité, ou par toute autre méthode serologique.
~ 'anticorps anti-e peut être obtenu par exemple par centrifugation zonale d'un sérum dans lequel on a préalablement détecté la présence de cet anticorps, ou~ de préférence, selon les méthodes classiques de préparation des gammaglobulines; voir les références rappelées ci-dessus. On peut utiliser les techniques connues de fractionnement à l'éthanol, au sulfate d'ammonium et/ou au Rivanol. On peut par exernple précipiter l'anticorps par addition d'une solution de sulfate d'ammonium à
40% de saturation, redissoudre le précipité et le soumettre à une dialyse pour eliminer le sulfate d'ammonium.
A titre d'illustration non limitative de ces méthodes connues on donne dans la partie expérimentale ci-après un exemple de fractionnement à l'éthanol.
~ a composition pharmaceutique selon l'invention est généralement une fraction purifiée d'anticorps anti-e, ladite fraction ayant été débarassée de tous autres constituants protéiques sanguins normaux (autres que des gammaglobulines) et de tous contaminants infectieux.
Mais la composition pharmaceutique selon l'invention peut etre également constituée par la plasma entier ou le sérum entier dans lequel on a reconnu 'a présence de cet anticorps.
~ es gammaglobulines contenant les anticorps anti-e utilisables co~mc ingredient3 actifs dans la compo~i-tion pharmaceutique de l'invention peuvent également avoir subi les transformations classiques permettant d'administrer les gamma-globulines par voie intraveineuse. On sait que ces traitements consistent à suppri~er ou à réduire le pouvoir anti-complémentaire s gammaglobulines, pouvoir anti!omplémentaire dû à la présence d'agregats qui peuvent fixer le complérnent comme le fait le coinple~e antigène-anticorps. On connait différents procédés qui permettent d'obtenir des gammaglobulines injectables par voie intraveineuse. Ces procédés consistent par exemple à sou-mettre la garnmaglobuline soit à une incubation à pH 4, soit à
une digestion enzymatique par la pepsine, la papaine ou la plasmine.
~a composition pharmaceutique selon l'invention peut être administrée notamment au cours des hepaties ou infections à virus B aigu~s afin de hâter leur guérison et de prévenir tout risque d'évolution chronique.
La composition pharmaceutique est injectée par voie intramusculaire, ou par voie intraveineuse.
I,e traitement par les gammaglobulines anti-e pourra 8tre utilisé seul ou en association avec des médications variées anti-allergiques, anti-inflammatoires ou autres. Une ou plusieurs injections successives seront effectuées en fonction des résultats biologiques et sérologiques.
~a composition pharmaceutique de l'invention peut aussi être administrée au cours des diverses hepatites et de toutes infections chroniques à virus B. Ces maladies sont diagnostiquées par les méthodes cliniques, biologiq`~es,histologiques et sérologiques habituelles, en particulier par la détection de l'Ag-HBs.
Ces affections seront caractérisées en outre sérologiquement par l'absence de réponse anticorps anti-e satisfaisante et mêlne Le plus souvent par une persistance de l'Ag-e.
~es hépatites chroniques actives en représentent la forme la plus grave, et doivent impérieusement être traitées par des anticorps anti-e.
- lOgO701 ~ 'administration d'an icorps anti-e sera nécessaire-ment plus prolongée dans ces formes de maladies chroniques, le recours à la voie intraveineuse sera parfois nécessaire et du plasma contenant des anticorps anti-e pourra être utilisé à la place des gammaglobulines adaptées à la voie intraveineuse. En cas d'antigène-e circulant en quantité importante, on pourra procéder à une élimination préalable de cet antigène-e circulant par une exsanguino-transfusion préalable, ou une plasmaphérèse continue au cours de laquelle le plasma contenant l'Ag-e sera remplacé par du plasma iso-groupe dépourvue d'Ag-e et d'antigène Australie, ou l'Ag-e sera retenu sur un filtre convenable par exemple un support poreux couplé à des anticorps anti-e.
