CH635242A5

CH635242A5 - Procede de preparation d'antiserums ou anticorps pour usage therapeutique.

Info

Publication number: CH635242A5
Application number: CH254179A
Authority: CH
Inventors: Kurt Baekgaard Osther
Original assignee: Benzon As Alfred
Priority date: 1974-10-30
Filing date: 1975-10-30
Publication date: 1983-03-31
Also published as: FR2289205A1; US4132769A; FI56117B; NO753638L; AU8609475A; DE2548636A1; FI56117C; NZ179095A; FR2289205B1; GB1531762A; SE7512192L; JPS5191322A; FI753025A; AU518663B2; CA1083037A; BE835020A; NL7512678A

Description

La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'antisérums et anticorps pour usage thérapeutique.

Le procédé selon l'invention est caractérisé en ce que l'on administre à un animal non humain un vaccin l'immunisant contre Cl IAC et en ce que l'on récolte ensuite du sérum de l'animal ainsi immunisé. Dans le sérum ainsi obtenu, les antisérums et anticorps peuvent être marqués avec un radio-isotope, sont chimiquement liés à un cytostatique ou sont immobilisés dans une matrice.

L'aspect important de l'invention repose sur le principe de l'utilisation d'anticorps dirigés de façon spécifique contre les protéines bloquantes et masquantes, en particulier le Cl IAC, associées aux affections cancéreuses de l'homme et présentes sur les membranes des cellules cancéreuses.

Le Cl IAC est une protéine associée au cancer de l'homme que l'on peut isoler des humeurs des patients cancéreux, y compris du sérum et des cellules malignes des cancers humains, ainsi que des cultures cellulaires. En répétant des cycles de culture et de récolte de cellules, on a isolé le Cl IAC des milieux de culture, ce qui indique que les cellules cancéreuses elles-mêmes sont capables de produire le Cl IAC.

Le Cl IAC s'est révélé posséder des propriétés biologiques semblables à celles de l'inactivateur du composant Cl du complément humain (qu'on appelle également inhibiteur de la Cl estérase) qui est une a2-neuramino glycoprotéine qu'on rencontre dans les humeurs de diverses espèces, y compris de l'homme [Pensky et al., « J. Biol, Chem.», 236,1674 (1961); Ratnolf et al., «J. Exp. Med.», 129, 315, Pensky et al., «Science», 163, 698 (1969); Nagaki et al., «Int. Arch. Allerg.», 46,935 (1964)], mais n'est pas identique, en ce qui concerne la chimie des protéines, à l'inactivateur du composant Cl du complément humain.

Ci-après, on appelle Cl IA, l'inactivateur du composant Cl du complément humain (inhibiteur de la Cl estérase), tandis qu'on utilise dans divers contextes le terme inactivateur du Cl pour désigner le groupe constitué par le Cl IAC et le Cl IA.

Le Cl IAC s'est révélé posséder des propriétés biologiques semblables aux propriétés du Cl IA, y compris l'effet d'inhibition sur l'activation initiale par le composant Cl du complément humain de C4 et C2 (c'est-à-dire, une inhibition de l'effet d'hydrolyse de la Cl estérase, l'inactivation de la fibrinolysine et l'absence d'effet sur le temps de coagulation du plasma (cette absence d'effet étant commune au Cl la et au Cl IAC). Selon le principe sur lequel repose l'invention, il semble que ces effets inhibiteurs du CI IAC jouent un rôle important dans la défense des cellules cancéreuses contre la destruction par le système immunitaire humain.

On a décrit, dans la littérature, la présence d'une protéine semblable au Cl IA sur les membranes des cellules cancéreuses humaines [voir, par exemple, Osther, K., Hojgaard, K., et Dybkjaer, E., «Acta neural. Scand.» (1974), 50,681 ; Osther, K., «The Lancer», 2mars 1974), p. 359; Osther, K., Linnemann, R., «Acta path. microbiol.

scand.» (1973), 81, p. 365). Or, grâce à l'invention, il est maintenant possible d'isoler et de caractériser cette protéine semblable au Cl IA associé au cancer humain et, comme précédemment indiqué, on a découvert qu'elle constituait une nouvelle protéine qui n'est pas identique au Cl IA. Des réalisations importantes reposent sur ces découvertes.

Le Cl IAC est une a neuraminoglucoprotéine (essentiellement a2) ayant une constante de sédimentation S20 x W = 6,2 S. La carac-térisation complète du Cl IAC le distinguant du Cl IA et d'autres protéines connues figure dans la partie ci-après intitulée «Caractéri-sation du Cl IAC». Par focalisation isoélectrique sur LKB Multi-phor, on observe deux bandes séparées par focalisation dans un composé de type ampholine du Cl IA et du Cl IAC purifiés, le composé de type ampholine étant une plaque de PAG (dénomination commerciale) utilisée pour l'électrofocalisation en couche mince sur gel de Polyacrylamide, avec un gradient de pH compris entre 4,0 et 8,6, en opérant pendant 2 h en refroidissant à 0°C avec une tension de 500 V et un courant de 50 mA. Après électrophorèse, on découpe le gel de Polyacrylamide et on le dispose selon un angle de 90° par rapport à un gel d'agarose à 2% dans du tampon véronal ayant une force ionique de 0,02, à pH 8,6 à 18° C pendant 12 h, ce gel d'agarose renfermant de l'anti-Cl IA humain de lapin. On obtient ainsi deux lignes de précipitation qui ne se croisent pas, tandis que dans des essais identiques, en utilisant un antisérum oligospécifique dirigé contre à la fois le Cl IA et le Cl IAC, préparé sur du porc Dansk Landrace (Da-nish Landrace), un porc obtenu par croisement de la race Yorkshire et de la race Dansk Landrace, ou du mouton de type Texel (Jysk He-derace) ou des moutons d'élevage mixte avec mélange de la race Shropshire et Oxford Down, on obtient deux lignes de précipitation qui se croisent.

Cela montre que, du point de vue immonologique, le lapin n'est pas capable d'établir la distinction entre le Cl IA et le Cl IAC, tandis que les autres animaux cités sont capables de reconnaître que les deux protéines ne sont que partiellement identiques. Le fait que l'an-tisérum de lapin ne soit pas capable d'établir la distinction entre le Cl IAC et le Cl IA joue un rôle important dans l'invention et mérite donc d'être souligné.

Dans la suite de la description, il est important de se rappeler qu'une réponse dans des essais immunologiques reposant sur la réaction avec l'anti-Cl IA humain de lapin (qui est un réactif du commerce) constitue une réponse relative à l'inactivateur du Cl, c'est-à-dire en d'autres termes, une réponse à la somme de Cl IAC et de Cl IA.

On a isolé le Cl IAC de milieux de culture de divers types de cellules humaines, y compris les carcinomes qu'elle qu'en soit l'origine, des sarcomes de type réticulolymphosarcomes, et de certains types de leucémies, à savoir la leucémie myéloïde chronique et lamyéloma-tose, et les Cl IAC préparés à partir de ces cellules se sont révélés identiques au point de vue immunochimique.

On peut utiliser divers procédés pour isoler et purifier le Cl IAC. Tous les procédés utilisables présentent le caractère commun de constituer des techniques de séparation destinées à l'isolement et à la purification d'une matière de type pseudoglobuline, ayant lçs propriétés décrites sous le titre «Caractérisation du Cl IAC» àpartir du milieu où elle se trouve. Les procédés appropriés utilisent des techniques d'adsorption et de filtration sur gel qui sont bien connues des spécialistes. Comme on a montré qu'on peut préparer le Cl IAC à partir du milieu de culture de cellules cancéreuses humaines, également qu'on ne peut pas utiliser de Cl IA des milieux de culture de ces cellules cancéreuses humaines, un procédé ne prêtant à aucune équivoque pour concentrer, isoler et purifier le Cl IAC consiste à utiliser des techniques d'adsorption et de filtration sur gel avec une détermination immunologique concomitante en utilisant l'anti-Cl IA humain de lapin pour obtenir, à partir des milieux de culture des cellules cancéreuses du type précité, une protéine réagissant du point de vue immunologique avec l'anti-Cl IA humain de lapin. Dans ces opérations, on doit prendre soin d'éviter des pH inférieurs à 5,5 et supérieurs à 10,5 et de chauffer à des températures supérieures à 56° C, car

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on a constaté (voir la partie «Caractérisation du Cl IAC»), que ces conditions altèrent les propriétés biologiques du Cl IAC. Pour mettre au point un procédé approprié de concentration et purification du Cl IAC, le spécialiste utilisera également d'autres caractéristiques figurant sous le titre «Caractérisation du Cl IAC», tel le poids moléculaire évalué du C1 IAC qui est de 110 000 à 130 000. On peut mettre en évidence la présence du Cl IAC dans une matière quelconque en utilisant des tests immunologiques avec des anticorps ou des antisérums réagissant avec le Cl IAC, cette réaction étant facile à distinguer des réactions obtenues avec d'autres protéines, y compris le Cl IA. La préparation de ces anticorps ou antisérums est décrite ci-après. Des procédés appropriés de concentration, d'isolement et de purification du Cl IA utilisent des techniques de Chromatographie par adsorption sur colonne et de filtration sur gel.

Il convient de noter que l'on a constaté que le Cl IA et le Cl IAC ne réagissent pas avec les anticorps présentant une spécificité vis-à-vis d'autres antigènes connus, en particulier ne réagissent pas avec les anticorps dirigés contre les antigènes oncofœtaux et, en particulier, avec les antigènes dirigés contre l'ai fœtoprotéine, ou la protéine CEA.

Un procédé préféré de préparation du Cl IAC à partir d'un milieu le renfermant est décrit sous le titre «Préparation du Cl IAC» et comporte une Chromatographie d'adsorption sur colonne suivie d'une filtration sur gel. On préfère comme colonne pour effectuer la Chromatographie d'adsorption sur colonne une résine échangeuse d'anion tel le Dowex 2 x 8, en grains mesurant 38 à 74 |x, et un gel préféré pour la filtration sur gel est un gel de dextrane tel que le Sé-phadex (dénomination commerciale) G 75 Superfine. Cette préparation utilise également des techniques classiques, telles que la dialyse et la lyophilisation qu'on effectue aux stades appropriés.

Le milieu à partir duquel on concentre, isole et purifie le Cl IAC peut être un milieu de culture de cellules cancéreuses humaines productrices de Cl IAC, ou une humeur telle que le sérum ou un épan-chement pleural ou de l'ascite d'un patient atteint d'un cancer producteur de Cl IAC. Comme précédemment indiqué, le milieu de culture des cellules cancéreuses ne renferme pas de Cl IA, tandis qu'on trouve le Cl IA associé au Cl IAC dans les humeurs des patients humains cancéreux. Dans la plupart des utilisations pratiques du Cl IAC, la présence de Cl IA dans le milieu de départ utilisé ne pose pas de problème grave, car les isolats renfermant du Cl IA en plus du Cl IAC sont utiles en soi, comme indiqué ci-après.

Pour cultiver des cellules cancéreuses pour produire du Cl IAC, on peut utiliser le milieu minimal essentiel de Eagle et le milieu synthétique RPMI renfermant des aminoacides (voir la Publication 73/ 74 de Flow Laboratories, Irvine Ayrshire, K.A. 12 8 NB, Ecosse), mais on peut également utiliser tout autre milieu permettant de cultiver les cellules cancéreuses. On a constaté que l'on obtient les meilleurs rendements en Cl IAC lorsque le milieu de culture est additionné d'une quantité de glutamine supérieure à environ 285 mg/1, et de préférence supérieure à 290 mg/1. En pratique, la quantité ajoutée optimale de glutamine est d'environ 294 mg/1, et l'addition de quantités plus importantes ne semble pas apporter d'avantages complémentaires.

Les procédés habituels de culture des cellules cancéreuses utilisent une phase de croissance dans le milieu essentiel minimal de Eagle enrichi en glutamine et une phase de production dans le milieu RPMI enrichi de glutamine. Chaque phase peut durer quelques jours, par exemple 3 à 7 d; en pratique, on préfère 3 d.

Comme précédemment indiqué, le Cl IAC semble jouer un rôle important dans la défense des cellules cancéreuses contre la destruction par le système immunitaire humain. Le Cl IAC, qui est une sia-loprotéine (neuraminoglycoprotéine), possède une faible antigénicité, et il semble que le Cl IAC, avec les autres protéines que l'on trouve dans les milieux de culture des cellules cancéreuses et dans les humeurs des patients cancéreux, en particulier l'orosumucoïde, l'a2HS glycoprotéine et la Zn a2 glycoprotéine (connue également sous l'ancien nom de Zn a3 glycoprotéine), masquent les cellules cancéreuses dans l'identification comme «non-auto» par le système immunitaire humain. De plus, comme précédemment indiqué, le Cl IAC est capable d'inhiber l'activation de C4 par Cl, et il semble que ce soit là une des raisons principales expliquant le fait que les cellules cancéreuses ne soient pas attaquées de façon efficace par le système immunitaire.

Autrement dit, la capacité qu'ont les cellules cancéreuses à produire du Cl IAC comme protéine de membrane peut être une des raisons principales expliquant pourquoi ces cellules cancéreuses sont capables de bloquer la branche afférente et la branche efferente de la réponse immunitaire. La branche afférente est apparemment bloquée essentiellement par l'effet de masquage du Cl IAC (effet symbody) et la branche afférente semble être bloquée à la fois au niveau de la défense immunitaire humorale et de la réponse immunitaire cellulaire, le premier blocage étant un blocage du système complémentaire au stade précité, et le second pouvant être attribué à la charge électrique fortement négative de la membrane des cellules cancéreuses à la suite de la présence du Cl IAC chargé négativement et des autres composés sialo fortement chargés négativement, qui repoussent les lymphocytes chargés négativement.

La fig. 1 représente schématiquement le système complémentaire humain et l'action de blocage et d'inhibition de l'inactivateur du Cl. Lorsqu'une réaction complémentaire a été amorcée par le fragment Fc d'une immunoglobuline, le Cl activé, lors d'une réaction ou cascade complémentaire normale, active le composant C4 et C2 du complément et la réaction se poursuit jusqu'au point final avec une lyse de la matière «non-auto» ou de l'antigène avec lequel l'immunoglu-buline a réagi, mais l'inactivateur du Cl peut inhiber l'activation de C4 par Cl, auquel cas C4 n'est pas fixé à l'antigène, et les réactions complémentaires ultérieures ne s'effectuent pas.

Les humeurs des sujets humains sains renferment du Cl IA comme régulateur obligatoire du système complémentaire. Il est bien établi que l'effet régulateur du Cl IA dans les organismes sains (cet effet régulateur se manifestant par l'inhibition de Clr et de Cls, s'ac-compagnant d'inactivation de C4 par Cl) est lié à la concentration du Cl IA et que, normalement, l'effet d'inactivation du Cl IA sur la molécule de Cl est limité à l'inactivation de l'excès d'activation de Cl qui provoquerait sinon une réaction complémentaire en cascade dans le sérum, produisant un œdème de Quincke. Les valeurs normales du Cl IA dans le sérum ne dépassent pas 40 à 50 mg%. Selon l'invention, on a découvert que les patients présentant des affections cancéreuses confirmées ont souvent des teneurs sériques anormalement élevées en inactivateur du Cl, cet accroissement étant probablement at-tribuable en totalité au Cl IAC présent dans le sérum.

Pour évaluer dans quelle mesure les patients atteints d'un cancer confirmé ont des teneurs élevées en inactivateur du Cl (Cl IA + Cl IAC), on a étudié la concentration sêrique de l'inactivateur du Cl, selon la technique rocket de Laurell avec de l'anti-Cl IA humain de lapin, chez cent patients porteurs de cancers d'origines diverses, tels que des carcinomes, des sarcomes, des lymphomes et des leucémies. Dans les expériences témoins, on a étudié de façon semblable le sérum de sujets sains et de sujets atteints d'affections non malignes confirmées. Les résultats sont illustrés par la fig. 2. On voit que les valeurs moyennes de l'inactivateur de Cl des sujets sains sont bien inférieures à celles des patients atteints d'un cancer. En outre, les patients atteints de maladies non malignes ont des teneurs en inactivateur du Cl dont les valeurs moyennes sont bien inférieures à celles des patients cancéreux et qui sont voisines de la gamme normale. Il semble que l'élévation de la concentration de l'inactivateur du Cl dans le sérum des patients atteints de cancer soit essentiellement due à la présence du Cl IAC libéré par les clones des cellules cancéreuses. On a vérifié selon la technique d'Ouchterlony que chez les cancéreux ayant des teneurs élevées en inactivateur du Cl, on observe des lignes de précipitation pour le Cl IA et le Cl IAC, tandis que, pour les patients atteints d'affections non malignes et pour les sujets sains, on n'observe pas la présence de Cl IAC (les deux déterminations étant effectuées avec de l'anti-Cl IA/C1 IAC humain de mouton oligospécifique). Un exemple typique d'examen du sérum selon la technique d'Ouchterlony de ce type est illustré par la fig. 3.

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L'évaluation de la teneur du composant C4 de complément, effectuée sur les mêmes groupes de patients, montre presque les mêmes valeurs moyennes pour les sujets sains et les patients atteints d'affections non malignes, tandis que les patients atteints de cancer ont des teneurs nettement supérieures en C4, comme le montre la fig. 2.

On a constaté que les valeurs de l'inactivateur du Cl (Cl IA + Cl IAC) supérieures à environ 50 mg% (50 mg/100 ml) (ces valeurs étant déterminées par électrophorèse de type rocket avec de l'anti-Cl IA humain de lapin) coïncident souvent avec une élévation de C4, ce qui indique que le système complémentaire est bloqué au stade C4, c'est-à-dire au stade où l'activation de C4 par Cl devrait se produire avec consommation concomitante de C4 (C4 activé devenant fixé aux membranes des cellules à lyser par le système complémentaire). Des études portant sur des cancers à évolution progressive ont montré que l'inactivateur du Cl et le C4 s'élèvent en continu jusqu'à la mort du patient. On a également constaté que les valeurs en phase subterminale et terminales du C4 atteignent jusqu'à 160 mg%, et que les valeurs de l'inactivateur de Cl atteignent environ 120 mg%. Dans le sérum de certains patients atteints de cancer confirmé avec de petits clones de cellules cancéreuses primaires, on a relevé des valeurs d'environ 40 à 50 mg% d'inactivateur de Cl (Cl IA + Cl IAC), sans aucun signe d'élévation anormale des teneurs de C4; cependant, lorsque ces patients ont subi une intervention chirurgicale, les teneurs de l'inactivateur de Cl soit déclinent après une période d'environ 3 semaines et demeurent dans la gamme normale, tandis que de façon concomitante C4 demeure dans la gamme normale (ce qui indique que l'intervention radicale a été couronnée de succès), soit s'élèvent en même temps que C4. L'explication de ce dernier phénomène peut être qu'une intervention radicale peut avoir provoqué une élévation de la concentration sérique de l'inactivateur de Cl par libération de Cl IAC par les cellules cancéreuses endommagées et par des cellules cancéreuses entraînées dans la circulation sanguine, cet accroissement de la concentration de l'inactivateur de Cl bloquant le système complémentaire, comme précédemment décrit.

En s'appuyant sur l'explication qui précède, on voit que l'on peut obtenir un accroissement important des chances de traitement efficace du cancer en neutralisant l'inhibition de la réponse immunitaire qui se produit lors d'un cancer, c'est-à-dire en supprimant le blocage de la défense immunitaire, démasquant les cellules cancéreuses de façon qu'elles soient plus facilement reconnues par l'immuno-surveillance du système immunitaire humain. Le présent procédé permet d'obtenir ce déblocage et ce démasquage.

