NO753638L

NO753638L -

Info

Publication number: NO753638L
Application number: NO753638A
Authority: NO
Inventors: Kurt Bekgaard Osther
Original assignee: Kurt Bekgaard Osther
Priority date: 1974-10-30
Filing date: 1975-10-29
Publication date: 1976-07-16
Also published as: FI56117C; NZ179095A; SE7512192L; AU8609475A; CH635242A5; DE2548636A1; FR2289205A1; BE835020A; US4132769A; NL7512678A; JPS5191322A; FR2289205B1; FI56117B; FI753025A; CA1083037A; GB1531762A; AU518663B2

Description

Cancerantigen, cancerterapi og cancerdiagnostikum.

Foreliggende oppfinnelse angår et humancancerassosiert protein, betegnetClIAC, fremgangsmåte for isolering derav og karakterisering, diagnostiske testmetoder og materiale basert på prinsippet å påvise nærvær av clIAC, antistoffer og antisera med spesifisitet overforClIAC, fremstilling av slike antistoffer og preparater inneholdende disse, matriks-immobiliserte antistoffer samt terapeutisk behandling av humcancer under anvendelse av antisera eller antistoffer med spesifisitet overforCl IAC.

Vesentlige aspekter ved foreliggende oppfinnelse baserer seg på prinsippet å .utnytte antistoffer med spesifisitet overfor blokkerende og maskerende proteiner , særlig clIAC, som er assosi-ert med humancancersykdommer og nærvær på membraner av cancerceller. Ifølge foreliggende oppfinnelse utnyttes dette prinsipp for b ehandling av cancer in vivo og for ekstrakorporal behandling av cancerpasientserum.

Cl IAC er et humancancerassosiert protein, som kan isoleres fra kroppsvæsker hos cancerpasienter, innbefattet serum, og fra maligne humancancerceller , og fra cellekulturer. Gjentatte dyrknings- og innhøstningssykler av cellekulturer er utført , og

Cl IAC er isolert fra dyrkningsmediene, hvilket antyder at cancercellene selv er i stand til å produsere Cl IAC.

Cl IAC har vist seg å ha biologiske egenskaper som ligner på egenskapene hos humankomplementkomponenten Cl-inaktivator (også betegnet "Cl-esteraseinhibitor") , som er et a2~neuramino9lykoprote-in, som man finner i kroppsvæskene hos ulike arter, innbefattet . menneske (pensky et al.: J.Biol.Chem. 236 (1961) 1674; Ratnoff et al.: J.Exp.Med. 129, 315;Pensky et al.: Science 16 3 (1969) 698; Nagaki et al.: Int.Arch.Allergy £6 (1974) 935), men har vist seg proteinkjemisk å ikke være identisk med humankomplementkomponentenCl-inaktivator.

I det følgende vil humankomplementkomponentenCl-inaktivator ^Cl-esteraseinhibitor) bli betegnet "Cl IA", mens det i forskjellige sammenheng anvendte uttrykket "Cl-inaktivator" anvendes

for å betegne den gruppe .som består av Cl IAC ogCl IA.

Cl IAC har vist seg å oppvise biologiske egenskaper som ligner på egenskapene hosCl IA, innbefattet den hemmende virkning av den opprinnelige humankomplementkomponentens Cl aktivering avC4 ogC2 (dvs. hemning avCl-esterasehydrolyserende virkning), in-aktiveringen av plasmin og mangel på virkning overfor plasmas koaguleringstid (dvs. denne mangel er felles for Cl IA og ClIAC). I-følge det prinsipp som foreliggende oppfinnelse baserer seg på, antas at disse hemmende virkninger av cl IAC spiller en betydelig . rolle ved cancercellenes forsvar mot ødeleggelse av det humane immunsystemet . .I litteraturen har man beskrevet at et cl IA-lignende protein er tilstede på membranen av humancancerceller (se f.eks. Osther, K., Højgaard, K. og Dybk jaer, E. : Acta neurol.Scand. 50_ (1974) 681; Osther, K.: the Lancet , 2. mars 1974, side 359; Osther, K., Linnemann, R.: Acta path. microbiol. scand. 81_ (1973) 365).

Ifølge foreliggende oppfinnelse er nu nevnte humancancer-assosierteCl IA-lignende protein isolert ogkarakterisert, og som angitt ovenfor, har det vist seg å være et nytt protein som ikke er identisk medCl IA. Betydelige nye utviklingsmuligheter baserer seg på disse oppdagelser.

Cl IAC er et a (hovedsakelig a^-)-neuraminoglykoprotein med en sedimentasjonskonstant av s~ = 6,2 S. En fullstendig ka-<cO , W

rakterisering avCl IAC, som skiller Cl IAC fra Cl IA og andre kjente proteiner , er gitt nedenfor under rubrikken "Karakterisering av Cl IAC". Ved isoelektrisk fokusering i LKB Multiphor har man påvist to separate bånd ved fokusering i en amfolin av rensetCl IA ogCl IAC, hvor amfolinen var "PAG"-plate for polyakrylamidgel-tynn-skiktelektrofokusering og pH-gradienten var 4,0-8,6, 2 timer under avkjøling til 0°C ved 5Q0 V, 50 mfl. Efter elektroforesen ble poly-akrylamidgelen skåret ut og ble derefter kjørt i en vinkel på 90° mot 2%-ig agarosegel i en diemalbuffer, ionestyrke 0,02, pH 8,6 ved 18°C i 12 timer, idet nevnte agarosegel inneholdt antihuman kanin-Cl IA.Herved fikk man to utfelningslinjer som ikke krysset hverandre, mens to identiske kjøringer, men med oligospesifikt antiserum mot bådeCl IA og cl IAC, fremstilt på griser av "dansk landrase", griser av blandet Yorkshire-rase og "dansk landrase", sauer