En fin d'opération, on remplacera une fraction du plasma du malade par du plasma riche en anticorps anti-e ou toute autre solution protéiniques humaine (albumine...) ou autre contenant des gammaglobulines anti-e traitées pour l'administration intraveineuse. ~'administration de médications anti-allergiques et anti-inflammatoires (corticostéro'Jdes, antihistaminiques, etc) évitera toute réaction fâcheuse durant cette opération qui pourra être répétée en cas d'échec et surtout complétée par un traitement avec des gammaglobulines anti-e ultérieur.
Cette thérapeutique pourra être associée à des traitements adjuvants de toute autre nature, chimiothérapie ou immunothérapie.
~ 'indication du traitement des hépatites chroniques par les anticorps anti-e, sous ltune quelconque de ses formes:
intraveineux ou intramusculaire, avec ou sans exsanguino-transfusion, isole ou associé à d'autres traitements sera décid~-e sur le résultat d'un bilan clinique et immunobiologique complet du malade.
~ a présence, dans le sérum et le foie du malade, du virus IIB et de ses particules et antigènes associes (Ag-Australie, 109070~
~ 3C, ~g-e) sera précisée par d~s examens sérologiques, et par des études des biopsies hépatiques en immunofluorescence ou en microscopie électronique.
~ 'étude des réponses immunes humorales et cellulaires dirigées contre ces trois antigènes pourra être appréciée par la titration serologique des anticorps et par des tests d'hypersensibilité retardés vis-à-vis de ces mêmes antigènes (inhibition de la migration des leucocytes et éventuellement intradermoréaction avec les trois antigènes ~ustralie, ~BC et e purifiée non infectieux).
~ es résultats de tous ces tests ainsi que de ceux explorant l'état des réponses immunitaires globales du malade servent à décider du type de traitement adopté, la posologie étant déterminée selon les méthodes habituelles de détermination de la posologie pour les traitements à l'aide de gammaglobulines.
Les gammaglobulines anti-e pourront à doses conve-nables être utilisées comme traitement préventif des infections à virus HB spontanés, post-trans~usionnelles ou autres, en étant soit injectées au sujets exposés soit ajoutées au sang et à
ses dérivés, avant ou après ~ractionnement éventuel pour injection à l'hornme, afin de neutraliser le virus HB.
Comme cela a été indiqué ci-dessus l'antigène-e est en réalité un complexe antigénique représentant un ensemble de protéines. Deux de ces protéines ont été désignées par Ag-e1 et Ag-e2 par Williams A~IAN et Georges ~E BOUVIER, Symposium International sur les sous-types de l'antigène ~IBs tenu au Centre National de transfusion Sanguine à Paris, 14-18 avril 1975, compte-rendu par dans Bibliotheca llematologica, ~, 65-70 (1976).
Il en existe d'autres qui peuvent être par exemple désignées par e3...etc. On a constaté que chez les porteurs d'antigène-e, les proportions respectives des divers antigènes-e lO~Oi rient. De la meme fa~on, les F oportions relative3 des divers anticorps anti-e1, anti-e2,...etc sont variables. h~ immunisant des sujets avec une préparation d'Ag-e riche en l'un des cons-tituants du complexe antigeniqu~, ou en sélectionnant des plasmas de sujets déjà porteurs d'anticorps anti-e riche en l'un des anticorps correspondants, on peut obtenir des fractions gammaglobuliniques riches en l'un de ces an-ticorps.
L'invention s'étend à de telles fractions gamma-globuliniques riches par exemple en anticorps anti-e1 ou 10 anti-e2 .