Comme précédemment indiqué, le système immunitaire de certains animaux, y compris les races et les types de porcs et de moutons précités, est capable d'établir la distinction entre le Cl IA humain et le Cl IAC humain lorsqu'on les introduit sous forme d'antigènes dans l'organisme de l'animal et est capable de produire des anticorps ayant des déterminants présentant une spécificité vis-à-vis du Cl IAC. Donc, un aspect important de l'invention concerne des antisérums ou des anticorps présentant une spécificité vis-à-vis du Cl IAC. On peut produire ces antisérums en immunisant des animaux susceptibles d'immunisation sélective, tels que les porcs ou les moutons, correspondant par exemple aux types et aux races précités, avec des vaccins renfermant du Cl IAC comme composant antigénique, et en recueillant le sérum des animaux immunisés.

L'effet des antisérums ou des anticorps de l'invention est expliqué plus en détail ci-après. Pour simplifier, on utilise l'abréviation INA (immun antisérum de neutralisation et de déblocage) pour désigner à la fois les antisérums ayant une spécificité vis-à-vis de Cl IAC et éventuellement vis-à-vis de Cl IA, de l'orosomucoïde, de l'a2HS glycoprotéine et de la Zn a2 glycoprotéine, ainsi que les fractions d'im-munoglobuline correspondante plus concentrée et purifiée.

Les anticorps anti-Cl IAC humains réagissent avec le Cl IAC sur la membrane des cellules cancéreuses, selon une réaction antigène/ anticorps. Par exemple, on peut mettre en évidence l'interaction entre l'INA et les cellules cancéreuses en marquant l'INA (par exemple avec de l'isothiocyanate de fluorescêine) et en incubant les cellules cancéreuses humaines avec l'INA marqué. Les cellules cancéreuses présentent un marquage positif. Les cellules de la même culture préincubées avec de la neuraminidase ne présentent aucun marquage après incubation avec l'antisérum INA marqué, ce qui indique que les déterminants antigéniques du Cl IAC sont décomposés par la neuraminidase. Lorsque l'INA bloque les déterminants du Cl IAC sur les membranes des cellules cancéreuses, les cellules cancéreuses deviennent accessibles à l'attaque par le système de défense immunitaire humoral humain, ce qu'on peut mettre en évidence par exemple de la façon suivante: on incube des cellules cancéreuses humaines avec de l'INA, puis on incube avec le sérum du même patient ou d'autres patients atteints du même type de cancer. Après une incubation par exemple de 6 h, les cellules cancéreuses se détachent du flacon de culture, et après 18 h par exemple, toutes les cellules cancéreuses sont mortes. Des cellules de mésothélium et des fibroblastes traités de la même façon continuent à se développer dans les flacons de culture, sans que l'incubation les gêne, et, dans des cultures témoins sans incubation avec l'INA, l'incubation avec le sérum n'affecte pas les cellules cancéreuses. Cela prouve que le Cl IAC se comporte comme un facteur inhibiteur et participe au blocage de l'action anticancéreuse du système immunitaire, et qu'également l'INA est capable de neutraliser in vitro cet effet de blocage. Lorsqu'on neutralise in vitro le Cl IAC par l'INA, son effet d'inhibition sur l'activation de C4 par Cl est neutralisé si bien que le blocage de l'action du système immunitaire cesse, C4 se fixe aux membranes des cellules cancéreuses et l'action ultérieure du système complémentaire se produit provoquant la lyse des cellules cancéreuses; après l'activation de C4, la réaction complémentaire ne peut être arrêtée par Cl IA ou Cl IAC, comme le montre la fig. 1.

Une autre façon de mettre en évidence l'effet cytotoxique in vitro de l'INA du sérum du même patient et des lymphocytes isolés dirigés contre ses cellules cancéreuses cultivées ou ses cellules leucémiques consiste à utiliser le procédé décrit par Hirschberg, H. et al., «Nature» 255, 62 (1975), dans lequel on incorpore du 51Cr au cytoplasme des cellules cancéreuses ou leucémiques. La libération du slCr dans le milieu où incube les cellules néoplasiques avec de l'INA, du sérum du même patient et des lymphocytes (isolés selon la méthode utilisant l'Isopaque Ficoll décrite par Osther, K. et Dybkjaer, E. in «Scand. J. HaematoL», 13,24,1974), est mesurée à l'aide d'une technique de scintillation. On a constaté que la cytolyse des cellules cancéreuses est accrue lorsque l'on soumet les cellules en plus de l'incubation avec l'INA à une incubation avec le système de défense immunitaire humoral et le système de défense immunitaire cellulaire.

Les détails expérimentaux figurent ci-dessous;

Réactifs: Immunoglobuline d'INA de porc, préparée comme décrit sous le titre «Vaccination des animaux hôtes». slCr sous forme de Na2Cr04 fabriqué par Behringuerke.

Méthodes: On utilise des cellules leucémiques humaines. On isole des cellules néoplasiques et des lymphocytes du même patient, on prépare du sérum frais du même patient, on isole les lymphocytes d'un donneur, on prépare du sérum frais du donneur en choisissant un donneur ayant le même groupe ABO que le patient; de plus, on vérifie que le sérum du patient ne renferme pas d'anticorps leucocytaires dirigés contre les leucocytes du donneur. Si l'on trouve chez le patient des anticorps leucocytaires dirigés contre les leucocytes du donneur, on doit choisir un autre donneur tel que le patient n'ait pas d'anticorps leucocytaires dirigés contre ces leucocytes.

Témoin négatif: Cellules leucémiques marquées au slCr dans le milieu essentiel minimal de Eagle.

Témoin positif: Il correspond à une cytolyse de 100% (c'est-à-dire une cytolyse des cellules normales et des cellules cancéreuses) obtenue par addition de Cétavlon à des cellules marquées au 51 Cr.

Matière étudiée: On prélève au patient du sang veineux dans 3 tubes de verre contenant du citrate ou de l'héparine et 1 tube de verre sans additif. On prélève le sang veineux du donneur dans 2 tubes de verre renfermant du citrate ou de l'héparine et 1 tube sans additif.

Préparation des cellules leucémiques et des cellules normales ( = lymphocytes) : On opère selon la méthode utilisant le Ficoll-Isopaque.

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Marquage des cellules leucémiques (et des lymphocytes normaux éventuellement présents).

Marquage des lymphocytes du donneur: A environ 2 x 108 cellules, on ajoute 200 n-C de 5 'Cr + 1 ml de milieu essentiel minimal de Eagle, on agite le mélange, puis on l'incube au bain-marie à 37° C pendant 30 min. On lave ensuite les cellules 4 fois jusqu'à ce qu'il n'y ait pratiquement plus de libération de 5 'Cr. On effectue les lavages avec du sérum physiologique salé ou de milieu essentiel minimal de Eagle.

Tests d'incubation: On incube les cellules tout d'abord avec 0,2 ml d'immunoglobuline d'INA (lorsqu'il convient), puis avec 0,1 ml de sérum et 0,1 ml de suspension de lymphocytes (lorsqu'il convient) (en décantant le surnageant des lymphocytes qu'on remet en suspension dans 2,0 ml de milieu essentiel minimal de Eagle). Toutes les cuves renferment le même volume de 1,4 ml; pour obtenir le même volume, on rajoute du milieu essentiel minimal de Eagle.

On ajoute au milieu essentiel de Eagle 100 unités de pénicilline G et 10 |ig de streptomycine/ml.

On ajoute au témoin positif 0,4 ml de Cétavlon et 1 ml de cellules marquées.

On ajoute au témoin négatif 0,4 ml de milieu essentiel minimal de Eagle et 2 ml de cellules marquées.

On effectue l'incubation pendant environ 18 h à 37° C.

Mesure: Lorsque l'incubation est achevée, on centrifuge les échantillons pendant 10 min à 1800 tr/min. On détermine ensuite dans des fractions de 1 ml de surnageant la quantité de 5'Cr libéré, en utilisant un compteur à scintillation. On corrige les comptages de la valeur du bruit de fond.

Avant de prélever le surnageant, on détermine les comptages de la totalité du contenu (1,4 ml).

Résultats:

1. Patient atteint de myélomatose. Comptage après incubation, en cpm.

Sur 1,4 ml (contenu total du tube)

Sur 1 ml de surnageant

Réduction (%)

Témoin négatif

1697

539

32

Témoin positif

1572

901

57

INA + sérum du patient

1613

804

50

INA + sérum du donneur

2033

884

44

-INA + sérum du patient

1600

521

33

-INA + sérum du donneur

1719

578

34

Les résultats montrent que l'addition d'immunoglobuline d'INA accroît la cytolyse par rapport aux expériences où l'on n'ajoute pas d'immunoglobuline d'INA.

2. Patient souffrant de leucémie myéloïde chronique. Comptage après incubation, en cpm.

Sur 1,4 ml (contenu total du tube)

Sur 1 ml de surnageant

Réduction (%)

Témoin négatif

2155

587

27

Témoin positif

2190

1404

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INA + lymphocytes du donneur

4- sérum du donneur

2104

668

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-INA + lymphocytes du donneur

+ sérum du donneur

2220

452

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INA + lymphocytes du patient

+ sérum du patient

2141

903

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Sur 1,4 ml (contenu total du tube)

Sur 1 ml de surnageant

Réduction (%)

-INA + lymphocytes du patient

+ sérum du patient

2040

610

30

INA + sérum du donneur

2100

830

40

-INA + sérum du donneur

2106

710

34

INA + sérum du patient

2149

809

38

-INA + sérum du patient

2102

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Les expériences in vitro précédemment décrites montrent que le sérum du patient renferme des anticorps dirigés contre les propres cellules néoplasiques du patient et montre également l'effet cytotoxi-que exercé à la fois par le système immunitaire humoral et le système immunitaire cellulaire (le système immunitaire cellulaire étant constitué par les lymphocytes et les monocytes isolés selon la méthode utilisant le Ficoll-Isopaque. Le fait que le sérum du patient renferme des anticorps dirigés contre les cellules néoplasiques peut sembler paradoxal puisqu'on a précédemment indiqué que les cellules cancéreuses inhibent la branche afférente de la défense immunitaire en se masquant elles-mêmes avec le Cl IAC et d'autres protéines d'antigénicité extrêmement faible, mais de nombreuses raisons expliquent qu'un certain taux d'anticorps dirigés contre les protéines des cellules cancéreuses puisse être présent, ces raisons étant par exemple des facteurs d'équilibre et de concentration chimique, la libération des protéines des cellules cancéreuses à partir des cellules cancéreuses, y compris cellules cancéreuses mourantes ou nécrotiques, ou qui ont éclaté sous l'effet de la chirurgie, de l'irradiation, d'un traitement cytostatique, etc. Ces expériences ne permettent pas de déterminer si au départ il existe un certain attachement d'immunoglobulines à la surface des cellules cancéreuses. En tous cas, la présence d'INA avec essentiellement le système de défense immunitaire provenant du patient cancéreux et également le système immunitaire dérivant du donneur (source de complément) provoque une cytolyse importante des cellules néoplasiques. De plus, on peut admettre que seule une certaine proportion du nombre total des cellules incubées comme décrit est cytolysée, comme le montre la comparaison avec la cytolyse obtenue avec le Cétavlon, ce qui semble indiquer que les cellules non malignes survivent au traitement par l'INA.

Lorsqu'on utilise des cellules non malignes au lieu de cellules néoplasiques, on ne constate pas de cytolyse notable lors de l'incubation avec l'INA.

Selon l'invention, on peut donc lutter contre les cellules cancéreuses en diminuant leur nombre par administration in vivo d'INA à des patients cancéreux. Divers résultats montrent que dans les systèmes biologiques bien plus complexes présents in vivo, l'INA est capable d'avoir des activités semblables à celles mises en évidence in vitro.

L'invention fournit des procédés et des produits pour le traitement des cancers par immunisation passive contre les protéines effectuant le masquage des cellules cancéreuses et le blocage du système de défense immunitaire, ce principe étant totalement nouveau, non seulement en thérapeutique anticancéreuse, mais, semble-t-il, de façon générale en médecine.

Parmi les effets qu'on a observés après administration d'INA à des patients cancéreux, on peut citer:

1) Une diminution de la concentration sêrique de l'inactivateur du Cl (somme de Cl IAC + Cl IA, mesurée avec un antisérum n'établissant pas de distinction entre le Cl IAC et le Cl IA, tel que l'anti-Cl IA humain de lapin) et une diminution de la concentration sérique du Cl IAC mesuré avec un antisérum anti-Cl IAC monospécifique. Bien entendu, dans le cas où on utilise un INA monospécifique vis-à-vis de Cl IAC, on doit présumer que la diminution résulte de façon spécifique de la neutralisation du Cl IAC mais, comme précédemment indiqué, on préfère utiliser de l'INA renfermant à la fois de l'anti-Cl IAC et de l'anti-Cl IA.

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Cette diminution de l'inactivateur du Cl apparaît généralement après une augmentation initiale rapide.

2) Une diminution de 1a concentration sérique de C4.

De plus, on a noté diverses manifestations de rémission, telles qu'une diminution de la masse tumorale et dans certains cas une disparition totale des cellules cancéreuses. Cependant, les deux teneurs précitées de l'inactivateur du Cl — et en particulier du Cl IAC — et du C4 constituent des indications importantes et faciles à déterminer de l'évolution de l'affection avant, pendant et après l'administration de l'INA et, de plus, de tous les types de thérapeutique anticancéreuse, comme précédemment indiqué. Une autre manifestation de rémission qu'on observe est le fait que la faible teneur (faible pourcentage) des lymphocytes T qu'on observe souvent chez les patients atteints de cancer, en particulier lors d'un traitement par des agents cy-tostatiques ou par irradiation, reprend des valeurs normales en quelques semaines après le début du traitement par l'INA.

La préparation d'anticorps spécifiques dirigés contre le Cl IAC, selon l'invention, permet également d'établir un diagnostic de cancer sans ambiguïté. Le diagnostic ainsi formulé repose sur la détermination de la présence ou de l'absence de Cl IAC dans les humeurs humaines et, en particulier pour des raisons pratiques, dans le sérum humain. Selon l'invention, on détermine la présence ou l'absence de Cl IAC dans un échantillon en soumettant l'échantillon à une réaction immunologique avec l'anti-Cl IAC humain dans des conditions telles que le résultat de la réaction immunologique soit facile à distinguer de la réponse due à la présence du Cl IA dans l'échantillon.

Cela signifie que l'antisérum INA et d'autres matières renfermant des anticorps ou autres substances ou dérivés correspondant à l'activité immunologique constituent des composés de diagnostic extrêmement utiles. L'application de l'invention au diagnostic est décrite en détail ci-après.

Pour préparer les antisérums selon l'invention, il est important d'utiliser des animaux hôtes dont le système immunitaire est capable d'établir la distinction entre le Cl IAC et le Cl IA, c'est-à-dire capable de former des anticorps spécifiques dirigés contre le Cl IAC et des exemples de tels animaux ont été précédemment cités. Il convient de noter que toutes les races et tous les types de porcs et de moutons ne semblent pas capable de produire des antisérums utiles de l'invention. Par exemple, un porc de la race Yorkshire pure ne permet pas d'obtenir un titre convenable en anticorps. Les lapins et les petits rongeurs ne sont pas capable d'établir la distinction entre le Cl IAC et le Cl IA. D'autre part, il semble possible que des races ou des types de chevaux et de vaches soient capables d'établir la distinction entre le Cl IAC et le Cl IA et de produire des titres convenables en anticorps. On sait généralement que les chevaux et les vaches sont des animaux permettant d'obtenir une bonne production d'antisérum que l'on peut ponctionner plusieurs fois, tandis que les porcs ne peuvent être ponctionnés et sont généralement saignés. Selon les principes de l'invention, l'animal hôte utilisé pour préparer un antisérum INA de l'invention est un animal hôte donnant une réponse spécifique vis-à-vis du Cl IAC. De plus, l'animal hôte doit de préférence avoir des anticorps qui sont généralement bien tolérés par l'homme. A cet égard, on préfère utiliser comme animaux hôtes les porcs, car en particulier les immunoglobulines IgG pures du porc (pratiquement non agrégées et pratiquement dépourvues d'autres protéines de porc) sont parfaitement tolérées par l'homme et on peut, apparemment, les considérer comme non hétérogènes pour l'organisme humain. Apparemment, les immunoglobulines IgG pures du porc ne sont pas fortement amenées au foie ni décomposées dans celui-ci, comme c'est le cas des protéines hétérogènes.

Des détails complémentaires relatifs à la préparation des antisérums et anticorps de l'invention figurent sous le titre «Vaccination des animaux hôtes» ci-après.

Les vaccins utilisés doivent avoir une composition telle qu'ils produisent un titre élevé en anticorps dans l'animal hôte utilisé, y compris un titre élevé en anti-Cl IAC humain. Les vaccins qu'on préfère pour préparer les antisérums chez le porc et le mouton figurent ci-après sous le titre «Vaccination des animaux hôtes», et la préparation des composants actifs des vaccins figure sous les titres «Préparation du Cl IAC», «Purification du Cl IAC/C1 IA à partir du fluide pleural/ascite de patients cancéreux» et «Purification du Cl IA/C1 IAC renfermant de l'orosomucoïde, de l'a2HS glycoprotéine et de la Zn a2 glycoprotéine du liquide pleural et de l'asci te» figurant ci-après.

Les antisérums produits comme précédemment décrits sont caractérisés par le fait qu'ils renferment de l'anti-Cl IAC humain, c'est-à-dire des anticorps capables de réagir de façon spécifique avec les déterminants du Cl IAC. On peut mettre en évidence cette réaction spécifique selon divers procédés immunologiques connus. En principe, on pourrait soumettre les anticorps spécifiques anti-Cl IAC humains, tels que l'IgG anti-Cl IAC humain, à des traitements bien connus de séparation des anticorps conservant la spécificité des anticorps, par exemple pour produire les fragments F(ab)2 correspondants. Selon le traitement de séparation utilisé, les anticorps peuvent ou non conserver leur aptitude à provoquer une réaction du système complémentaire. En principe, ces modifications, dérivés ou fragments des anticorps selon l'invention ayant conservé leur aptitude spécifique à bloquer les déterminants Cl IAC sont utiles pour le traitement et le diagnostic du cancer étant donné leur capacité de marquer les cellules cancéreuses, d'identifier le Cl IAC et de neutraliser l'activité bloquante de Cl IAC. Par conséquent, les anticorps, fragments d'anticorps, dérivés d'anticorps ou modifications des anticorps de l'invention peuvent être considérés comme des anticorps, fragments, modifications ou dérivés d'anticorps capables de réagir avec des cellules cancéreuses cultivées, de telle sorte que les cellules cancéreuses incubées avec de l'anti-Cl IAC marqué ou des fragments, modifications ou dérivés marqués correspondants présentent un marquage positif, tandis que les cellules de la même culture préincubées avec de la neuraminidase ne présentent aucun effet de marquage après incubation de la matière marquée, et que la présaturation avec de l'antisérum non marqué dirigé contre le Cl IAC suivie d'une incubation avec l'immunoglobuline marquée, une fraction d'immunoglobuline marquée, un dérivé d'immunogluboline marquée ou une modification d'immunoglubuline marquée selon le procédé décrit dans «Acta path. microbiol. scand.», Section B, 81,365-372 (1973), ne provoque aucun marquage des cellules cancéreuses. On peut citer comme exemples de modifications des anticorps selon l'invention les anticorps IgG à marquage isotopique (de préférence marqués avec un isotope ayant une période brève dans le cas d'une utilisation in vivo pour le diagnostic, à titre d'exemple marqués au technétium) qui, par suite de leur capacité de marquer les cellules cancéreuses, sont utiles dans le domaine du diagnostic pour confirmer la localisation des tumeurs ou des métastases, par utilisation par exemple d'une caméra sensibles aux rayons y, et les anticorps IgG spécifiques du Cl LAC marqués avec un isotope ayant une période quelque peu plus longue, par exemple un émetteur de rayons ß, tel que le 131I, pour l'utilisation en thérapeutique, ou des anticorps IgG spécifiques du Cl IAC combinés chimiquement avec des molécules à activité cytostati-que, par exemple des dérivés formés à partir de cytostatiques connus, ces anticorps spécifiques du Cl LAC, portant un émetteur de rayons ß ou un agent cytostatique, permettant d'utiliser de façon plus efficace et plus sûre les émetteurs de rayons ß ou les agents cytostatiques du fait que ces émetteurs de rayons ß et agents cytostatiques sont apportés sélectivement aux cellules cancéreuses (il convient à cet égard de se rappeler que les cellules normales ne produisent apparemment pas de Cl IAC).

Une composition préférée selon l'invention, utile pour le traitement des cancers humains, consiste en une solution d'IgG de porc, constituée de 1000 mg d'IgG dissous dans environ 200 ml de solution salée isotonique (ou d'une solution équivalente, par exemple une solution isotonique de glucose). En pratique, on peut conditionner ces compositions dans des flacons de 10 ml convenant à la perfusion intraveineuse après dilution dans des quantités habituelles de solution saline isotonique ou d'une solution équivalente. Une autre composition préférée est constituée d'immunogluboline IgG de porc lyophilisée destinée à être reconstituée. Les posologies appropriées sont com6

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prises entre environ 20 et 30 mg d'immunoglobuline/kg de poids corporel du patient et par jour du 1er au 5e jour environ, puis d'environ 10 mg/kg de poids corporel par jour pendant environ 2 à 3 semaines. Dans le cas où le patient commence à produire des anticorps dirigés contre l'immunoglobuline de l'animal hôte qu'il reçoit, on doit lui administrer de la cortisone et mettre en œuvre un traitement du choc anaphylactique. Cependant, on n'a pas constaté de manifestations d'anaphylaxie lors de l'administration d'immunoglobulines IgG de porc, ni après des durées prolongées d'administration intraveineuse avec des arrêts intermittents de 15 d.

Pendant le traitement par l'antisérum ou les anticorps INA, on doit suivre soigneusement le patient, comme décrit sous le titre «Thérapie du cancer avec du sérum immunitaire selon l'invention», et, en particulier, des paramètres importants à surveiller sont les teneurs sé-riques du Cl IAC et du C4. Un traitement couronné de succès doit éliminer le Cl IAC et ramener à la normale la teneur en C4. On préfère selon l'invention ne pas effectuer un traitement simultané avec des agents cytostatiques à cause de l'effet immunosuppresseur de ces agents. D'autre part, si on utilise un traitement cytostatique, on doit de préférence traiter le patient avec l'INA, par exemple pendant les 15 derniers jours du traitement cytostatique, et poursuivre le traitement par l'INA pendant 1 à 2 mois après l'arrêt du traitement par l'agent cytostatique pour ramener à la normale le système immunitaire effondré et, en particulier, rétablir les teneurs normales en lymphocytes T. Cependant, des cytostatiques couplés à l'anti-Cl IAC humain comme support sélectif peuvent être utiles, car on peut les administrer à des doses bien inférieures à celles utilisées pour les cytostatiques classiques.

Pour suivre et régler la teneur en immunoglobulines des patients, on doit en particulier évaluer en continu la valeur en IgG qui reflète à la fois la teneur en sérum en IgG humaine et en IgG porcine. Le but de cette surveillance et de cet ajustement est d'assurer l'administration d'une quantité suffisante d'antisérum INA pour dominer et neutraliser les protéines bloquant et masquant la défense immunitaire, en particulier la Cl IAC, à la fois dans les humeurs et sur les membranes des cellules cancéreuses. La quantité nécessaire d'antisérum INA dépend donc à la fois de la masse totale et de l'activité (capacité de produire du Cl IAC) des cellules cancéreuses.

L'expérience thérapeutique acquise à ce jour indique que généralement le traitement par l'INA suffit pour obtenir une rémission. Cependant, on ne peut exclure les cas où, en particulier lorsque la capacité du patient à produire des anticorps est réduite, il est avantageux de combiner le traitement par l'INA avec des immunoglobulines IgG de porc présentant une spécificité vis-à-vis des protéines associées au cancer à traiter autre que le Cl IAC, telles que des protéines connues associées au cancer telles que les fœtoprotéines, le CEA ou d'autres Polypeptides tel que le CAPA, etc. (lorsque ces protéines sont présentes), ou des immunoglobulines IgG de porc provenant de porcs immunisés par des homogénéisats de cellules cancéreuses ou de tissu cancéreux du patient traité ou d'autres patients atteints du même type de cancer.

Pendant le traitement par l'INA, on doit surveiller la formation chez le patient d'anticorps dirigés contre l'INA, selon des procédés connus utilisant comme témoin de l'IgG de porc (provenant de porc non immunisé de même souche), en utilisant un test d'hémagglutina-tion et, dans le cas où on observe la formation d'anticorps, on peut poursuivre le traitement par l'INA selon un nouveau principe de l'invention, c'est-à-dire par immunoadhérence à de l'INA immobilisé.

Selon ce principe, on peut appliquer de l'antisérum ou des anticorps INA à une matrice qui les immobilise en faisant passer le sérum du patient à travers une colonne renfermant cet INA immobilisé par une matrice. Le principe de l'élimination des protéines du sérum d'un patient par immunoadhérence à des anticorps immobilisés par une matrice est nouveau et constitue un des aspects de l'invention. Des détails complémentaires concernant le traitement par de l'INA immobilisé figurent sous le titre «Déblocage et démasquage extracorporels du sérum de patient cancéreux» ci-après. Bien que ce traitement extracorporel ne neutralise pas le Cl IAC présent sur les membranes des cellules cancéreuses, il abaisse la teneur générale de l'inactivateur du Cl (et de préférence de l'orosomucoïde, de l'a2HS glycoprotéine et de la Zn a2 glycoprotéine) dans le sérum et améliore les possibilités de destruction des cellules cancéreuses par les systèmes immunitaires. A cet égard, de même qu'en ce qui concerne les explications précédentes relatives au traitement par l'INA, il convient de se rappeler que les concentrations et l'équilibre chimique jouent probablement un rôle important dans les réactions décrites.

On a prouvé le fait que l'anti-Cl IAC de l'antisérum INA est capable de se combiner aux cellules cancéreuses in vivo :

Dans un expectorât d'un patient présentant des métastases pulmonaires d'un carcinome mammaire et traité par de l'INA de porc, on a mis en évidence, selon des techniques histologiques, la présence de cellules cancéreuses. On a vérifié la présence de globulines de porc en utilisant des globulines antiporc marquées à l'isothiocyanate de fluorescéine (FITC). Les cellules ainsi étudiées présentaient une réaction positive d'immunofluorescence. Cela prouve que l'INA administré au patient est capable de recouvrir les protéines des cellules cancéreuses du patient. De plus, on ne peut mettre en évidence aucune im-munofluorescence spécifique typique en utilisant de l'anti-Cl IA humain de lapin marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine. Ce fait est particulièrement important, parce que les cellules cancéreuses provenant de la plèvre de ce patient avant le traitement présentaient un marquage positif par l'anti-Cl IA humain de lapin marqué à l'isothiocyanate de fluorescéine. Ces observations indiquent également que de l'INA marqué par un isotope, lorsqu'on l'injecte à un patient, est capable de marquer les cellules cancéreuses.

Pour préparer un antisérum ou une immunoglobuline utile pour le diagnostic in vivo après marquage isotopique, par exemple, de préférence, après marquage par le technétium, qui a une période très brève de 4 h, on utilise de préférence un vaccin ne renfermant pas de Cl IA.

Des modes de réalisation préférés d'un système de diagnostic selon l'invention figurent ci-après sous le titre «Systèmes de diagnostic».

Les systèmes de diagnostic de l'invention renferment une matière de type anti-Cl IAC humain dont la réaction avec le Cl IAC humain dans les tests immunologiques est facile à distinguer de la réaction avec le Cl IA humain. Une de ces matières consiste en de l'anti-Cl IAC humain monospécifique (par exemple de l'anti-Cl IAC humain absorbé) qui donne une réaction immunologique avec le Cl IAC, mais non avec le Cl IA. On peut citer comme autre matière de l'antisérum de mouton renfermant de l'anti-Cl IAC humain et de l'anti-Cl IA humain dans divers tests immunologiques, qui donne deux précipitations avec un sérum d'un patient cancéreux et une seule précipitation avec un sérum de patient non cancéreux. Les antisérums décrits peuvent être utilisé dans divers tests immunologiques tels qu'un test d'hémagglutination, une détermination radio-immunologique (RIA), un test d'immunodiffusion selon Ouchterlony et Mancini, un test d'immunoélectrophorèses, un test d'immuno-autoradiographie sur gel, etc. Les constituants particuliers de ces compositions, matières ou systèmes de diagnostic sont évidents pour le spécialiste puisqu'on a montré qu'il existait des matières établissant la distinction entre le Cl IA et le Cl IAC.

On a étudié plusieurs centaines de sérums en utilisant le système de diagnostic par immunodiffusion comparative, décrit ci-après sous le titre «Systèmes de diagnostic» en obtenant des résultats conduisant aux conclusions suivantes.

Faibilité:

Le test permet d'obtenir un degré de reproductibilité très élevé, de l'ordre de 96% ou plus, ce qui signifie que lorsqu'on utilise un même échantillon de sérum dans deux tests indépendants, les résultats des tests sont identiques dans 96% des cas ou plus. Ce degré de reproductibilité très élevé permet de dire que le test de l'invention est très fiable. Lorsqu'on définit autrement la fiabilité du système de diagnostic de l'invention, la fiabilité peut être moindre. Ainsi, l'expérience a montré que, si l'on étudie le sérum de patient pris au hasard, environ

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80% des tests sont conformes aux diagnostics établis. Cependant, ce degré apparemment moindre de conformité ne semble pas traduire un défaut du test. La non-conformité aux diagnostics établis peut être pour une part due au fait bien connu que la sensibilité d'un test d'immunodiffusion dépend de l'appréciation d'un précipité visible, c'est-à-dire au fait qu'une concentration suffisante d'un antigène doit être présente dans l'échantillon étudié pour qu'on obtienne un précipité visible. De plus, une concentration trop élevée de l'antigène dans l'échantillon étudié peut provoquer une redissolution du précipité, et l'équilibre entre l'antigène et l'anticorps peut être situé bien au-delà du titre de l'antisérum dirigé contre l'antigène en question. Cependant, on peut résoudre ces problèmes, dans les cas particuliers où l'on pense qu'ils se posent, soit en concentrant l'échantillon (dans le premier cas cité), soit en le diluant (dans le second cas). On peut également expliquer en partie la non-conformité de la façon suivante: Il faut se rappeler que le test indique la présence ou l'absence de Cl IAC dans le sérum du patient (de plus, dans le mode d'immunodiffusion comparative décrit sous le titre «Systèmes de diagnostic», une réaction montrant la présence de Cl IAC permet également une évaluation semi-quantitative). L'invention étant bien comprise, on peut présumer qu'une réaction positive indiquant la présence de Cl IAC selon le test de diagnostic montre que le patient se trouve dans un stade de production active de Cl IAC. Le test de l'invention permet de mettre en évidence ce stade de production active de Cl IAC dans le cas d'un cancer précoce qu'aucun autre procédé connu ne permet de confirmer. Cela peut expliquer les résultats d'essai considérés apparemment comme faussement positifs. L'expérience a montré que parmi les échantillons de sérum d'environ 200 donneurs de sang, 2% des échantillons, c'est-à-dire 4 échantillons, donnaient une réaction positive de présence de Cl IAC, et que 5%, c'est-à-dire 10 échantillons, donnaient des réactions positives douteuses. Ces résultats impliquent naturellement que le donneur de sang en question ne doit plus continuer à donner de sang et doit être examiné pour qu'on découvre la raison de la présence de Cl IAC dans son sérum selon le test de l'invention et, en pratique, il conviendrait de soumettre le patient à un traitement par l'INA selon l'invention à ce stade précoce jusqu'à ce qu'on n'observe pas de réaction positive de présence de Cl IAC, ce traitement étant justifié par l'existence d'un test positif de présence du Cl IAC, avant qu'un cancer ou une autre affection ait eu le temps de se développer. Il est souhaitable d'examiner selon le test de l'invention de façon continue les patients présentant une réaction positive de présence de Cl IAC sans autres signes apparents de cancer. L'expérience a également montré que certains types de virus, en particulier le virus de la mononucléose, sont capables de produire du Cl IAC. Dans le cas de la mononucléose, le test de mise en évidence du Cl IAC est négatif lorsque la mononucléose a disparu. Cela semble indiquer que le virus de la mononucléose produit du Cl IAC et qu'un traitement par l'IgG anti-Cl IAC de porc peut constituer un traitement efficace de la mononucléose. D'autres cas où les tests de l'invention semblent à première vue ne pas concorder avec le diagnostic établi sont ceux où des patients cancéreux présentent une réaction négative de présence du Cl IAC. Le problème réside alors souvent dans ce qu'on entend par patient cancéreux. Si un patient a été soumis à un traitement chirurgical couronné de succès, éliminant des tumeurs primaires avant que des métastases ne se soient formées, l'organisme de ce patient ne conserve aucune réminiscence de l'état cancéreux d'origine et ne renferme pas de cellules productrices de Cl IAC. Naturellement, chez un tel patient la recherche du Cl IAC est négative bien que, dans son dossier hospitalier, il puisse être considéré comme cancéreux. D'autres cas où des tests négatifs de mise en évidence du Cl IAC semblent à première vue erronés sont les cas où des patients cancéreux sont en rémission, si bien que leurs cellules cancéreuses ne produisent plus de Cl IAC. De même, des patients cancéreux porteurs de métastases osseuses qui sont dans un état sta-tionnaire depuis de nombreuses années donnent souvent des résultats négatifs dans le test d'immunodiffusion de l'invention. Comme ce test a pour but de mettre en évidence la présence de Cl IAC dans le sérum analysé, il ne donne pas de résultat positif lorsque ce sérum ne renferme pas de Cl IAC. D'autre part, lorsque le cancer du patient n'est pas actif, son sérum ne renferme pas de Cl IAC. On peut dire, à partir de ces considérations, que le test de diagnostic du Cl IAC de l'invention donne des résultats positifs avec les types de cancers actifs qui, en activité, produisent du Cl IAC, ce qui semble être le cas de la plupart des types de cancers, comme indiqué ci-après.

Comme ce test n'est pas seulement qualitatif, mais également semi-quantitatif (et susceptible d'être ultérieurement transformé en un test quantitatif), ces faits soulignent l'importance du test qui indique de façon précise la concentration sérique d'une protéine qui,

dans de nombreux types de cancers, semble constituer l'élément principal de la capacité qu'ont les cellules cancéreuses à échapper à la destruction par le système immunitaire ou à lutter contre cette destruction.

Plus particulièrement, l'expérience acquise à ce jour avec le système de diagnostic par immunodiffusion est la suivante:

On a constaté que les types suivants de cancers sont Cl IAC positif de façon assez constante: les carcinomes tels que le carcinome du sein, le carcinome de l'utérus, le cancer du poumon, le cancer du pancréas, le cancer de l'estomac, le cancer primitif du foie, le cancer du colon et du rectum, le cancer du rein, y compris le cancer du bassin, le carcinome de la vessie et les sarcomes (on a étudié quelques ostéo-sarcomes et fibrosarcomes qui se sont révélés faiblement Cl IAC positifs). Un cas d'ostéosarcome en rémission s'est révélé négatif après un traitement couronné de succès avec des agents cytostatiques; avant traitement, la réaction était faiblement positive. Les tératomes testiculaires sont fortement Cl IAC positifs. Tous les mélanomes ne sont pas Cl IAC positifs. Quelques cas étudiés de maladie de Hodgkin ont donné des résultats Cl IAC positifs.

Chez l'enfant, le néphroblastome s'est révélé Cl IAC positif. Les heurablastomes sont Cl IAC positifs. Les tumeurs du système nerveux central, par exemple les astrocytomes et les glyoblastomes, ne donnent pas de réaction positive de mise en évidence du Cl IAC dans le sérum. Les affections malignes du sang et du système lymphatique telles que la myéloblastose aiguë (AML) et la leucémie myéloïde chronique (CML) sont Cl IAC positives, sauf pendant les phases de rémission. La myélomatose est également Cl IAC positive. La lym-phoblastose aiguë et la leucémie lymphoblastique chronique (ALL) sont Cl IAC positives dans 5 à 20% de la totalité des cas confirmés; il convient de noter que la plupart des cas de lymphoblastose aiguë étudiés à ce jour étaient des cas en rémission, tandis que les quelques cas en phase active étaient nettement Cl IAC positifs. Un cas de lym-phosarcome aigu s'est révélé Cl IAC négatif. Les lymphomes sont faiblement positifs ou dans certains cas fortement positifs.

Il convient de noter que les caractéristiques importantes du test de diagnostic de l'invention sont qu'il permet une surveillance de grande valeur du patient pendant les tentatives de traitement. L'expérience a montré qu'un traitement par les agents cytostatiques de diverses maladies n'abaisse pas le titre en Cl IAC du patient, s'il ne provoque pas de rémission des tumeurs. En d'autres termes, si le test de l'invention montre qu'il n'y a pas de diminution de la teneur en Cl IAC du sérum pendant une tentative de traitement, cela indique que le traitement n'est pas efficace. On peut également, à partir des explications précédentes, dire que les types et les stades de cancers Cl IAC positifs peuvent être considérés comme susceptibles de recevoir un traitement couronné de succès avec un antisérum anti-Cl IAC de l'invention.

Il est intéressant de noter qu'une maladie auto-immune telle que le lupus érythémateux disséminé est Cl IAC positif dans environ 30% des cas. Cela est particulièrement important du fait que, lorsqu'on infecte expérimentalement une souris par le virus du lupus érythémateux disséminé,on observe dans une partie de l'organisme l'apparition d'un lupus érythémateux disséminé et l'apparition de lymphomes dans le reste de l'organisme. L'étude du sérum d'environ 200 patients d'un service de neurologie présentant diverses affections allant de la thrombose cérébrale, de l'infarctus cérébral a des affections telles que la sclérose en plaques donne environ 2% de réactions

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positives, ce qui correspond précisément au résultat obtenu pour le groupe de donneurs de sang. Dans le groupe de 200 donneurs de sang, comme précédemment indiqué, on a découvert 4 échantillons de sérum Cl IAC positifs et 4 échantillons de sérum de positivité douteuse. Après quelques semaines, on a examiné à nouveau les sé-rums de certains des donneurs de sang Cl IAC positifs et constaté que certains des sérums précédemment positifs étaient devenus Cl IAC négatifs. Les sérums d'environ 50 patients présentant divers types d'affections allergiques allant de l'asthme et de l'eczéma à un urticaire (à l'exception de l'œdème de Quincke) se sont révélés Cl IAC négatifs.

On a examiné au total 9 femmes enceintes avec des résultats négatifs, sauf un cas de positivité douteuse.

Dans son aspect général, l'invention concerne le principe de la production d'antisérums et d'anticorps présentant une spécificité vis-à-vis des protéines des membranes des cellules cancéreuses par isolement de ces protéines à partir de milieu de culture de cellules cancéreuses, ou par isolement de protéines identiques lorsqu'elles sont présentes dans les humeurs de patients cancéreux, l'utilisation de ces protéines comme antigènes pour immuniser des animaux hôtes en recueillant ultérieurement le sérum des animaux hôtes qui présente une spécificité vis-à-vis des protéines de membranes de cellules cancéreuses correspondantes. Les tentatives connues de formation d'antisérums et d'anticorps dirigés contre les protéines cancéreuses impliquaient soit l'immunisation des animaux hôtes par des cellules cancéreuses vivantes, soit par des homogénéisats de cellules cancéreuses ou de tissu cancéreux, sans qu'on obtienne des antisérums ou des anticorps présentant une spécificité vis-à-vis des protéines produites par le cancer, associées au cancer, ou des membranes des cellules cancéreuses qui présentent une faible antigénicité.