Une autre application des fractions gammaglobuliniques contenant des anticorps anti-e est l'élimination des virus HB
complets infectieux et des antigènes-e de tous liquides biologiques les contenant ou susceptibles de les contenir, par agglutination et/ou neutralisation réalisée par mise en contact avec des anti~
corps anti-e, par exemple en ajoutant les anticorps anti-e auxdits liquides. Par exemple, on peut ajouter la fraction gammaglobulinique contenant des anticorps anti-e dans des flacons de sang ou de plasma ou de tout autre liquide biologique à perfuser en urgence et dont on n'a pas le temps de vérifier l'innocuité, c'est-à-dire, dans le cas présent, l'absence de virus HB. On peut aussi faire passer lesdits liquides biologiques sur un immunoadsorbant dont la surface est revetue par des particules anticorps anti-e. Pour cela, on peut par exemple effectuer une chromatographie d'affinité analogue à celle qui est mentionnée ci-dessus à propos de l'obtention de préparations partiellement ou totalement purifiées d'antigène-e, c'est-à-dire une chromatographie sur un support poreux couple i de~ anticorps anti-e. La régéneration du support, par élution de l'antigène ~0 adsorbé, permet en outre l'obtention de préparations d'Ag-e dont l'utilité a été rappelée ci-dessus.
Dans ce cas, la composition pharmaceutique de nvention est constituce par le sang, le plasma ou par tout autre liquide biologique à perfuser, dans lequel on a ajouté la fraction gammaglobulinique contenant des anticorps anti-e, ou que l'on a fait passer sur un immuno-adsorbant tapissé de particules anticorps anti-e.
Bien entendu, les fractions gaMmaglobuliniques ajoutées aux liquides biologiques, ont subi un traitement permettant l'administration par voie intraveineuse.
~ es exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.
~MPLE 1 : Purification de l'antigène-e par ultra-centrifugation ~onale On sélectionne, comme décrit ci-dessus, le plasma de sujets porteurs de l'antigène-e, par exemple par réaction d'identité en im~unodiffusion vis-àvis d'antigène-e de preférence.
On ajoute au plasma du chlorure de calciurn et laisse reposer 24 heures afin d'éliminer la fibrine. On ajoute du polyéthylène glycol de poids moléculaire compris entre 6.000 et 7.500 (CAR~O~AX 6000) jusqu'à 13% de concentration finale (poids/volume) dans un tampon phosphate disodique 0,02% à pH 7.
~ près 24 heures à + 4C le précipite est séparé du surnageant par décantation soigneuse. On se débarasse ensuite de la plus grande partie du polyéthylèneglycol en ajustant le pH du précipite à 5 dans un tampon acétate de sodium 0.25 M. On sépare le précipité, après 24 heures à + 4C, par une centrifugation à
4.000 tours/minute. ~e surnageant qui contient l'Ag-e est disposé sur une colonne de Sephadex G200 et les fractions sont co]lectées.
~ es fractions trouvees positives pour l'Ag-c, par immunodiffusion et/ou électroimmunodiffusion sont réunies et concentrées par ultrafiltration sur Amicon équipé de filtre PM ~0.000.
105~0701 I.a solution ainsi con entrée est deposee à la sur~ace de trois tu~es contenant un gradient linéaire de sucrose de lO à
30% (P/P en tampon phosphate de pH 7,4 et soumis à une centri-fugation zonale préparative à 20.000 tours/minute à 4C pendant 18 heures. Des fractions de ~ ml sont collectées à partir du fond du tube. Les fractions positives pour l'antigène-c (par exemple par le test d'immunodiffusion) sont réunies. On peut répéter la centrifugation de fa~con analogue sur ces fractions positives pour l'Ag-e afin d'augmenter la purification. On dialyse ensuite vis-à-vis de tampon phosphate de pH 7,~ pendant 24 heures puis concentrées par ultra-filtration avec un filtre muni d'une membrane dont la dimension des pores est telle qu'elle retient les molécules de poids moléculaire supérieur à 30.000.
~ a solution d'antigène-e obtenue peut être utilisée pour susciter la ~ormation d'AC anti-e après avoir été soumise par précaution à une atténuation par action de la chaleur, du formol, de la bêta-propiolactone ou des rayonnements ultra-violets, dosés et associés de façon à éliminer tout résidu d'infectiosité
éventuel, sans abolir l'antigénicité.
EXEMP~E 2 : Purification de l'antigène-e par chromatographie d'affinité
a) Préparation d'un immuno-adsorbant Sépharose/anti-e ~ a fraction gammaglobulinique d'un sérum trouvé anti-e positif est préparée par précipitation avec du sulfate d'ammonium pH 7 à 40~ de concentration finale. ~e précipité est redissous en tampon 0.1 M NaHC03 et dialysé vis-à-vis d'une solution 0,5 M
NaCl - 0,1 M Nal~CO~..