De plus, sous son aspect le plus général, l'invention concerne l'utilisation de ces anticorps ou antisérums comme réactifs ou matières de diagnostic, ou comme agents thérapeutiques dans des traitements d'immunisation passive. Outre les différentes méthodes de diagnostic dans lesquelles on vérifie la présence ou l'absence de Cl IAC dans des liquides du corps humain, il convient de mentionner des méthodes de diagnostic fondées sur la vérification de la présence ou de l'absence d'activité biologique Cl IAC. (On notera que le Cl IAC présente des activités biologiques similaires à celles du Cl IA.) On peut appliquer ces méthodes, par exemple, en soumettant un échantillon d'un liquide prélevé sur le corps humain à une élimination de l'activité biologique de Cl IA, notamment par absorption, en utilisant un anti-Cl IA humain spécifique (qui peut être préparé d'une manière analogue à celle de la préparation de l'anti-Cl IAC dans des animaux hôtes spécifiquement immunisables par rapport à l'anti-Cl IA par l'utilisation d'un vaccin comprenant le Cl IA en tant qu'antigène), après quoi on applique des méthodes de vérification classiques décrites dans la littérature relative au Cl IA pour vérifier, le cas échéant, quantitativement l'activité biologique caractéristique Cl IAC/C1 IA, par exemple l'activité inhibitrice par rapport à l'effet d'hydrolyse sur l'estérase Cl (en utilisant par exemple la méthode AAME décrite dans le chapitre ci-dessous intitulé, «Caractérisation du Cl IAC»).

Par ailleurs, le fait que le Cl IAC présente une activité biologique similaire à celle du Cl IA offre la possibilité de contrôler le déroulement d'une affection cancéreuse en déterminant quantitativement l'activité biologique de l'inhibiteur de Cl (Cl IAC Cl IA) dans des liquides du corps du patient. Un tel contrôle qui peut être effectué à l'aide de méthodes classiques décrites dans la littérature concernant le Cl IA, par exemple pour déterminer l'effet inhibiteur sur l'effet d'hydrolyse de l'estérase Cl, permet d'obtenir les mêmes informations quantitatives importantes sur le niveau global d'inhibition de Cl que celles qu'on obtient lors du contrôle du niveau d'inhibition de Cl à l'aide de l'anti-Cl IA humain du lapin.

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description non limitative qui suit.

Préparation du Cl IAC

— Obtention de cellules cancéreuses humaines par culture

On peut obtenir des cellules cancéreuses humaines à partir de liquide pleural ou de liquide d'ascites de patients atteints de cancer avec des métastases pleurales et/ou présentant une ascite. On doit manipuler le liquide pleural et le liquide d'ascites en conditions stériles et rejeter les liquides pleuraux et les liquides d'ascites infectés.

On peut séparer les cellules des liquides par centrifugation à 1000 tr/min, pendant 10 min à température ambiante. Le précipité renferme les cellules. On sépare le surnageant et on le conserve à moins 20° C pour isoler ultérieurement les protéines utiles du point de vue immunologique, comme décrit ultérieurement.

Une autre source de cellules est constituée par les tumeurs humaines solides prélevées lors des opérations des patients, par exemple des tumeurs cérébrales malignes de patients atteints de tumeurs cérébrales malignes primaires. On peut obtenir les cellules cancéreuses de ces tumeurs par trypsination. Par exemple, on lave les échantillons de tumeurs cérébrales plusieurs fois dans du milieu essentiel minimal de Eagle, on découpe le tissu en cubes de 2 mm, on remet les cubes en suspension dans le milieu, on lave et on centrifuge par exemple pendant 10 min à 900 tr/min, on ajoute une solution de trypsine, on incube par exemple pendant 30 min à 25e C, puis on filtre la suspension cellulaire sur une gaze stérile, on mélange avec du milieu essentiel minimal de Eagle, additionné de 15% de sérum de bœuf et on centrifuge comme précédemment indiqué. Le précipité renferme les cellules et on décante le surnageant.

On peut utiliser séparément les précipités obtenus comme ci-dessus ou regrouper plusieurs précités. De plus, on peut traiter de façon analogue des cellules cancéreuses humaines provenant d'autres sources et les utiliser telles quelles ou en association avec des cellules cancéreuses obtenues comme précédemment décrit.

— Culture des cellules cancéreuses

On introduit les cellules cancéreuses obtenues comme précédemment décrit dans des flacons de Roux de 1000 ml renfermant du milieu essentiel minimal (MEM) de Eagle enrichi par addition d'environ 294 mg/1 de glutamine et renfermant 15% de sérum de veau fœtal inactivé, ensuite on incube dans une étuve, après addition de dioxyde de carbone. Dans les cultures tests parallèles, on cultive directement 0,5 ml de suspension cellulaire sur les parois d'un tube de Leighton, pour mettre en évidence la présence de Cl IAC sur les membranes cellulaires par cytophotométrie en immunofluorescence [Osther et al., «Acta. path. microbiol. scand. B», 81,365 (1973)]. Lorsqu'on observe la présence de Cl IAC dans les cultures tests, on utilise la culture principale comme culture de production.

On élimine le milieu, on lave la culture cellulaire avec du tampon PBS phosphaté, à pH 7,3, on introduit du milieu synthétique RPMI renfermant des aminoacides de Flox (Ecosse), enrichi uniquement avec environ 294 mg/1 de glutamine, on incube pendant 3 d à 37° C, on recueille le milieu en conditions stériles et on le centrifuge à 1000 tr/min pendant 15 min à température ambiante, puis on conserve le surnageant dans des flacons fermés à — 20e C en attendant d'isoler le Cl IAC. On cultive à nouveau les cellules cancéreuses dans le milieu essentiel minimal de Eagle modifié précité, et après 3 d d'incubation, on remplace à nouveau le milieu par du milieu RPMI enrichi en glutamine, qu'on recueille après 3 d d'incubation et qu'on traite et qu'on gèle comme précédemment décrit. On poursuit l'alternance de culture dans le milieu essentiel minimal de Eagle modifié et le milieu RPMI enrichi en glutamine, ainsi que la récolte de ce dernier milieu tant que la culture de cellules cancéreuses est productive.

Dans le cas d'une culture particulièrement bonne (bien supérieure à environ 2 x 105 cellules par flacon de Roux), on transplante d'autres cultures dans d'autres flacons de Roux et on utilise ces nouvelles cultures cellulaires pour la production comme précédemment décrit. Pendant la production, on surveille la formation de Cl IAC par les cultures cellulaires en utilisant les cultures tests en tubes de Leighton s

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et, avant l'emploi, on ajoute au milieu de culture de la pénicilline et de la streptomycine aux concentrations appropriées.

— Isolement du Cl IAC

On soumet le milieu RPMI enrichi en glutamine, obtenu après culture des cellules cancéreuses comme précédemment décrit, à un relargage pour précipiter les protéines contaminantes, en additionnant jusqu'à 40% de la saturation de sulfate d'ammonium saturé à 0°C et en agitant. On centrifuge le milieu ainsi traité à 4000 tr/min pendant 15 min à température ambiante. On peut également utiliser d'autres techniques de centrifugation, mais celle indiquée donne d'excellents résultats. On rejette le précipité et on dialyse le surnageant pendant environ 48 h à 4; C dans de l'eau distillée que l'on change plusieurs fois, puis on centrifuge à 3500 tr/min à température ambiante pendant 15 min.

On peut utiliser d'autres techniques de centrifugation en utilisant par exemple un centrifugeur réfrigéré. On obtient une purification particulièrement bonne en utilisant une ultracentrifugeuse preparative réfrigérée.

Le premier stade du traitement ultérieur du Cl IAC présent dans le surnageant limpide est une Chromatographie d'absorption sur colonne. On préfère à cet effet comme résine échangeuse d'anions la résine Dowex 2 x 8, en particules de 74 à 38 jx, mais on peut également utiliser d'autres matières échangeuses d'ions. On soumet la résine échangeuse d'ions à un prétraitement par ébullition dans l'eau pendant 2 h, à 5 échanges de 2 h avec de l'acide chlorhydrique 0,1N, puis à un équilibrage par agitation avec du tampon Tris 0,06M, à pH 7,3 jusqu'à ce que le pH soit stabilisé à environ 7,3. On peut également utiliser d'autres tampons Tris et des tampons phosphate ayant des pH et des forces ioniques autres, mais le tampon précité donne les meilleurs résultats.

On introduit le surnageant limpide précité dans la colonne de résine échangeuse d'anions Dowex 2x8 (colonne K 50/100 munie d'adaptateurs), en faisant s'écouler le tampon Tris, à pH 7,3 précité, à raison de 100 ml/h à température ambiante. On obtient le meilleur rendement en Cl IAC en utilisant 160 ml de milieu RPMI pour 1500 ml de charge de colonne. L'efïluent de la colonne traverse la microcuve à écoulement d'un spectrophotomètre qui donne un enregistrement graphique de la densité optique à 580 nm de l'efïluent (on utilise un spectrophotomètre Iseo) et on recueille avec un collecteur des fractions de 10 ml. Lors de ce fonctionnement et lors des fractionnements suivants, on détermine le Cl IAC des protéines élevées mises en évidence par des pics de densité optique sur l'enregistrement du spectrophotomètre en opérant par immunoélectrophorèse de type rocket avec de l'anti-Cl IA humain de lapin, de l'anti-Cl IAC humain de porc ou de l'anti-Cl IAC humain absorbé de mouton (qu'on prépare comme décrit ci-après) dans le gel, et on dose les protéines contaminantes par immunoélectrophorèse croisée selon Freeman, en utilisant un sérum complet antiprotéines humaines dans le gel, et par immunoélectrophorèse selon Grabar, en utilisant les deux types précités d'antisérum. On détecte les protéines contaminantes en mettant en évidence l'orosomucoïde, la transferrine, l'a2HS glycoprotéine, l'inhibiteur de l'inter-a-trypsine, la préalbumine et l'albumine.

La majeure partie du Cl IAC est absorbée dans l'échangeur d'ions. Par passages répétés à travers l'échangeur d'ions dans le tampon Tris, on peut absorber le restant du Cl IAC.

La majeure partie des protéines contaminantes apparaît sous forme d'un premier type principal d'élution lors de l'élution par le tampon Tris. L'enregistrement spectrophotométrique typique de cette élution est illustré par la fig. 5. Après qu'un nombre approprié de fractions a suivi l'apparition du pic, on introduit dans la colonne une solution à concentration croissante rectiligne de chlorure de sodium jusqu'à l'obtention d'une concentration finale de 0,09 M en NaCl. Le nombre de fractions appropriées, précédemment indiqué, est le nombre de fractions assurant une bonne séparation entre le premier pic et les protéines éluées ultérieurement. On peut également utiliser une solution salée dont la concentration augmente par paliers, sans obtenir d'avantage additionnel.

Le Cl IAC est libéré de l'échangeur d'ions au point final correspondant à une concentration en chlorure de sodium d'environ 0,09M (comme le montre un petit pic de l'enregistrement spectrophotométrique de la fig. 5), et on regroupe les fractions renfermant le Cl IAC, puis les dialyse pendant environ 24 h à 4° C contre de l'eau distillée. On lyophilise ensuite le produit dialysé. (La lyophilisation en coquille en s'aidant du vide et d'un léger chauffage extérieur à 40° C convient.)

On remet le lyophilisât en suspension dans du tampon Tris 0,06M, à pH 8,6, et on introduit sur une colonne de filtration sur dex-trane constituée d'un gel de Séphadex (dénomination commerciale) G 75 Superfine, telle qu'une colonne Pharmacia K15/50, en utilisant comme tampon efïluant le tampon Tris à pH 8,6. Le débit convenable est d'environ 10 ml/h. On surveille l'efïluent en utilisant le spectrophotomètre et on l'étudié selon des techniques d'immuno-électrophorèse indiquées ci-après. Un enregistrement spectrophotométrique typique de la densité optique de l'efïluent est illustré par la fig. 6 et on y observe un premier pic correspondant au Cl IAC. On recueille les fractions riches en Cl IAC, on les dialyse à fond contre de l'eau distillée pendant 48 h, puis on les lyophilise comme précédemment décrit. On appelle ci-après ce produit Cl IAC (Séphadex G 75 Superfine) ou Cl IACpure. L'étude par immunoélectrophorèse montre que ce produit est pur et non agrégé.

Dans une autre technique de purification, on remet en suspension le lyophilisât des fractions dialysées renfermant le Cl IAC qu'on a obtenu avec la résine échangeuse d'ions Dowex 2x8, dans du tampon Tris 0,06M, à pH 8,6, et on l'introduit sur une colonne (par exemple une colonne K 25/60) garnie d'un échangeur d'anions constitué de cellulose Whatman DE-52 et munie d'adaptateurs. On élue l'échangeur d'anions avec un gradient croissant rectiligne de chlorure de sodium dont la concentration varie de 0 à 0,15M. On effectue des passages répétés sur l'échangeur d'ions Whatman jusqu'à ce qu'on obtienne la purification optimale déterminée selon les procédés précités. Le Cl IAC ainsi purifié est agrégé dans une certaine mesure, comme le montre l'examen par immunoélectrophorèse (voir fig. 7).

Pour les utiliser comme agent immunogène dans un vaccin convenant à la première vaccination d'animaux hôtes appropriés, on regroupe les fractions riches en Cl IAC de l'échangeur d'ions Whatman avec les fractions obtenues avec la colonne de Séphadex G 75 Superfine, et on dialyse les fractions groupées, puis on les lyophilise comme précédemment décrit. On appelle ci-après ce produit combiné protéine Cl IAC agglomérée + Cl IAC Séphadex G 75 Superfine. Ce produit est prêt à être remis en suspension pour être éventuellement mélangé à d'autres protéines comme décrit ci-après et/ou à être mélangé avec du Cl IA seul pour former un antisérum spécifique de propriété optimale.

Caractérisation du Cl IAC — Matières et procédés utilisés dans la caractérisation et dans d'autres opérations décrites ci-après

Antisérums

L'anti-Cl IA humain de lapin (teneur en anticorps: 0,7 mg/ml), l'anti-C4 humain de lapin (teneur en anticorps : 1,0 mg/ml), l'anti-C3 humain de lapin (teneur en anticorps: 1,2 mg/ml), l'antiactivateur de C3 humain de lapin (teneur en anticorps : 0,5 mg/ml),

l'anti-a2 HS glycoprotéine humaine de lapin (teneur en anticorps: 0,35 mg/ml),

l'anti-inhibiteur de l'inter-a-trypsine humaine de lapin (teneur en anticorps: 1,0 mg/ml),

l'antiorosomucoïde humain de lapin (teneur en anticorps: 0,9 mg/ml),

l'antitransferrine humaine de lapin (teneur en anticorps: 2,5 mg/ml),

l'antialbumine humaine de lapin (teneur en anticorps:

1,1 mg/ml),

l'antipréalbumine humaine de lapin (teneur en anticorps: 0,25 mg/ml),

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l'anti-ct] fœtoprotéine humaine de lapin (teneur en anticorps : 0,2 mg/ml),

l'antiprofibrinolysine humaine de lapin (teneur en anticorps: 0,25 mg/ml)

proviennent de Behringwerke.

L'anti-IgG humaine de lapin (teneur en anticorps: 0,4 mg/ml), l'anti-IgM humaine de lapin (teneur en anticorps: 0,4 mg/ml), et l'antisérum entier humain de lapin proviennent de Dakopatts.

Streptokinase

On utilise de la streptase renfermant l'équivalent de 100 000 unités de Streptokinase (soit 30 mg) dans 10 mg de glutamine et 10 mg d'hyaluronidase. On dissout la streptase dans 400 ni de solution salée 0,15M, ce qui correspond à 75 ng de streptokinase/ml. On prépare la solution dans l'heure précédant l'utilisation.

Plasma

On utilise du plasma frais de sujets sains prélevé dans des tubes (14/15 mm) contenant 1 mm d'ACD et 9 ml de sang.

Sérum

On prélève du sang humain par ponction veineuse sans anticoagulant sur des donneurs sains. On laisse coaguler à température ambiante pendant 1 h et on maintient pendant une nuit à 4°C. On sépare le sérum par centrifugation à 4200 tr/10 min à 4°C.

Fibrinogene bovin

Fourni par Behringwerke, renfermant 60 mg de fibrinogène bovin lyophilisé, fraîchement préparé à la dilution de 0,4% pour la fibrino-lyse par diffusion et à 0,6% pour l'électrophorèse sur fibrine/agarose.

Neuraminidase

Provenant de Vibrio cholerae et renfermant 500 unités/ml; fournie par Behringwerke.

Immunoélectrophorèse

On utilise un gel d'indubiose A 37 Agarose fourni par l'industrie biochimique française.

Tampons

On utilise du tampon Diemal, à pH 8,6, ayant une force ionique de 0,02. Le tampon salé au barbital est constitué de barbital 0,025M et de chlorure de sodium 0.125M à pH 7,5 [Ratnofif, O.D., Davie, E.W., et Mallet, «Studies on the Action of Hageman Factor: Evidence that Activated Hageman Factor in Turn Activâtes Plasma Thromboplastin Antecedent» in «J. Clin. Invest.», 40:803 (1963)]. Le tampon véronal à pH 7,3-7,4 est additionné de MgCl2, CH20, CaCl2 et 2H20.

Cl humain

On prépare la Cl-estérase à partir de la fraction d'euglobulines par Chromatographie sur DEAE-cellulose en utilisant du tampon de Lepow renfermant du Na HEDTA, comme décrit par Bing. On regroupe les fractions renfermant les solutions brutes de Clq, Clr et Cls et on les dialyse contre les tampons phosphate de sodium, contenant 0.006M, à pH 7,4,0,015M en EDTA, et on lyophilise.

Chlorhydrate de l'ester mèthylique de la N-acétyl-L-arginine (AAME)

On dissout de la AAME de Cyclo Chemical Corp., Los Angeles (Californie), à la concentration de 0,015M dans du tampon salé phosphaté, et on ajuste à pH 7,4 par addition d'hydroxyde de sodium 0,15M.

EA

On utilise du sang de mouton dans un volume égal de solution d'Alsevers, conservé à 4 C, et un ambocepteur (hémolysine), conservé à — 20 C, aimablement fourni par le Serum Institute, Copenhague, et on les standardise par spectrophotométrie comme décrit par Mayer [Mayer, M.M., «Complément and Complément Fixation in Expérimental Immunochemistry», E.A. Kabat & M.M. Mayer éd., Springfield (Illinois), Charles C. Thomas, 2e éd., p. 133 (1961)].

EAC1

On prépare ce complexe entre EA et Clq, Clr et Cls à partir de EAC1. On maintient la concentration en Ca + + à 10_3M. On détermine l'activité de ce complexe en mesurant l'importance de l'hémolyse produite par une dissolution appropriée de sérum humain renfermant 16 x 10 3M de Na2MG EDTA pour chélater Ca+ + en bloquant l'action ultérieure de Cl, mais en permettant la réaction de C2, C4, etc.

— Modes opératoires

Immunoélectrophorèse

On effectue une immunoélectrophorèse quantitative dans de l'agarose à 1% renfermant un anticorps (épaisseur 1,5 mm), en utilisant un courant de 1,5 V/cm pendant 18 à 20 h à 20°C [Laurell C.B., «Quantitative Estimation of Proteins by Electrophoresis in Agarose Gel Containing Antibodies» in «Ann. Biochem.», 15:45-52 (1966)]. On effectue l'immunoélectrophorèse qualitative selon le procédé de Grabar et Scheidegger. On effectue l'électrophorèse croisée antigène/anticorps selon Freeman [Clarke, H.C. et Freeman, T., «A Quantitative Immunoelectrophoresis Method (Laurell Electrophoresis), pp. 503-509 in «Protides of the Biological Fluids», vol. 14, Elsevier, Amsterdam (1966); Laurell, C.B., «Antigen-antibody Crossed Electrophoresis» in «Ann. Biochem.», 10: 358-361 (1965)]. On effectue une séparation initiale par électrophorèse sur agarose avec un courant de 10 V/cm pendant 1,5 h à 20°C. Après avoir tourné le champ électrique de 90°, on effectue une électrophorèse dans un gel d'agarose contenant l'anticorps avec un courant de 2,5 V/cm pendant 18 à 20 h à 20° C.

Immunodiffusion

On opère avec de l'agarose à 1 % selon la technique de diffusion sur gel d'Ouchterlony (Ouchterlony, Ö., «Progr. Allergy», 6: 30, 1962). On effectue la diffusion à température ordinaire pendant 3 d.

Immunoélectrophorèse croisée en tandem

On opère selon Krall [Krall, J. «Tandem-crossed Immunoelectrophoresis» in «a Manuel of Quantitative Immunoelectrophoresis» (éd. Axelsen, N.H., Krall, J., Weeke, B.) Universitetsforlaget, Oslo (1973), pp. 57-59). Le principe consiste à effectuer une électrophorèse initiale de deux échantillons d'antigène dans la même séparation avec un gel d'agarose en utilisant un courant de 10 V/cm pendant 1,5 h. Après avoir tourné le champ électrique de 90°, on effectue une électrophorèse dans un gel contenant un anticorps avec un courant de 2,5 V/cm pendant 18 à 20 h à 20° C.

Electrophorèse sur gel de fibrine I agarose

On utilise une modification de la technique d'électrophorèse sur gel de fibrine décrite par Heimburger N. et al. On prépare une solution de fibrinogène bovin à 0,4% dans une solution salée à 0,9%. On agite 9 parties d'une fibrinogène à 0,4% à 2 parties de Ca(H2P04)2, H20 de 0,1N. On incube la solution de fibrinogène à 37° C pour la rendre totalement visqueuse sans qu'elle contienne de fibrinogène non dilué. On ajoute 2 parties d'agarose à 1 % dilué dans du tampon diémal et on maintient la solution à 45° C jusqu'à l'emploi. On verse le gel sur des microlames, on coagule à la température ordinaire, puis on chauffe au bain-marie à 80° C pendant 60 min. On place les échantillons dans les trous de la plaque d'électrophorèse à la fibrine/agarose et on utilise un courant de 160 V pendant 1,5 h à la température ordinaire. Après électrophorèse, on place les réactifs indiqués dans les rainures. On effectue la diffusion à 37° C pendant une nuit. On maintient ensuite le gel de fibrine/agarose dans une solution salée à 0,9% au bain-marie à la température ordinaire, puis on lave pendant 1 h à l'eau distillée. On colore les lames avec du bleu brillant Cooma-sie.

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— Propriétés biologiques du Cl IAC

1 ) Inhibition de l'effet d'hydrolyse de la Cl estérase

On régénère la Cl estérase à partir des fractions brutes dialysées et lyophilisées de Clq, Clr et Cls, et on la remet en suspension à une concentration correspondant à environ 5 mg/ml. On utilise comme source de Ca+ + pour la régénération 0,1 ml de Ca(H2P04)2 0,033M par millilitre.

On évalue l'inhibition des propriétés estérolytiques de la Cl estérase en incubant 0,5 ml de Cl estérase avec 0,25 ml de Cl IA ou de Cl IAC (ayant une concentration en protéines de 10 mg/ml) ou comme témoin du tampon phosphate de sodium, ayant une force ionique de 0,15, à pH 7,45. On ajoute 0,75 ml du tampon précité dans tous les tubes. On incube les tubes à température ambiante pendant 15 min.

On utilise comme substrat 1 ml de AAME (chlorhydrate de l'ester méthylique de la N-acétyl-L-arginine) à la concentration de 0,015M, qu'on ajoute à tous les tubes, avant d'incuber pendant 60 min à 37 C.

Immédiatement après l'addition de l'AAME et 60 min après, on prélève des portions de 1 ml qu'on mélange à 1 ml de formaldéhyde à 37%. On mesure l'acidité titrable de l'échantillon initial et de l'échantillon incubé pendant 60 min en ajoutant de l'hydroxyde de sodium 0,05N jusqu'à un pH de 7,8. On effectue les titrages en utilisant un pH-mètre 26 Radiometer (Radiometer, Copenhague).

L'hydrolyse de l'AAME est partiellement inhibée par des quantités aussi faibles que 0,25 unité/ml de Cl IAC, ces résultats étant comparables à l'effet d'inhibition du Cl IA indiqué dans la littérature par divers auteurs.

2) Effet d'inhibition du CI IAC sur l'activation de C4par Cl, mis en évidence par l'inhibition de l'hémolyse en présence de complément On revêt des érythrocytes de mouton d'ambocepteur et du premier composant purifié du complément humain, selon la technique de Ruddy et al. On utilise le sérum surnageant, dépourvu de Cl, comme source des composants de C2 à C9 du composant. On utilise des érythrocytes de mouton à la concentration de 2% dans du tampon véronal sodique sans gélatine. On utilise l'ambocepteur à la dilution de 1 /400, évaluée par titrage de l'hémolysine. On titre le complément en effectuant des dilutions en série dans des plaques de microtitrage. On mélange 100 |il d'EACl (la concentration de Cl correspond au volume d'origine et on dilue en série comme on le fait pour le sérum), 100 (il de sérum dépourvu de Cl qu'on dilue en série et 50 (il de tampon véronal sodique (VBS) renfermant 3 mg de Cl IAC ou 50 |il de tampon véronal sodique comme témoin et on incube à 37 C pendant 30 min. On lit l'hémolyse en utilisant un spectrophotomètre PMQ II de Cari Zeiss, à la longueur d'onde de 541 nm, dans des microcuves de quartz. On détermine C4, C3 et Cl IAC des dilutions en série par immunoélectrophorèse de type rocket. Comme le montre la fig. 8, les solutions renfermant le Cl IAC présentent une inhibition de l'hémolyse par rapport aux solutions ne renfermant pas de Cl IAC.

3 j Absence d'effet du Cl IA et du Cl IAC sur le temps de coagulation du plasma

On évalue l'effet du Cl IA et du Cl IAC purifiés sur le temps de coagulation du sang selon une modification de la technique décrite par Ratnoff et al. (Ratnoff, O.D., Copoly, J.E. et Pritchard, J.A., «The Blood Clotting Mechanism during Normal Parturition» in «J. Lab. Clin. Med.» 44/408,1954).

On mélange avec 1 mm de plasma citraté, ayant une concentration de phosphate de calcium de 0.025M, dans des tubes de polystyrène du Cl IA et du Cl IAC, à la concentration de 10 mg/ml avec un témoin tampon (tampon phosphate 0.005M). On ajoute simultanément aux tubes 200 jj.1 de Cl IA, Cl IAC, ou de tampon.

On incube les mélanges à 37° C au bain-marie. Le temps de coagulation est l'intervalle s'écoulant entre l'incubation et la coagulation.

Le Cl IA et le Cl IAC, à la concentration de 1 mg/ml, n'ont pas d'effet sur le temps de coagulation du plasma recalcifié, pauvre en plaquette, lorsqu'on opère dans des tubes de polystyrène (tableau I).

s Tableau I

Effet de Cl IA et Cl IAC sur la coagulation du sang

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Plasma régénéré parCa+ +

N° de l'inactivateur de Cl

Temps de coagulation (min + s)

Donneur N° 16697

Cl IAC]jqUi(jepieurai

(4010)

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Tampon

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Donneur N° 16697 Donneur N° 16697

Cl I ACjjqyJdg pleural Tampon

(4011)

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Donneur N° 16697

Cl IAC|fqUj,je d'ascites

(4014)

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Tampon

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Donneur N° 16697

Cl lACjjqyjjJg d'ascJtes

(4015)

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Donneur N° 16697

Tampon

3

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Donneur N° 16697

Cl IAC (donneur)

(4021)

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Donneur N° 16697

Tampon

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Donneur N° 16697

Cl IACMEM

(4023)

3

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Donneur N° 16697

Tampon

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Donneur N° 16697

Cl IACrpm!

(4025)

3

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Donneur N° 16697

Tampon

3

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Donneur N° 16697

Cl iacmem

(4026)

4

0

Donneur N° 16697

Tampon

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35 40

Le système de régénération est constitué de 0,5 ml de plasma avec du Ca(H2P04)2 0,025M.

Le tampon est du tampon phosphate 0,05M, à pH 7,4. On maintient approximativement constantes les concentrations de Cl IAC et de Cl IA, à partir de la concentration déterminée par immunoélectrophorèse de type rocket et du poids sec de la protéine purifiée.

Donc, le temps de coagulation pour du plasma additionné de Cl IAC ou de Cl IA, ainsi que pour un plasma ayant une teneur en Cl

45 IA d'environ 30 mg/100 ml, varie de 60 s sans différence significative entre les plasmas auxquels on a mélangé du Cl IAC ou du Cl IA et les plasmas auxquels on n'a pas mélangé ces composés. La moyenne du temps de coagulation dans ce système correspond à la moyenne du temps de coagulation trouvée par Ratnoff et al. dans la référence citée.

4) Effet d'inhibition de Cl IAC sur lafibrinolyse

On étudie l'effet d'inhibition de Cl IAC sur un système régénéré constitué de plasma recalcifié par du phosphate de calcium.

On pèse des caillots avant de provoquer leur lyse par 100 000 unités/ml de Streptokinase (Streptase, 20 |ig). On note le poids des caillots individuels après 6 h d'incubation (en tubes scellés) à 37° C et on les compare au poids d'origine des caillots individuels avant leur lyse.

60 Avant d'effectuer la lyse, on ajoute au plasma coagulé du Cl IAC ou du Cl IA à la concentration de 10 mg/ml ou du tampon comme témoin. Les résultats paraissent dans le tableau II.

(Tableau en tête de la colonne suivante)

65

Comme le montre le tableau II, la lyse des caillots est inhibée dans une certaine mesure par le Cl IAC.

13

635 242

Tableau II Etude de la lyse des caillots

Plasma régénéré par Ca+ +

N° du Cl IAC ou du Cl IA/ tampon

Poids du caillot avant la lyse (g)

Streptase (ng)

Poids du caillot après 6 h de lyse (g)

Donneur N° 16697

4011

0,368

20

0,039

Donneur N° 16697

Tampon

0,371

20

0,026

Donneur N° 16697

4014

0,365

20

0,047

Donneur N° 16697

Tampon

0,363

20

0,033

Donneur N° 16697

4015

0,361

20

0,047

Donneur N° 16697

Tampon

0,367

20

0,025

Donneur N° 16697

4021 (Cl IA)

0,367

20

0,038

Donneur N° 16697

Tampon

0,365

20

0,025

Donneur N° 16697

4023

0,360

20

0,030

Donneur N° 16697

Tampon

0,361

20

0,029

Donneur N° 16697

4025

0,364

20

0,044

Donneur N° 16697

Tampon

0,365

20

0,036

Donneur N° 16697

4026

0,363

20

0,043

Donneur N° 16697

Tampon

0,361

20

0,034

Le système régénéré est constitué de plasma et de Ca(H2P04)2. On utilise pour la lyse une quantité de Streptase correspondant à 100 000 unités de streptokinase/ml.

On maintient pratiquement constante la concentration de Cl IACoudeClIAà partir des résultats de l'immunoélectrophorèse de type rocket et du poids sec de la protéine purifiée.

5) Effet d'inhibition du Cl IAC sur le systèmefibrinolytique du plasma mis en évidence par électrophorèse sur fibrine/agarose On utilise le mode opératoire décrit en détail ci-dessus. Les matières placées dans les trous ou dans les rainures figurent dans le tableau III.

Tableau III

Combinaison étudiée par électrophorèse sur fibrine! agarose

Perforations

Rainures

Sérum humain, non dilué

Streptokinase 10000 unités/ml

Sérum humain, non dilué

Streptokinase 10000 unités/ml + Cl IAC, à la concentration de 1 mg/ml

Plasma renfermant 40 unités de streptokinase/ml

Antiprofibrinolysine

Plasma renfermant 40 unités de streptokinase/ml

Cl IAC à la concentration de 1 mg/ml

Sérum humain, non dilué

Plasma renfermant 40 unités de streptokinase/ml

Sérum humain, non dilué, renfermant 1 mg/ml de Cl IAC

Plasma renfermant 40 unités de streptokinase/ml

L'étude des mélanges de Cl IAC et de plasma humain additionnel de Streptokinase montre que le Cl IAC à la concentration finale de 1 mg/ml inhibe l'activité de la fibrinolysine. La fibrinolyse est mise en évidence par une zone claire formée dans le réseau de fibrine. On constate que la zone claire formée avec le sérum mélangé au Cl IAC est plus petite que la zone claire obtenue avec le sérum témoin additionné de tampon.

L'étude par électrophorèse dans un gel de fibrine et d'agarose d'un plasma additionné de Streptokinase avec de l'antiprofibrinoly-sine dans une rainure et du Cl IAC dans l'autre rainure montre une zone d'inhibition de la consommation de la fibrine dans une région correspondant au précipité de profibrinolysine et à la rainure renfermant le Cl IAC.

Les essais d'électrophorèse sur gel de fibrine/agarose portant sur du sérum humain mélangé à du Cl IAC à la concentration de 1 mg/ ml, immédiatement après addition de Streptokinase dans les rainures, montrent l'absence de consommation dans le gel de fibrine/agarose alors qu'il y a consommation pour un sérum ne renfermant pas de Cl IAC.

6) Effet du pH sur l'inhibition de l'effet d'hydrolyse de la Cl estérase parle Cl IAC

On étudie l'effet du pH sur l'activité biologique du Cl IAC dans la gamme de pH de 3 à 11. On dilue du Cl IAC à une concentration d'environ 30 mg%. On étudie des portions de 2,0 ml de la solution de Cl IAC en les amenant au pH désiré avec de l'acide chlorhydrique 0,15N ou de l'hydroxyde de sodium 0,15M. On maintient les mélanges à 4° C pendant 18 h, puis on ramène le pH à 7,4 + 0,1. On porte le volume de chaque mélange à 3,0 ml avec du chlorure de sodium 0,15M et finalement à 4,0 ml avec 1,0 ml de phosphate de sodium, à pH 4,7, ayant une force ionique de 0,15. On prélève des volumes de 0,25 et 0,5 ml de chaque mélange pour y déterminer l'effet inhibiteur du Cl IAC. Le principe de la détermination de cette inhibition est le blocage de l'effet estérasique de Cl sur l'AAME.

L'activité du Cl IAC diminue progressivement au-dessous de pH 5,5 et de pH 10,5.

7) Effet de la chaleur sur l'inhibition de l'effet d'hydrolyse de la Cl estérase par Cl IAC

On évalue la stabilité du Cl IAC en incubant du Cl IAC purifié dans du chlorure de sodium 0,15M maintenu à pH 7,1 pendant 30 min à diverses températures comprises entre 0 et 60° C. On détermine l'activité biologique en évaluant l'effet inhibiteur du Cl IAC sur l'hydrolyse du AAME par la Cl estérase. On opère sur des échantillons de 0,5 ml. On constate que l'activité du Cl IAC diminue considérablement après incubation à des températures > à 56° C.

— Propriétés immunologiques de Cl IAC

8) Immunoélectrophorèse selon Grabar-Scheidegger Lorsqu'on effectue une immunoélectrophorèse selon Grabar-

Scheidegger avec de l'anti-Cl IA humain de lapin, on obtient pour le Cl IA un précipité en aile de mouette, alors que le Cl IAC ne donne pas de précipitation en aile de mouette (fig. 9). [Le précipité en «aile de mouette» a été décrit par Hirschfeld (I960).]

Le précipité de Cl IAC s'étend dans la zone ß lorsqu'on effectue l'immunoélectrophorèse en présence de lactate de calcium (voir % 9).

9 ) Immunoélectrophorèse de type rocket selon Laurell (ou à fusée) Par immunoélectrophorèse de type rocket selon Laurell avec de l'anti-Cl IA humain de lapin, on observe une légère différence dans la configuration des images en forme de fusées (rockets), qui sont quelque peu plus émoussées pour le Cl IAC que pour le Cl IA, approximativement comme illustré par la fig. 7.

10) Immunoélectrophorèse croisée en tandem selon Kroll

En utilisant l'anti-Cl IA humain de lapin, on constate par immunoélectrophorèse croisée en tandem une identité totale entre Cl IA et Cl IAC, comme le montre les fig. 11 et 12.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

635 242

14

11) Immunoélectrophorèse croisée selon Freeman

En utilisant des antiprotéines sériques totales humaines de lapin, on obtient par immunoélectrophorèse croisée, selon Freeman, avec du CI IA purifié et du Cl IAC purifié des précipités identiques (ayant un aspect semblable à celui illustré par la fig. 14,2e pic).

12) Effet de la neuraminidase sur les propriétés immunologiques du Cl IAC

On incube 1 ml de Cl IAC purifié à une concentration d'environ 1,0 mg/ml avec 0,2 ml de neuraminidase de Vibrio cholerae (V.C.N.) correspondant à 100 unités de neuraminidase (une unité de neuraminidase est la quantité d'enzyme suffisante pour libérer 1 ng d'acide N-acétyl neuraminique à partir d'une a-glycoprotéine humaine).

On agite le mélange et on incube à 37° C pendant 15 min. Le témoin renferme 0,2 ml de tampon phosphate 0.09M.

On soumet le Cl IAC purifié ainsi traité à une immunoélectrophorèse croisée en tandem avec de l'anti-Cl IA humain de lapin; on obtient une seule courbe (fig. 13) correspondant au Cl IAC; le Cl IAC traité par la neuraminidase n'est pas capable de former de précipité. (La courbe est très haute par suite de la concentration excessive de l'anti-Cl IA humain de lapin par rapport au Cl IAC dans cette expérience particulière.)

Par immunoélectrophorèse selon Grabar-Scheidegger avec de l'anti-Cl IA humain de lapin, on constate que le Cl IAC traité par la neuraminidase comme précédemment décrit ne donne pas de précipité (voir fig. 10).

13) Immunodiffusion selon Ouchterlony avec un antisérum oligospécifique

Dans des essais d'immunodiffusion selon Ouchterlony, en utilisant un antisérum produit avec des porcs Dansk Landrace ou York-shire race mélangé à Dansk Landrace, ou sur des moutons de type Texel (Jysk Hederace) ou des moutons d'élevage mixte de Shropshire et Oxford Down, que l'on a vaccinés avec des vaccins renfermant du Cl IAC et du Cl IA, tels que les vaccins de type 1 ou 2 décrits sous le titre «Vaccination des animaux hôtes», ou avec un antisérum provenant d'un autre animal capable d'établir la distinction entre Cl IAC et Cl IA et que l'on a vacciné avec des vaccins renfermant du Cl IAC et du Cl IA en quantité suffisante pour qu'on obtienne une réaction d'immunisation; le Cl IAC donne un précipité différent de celui du Cl IA. Par exemple, le sérum d'un patient cancéreux donne deux précipités distincts, tandis que le sérum de donneurs sains (ou de patients atteints d'affections non malignes) ne donne qu'un précipité qui est le précipité de Cl IA. Un des précipités du sérum des patients cancéreux correspond au précipité de Cl IA du sérum des patients cancéreux. La fig. 3 illustre une immunodiffusion de ce type. Dans les deux trous centraux, on introduit de l'antisérum oligospécifique et dans les trous de la circonférence, on introduit du sérum de donneurs sains et de divers patients. On introduit le sérum correspondant à chaque échantillon dans deux trous opposés. Dans le cas illustré, l'antisérum illustré provenait d'un mouton vacciné avec un vaccin de type 1 (voir ci-après «Vaccination des animaux hôtes»),

La fig. 3 montre la formation d'un précipité intérieur important identique pour le donneur et tous les patients. C'est le précipité de Cl IA. Cependant, le sérum du patient 3 (cancer confirmé) donne un précipité complémentaire facile à distinguer du précipité de Cl IA. C'est le précipité de Cl IAC. De même, tous les sérums donnent un précipité extérieur plus faible qui est le précipité d'orosomucoïde.