Les gammaglobulines anti-e sont couplées à du Sépharose 4 ~ activite; au brolnure de cyanogène (PHARMACIA-l~'INE UPSAL~, Suède) selon le procédé décrit par CUA~RECAS et AFINSEN dans ANN REV BIOCHEM 40 : 259, 1971.
7 g de Sépha-rose 4 B activé au CN~r sont mis à gonfler ~090701 . lavés sur un filtre en verre a ec 0,001 M ~iCl pen~ant 30 minutes. Immédiatement après lavage, le gel est loélange avec 200 mg de gammaglobulines anti-e en solution bicarbonatée et on agite pendant 2 heures à température ambiante.
~ e gel est ensuite lavé avec 600 ml de la solution 0.1 M Naf~C03 contenant 0,5 M NaCl et traitee avec 50 ml d'une solution d'éthanolamine 1 M, pH 8, pendant 2 heures à 25~C. ~e Sépharose ainsi couplé est ultérieurement lavé alternativement avec un tampon 1 M NaCl - 0,1 M acétate pH 4,0 et un tampon 1 M
NaCl - 0,1 M borate, p~I 8,4.
Le dernier lavage est fait en tampon 0,1 M borate pH 8,4 contenant 0,5 M de NaCl et 0,0005 M d'EDlA.
b) Isolement de l'antigène-e Une colonne de 2 x 11 cm de Sépharose couplée à l'anti-e est utilisée. ~a colonne est équilibrée avec le tampon à tempé-rature ambiante. On ajoute 25 ml de la solution contenant l'antigène-e obtenue à l'exemple 1 et diluée au 1/2 avec le tampon et on laisse une heure à ~7C pour favoriser une adsorption maximale. La colonne est ensuite placée à 4C et lavée avec le tampon boraté jusqu'à ce que la densité optique des fractions devienne nulle. I,'antigène-e est élué de la colonne par un tampon phosphaté 0,1 M, pH 10,8, ~es fractions contenant l'antigène-e déterminees par mesure de la densité optique à 280 nm sont immédiatement ramenees à un pH physiologique par addition d'HCl
2 N.
On réunit toutes ces fractions et on concentre par ultra-filtration sur filtre Amicon PM 30.
~es essais effectués montrent que le produit obtenu ne contient pas d'antigène Australie.
Par précaution, la preparation d'Ag-e peut être soumise à une atténuation par le formol, la bêta-propiolactone ou les ultra-violets afin d'éliminer une éventuelle infectiosité
1090~0~
,iduelle sans abolir l'antigcni(~ité.
~ 'absence de pouvoir infectieux et l'efficacité de cette préparation sont évaluées par des essais sur le chimpanzé.
Ces essais comportent notamment la recherche d'une replication virale par détermination de l'antigène Australie et de l'anticorps anti-HBC, l'étude des transaminases et la surveillance histologique par biopsie du foie.
L'administration de cette préparation per~et de faire apparaître des anticorps anti-e chez des donneurs volontaires, et le sang provenant de ces donneurs peut constituer le produit de départ pour l'obtention de fractions purifiées contenant de l'anticorps anti-e, comme décrit ci-après dans l'exemple 3.
EXEMP~E 3 : Préparation d'une fraction gamma~lobulinique comprenant des anticorps anti-e ~ e produit de départ est un plasma défibrine obtenu par plasmaphérèse provenant de donneurs sélectionnes dont le sang contient des anticorps anti-e. On ajoute au plasma de l'éthanol jusqu'à une concentration de 19% à pH 5,85 à une température de -5C, les volumes étant choisis de façon à obtenir une concentration finale de protéines égale à j~ environ. On soumet à une centrifugation et isole un precipité qui contient toutes les gammaglobulines et une partie des globulines alpha et bêta.