Il est évident que l'on peut facilement distinguer le précipité formé par le Cl IAC du précipité formé par le Cl IA. L'immunodif-fusion illustrée par la fig. 3 correspond à des expériences effectuées dans un but de diagnostic et, bien entendu, on peut obtenir des motifs de précipitation analogues avec des mélanges de Cl IA pur et de Cl IAC, et il va de soi que la technique d'Ouchterlony n'est qu'un exemple des techniques immunologiques d'identification ou de détermination (on pourrait citer également les techniques de Laurell,

Mancini et autres) permettant de différencier Cl IA et Cl IAC en utilisant un antisérum oligospécifique.

— Autres propriétés du Cl IAC

14) Evaluation du poids moléculaire du Cl IAC selon la technique de filtration sur gel

On équilibre une colonne de filtration sur gel Séphadex G 200 (Pharmacia K 25/50) avec du tampon Tris, à pH 8,6. On introduit dans la colonne une solution de Cl IAC-Sêphadex G 75 Superfine, de l'albumine humaine purifiée (qu'on a chromatographiée et dont on a vérifié la pureté par immunoélectrophorèse), d'hémoglobine (préparée par hémolyse d'érythrocytes et purifiée, dont on a vérifié la pureté) et d'IgG purifié (ayant un poids moléculaire de 130 000 à 150000), et on étudie l'efïluent par analyse spectrophotométrique, en confirmant l'identité des pics par immunoélectrophorèse. Le premier pic est constitué d'IgG et, lorsqu'il a totalement disparu, un second pic (Cl IAC) commence à apparaître. Lorsque le pic du Cl IAC est passé, on note de nombreuses fractions pratiquement vides, puis apparaît le pic suivant dû à l'albumine. Presque immédiatement après le pic d'albumine, le pic d'hémoglobine apparaît.

A partir de l'enregistrement spectrophotométrique, il est évident que le poids moléculaire du Cl IAC doit être supérieur au poids moléculaire de l'albumine qui est de 60 000 et juste inférieur au poids moléculaire de l'IgG. Le poids moléculaire de l'IgG est incertain (gamme de 130 000 à 150 000), la même incertitude s'applique à l'évaluation du poids moléculaire du Cl IAC, la position du pic correspondant à une valeur de 110 000 à 130 000.

15 ) Constante de sédimentation du Cl IAC déterminée à partir de la vitesse de sédimentation en ultracentrifugation

Conditions expérimentales:

Ultracentrifugeur: ultracentrifugeur analytique Mk2 de MSE, dispositif optique: Schlieren.

Cellules d'ultracentrifugation: cellules de 10 mm à double secteur à séparation synthétique et à trop-plein.

Echantillon: Cl IAC pur, provenant d'une culture de cellules de carcinome du sein d'origine humaine dans le milieu RPMI.

Vitesse de rotation: lre expérience: 60 000 tr/min,

2e expérience: 60 010 tr/min.

Température: lre expérience: 19,7°C,

2e expérience: 20,2°C.

Analyse de la solution: lre expérience: KH2P04,0,01M,

NaCl, 0,1M, àpH 7,00.

2e expérience: KH2P04,0,02M,

NaCl, 0,1M, àpH 7,00.

— Résultats lre expérience (c = 0,55% )

Photo N°

Temps écoulé après maintien de la vitesse

1 Alnr (SJapp ~ m2 At

4

10s

5,29 S

5

210 s

4,94 S

6

410 s

4,82 S

7

610 s

4,98 S

8

810s

4,57 S

Les résultats de la lre expérience sont illustrés par le graphique 1 de la fig. 15.

Par extrapolation (régression linéaire des valeurs) au ménisque (rT{)), on obtient le résultat suivant (voir graphique 1):

Se = s°9,7,sol. — 5,28 S

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

15

635 242

2e expérience (c = 0,94% )

Photo N°

Temps écoulé après maintien de la vitesse

1 Ain r

(Sc)app~co> At

7

0 s

5,00 S

8

201s

4,71 S

9

402 s

5,06 S

10

603 s

5,06 S

11

804 s

5,01 S

12

1005 s

4,86 S

Les résultats de la 2« expérience sont illustrés par le graphique 2 de la fig. 15.

Par extrapolation (régression linéaire des valeurs) au ménisque (r-fo), on obtient le résultat suivant (voir graphique 2):

Sc = S20,2,so1. = 4,97 S

— Conversion aux conditions standards:

1" expérience (c = 0,55% )

•ni 9,7,sol.

s20,soi. « «19,7,sol X ~ 5,28 x 1,01 S

il 20,sol.

•n20,sol.

s20w ~ s2osoi x ~ 5,28 x 1,01 x 1,03 = 5,49 S

' ' t|20,w

2e expérience (c — 0,94%)

ri20,2,sol.

S20,soi. « 520,2,sol. x . « 4,97x0,995 S

il20,sol.

n20,sol.

S20 w « S§0 sol x - Ä 4,97 x 0,005 x 1,03 = 5,09 S

' ' t|20,w

Il convient de noter que dans la conversion en conditions standards, on ne tient pas compte de la correction de densité, ni de la correction du volume spécifique partiel du Cl IAC. Le facteur de correction correspondant est probablement très voisin de 1.

Extrapolation à c = 0. Voir graphique 3, fig. 15. Le graphique 3

Les fig. 16 et 17 correspondent aux photos Nos 4, 6 et 8 de la lre expérience et 7,9 et 11 de la 2e expérience. De plus, la fig. 18 montre deux photos à t < 0 s (prise pendant l'accélération à 30 000 tr/min) et également à t = 1206 et 1608 s, respectivement.

Démonstration de l'association du CI IAC au cancer

Les matières et les méthodes utilisées dans cette expérience sont celles qui sont décrites ci-dessus.

Des exsudats pleuraux ou des ascites provenant de patients souffrant de carcinomes avancés servent de sources pour réaliser la culture de cellules de carcinomes. On exclut les fluides contaminés. Les cultures cellulaires, élevées dans des flacons Roux et dans des flacons en plastique de Falcon, sont réparties entre une croissance clonale ou un développement plus diffus. La morphologie des clones présente une polymorphie de noyaux et de cellules, un gros ou plusieurs nucléoles, beaucoup de cellules avec plusieurs noyaux. On constate de nombreuses mitoses. Parmi ces mitoses plusieurs sont atypiques. Les cellules sont suffisamment fixées au plastique et au verre.

27 des 37 cultures de carcinomes humains sont sous-cultivées de 1 à 4 fois. Cela fait une moyenne de 1,8 sous-culture de 27 cultures. On cultive donc des lignes de cellules et on les utilise pour produire du Cl IAC pendant une période s'étalant entre 2 et 5 mois. 10 cultures de cellules de carcinomes ne sont pas soumises à une sous-culture et sont ensuite utilisées pour produire du Cl IAC pendant environ 2 mois.

Le Cl IAC dépourvu de cellules est recueilli environ une fois par semaine et libéré alternativement dans un milieu MEM, contenant 15% de sérum de veau fœtal inactivé, et dans un milieu aminoacide RPMI. On peut ainsi faire 4 récoltes par mois sur une même culture de cellules. Au total, on réalise 235 isolations de Cl IAC. Parmi ces isolations, on en réalise 37 à partir de fluide pleural et d'ascites dépourvus de cellules.

On effectue 101 isolations à partir du milieu MEM contenant 15% de sérum de veau fœtal inactivé et 97 isolations à partir du milieu RPMI. Sur chacune des cultures de cellules de carcinome, on isole le Cl IAC de 2 à 14 fois. Cela fait une moyenne de 5,4 opérations d'isolations par culture cellulaire. Pendant la période de croissance dans le milieu RPMI, le développement cellulaire est diminué, tandis que, pendant la période de croissance dans le milieu MEM contenant le sérum de veau fœtal inactivé, les cellules reprennent leur cycle de croissance normale in vitro. Dans plusieurs cultures cellulaires, il est nécessaire de laisser la culture cellulaire se développer davantage avant de réutiliser le milieu RPMI. On maintient une quantité optimale de cellules dans une culture d'environ 2 • 105 cellules par flacon Roux. On contrôle constamment les cultures cellulaires pour examiner le développement des différents types de cellules. Les types de cellules provenant de la plèvre et de l'ascite consistent en cellules de carcinomes, en fibroblastes et cellules mésothéliales. Dans des flacons avec croissance clonale de cellules de carcinomes, il n'est pas difficile d'établir une quantité approximative de ces cellules. Mais dans les cultures cellulaires à croissance relativement diffuse, il est plus difficile d'évaluer la quantité approximative des cellules de carcinomes. La quantité de cellules produisant le Cl IAC est reliée à la quantité de cellules enduites de Cl IAC, telle qu'on la trouve par cytophoto-métrie, à partir de lignes de cultures cellulaires identiques.

On utilise un total de 37 patients à titre de donneurs. L'âge des patients est compris entre 33 et 80 ans. Il y a 34 femmes et 3 hommes. Les 37 patients sont soignés à l'hôpital où on leur élimine les liquides pleuraux et d'ascites. Tous les malades présentent des carcinomes très avancés de diverses origines. Ils ont tous déjà subi au cours de leur maladie 1 à 3 traitement par rayonnements. Tous les malades ont été traités avec des cytostatiques et de la cortisone ou de la Prednisone. 25 patients sont traités à la cortisone ou la Prednisone durant la période où ils servaient de donneurs.

Cultures témoins de cellules humaines

Des transsudats pleuraux et d'ascites provenant de patients souffrant de maladie non néoplastique servent de source de cellules non malignes. Cette forme de source de cellules pour une culture in vitro se révèle être une source suffisante. La fixation au flacon Falcon est suffisante, mais elle est plus difficile sur les flacons en verre du type Roux. L'expérience montre qu'il faut une plus longue période de temps pour obtenir une quantité suffisante de cellules pour la production de protéines, comparables à celles que l'on obtient dans une culture de cellules malignes. On n'obtient aucun développement clonai, mais toutes les cultures de cellules se développent de façon diffuse.

Les cellules qu'on a trouvé sur les flacons sont des fibroblastes et des cellules mésothéliales. Au total, on fait 28 isolations témoins de protéines pour détecter une protéine ressemblant au Cl IA ou au Cl IAC. De même que pour les cultures de cellules de carcinomes, on récolte la protéine dépourvue de cellules environ une fois par semaine et on la laisse tour à tour dans un milieu MEM contenant 15% de sérum de veau fœtal inactivé et dans un milieu aminoacide RPMI. On examine de plus des cultures cellulaires témoins par immunofluo-rescence et cytophotométrie pour rechercher la présence de dépôt d'inactivateur Cl, tel qu'on le montre plus loin.

Cytophotométrie par immunofluorescence

Les mesures cytophotométriques sont effectuées sur 36 cultures cellulaires primaires provenant de patients atteints de carcinomes et sur 10 cultures de cellules de contrôle provenant de lignes cellulaires non malignes. On utilise un total de 25 cultures secondaires prove5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

635242

16

nant de lignes cellulaires de carcinomes pour réaliser les mesures cy-tophotométriques, afin d'établir l'enduit de Cl IAC sur les lignes de cellules de carcinomes sous-cultivées.

L'enduit de Cl IAC est associé à une membrane ainsi que le montrent les photos des cellules présentant une immunofluorescence positive.

Parmi les lignes de cellules primaires de carcinomes, une moyenne de 51,3% des cellules montre une immunofluorescence spécifique avec l'anti-Cl IA-FITC tel que mesuré par cytophotométrie. Les distributions moyennes des mesures d'immunofluorescence sur des cultures de cellules de carcinomes sont indiquées dans la fig. 19. On estime que des valeurs inférieures à 40 u.p. correspondent à des signaux non spécifiques.

Une moyenne de 58,4% des cellules provenant des lignes de cellules sous-cultivées montre une immunofluorescence spécifique. Lorsque l'on compare les cellules de carcinomes cultivées de façon primaire avec les lignes de culture sous-cultivées, la quantité de cellules présentant un dépôt de Cl IAC varie de façon significative.

Dans certaines des lignes de cellules sous-cultivées, la quantité de cellules enduites de Cl IAC est supérieure à celle que l'on trouve dans leur culture d'origine.

Lorsque l'on effectue une immunofluorescence spécifique de contrôle, telle qu'on la réalise avec présaturation de la culture cellulaire avec de l'anti-Cl IA non marqué, suivie d'une incubation avec de l'anti-Cl IA-FITC et d'une neutralisation de l'anti-Cl IA-FITC (avec du Cl IA purifié), on ne constate pas de valeurs dépassant la ligne de séparation et, donc, on ne trouve pas une seule cellule qui montre une immunofluorescence spécifique. Les cultures de cellules de contrôle (cellules non malignes), examinées par cytophotométrie, ne présentent aucun dépôt d'inactivateur de Cl. Les valeurs déterminées à propos de ces cellules sont toutes inférieures à 40 u.p. Les valeurs des cultures de cellules de contrôle sont distribuées en gros comme les valeurs obtenues dans le contrôle de la spécificité de l'immunofluorescence. La régularité des résultats obtenus avec les cultures de cellules de contrôle est d'au moins 63% et elle est d'au moins 90% avec les cultures de cellules malignes. La différence significative est inférieure à 0,002 (test exact de Fischer).

Des milieux de contrôle MEM contenant 15% de sérum de veau fœtal inactivé et des milieux de contrôle RPMI (qui ne sont pas utilisés pour la culture cellulaire) sont soumis à une immunoélectrophorèse avant et après une élution sur Dowex. Les milieux étudiés ne révèlent pas la présence de lignes de précipitation vis-à-vis de l'antisérum anti-Cl IA humain du lapin. Les seules lignes de précipitation détectées sont obtenues vis-à-vis de l'antisérum albumine antihumaine provenant du lapin. Ces expériences témoins prouvent donc que les milieux utilisés pour réaliser la culture de cellules ne renferment pas de protéines capables de réagir avec l'anti-Cl IA avant d'être utilisées pour la culture de cellules.

Des milieux MEM et des milieux RPMI, récoltés à partir de lignes de cellules non malignes et soumises à une immunoélectrophorèse, ne révèlent aucune ligne de précipitation en présence d'antisérum anti-Cl IA humain du lapin. Dans le test d'immunodiffusion Ouchterlony, il n'y a aucune lignes de précipitation en présence d'antisérum Cl IA humain provenant du lapin.

Il en résulte que les cultures témoins de cellules non malignes ne libèrent pas une quantité détectable de Cl IA dans les milieux, lorsque la détection est réalisée par immunoélectrophorèse et immuno-diffusion.

Purification du Cl IACjCl IA provenant defluide pleural/d'ascites cancéreux

On centrifuge de la manière décrite plus haut dans la partie «Préparation du Cl IAC» du fluide pleural ou ascitique provenant de malades atteints d'un cancer avec métastases à la plèvre et/ou au péritoine, et l'on transplante le précipité dans des cultures de cellules cancéreuses, tel que décrit ci-dessus. On laisse se coaguler spontanément pendant 2 h à la température ambiante le liquide surnageant, éventuellement après un stockage à — 20e' C (voir plus haut). Ensuite, on laisse reposer pendant 16 h dans un réfrigérateur pour obtenir une coagulation spontanée complète. On centrifuge à nouveau le liquide surnageant afin d'éliminer la fibrine et on le gèle à — 20° C jusqu'à la prochaine étape de purification.

On mélange 2 ml de fluide pleural/ascitique ainsi traité avec 2,5 g d'échangeur d'anions Séphadex A50 DEAE qui a été préchauffé à 100° C pendant 30 min, puis refroidi à température ambiante. On agite le mélange à 8°C pendant 1 h. Ensuite, on place le mélange dans une colonne et on lave avec 5 fois 40 ml de NaCl 0,15M en établissant une succion au bas de la colonne. La matière protéinique Cl IAC/C1 IA est absorbée dans l'échangeur d'ions. On lave la matière échangeuse d'ions dans la colonne avec 20 ml de NaCl, 2M, et du citrate trisodique, 0,01M, pH 7,0.

Le dernier éluat contenant Cl IAC/C1 IA est mélangé à du sulfate d'ammonium saturé (pH ajusté à 7,0 avec de la soude) jusqu'à saturation à 50%, à 8°C, en 1 h.

Ensuite, on effectue une centrifugation (10 min à 3000 tr/min à température ambiante), puis on ajoute au liquide surnageant du sulfate d'ammonium (tel que ci-dessus et à pH 7,0), jusqu'à saturation à 65%, à 8°C, en 1 h. A nouveau, on réalise une centrifugation (10 min à 3000 tr/min à température ambiante). On dialyse ensuite le précipité contenant le Cl IAC/C1 pendant 16 h en présence d'eau distillée de 4 à 6°C, puis on le redissout dans du NaCl 0,15M.

On lyophilise la solution soit par une lyophilisation en coquille, soit par une lyophilisation sous vide avec chauffage extérieur tel que décrit dans la partie intitulée «Préparation du Cl IAC».

Le produit, par la suite dénommé Cl IAC/C1 IA DEAE Séphadex A50, est prêt à être utilisé dans des vaccins, seul ou en mélange avec Cl IAC/C1 IA, a2HS, Zn a3, orosomucoïde.

Purification du Cl IA/C1 IAC contenant de l'orosomucoïde, de l'a2HS glycoprotéine et de la Zn a2 glycoprotéine à partir de fluide pleural/d'ascites

On centrifuge de la façon décrite dans la partie ci-dessus, «Préparation de Cl IAC», du fluide pleural ou ascitique provenant de malades atteints de cancer avec des métastases dans la plèvre et/ou le péritoine, et on transplante le précipité dans des cultures de cellules cancéreuses telles que décrites plus haut. On laisse le liquide surnageant, éventuellement après un stockage à — 20° C sous vide, coaguler pendant 2 h à température ambiante. On enlève le caillot et recentrifuge le fluide à 1200 tr/min à température ambiante pendant 10 min. Ensuite, on relargue le fluide pour faire précipiter les protéines contaminantes, en établissant par exemple une saturation à 40% à l'aide de sulfate d'ammonium saturé à 0°C, tout en agitant. Ensuite, la poursuite des opérations est réalisée de la même manière et dans les mêmes conditions que celles qui sont décrites après le relargage décrit dans la section ci-dessus, «Préparation du Cl IAC», sous-section «Isolation du Cl IAC», en utilisant une colonne échangeuse d'anions de cellulose Whatman DE-52 pour la purification finale.

La fig. 14 illustre un exemple d'une immunoélectrophorèse croisée Freeman vis-à-vis du sérum antiprotéine humain entier.

Le pic 1 est obtenu avant traitement du fluide pleural, tandis que le pic 2 est obtenu sur une fraction riche en Cl IA + Cl IAC provenant d'un passage sur Dowex. Sur l'immunoélectrophorèse pic 1, on voit que le pic représentant Cl IAC + Cl IA est relativement élevé par rapport à la plupart des autres protéines (le pic très haut est celui de l'albumine), ce qui indique l'état cancéreux. Dans la partie du pic 2, on peut aussi détecter des pics correspondant à l'orosomucoïde et à l'a2HS glycoprotéine, bien qu'il soit faible (l'identité de la protéine dans chacun des pics est déterminée de façon certaine par immunoélectrophorèse croisée parallèle vis-à-vis d'antisérum spécifique).

La fig. 20 montre un exemple d'un graphique de première élution sur Whatman DE-52. La colonne est une Pharmacia K 26/70, avec un volume de lit de 2,6 x 70 cm et munie d'un raccord d'écoulement. Le pic correspondant au Cl IAC + Cl IA est le pic 6.