~e précipité est mis en suspension dans de l'eau à
0C à raison de 10 litres d'eau pour chaque kilo~ramme de préci-pité. On ajuste le pH à 4,5 par addition d'un mélange tampon de pH 4 obtenu en mélangeant un volwne de Na2HP04 0,05 M et six volumes d'acide acetique 0,05 M.
On ajoute ensuite un tampon de pH 4,~ composé d'un volurne de Na2HP04 0,05 M et de 1,65 volume d'acide acétique à 0,05 M, afin d'augmenter la force ionique. Il faut ajouter environ 2,35 litres de tampon à pH 4.
10C~0701 On ajuste en~uite le lH à 5,1 en ajoutant environ 4,5 litres d'un tampon obtenu en mélangeant un volume de Na2~IP04 0,05 M et 0,83 volume d'acide aGétique 0,05 M, tout en maintenant la température à - 5C.
On ajuste la ~orce ionique en ajoutant 0,4 litre d'un tampon de pH 5,1 composé d'un volume de Na~HP04 0,05 ~l et de 1,25 volume d'acide acétique.
La suspension est ensuite diluée dans 9,7 litres d'eau.
On a alors un volume total de solvant de l9,45 litres pour cha~ue kilogramme de précipité.
On ajoute de l'éthanol jusqu'à obtention d'une concen-tration en éthanol de 12~.
On centrifuge et recueille le surnageant. On ajoute du chlorure de sodium jusqu'à obtention d'une force ionique comprise entre 0,03 et 0,04. On ajuste ensuite le pH à 7,2 et ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 25~, à la tempé-rature de -7C. On ~btient un précipité de gammaglobulines que l'on recueille par centrifugation. On prépare ensuite le médicament final par les méthodes usuelles, c'est-à-dire mise en solution, clarification et lyophilisation, puis préparation d'une solution aqueuse à 16%. Afin d'obtenir une solution isotonique procurant une meilleure solubilité et une meilleure stabilité, on ajoute 0,3 mole par litre de glycine. On ajoute également 0,1 g par litre de merthiolate comme agent de conservation.
~ es traitements supplémentaires en vue de l'obtention dc gamma~lobulines injectables par voie intraveincuse pcuvent également être réalisés selon les procédés habituels.
F~EMPLE ~ - Préparation d'une fraction gammaglobulinique riche e_ anticorps anti-e1.
En opérant comme dans l'exemple 3, mais au départ de ~asmas sélectionnées pour leur rLchesse en anticorps anti-e1, on obtient une fraction gammaglobulini~ue riche en anticorps anti-e1 que l'on conserve sous forme lyophilisée.
EXEMPLE 5'- Préparation d'une fraction gamma~lobul nique riche en anticorps anti-e .
En opérant comme dans l'exemple 3, mais au départ de plasmas sélectionnées pour leur richesse en anticorps anti-e2, on obtient une fraction gammaglobulinique riche en anticorps anti-e2 que l'on conserve sous forme lyophilisée.
On réunit toutes ces fractions et on concentre par ultra-filtration sur filtre Amicon PM 30.
~es essais effectués montrent que le produit obtenu ne contient pas d'antigène Australie.
Par précaution, la preparation d'Ag-e peut être soumise à une atténuation par le formol, la bêta-propiolactone ou les ultra-violets afin d'éliminer une éventuelle infectiosité
1090~0~
,iduelle sans abolir l'antigcni(~ité.
~ 'absence de pouvoir infectieux et l'efficacité de cette préparation sont évaluées par des essais sur le chimpanzé.
Ces essais comportent notamment la recherche d'une replication virale par détermination de l'antigène Australie et de l'anticorps anti-HBC, l'étude des transaminases et la surveillance histologique par biopsie du foie.
L'administration de cette préparation per~et de faire apparaître des anticorps anti-e chez des donneurs volontaires, et le sang provenant de ces donneurs peut constituer le produit de départ pour l'obtention de fractions purifiées contenant de l'anticorps anti-e, comme décrit ci-après dans l'exemple 3.