Les fractions riches en Cl IA/C1 IAC et les trois autres protéines mentionnées ci-dessus [dont la nature est déterminée par immuno-

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électrophorèse dite à fusée (rocket) et Grabar-Scheidegger utilisant des antisérums disponibles industriellement vis-à-vis de l'a2HS glycoprotéine, la Zn a2 glycoprotéine, et l'orosomucoïde, et l'anti-Cl IA humain de lapin (un exemple de l'immunoélectrophorèse à fusée vis-à-vis de l'antiorosomucoïde est montrée dans la fig. 21)] sont rassemblées, dialysées et lyophilisées tel que décrit plus haut. Par la suite, le produit résultant est appelé Cl IAC/C1 IA, a2HS, Zn a2 orosom.. Ce produit est prêt à être utilisé en tant qu'agent immunogênique dans un vaccin qui convient pour des vaccinations de rappel (2e et 3e vaccinations des animaux hôtes), de préférence en mélange avec d'autres protéines décrites ici.

Vaccination des animaux hôtes

On peut choisir divers animaux pour les vacciner avec des vaccins contenant le produit décrit ci-dessus en tant qu'agent immunogênique pour produire des antisérums. On a trouvé que des cochons de la Dansk Landrace ou un mélange de race Yorkshire et de Dansk Landrace et les moutons de race Jysk Hederace et de race Oxford Down fournissent la spécificité optimale des anticorps vis-à-vis des protéines décrites ci-dessus. Un type de cochon particulièrement intéressant à utiliser en tant qu' hôte est celui des cochons appelés SpF, c'est-à-dire des cochons qui sont nés et ont grandi en conditions stériles, dans la mesure où de tels cochons ne portent pas déjà des anticorps vis-à-vis des antigènes autres que ceux qui apparaissent normalement au cours des étapes initiales de la vie du cochon, ce qui signifie que, grâce à l'immunisation réalisée selon l'invention, il est possible d'obtenir une fraction IgG contenant une forte proportion de spécificité vis-à-vis de l'antigène ou des antigènes inclus dans le vaccin utilisé.

Les cochons sont choisis à l'âge de 4 mois; on leur fait une première vaccination sous-cutanée sur un côté du cou, puis on surveille leur réaction à la vaccination. Lorsque la réaction est correcte, les lieux de vaccination sont gonflés et éventuellement ulcérés (comme des blessures), de même qu'une réponse positive à la vaccination contre la variole.

De plus, la détermination du titre et la détermination de l'IgG sur le sérum du cochon sont faites de la manière suivante:

— Titre d'anti-Cl IA : On soumet un sérum humain standard ayant une concentration connue en Cl IA (30 mg/ml ± 10%) à une immunoélectrophorèse à fusée vis-à-vis de 2% d'anti-Cl IA humain de lapin (2 mg/ml) dans le gel. Les fusées ainsi obtenues servent maintenant de référence pour des fusées d'immunoélectrophorèse de sérum humain standard vis-à-vis de dilutions d'antisérum de cochon dans des gels. La dilution d'antisérum de cochon, donnant la même hauteur de fusée que le gel contenant 2% d'anti-Cl IA humain de lapin, renferme donc 2 mg/ml d'anti-Cl IA humain de cochon et, en multipliant avec le facteur de correction correspondant à la dilution, on calcule le titre d'anti-Cl IA humain de cochon.

— Titre d'anti-Cl IAC: On suit la même procédure, en utilisant cette fois une solution standard de Cl IAC Séphadex (dénomination commerciale) G 75 Superfine à la place de sécum humain standard. On attribue un titre de 2 mg/ml à une dilution de gel de sérum de cochon fournissant la même hauteur de fusée que les 2% d'anti-Cl IA de lapin et l'on corrige le résultat pour tenir compte de la dilution.

— IgG: La concentration moyenne d'IgG dans le sérum du cochon est déterminée par immunoélectrophorèse à fusée de la façon décrite ci-dessus avec un gel contenant 4% d'anti-IgG humain de lapin. La référence est constituée par le lot 974 Behringwerke de sérum humain standard.

3 semaines après la première vaccination, on administre par voie sous-cutanée une dose de rappel de vaccin de l'autre côté du cou. On examine ensuite les cochons et étudie leur sérum de la façon décrite ci-dessus.

Une deuxième dose de rappel est administrée dans le dos, en partie en intramusculaire profonde, en partie par voie sous-cutanée, 4 semaines après la première vaccination de rappel. 6 d après la seconde vaccination de rappel, on examine les cochons à nouveau de la façon décrite plus haut et l'on détermine le titre d'anticorps sanguin et la spécificité. Des valeurs moyennes normales après le second rappel sont d'environ 2 mg/ml d'anti-Cl IA, 2 mg/ml d'anti-Cl IAC, et environ 1200 mg% d'IgG.

De 9 à 14 d après la dernière vaccination, on égorge les cochons après décharge électrique dans un abattoir sanitaire tel que décrit ci-dessous.

On vaccine les moutons au cou de la façon décrite à propos des cochons. Ces animaux peuvent servir de donneurs et peuvent avantageusement être revaccinés et resservir plusieurs fois. Des valeurs de titre normal moyennes, obtenues chez le mouton (déterminées d'une manière analogue selon les méthodes décrites plus haut), sont d'environ 1 mg/ml d'anti-Cl IA, 3 mg/ml d'anti-Cl IAC, et d'environ 1500 mg% d'IgG.

Exemples de vaccins préférés

— Type 1

La première vaccination est réalisée avec une quantité totale de 20 mg de protéine Cl IAC agglomérée + Cl IAC Séphadex (dénomination commerciale) G 75 Superfine, dissoute dans 1 ml de NaCl 0,15M, et mise sous forme d'émulsion eau dans l'huile avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund.

Pour faire la dose de rappel, on mélange 20 mg de protéine Cl IAC agglomérée + Cl IAC Séphadex (dénomination commerciale) G 75 Superfine, avec 20 mg de Cl IAC/C1 IA DEAE Séphadex (dénomination commerciale) A50 et 20 mg de Cl IAC/C1 IA, a2HS, Zn a2, orosomucco. On remet en suspension le mélange dans 1 ml de NaCl 0,15M et le met sous forme d'émulsion eau dans l'huile avec un volume égal d'adjuvant complet de Freund. Ce produit de rappel convient comme dose de premier et deuxième rappels pour les cochons et les moutons.

— Type 2

De la protéine Cl IAC agglutinée + Cl IAC Séphadex (dénomination commerciale G 75 Superfine est donnée comme produit de vaccination initiale à des animaux de production de type mouton ou cochon, utilisables à la préparation d'antisérum dans des buts de diagnostic ou de thérapie.

La dose de rappel est constituée par du Cl IAC/C1 IA DEA Séphadex (dénomination commerciale) A50 remis en suspension dans 1 ml de NaCl 0,15M, mis sous forme d'émulsion eau dans l'huile à l'aide d'un volume égal d'adjuvant complet de Freund. Ce vaccin peut servir pour les doses de rappel.

On égorge les cochons de la façon suivante. D'abord, on les soumet à une décharge électrique, à la suite de laquelle ils se trouvent dans un état inconscient et sont saignés par l'intermédiaire de tuyaux en forme d'entonnoirs dans des bouteilles Pyrex stériles de 51 contenant 11 de citrate du type ACD comme agent anticoagulant. Il serait possible de mettre en œuvre d'autres agents anticoagulants, par exemple l'héparine, mais comme le sang du cochon a une tendance très prononcée à se coaguler, on préfère utiliser l'ACD. Ensuite, on conserve le sang dans des conditions de basse température, jusqu'au moment où on l'utilise.

Lors du traitement du sang, on réalise la centrifugation du plasma sur une centrifugeuse refroidie MSE Mistral 61 tournant à 4000 tr/min. Le plasma est immédiatement congelé à — 20° C et conservé à cette température jusqu'au moment où on effectue le fractionnement en immunoglobuline.

Avant de réaliser le fractionnement des immunoglubulines, le plasma du cochon est filtré de façon stérile, par exemple à l'aide d'un filtre Millipore, dont la dimension de pore diminue jusqu'à 0,22 |i.

On peut traiter le sérum du cochon pour obtenir un produit comprenant les immunoglobulines IgG et pratiquement aucune autre protéine du cochon, selon des méthodes bien connues; par exemple une précipitation associée Rivanol et ammonium, et des exemples de méthodes cohvenables sont décrits par exemple par Schwick et al., «Progress Immunobiol.» Standard 4,96, Basle, Munich, New York (1968) (Karger), par Horejsi, J., et Smetana, R., «Acta Med. Scand.»

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155,65 (1956), et par Dietzel, E., et al., «Behringwerke Mitteilungen» 43, 129(1964).

On a donc ainsi préparé les immunoglobulines IgG du cochon de la façon ci-dessus; on les a administrées par voie intraveineuse tous les jours pendant 4 mois à un cancéreux, avec une interruption de 14 d (vacances) réalisée 1 mois 'A après le début du traitement. On surveille en continu le patient du point de vue immunologique pour déterminer tous signes de développement de réponse immunitaire vis-à-vis des immunoglobulines IgG du cochon; un tel examen comprend des tests de précipitation par interaction du sérum du patient avec les immunaglobulines IgG du cochon [autres que le précipité dû à la présence dans le sérum du patient, de protéines vis-à-vis desquelles le cochon a été immunisé (en utilisant également l'IgG provenant d'un cochon non-immunisé à titre de témoin)], des essais pour produire de l'IgE, des essais pour observer l'interaction entre le sérum du patient avec d'autres protéines du cochon. La surveillance immunologique ne révèle aucun développement d'une réponse immunitaire vis-à-vis de l'IgG du cochon chez le patient, même après l'intervalle de 14 d. On ne remarque également aucune indication clinique d'une quelconque non-tolérance de l'IgG du cochon.

— Systèmes diagnostics

Pour obtenir un système diagnostic utile et sûr permettant d'établir un diagnostic différentiel entre des maladies malignes et non-malignes et de suivre l'évolution d'une maladie maligne, à la fois par rapport à l'état non-traité et en fonction de différents traitements et pendant la période d'après-traitement (cette dernière pour savoir s'il y a une rechute du cancer), un système diagnostic selon la présente invention est, de préférence, un système qui comprend de l'anti Cl IAC humain ou son produit de modification ou dérivé actif du point de vue immunologique, et il est conçu et utilisé de telle façon que la réaction immunologique avec le CA IAC dans un échantillon est facilement distinguable de toute réponse au Cl IA dans l'échantillon. Ceci est une nécessité fondamentale qui doit être remplie par tout système diagnostic selon l'invention, dans la mesure où c'est la présence du Cl IAC dans l'échantillon provenant du patient qui indique sans ambiguïté que le malade souffre d'un cancer.

Ainsi qu'on l'a expliqué ci-dessus, les niveaux de sérum d'inacti-vateurCl (Cl IA + Cl IAC) et C4 constituent d'utiles indications concernant l'évolution de cancer prouvé et l'évolution au cours de la période d'après-traitement, et de plus, un haut niveau d'inactivateur Cl montre la présence d'un cancer, voir la fig. 2. L'un des aspects de l'invention concerne les systèmes diagnostics permettant la surveillance de l'évolution de maladies cancéreuses, tels que des systèmes diagnostics comprenant des anti-Cl IA et anti-C4. Cependant, la présence d'un taux élevé d'inactivateur Cl ne donne pas une preuve certaine d'une maladie cancéreuse, parce que également, certaines affections virales peuvent provoquer l'élévation forte des niveaux d'inactivateur Cl qui, de plus, peuvent être accompagnées par des niveaux C4 élevés. Dans le cas de telles maladies à virus non-malignes, le niveau d'inactivateur Cl, bien que haut, ne comprendrait pas de Cl IAC. Donc, un système diagnostic fournissant une distinction sûre entre de telles maladies non-malignes et le cancer est un système qui doit être capable de montrer de façon sélective la présence de Cl IAC dans un échantillon.

La fig. 4 illustre un système diagnostic préféré selon l'invention susceptible de remplir les trois conditions précédentes. Le système comprend une plaque de verre ou un autre support convenable 1 sur lequel sont déposées trois sections de couches de gel (2,3 et 4) avec différents antisérums. Dans les couches de gel, on ménage des trous 5 à l'emporte-pièce ou à l'aide d'une autre technique convenable. Dans la section 2 de gel, on incorpore une substance contenant de l'anti-Cl IAC humain. Cette substance peut être un sérum oligospécifique qui est sensible, à la fois au Cl IAC et au Cl IA, mais les différencie (par exemple, un sérum préparé à partir de mouton en utilisant un vaccin de type 2 tel que décrit dans la section «Vaccination des animaux hôtes»); dans ce cas, un échantillon de sérum provenant d'un donneur en bonne santé ou d'un malade souffrant d'une maladie non-maligne ne donnera lieu qu'à un anneau de précipitation, tandis qu'un sérum provenant de malades cancéreux fournira deux anneaux de précipitation.

Il est préférable, cependant, que la matière contenant l'anti-Cl IAC humain incorporé dans le gel de la section 2, soit une matière anti-Cl IAC humaine monospécifique, par exemple préparée par l'absorption d'anticorps vis-à-vis de toute autre protéine du sérum humain à partir d'une matière contenant de l'anti-Cl IAC humain par incubation avec le sérum global provenant de donneurs en bonne santé, suivie d'une séparation telle que décrit ci-dessous. Dans le cas où la section 1 comprend une telle substance monospécifique en Cl IAC humaine, la réaction à un échantillon de sérum de malade cancéreux dans la section 2 sera un anneau simple autour du trou dans lequel l'échantillon a été appliqué, tandis qu'avec un donneur en * bonne santé, ou souffrant d'une maladie non-maligne, on constatera une absence totale de tout anneau de précipitation autour du trou dans lequel a été appliqué l'échantillon. On considère que cela est la réaction la plus caractéristique et la moins ambiguë que l'on puisse obtenir. Dans la fig. 3, FS INA indique une telle matière contenant l'anti-Cl IAC humain monospécifique, préparé par absorption à partir d'antisérum produit chez le mouton.

Dans la section 3, une matière contenant l'anti-C4 humain est incorporée dans le gel, par exemple un anti-C4 humain de lapin industriel.

Dans la section 4, on incorpore dans le gel un inactivateur Cl antihumain; c'est par exemple l'anti-Cl IA humain du lapin qui, tel que décrit ci-dessus, n'est pas capable de distinguer le Cl IAC du Cl IA et qui donne donc lieu à précipitation avec la totalité de Cl IA s'il y a présence de Cl IAC dans l'échantillon de sérum appliqué. Bien sûr, dans les sections 3 et 4 également, la matière à activité immunologique présentant la réaction recherchée peut être une modification ou un dérivé de l'anticorps naturel, à condition qu'il présente les réactions caractéristiques immunologiques avec C4 et Cl IA, respectivement. Les sections 3 et 4 servent pour estimer quantitativement les niveaux de C4 et d'inactivateur Cl, respectivement.

Ainsi qu'on le voit sur la fig. 4, le sang provenant d'un donneur en bonne santé ne donne aucun anneau de précipitation dans la section FS INA, tandis que l'on voit des anneaux de précipitation de diamètres relativement petits dans les sections anti-C4 et anti-Cl IA, correspondant à des valeurs normales basses de C4 et Cl IA. Le sérum du malade N° 1 donne un anneau de précipitation dans la section FS INA, ce qui démontre que le patient souffre d'un cancer. Dans la section anti-C4, l'anneau de précipitation présente un grand diamètre et indique de hauts niveaux de C4 dans le sérum, et aussi dans la section anti-Cl IA, on voit un grand anneau de précipitation qui montre que le taux d'inactivateur Cl (Cl IA + Cl IAC) dans le sérum du patient est élevé. Le sérum du patient N° 2 fournit de grands anneaux de précipitation dans les sections anti-C4 et anti-Cl IA, mais aucun anneau de précipitation dans la section FS INA. Ceci montre que le patient ne souffre pas d'un cancer, mais qu'il présente des niveaux d'inactivateur Cl et de C4 anormalement hauts, ce qui peut être dû, par exemple, à une infection virale.

On prépare de la manière suivante un système diagnostic préféré du type illustré par la fig. 4: on chauffe 1 % d'agarose dans du tampon diémal, pH 8,6, jusqu'à ce qu'elle soit fluide (d'autres gels, comme l'agar, et d'autres tampons peuvent être aussi utilisés, mais l'association indiquée ici fournit d'excellents résultats). Ensuite, on refroidit le gel à 45° C et l'on ajoute l'antisérum. Un antisérum convenable pour là section anti-C4 est constitué par l'anti-C4 humain de lapin employé de préférence à raison de 1%. Pour la section anti-Cl IA, l'anti-Cl IA humain de lapin donne d'excellents résultats lorsqu'on utilise une quantité de préférence de 1 %. Pour la section anti-Cl IAC, la matière préférée (donnant un anneau de précipitation uniquement dans le cas de cancer) est l'anti-Cl IAC humain du mouton (absorbé, si besoin est), ajouté à raison de 0,25% [la préparation de l'anti-Cl IAC humain du mouton (absorbé) est décrit en détail ci-après].

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Lorsqu'on a ajouté l'anticorps ou l'antisérum, on verse chaque portion distincte de gel selon la configuration désirée sur le support, puis on laisse le gel se solidifier à la température ambiante. Lorsque le gel est solide, on perce des trous en un nombre et selon un modèle recherché, par exemple tel que montré sur le dessin, et l'on marque les sections de gel de façon appropriée si l'on veut. On emballe correctement les systèmes diagnostics et les munit d'un mode d'emploi accompagné de photos indiquant les réponses caractéristiques, ainsi que des courbes d'étalonnage standard permettant de déterminer le niveau dans le sérum de C4 et d'inactivateur Cl à partir du diamètre de l'anneau de précipitation formé.

Naturellement, on peut effectuer plusieurs modifications dans le projet et la technique ci-dessus. Par exemple, on peut mettre chacun des gels sur un support séparé, et on peut utiliser plusieurs autres modèles que celui qui est indiqué sur le dessin. Ce sont des modifications insignifiantes et évidentes à l'homme de l'art. De même, on peut utiliser d'autres supports que le gel décrit ici. Cependant, la mise en œuvre décrite ci-dessus permet d'obtenir des résultats excellents et sans ambiguïté en pratique.

On prépare l'anti-Cl IAC humain du mouton (absorbé), utilisé dans la procédure ci-dessus, de la manière suivante: On ajoute à 10 ml d'anti-Cl IAC humain du mouton, préparé tel que décrit dans la section «Vaccination des animaux hôtes» (à l'aide du vaccin de type 2), et ayant une concentration en immunoglobuline de 1500 mg% d'IgG et un titre en anticorps spécifique de 3 mg/3 ml, 400 jj.1 de sérum de donneur humain (qui évidemment n'a pas été inactivé à chaud); on incube le mélange à 37°C pendant 30 min. Ensuite, on réalise une centrifugation à 3000 tr/min, et incube le liquide surnageant à 4°C, puis on le recentrifuge. Le liquide surnageant provenant de la dernière centrifugation sert d'anti-Cl IAC humain du mouton (absorbé).

Un autre aspect intéressant d'un système diagnostic selon l'invention est un système à gel agarose à immunodiffusion comparative (Weir, «Handbook of Expérimental Immunology», Vol. 1, Immuno-chemistry, Blackwell Scientific Publications, 1973, pp. 19-21), pourvu d'un ensemble de trous, tel que montré dans les fig. 29 et 30. Un système de ce type convient pour réaliser un essai de dépistage et également, dans une certaine mesure, pour surveiller de manière semi-quantitative le milieu de Cl IAC dans les fluides corporels du malade, en particulier le sérum. On prépare le système d'essai d'immunodiffusion comparative illustré dans les fig. 29 et 30 en déposant du gel agarose contenant l'antisérum sur une plaque de verre, puis en perçant des trous assortis dans le gel quand celui-ci est solidifié.