EXEMP~E 3 : Préparation d'une fraction gamma~lobulinique comprenant des anticorps anti-e ~ e produit de départ est un plasma défibrine obtenu par plasmaphérèse provenant de donneurs sélectionnes dont le sang contient des anticorps anti-e. On ajoute au plasma de l'éthanol jusqu'à une concentration de 19% à pH 5,85 à une température de -5C, les volumes étant choisis de façon à obtenir une concentration finale de protéines égale à j~ environ. On soumet à une centrifugation et isole un precipité qui contient toutes les gammaglobulines et une partie des globulines alpha et bêta.
~e précipité est mis en suspension dans de l'eau à
0C à raison de 10 litres d'eau pour chaque kilo~ramme de préci-pité. On ajuste le pH à 4,5 par addition d'un mélange tampon de pH 4 obtenu en mélangeant un volwne de Na2HP04 0,05 M et six volumes d'acide acetique 0,05 M.
On ajoute ensuite un tampon de pH 4,~ composé d'un volurne de Na2HP04 0,05 M et de 1,65 volume d'acide acétique à 0,05 M, afin d'augmenter la force ionique. Il faut ajouter environ 2,35 litres de tampon à pH 4.
10C~0701 On ajuste en~uite le lH à 5,1 en ajoutant environ 4,5 litres d'un tampon obtenu en mélangeant un volume de Na2~IP04 0,05 M et 0,83 volume d'acide aGétique 0,05 M, tout en maintenant la température à - 5C.
On ajuste la ~orce ionique en ajoutant 0,4 litre d'un tampon de pH 5,1 composé d'un volume de Na~HP04 0,05 ~l et de 1,25 volume d'acide acétique.
La suspension est ensuite diluée dans 9,7 litres d'eau.
On a alors un volume total de solvant de l9,45 litres pour cha~ue kilogramme de précipité.
On ajoute de l'éthanol jusqu'à obtention d'une concen-tration en éthanol de 12~.
On centrifuge et recueille le surnageant. On ajoute du chlorure de sodium jusqu'à obtention d'une force ionique comprise entre 0,03 et 0,04. On ajuste ensuite le pH à 7,2 et ajoute de l'éthanol jusqu'à une concentration de 25~, à la tempé-rature de -7C. On ~btient un précipité de gammaglobulines que l'on recueille par centrifugation. On prépare ensuite le médicament final par les méthodes usuelles, c'est-à-dire mise en solution, clarification et lyophilisation, puis préparation d'une solution aqueuse à 16%. Afin d'obtenir une solution isotonique procurant une meilleure solubilité et une meilleure stabilité, on ajoute 0,3 mole par litre de glycine. On ajoute également 0,1 g par litre de merthiolate comme agent de conservation.
~ es traitements supplémentaires en vue de l'obtention dc gamma~lobulines injectables par voie intraveincuse pcuvent également être réalisés selon les procédés habituels.
F~EMPLE ~ - Préparation d'une fraction gammaglobulinique riche e_ anticorps anti-e1.
En opérant comme dans l'exemple 3, mais au départ de ~asmas sélectionnées pour leur rLchesse en anticorps anti-e1, on obtient une fraction gammaglobulini~ue riche en anticorps anti-e1 que l'on conserve sous forme lyophilisée.
EXEMPLE 5'- Préparation d'une fraction gamma~lobul nique riche en anticorps anti-e .
En opérant comme dans l'exemple 3, mais au départ de plasmas sélectionnées pour leur richesse en anticorps anti-e2, on obtient une fraction gammaglobulinique riche en anticorps anti-e2 que l'on conserve sous forme lyophilisée.
Claims (18)
1. Composition pharmaceutique pour le traitement des infections aiguës ou chroniques dues au virus de l'hépatite B, caractérisée par le fait qu'elle comprend dans un milieu physiologiquement acceptable, une fraction gammaglobulinique contenant des anticorps anti-e, ladite fraction étant obtenue au départ de sérum ou de plasma sanguin ou au départ d'extraits placentaires contenant des anticorps anti-e.
2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle est constituée par une fraction purifiée d'anticorps anti-e, ladite fraction ayant été débarrassée de tous autres constituants protéiques sanguins normaux, en dehors des gammaglobulines, et de tous contaminants infectieur.
3. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle est constituée par un plasma entier ou un sérum entier dans lequel on a reconnu la présence d'anticorps anti-e.
4. Composition pharmaceutique selon les revendications 1 ou 2, caractérisée par le fait que les gammaglobulines ont subi un traitement destiné à supprimer ou à réduire le pouvoir anti-complémentaire de façon à permettre l'administration par voie intraveineuse.
5. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait qu'elle est constituée par du sang, par un plasma ou par tout autre liquide biologique dans lequel on a ajouté une fraction gammaglobulinique contenant des anticorps anti-e, ladite fraction gammaglobulinique ayant subi préalablement un traitement destiné à supprimer ou à réduire pouvoir anti-complémentaire.
6. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, caractérisée par le fait que ladite fraction gammaglobulinique est riche en l'un des anticorps anti-e.
7. Composition pharmaceutique selon la revendication 6, caractérisée par le fait que ladite fraction gammaglobulinique est riche en l'un des anticorps anti-e1 et anti-e2.
8. Procédé permettant d'éliminer ou de réduire l'infectivité de fluides biologiques contenant ou susceptibles de contenir des virus HB ou des antigènes-e, caractérisé par le fait que l'on met en contact lesdits fluides avec une fraction gammaglobulinique contenant en quantité suffisante des anticorps anti-e, ladite fraction étant obtenue au départ de sérum ou de plasma sanguin ou au départ d'extraits placentaires contenant des anticorps anti-e.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on ajoute auxdits fluides la fraction gammaglobu-linique contenant des anticorps anti-e.
Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que l'on fait passer lesdits fluides sur un immunoadsorbant dont la surface est tapissée d'anticorps anti-e.
11. Procédé selon la revendication 8, caractérise par le fait que la fraction gammaglobulinique est constituée par une fraction purifiée d'anticorps anti-e, ladite fraction ayant été
débarassée de tous autres constituants protéiques sanguins normaux, en dehors des gammaglobulines, et de tous contaminants infectieux.
débarassée de tous autres constituants protéiques sanguins normaux, en dehors des gammaglobulines, et de tous contaminants infectieux.
12. Procédé selon la revendication 8, caractérisée par le fait que la fraction gammaglobulinique est constituée par un plasma entier ou un sérum entier dans lequel on a reconnu la ?sence d'anticorps anti-e.
13. Procédé selon les revendications 8 ou 11, caractérisé par le fait que les gammaglobulines ont subi un traitement destiné à supprimer ou à réduire le pouvoir anti-complémentaire de façon à permettre l'administration par voie intraveineuse.
14. Procédé selon la revendication 8, caractérisé par le fait que la fraction gammaglobulinique est riche en l'un des anticorps anti-e.
15. Procédé selon la revendication 14, caractérisé
par le fait que la fraction gammaglobulinique est riche en l'un des anticorps anti-e1 et anti-e2.
par le fait que la fraction gammaglobulinique est riche en l'un des anticorps anti-e1 et anti-e2.
16. Procédé de préparation d'une composition pharmaceutique pour le traitement des infections aigu?s ou chroniques dues au virus de l'hépatite B, caractérisé par le fait que l'on soumet un sérum, plasma ou extrait placentaire à une analyse pour la présence d'anticorps anti-e, on prépare une fraction gammaglobulinique au départ de sérums, de plasmas ou d'extrait placentaires dans lequels la présence d'anticorps anti-e a été reconnue, et on associe cette fraction gammaglobuli-nique avec un milieu physiologiquement acceptable.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé
par le fait que la fraction gammaglobulinique est soumise à un traitement destiné à la débarasser de tous contaminants infectieux.
par le fait que la fraction gammaglobulinique est soumise à un traitement destiné à la débarasser de tous contaminants infectieux.
18. Procédé selon les revendications 16 ou 17, caractérisé par le fait que la fraction gammaglobulinique est soumise à un traitement destiné à supprimer ou à réduire le pouvoir anti-complémentaire.
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|---|---|
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