Pour préparer le système d'essai d'immunodiffusion comparative, on utilise de préférence un gel agarose Litex ou un gel agarose Indubiose A37, tous les deux avec une faible électro-endosmose. Le même gel peut également être utilisé pour la préparation des systèmes d'essai contenant l'anti-inactivateur de Cl et l'anti-C4', et la concentration moyenne du sérum par rapport à la concentration du sérum standard est réduite quant à l'anti-inactivateur de Cl et l'anti-C4 lorsqu'on utilise un gel à faible électro-endosmose.

Pour préparer le système d'essai d'immunodiffusion comparative, on dissout 1 % de gel agarose Litex ou de gel agarose Indubiose A37 dans du tampon diémal, à pH 8,6. La solution est chauffée en autoclave à 120°C, puis refroidie à 51°C. A cette température, l'antisérum [en général de l'antisérum du mouton (généralement non absorbé)] est ajouté au gel à la concentration désirée, cette concentration étant ajustée par un essai initial de précipitation vis-à-vis d'un aliquote de sérum standard de cancer d'une telle manière que, de charge en charge, l'anneau de précipitation avec le sérum standard ait toujours le même diamètre. Cela aide à la lecture semi-quantitative du précipité de Cl IAC et constitue une technique normale utilisée dans la préparation de tests d'immunodiffusion Mancini. On ajoute au gel I % d'azide de sodium et 0,1 % de merthiolate en tant qu'agents bac-tériostatiques ou fongicides. A la place de l'antisérum du mouton non absorbé, on peut également utiliser de l'antisérum de lapin absorbé ou de l'antisérum de cochon ou une fraction d'immunoglobuline IgG de cochon dans cet essai d'immunodiffusion comparatif ou impliquant une haloplaque selon l'invention.

On se réfère aux fig. 29 et 30. Dans la fig. 29, on voit trois réactions positives Cl IAC dans la rangée inférieure de trous percés. Il est évident que, dans tous les cas, la précipitation interréagit complètement avec l'antigène standard Cl IAC négatif (sérum de donneur de sang ou ensemble de sérum de donneur de sang), appliqué dans la rangée supérieure de trous. Dans le trou du milieu, l'anneau de Cl IAC est tout à fait rond, sans qu'il y ait une quelconque inhibition vis-à-vis du sérum standard contenant l'antigène. Dans le trou en bas à gauche, on voit un anneau plus large, qui indique une plus grande concentration de Cl IAC. Dans le trou de droite, on voit deux anneaux distincts, l'un qui ne présente aucune inhibition vis-à-vis de ces sérums standards, et l'autre qui interréagit avec celui-ci. L'un de ces anneaux est un anneau de précipitation de Cl IAC.

Dans la fig. 30, on voit trois exemples classiques de tests négatifs de Cl IAC. On constate que, dans deux des trois cas, il se forme des anneaux complètement coalescents entre le sérum du malade et le sérum négatif standard, tandis que, dans la troisième rangée, il y a à la fois un anneau coalescent et une inhibition de l'anneau entre le sérum standard et le sérum du patient, ce qui indique une identité entre les deux types d'antigènes.

Lorsqu'on met en œuvre le système d'essai d'immunodiffusion comparative selon l'invention, il faut appliquer le sérum du patient et le sérum négatif standard en même quantités et aux mêmes concentrations, de préférence à raison de 10 |il par trou, de préférence non dilué; la durée d'incubation est avantageusement de 48 h à la température ambiante, ou de 72 h à 4°C.

La distance optimale entre les trous découpés dans le gel (le trou supérieur pour le sérum négatif standard et le trou inférieur étant pour le sérum du patient) est de 2 mm entre les périphéries des trous, le diamètre des trous étant de 5 mm.

Il faut conserver les systèmes de diagnostics selon la présente invention à basse température (entre 4 et 8°C), et dans une atmosphère humide ou dans un récipient clos. La durée de vie des systèmes diagnostics selon l'invention est estimée à environ 1 an dans de telles conditions.

La meilleure lecture des essais du système diagnostic selon l'invention est obtenue après coloration avec, par exemple, du Bleu Coo-masie. Avant de colorer, on relargue le gel avec une solution saline (0,15M) pendant 16 h, puis on la rince dans de l'eau distillée pendant 1 h. On fait suivre la coloration avec du Bleu Coomasie d'une décoloration à l'aide d'une solution de méthanol/acide acétique; on sèche ensuite le test à la température ambiante jusqu'à ce que le film soit dur. Ensuite, il est possible d'effectuer une nouvelle décoloration avec la même solution, afin d'obtenir un arrière-fond plus clair.

Evidemment, il faut soigneusement vérifier la pureté et la spécificité des réactifs utilisés pour préparer le système diagnostic et exercer un contrôle scrupuleux de qualité lors de la prépration du système ou équivalent.

Le sérum du malade utilisé pour réaliser le test d'immunodiffusion de Cl IAC selon l'invention (ou pour tout autre essai selon l'invention tendant à montrer la présence ou l'absence de Cl IAC) doit de préférence ne pas avoir plus de 8 d, et il doit être conservé à basse température (de préférence entre 4 et 8°C, plutôt que dans des conditions de réfrigération) juqu'à ce que l'on réalise le test. Cependant, dans le cas où il est nécessaire de conserver l'échantillon de sérum pendant des périodes plus longues avant de pouvoir réaliser l'essai, ce sérum doit être conservé à — 80° C ou plus bas, bien qu'une période de conservation limitée (de l'ordre d'environ une quinzaine) à —20° C n'altère pas sérieusement la sûreté du résultat de l'essai.

On utilise également un essai d'immunodiffusion comparatif du type décrit ci-dessus pour contrôler la spécificité en Cl IAC sur des échantillons de sérum prélevés sur des animaux vaccinés, pendant leur immunisation. Dans ce cas, on incorpore l'échantillon d'antisérum, provenant de l'animal, dans le gel à différentes concentrations; par ailleurs, on dispose d'aliquotes (conservés à — 80° C) d'un sérum standard Cl IAC positif (ayant une concentration standard en Cl

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IAC qui reste la même); on dépose un tel aliquote standard dans le trou inférieur, tandis que l'on applique le sérum négatif standard à la même concentration dans le trou supérieur. La dimension de l'anneau du Cl IAC obtenu dans le test fournit une mesure du titre de spécificité en Cl IAC du sérum de l'animal.

Déblocage extracorporel et démasquage du sérum d'un cancéreux

Dans une centrale de déblocage utilisant des anticorps INA immobilisés, on élimine les protéines de blocage et de démasquage du sérum d'un cancéreux par une immunoadhérence aux anticorps. Selon des aspects préférés de la présente invention, les anticorps immobilisés comprennent généralement au moins des anticorps vis-à-vis de Cl IAC, éventuellement aussi vis-à-vis de Cl IA et de préférence également des anticorps vis-à-vis de l'orosomucoïde, de l'a2HS glycoprotéine, et la Zn a2 glycoprotéine.

On préfère tout particulièrement mettre en œuvre les anticorps spécifiques vis-à-vis de Cl IAC préparés de la manière décrite ici et sur des animaux hôtes, dont on sait que le sérum est mieux supporté par des êtres humains, et jusqu'à maintenant, il n'y a aucune preuve que l'usage simultané d'anticorps vis-à-vis d'orosomucoïde, d'a2HS glycoprotéine, et de Zn a2 glycoprotéine ne soit pas avantageux; c'est pour cette raison que l'on préfère utiliser un INA dans le traitement extracorporel du sérum d'un cancéreux, qui présente la même composition en anticorps que l'INA préféré utilisé pour l'administration par voie intraveineuse.

On prépare de préférence des anticorps immobilisés en matrice selon la présente invention à l'aide de CNBr-Sépharose (dénomination commerciale) 4B provenant de Pharmacia. Cette substance est décrite dans la publication « Affinity Chromatography, Principles and Methods», publiée par Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suède, octobre 1914, en particulier pp. 8-15 et 57-58. Evidemment, on peut utiliser d'autres substances matrices qui permettent d'immobiliser correctement les anticorps sans nuire à leur activité et présentent de bonnes propriétés d'élution.

On donne maintenant un exemple d'immobilisation d'INA par association à de la CNBr-Sépharose (dénomination commerciale) 4B et de déblocage et démasquage du sérum d'un malade atteint du cancer.

On prépare 30 mg d'INA lyophilisé et remis en suspension, préparé sur un cochon à l'aide d'un vaccin de type 1 selon la façon décrite dans la partie «Vaccination des animaux hôtes»; on applique cet INA à de la CNBr-Sépharose (dénomination commerciale) 4B selon la procédure décrite plus haut.

La matrice activée par de l'INA ainsi obtenu sert à garnir une colonne Pharmacia K 15/25. On équilibre la colonne avec une solution tampon Tris/HCl (0,2%, pH 8) contenant 0,5M de NaCl.

On envoie dans cette colonne 10 ml de sérum provenant d'un cancéreux et l'on réalise l'élution avec du tampon Tris/HCl 0,2M, pH 8,0 et contenant 0,5M de NaCl. On contrôle les fractions éluées par voie spectrophotométrique, et recueille les fractions contenant les protéines. L'identification et l'estimation quantitative du rapport Cl IAC/C1 IA sont réalisées par une immunoélectrophorèse de type rocket ou fusée selon Laurell sur le sérum cancéreux avant le traitement dans la colonne et sur les fractions éluées. On trouve que la teneur initiale en inactivateur de Cl (Cl IAC/C1 IA) est de 60 mg% dans le sérum initial et s'abaisse à une valeur de 15 à 20 mg% à la suite du traitement. (On effectue les estimations dans les fractions contenues dans l'efïluent de Tris, mais on fait une correction pour tenir compte de la dilution.)

Après l'élution, on prépare la colonne pour un nouvel essai en éluant avec une solution de glycine/HCl (0,2%, pH 2,8) contenant 0,5M de NaCl, puis en faisant passer une solution saline isotonique et en équilibrant avec tampon Tris/HCl 0,2M (pH 8,0) contenant 0,5M de NaCl.

Dans la thérapie pratique du cancer mettant en œuvre le déblocage extracorporel à l'aide d'anticorps INA immobilisés, on réalise avantageusement le traitement du sérum du patient dans une centrale dans laquelle le plasma du malade cancéreux est envoyé après plas-

mafêrèse du patient. La fig. 22 montre une unité ou une centrale de déblocage selon l'invention. Sur cette fig. 22, un sac 1 renferme le plasma du patient avec du citrate (plasma ACD); il se vide dans un réservoir de recalcification 2 dans lequel la recalcification est effectuée à 37° C pendant 30 min. Le sérum traverse un filtre 3 qui retient le caillot de fibrine et passe par la conduite 4 jusqu'à la colonne 5 refroidie à 8°C à l'aide d'une gaine réfrigérante. La colonne renferme l'INA immobilisé dans une matrice, par exemple l'INA appliqué sur une CNBr-Sépharose (dénomination commerciale) 4B chargée d'INA de la manière décrite plus haut. On a déjà ajouté à la colonne des antibiotiques en quantité correcte. On calcule la dimension de la colonne et la charge d'INA, de telle sorte que la colonne renferme un excès d'anticorps immobilisés par rapport à la teneur en antigènes correspondants dans le sérum.

L'élution de la colonne est réalisée à l'aide de tampon Tris/HCl 0,2M (pH 8,0) contenant 0,5M de NaCl, tel que décrit plus haut; l'éluat traverse une cuvette 6 et va dans un réservoir 7. On étudie l'éluat traversant la cuvette 6 à l'aide d'un spectrophotomètre 8 associé à un appareil d'enregistrement 9. Lorsque l'examen spectrophotométrique indique que toutes les protéines du sérum sont éluées, on pompe l'éluat du réservoir 7 à l'aide d'une pompe 10 et l'envoie dans un dialyseur sous pression 11, par exemple une unité fonctionnant selon le principe du rein. Le sérum sortant du dialyseur 11 emprunte une conduite 12 munie d'une vanne permettant de soutirer un échantillon et va sur un filtre stérile 14; on le recueille à cet endroit dans un sac stérile 15 pour le réinfuser dans le malade.

On étudie des échantillons soutirés par la vanne 13 pour déterminer la teneur en Cl IAC/C1 IA et orosomucoïde, a2HS glycoprotéine, et Zn a2 glycoprotéine par immunoélectrophorèse et la teneur en impuretés à l'aide de méthodes convenables, par exemple la Chromatographie en phase gazeuse pour le CNBr. On peut aussi réaliser d'autres analyses de contrôle similaire en d'autres étapes, par exemple une Chromatographie en phase gazeuse avant le dialyseur sous pression.

Il est préférable d'effectuer toutes les manipulations sur le sérum en amont du filtre stérile, les seules opérations effectuées après le filtre stérile étant le contrôle de stérilité et la détermination de la teneur en pyrogène.

Après le passage du sérum, on régénère la colonne 5 avec de la glycine/HCl et l'on équilibre avec le tampon Tris. L'éluat provenant du traitement glycine/HCl et de la mise en équilibre est évacué, par exemple par la conduite 16.

On réalise divers examens en rapport avec le déblocage. Par exemple, on contrôle la stérilité et détermine la teneur en pyrogène du plasma alors qu'il arrive à la centrale, et l'on détermine la teneur en fibrine et en produits de scission de la fibrine chez le patient. Egalement, on teste les niveaux en C4 et en inactivateur de Cl dans le sérum sur des échantillons prélevés chez le malade, et dénombre les lymphocytes pour les types B, T et O. A part cela, on effectue les essais standards de laboratoire, de la même manière que dans le traitement avec les cytostatiques.

Il est très important de déterminer chez le patient le facteur de coagulation, dans la mesure où une partie des produits de coagulation est éliminée dans la conversion de plasma afférent. Cependant, les cancéreux présentent souvent d'importants niveaux de fibrine. Si cela est nécessaire, le facteur de coagulation est fourni au malade, par exemple par infusion de plasma donneur ou sous forme de Lysofi-brine (Novo).

Thérapie du cancer avec du sérum immunitaire selon l'invention

Dans ce qui suit, on passe en revue trois essais préliminaires d'utilisation de sérums de déblocage selon l'invention dans un traitement de courte durée de cancer humain. En plus du traitement décrit ci-dessous, on a traité également d'autres cancéreux et mis en évidence une rémission, c'est-à-dire une diminution de la masse tumorale. Cependant, les traitements décrits ici sont les premiers dans lesquels il est possible d'effectuer une description plus complète de l'effet du traitement.

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Sérums immunitaires de déblocage

On produit des sérums de déblocage INA (antisérum immunitaire neutralisant) sur des cochons et des moutons de la façon décrite ci-dessus. Le sérum du cochon renferme 2 mg/ml d'anticorps vis-à-vis du C1 IAC dans le sérum total, ce titre étant estimé de la façon dé- 5 crite dans «Vaccination des animaux hôtes». La concentration moyenne en IgG dans le sérum total du cochon est de 1200 mg/ 100 ml, estimée à l'aide d'anti-IgG humain. Le titre en anticorps vis-à-vis du Cl IAC dans le sérum du mouton est d'environ 3 mg/ml. On frtionne le sérum sur une colonne stérile de Séphadex (dénomina- 10 tion commerciale) G200 à l'aide de tampon de phosphate de sodium à un pH physiologique, et l'on recueille et isole des fractions contenant l'immunoglobuline; on les dialyse et les lyophilise. Au début du traitement, on remet en suspension la protéine lyophilisée dans une solution saline isotonique. On estime que le sérum purifié INA de dé- 15 blocage renferme 10 mg d'IgG/ml (immunoélectrophorèse à fusée utilisant l'anti-IgG humain).

Examen de routine effectué sur les patients au cours de l'immunothérapie avec l'INA 2o

On surveille chez le malade l'électrocardiogramme, la vitesse du pouls, et la température externe et interne.

Les concentrations dans le sérum d'immunoglobulines, du composé C4 complémentaire et de l'inactivateur Cl (Cl IA + Cl + Cl IAC) sont estimées successivement avant, pendant et après le traite- 25 ment. On effectue des essais sérologiques par immunoélectrophorèse à fusée selon la méthode de C.B. Laurell, «Analyt. Biochem.», 15,45 (1966), à l'aide des sérums d'essai suivants:

— anti-Cl IA humain de lapin (teneur en anticorps 0,7 mg/ml), et

— anti-C4 humain de lapin (teneur en anticorps 1,0 mg/ml)

provenant tous deux de Behringwerke;

— anti-IgG humain de lapin (teneur en anticorps 0,4 mg/ml), et

— anti-IgM humain de lapin (teneur en anticorps 0,4 mg/ml) provenant de Dakopatts, Copenhague. ^

L'enduit d'immunoglobuline et la sécrétion de lymphocytes du malade sont étudiés ensuite selon la méthode suivante.

On sépare les lymphocytes d'un échantillon de sang contenant du citrate provenant du malade, à l'aide d'une centrifugation fractionnée Isopaque-Ficoll, suivie de lavages dans une solution mère de Hanck, en y réalisant une centifugation entre chaque lavage. Les lymphocytes résultants sont divisés en deux portions. Sur une portion on détermine la présence de dépôt d'immunoglobuline selon la méthode décrite par Osther, K. et Dybkjaer, E., «Scand. J. Hae-mat.», 13,24 (1974). L'autre portion est soumise à une opération de trypsinisation à l'aide d'un tampon Trypure-PBS pendant 2 min à 37° C. On arrête l'effet de la trypsine en effectuant des lavages répétés dans un milieu MEM Eagle contenant 15% de sérum de veau fœtal inactivé. Ensuite, on détermine sur les lymphocytes la présence d'immunoglobuline. Lorsque la réponse est négative, on incube les lymphocytes dans une solution mère de Hanck à 4° C pendant 16 h. Ensuite, on sépare les lymphocytes puis on les incube dans des anti-immunoglobuline humaines marquées par FITC. Le FITC (Isothio-cyanate Fluorescéine) provient de chez BBL, Cockeysville, Maryland, USA. Les antisérums sont associés au FITC selon la méthode décrite par J.E. Fothergill [«Properties of conjugated sérum proteins». Cf. Nairn, R.C. éd., «Fluorescent Protein Tracing», p. 5,3e éd., E. & S. Livingstone Ltd, Edinburgh & London (1969)]. Juste après, on mesure l'immunofluorescence des lymphocytes cytophoto-métriques de la façon décrite par Osther, K. et Dybkjaer, E. [«Scand. J. Haemat.», 13, 24 (1974)].

Evidemment, on détermine la viabilité des lymphocytes dans les deux portions à l'aide de la technique bien connue au bleu trypane, et l'on calcule le nombre de cellules revêtues d'immunoglobulines en en déduisant les cellules non viables. Les quantités de lymphocytes capables de sécréter, reportées dans les fig. 24,26 et 28, sont les quantités que l'on a déterminé de façon certaine dans la portion qui a subi une incubation dans une solution mère de Hanck, l'autre portion servant principalement de référence et de contrôle.

Procédure du traitement

On effectue un essai intracutané avec le sérum INA de déblocage dilué à 1/10 et note la réaction s'il y en a. On prétraite le malade avec de l'antihistamine afin d'éviter une libération d'histamine iatrogène chez le patient.

Le sérum INA de déblocage est dilué dans une solution saline, puis administré par voie intraveineuse. On administre une dose totale avec un débit d'écoulement qui dépendent de la condition du malade.

R

24 feuilles dessins

Claims

635 242

1. Procédé pour préparer des antisérums ou anticorps pour usage thérapeutique, présentant une activité spécifique vis-à-vis du Cl IAC, caractérisé en ce que l'on administre à un animal non humain un vaccin l'immunisant contre Cl IAC, et en ce que l'on récolte ensuite du sérum de l'animal ainsi immunisé.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'animal immunisé est un cochon, qui est immunisable de façon spécifique vis-à-vis des protéines de la membrane cellulaire cancéreuse.

2

REVENDICATIONS

3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'on soumet le sérum, provenant du cochon, à un fractionnement permettant de recueillir une fraction d'immunoglobuline IgG pratiquement pure.