av Texel-typen eller blandingsrasesauer omfattende Shropshire og Oxford Down, resulterte i to utfelningslinjer, som krysset hverandre. Dette viser at immunologisk sett er kaninen ikke i stand til å skille mellom cl IA og Cl IAC,. mens de øvrige, ovennevnte dyr er i stand til å identifisere de to proteiner som bare delvis identiske. Det faktum at kaninantiserum ikke er i stand til å skille mellom •Cl IAC og Cl IA, spiller en betydelig rolle i foreliggende sammenheng og skal derfor understrekés. Ved lesning av foreliggende beskrivelse er det vesentlig å huske at en reaksjon ved immunologiske undersøkel-ser som er basert på reaksjon med antihuman kanin-Cl IA (som er et

kommersielt tilgjengelig reagens), representerer et svar på "Cl-inaktivator" eller, med andre ord, et svar på summen avCl IACog Ci IA.

Ci IACer isolert fra medier fira dyrkning av flere typer humancancerceller, innbefattet karcinom uavhengig av opprinnelse, sarkom av typen retikulolymfosarkom og visse typer av leukemi, nemlig kronisk myelod leukemi og myelomatose, og Cl' IAC fremstilt fra disse celler har vist seg å være immunokjemisk identiske.

For isolering og rensning avClIACer flere metoder utnyt-tet. Felles for samtlige.anvendlige metoder er at de omfatter sepa-rasjonsteknikk, som medvirker til å isolere' og rense et pseudoglobu-linmateriale med de egenskaper som angis nedenfor under rubrikken

"Karakterisering av Cl IAC" fra det medium der det finnes. Egnede metoder omfatter for fagmannen velkjent adsorpsjons- og gelfiltreringsteknikk. Eftersom det har vist seg at Cl IACkan fremstilles fra medier oppnådd fra dyrkning av humancancerceller og også atCl IA. ikke kan isoleres fra medier fra dyrkning av slike hu mancancer-celler, er en utvetydeig metode for konsentrering, isolering og rensning av Cl IAC å anvende adsorpsjons- og gelfiltreringsmetoder med på-følgende immujnologisk analyse under anvendelse av antihuman kanin-Cl IA for å oppnå, fra dyrkningsmediet fra ovennevnte typer av cancerceller, det protein som reagerer immunologisk med antihuman kanin-Cl IA. Ved en slik fremgangsmåte bør man unngå å anvende pH-verdier under 5,5 og over 10,5 samt oppvarmningstemperaturer over 56°C, eftersom det har vist seg (se nærmere under rubrikken "Karakterisering av cl IAC") at slike betingelser kan forårsake endringer i de biologiske egenskapene hosCl IAC. Ved utformning av en egnet metode, for konsentrering eller rensning av Cl IACkan fagmannen også utnytte de øvrige kjennetegnende trekk som er gjengitt under rubrikken

"Karakterisering avCl IAC", innbefattet den beregnede molekylvekten for Cl IAC, som er 110000- 130 000. Man kan påvise nærvær av Cl IAC

i hvilket som helst materiale ved anvendelse av immunologiske undersøkelser mot antistoffer eller antisera, som gir reaksjon med Cl IAC, som ved reaksjonen lett kan skilles frahver annet protein innbefattet Cl IA. Fremstillingen av slike antistoffer eller antisera beskrives nærmere i det følgende. Egnede metoder for konsentrering , isolering og rensning avCl IAC utnytter kolonnekromatografiadsorpsjon og gelfiltrering.

Det skal legges merke, til at cl IA ogCl IAC. har vist seg

å ikke reagere med antistoffer med spesifisitet overfor andre kjente antigener, spesielt ikke med antistoffer mot kjente onkofoetale antigener, og særlig ikke med antistoffer mot cv-^-foetaoprotein eller CEA-protein.

En foretrukket fremgangsmåte for fremstilling av cl IAC

fra etClIAC-holdig medium beskrives nedenfor under rubrikken "Fremstilling av Cl IAC" og omfatter kolonnekromatografiadsorpsjon og efterfølgende gelfiltrering.Enforetrukket kolonne for kolonne-kromatograf iadsorps jon er ananionebytterharpikskolonne såsom Dowex

2x8, mesh 200 - 400, og et foretrukket gelmateriale for gelfiltre-ringen er en dekstrangel såsom "Sephadex" G75 Superfine. Konvensjonelle enhetsoperasjoner omfattes i disse metoder, f.eks. dialyse og lyo-filisering på passende trinn.

Det medium fra hvilket cl IAC konsentreres, isoleres og ren-ses , kan være et dyrkningsmedium fra dyrkningen av en Cl IAC-produserende type av humancancerceller eeller en kroppsvæske såsom serum eller pleural/askites-eksudat fra en pasient som lider av enCl IAC-produserende cancertype. Som forklart ovenfor inneholder cancer-celledyrkningsmediet ikkeCl IA, men Cl IA kan man finne sammen med Cl IAC i kroppsvæsken fra humancancerpasienter. For de fleste praktiske anvendelser av .Cl IAC utgjør'nærvær av Cl IA i et anvendt ut-gangsmedium ikke noe alvorlig problem,.eftersom isolat inneholdende

Cl IA foruten Cl IAC er verdifulle i seg selv, som forklart nærmere

i det følgende.

Når cancerceller dyrkes for produksjon av Cl IAC, utgjør egnede dyrkningsmetoder "Eagle minimum essential medium" og -RPMI syntetisk aminosyremedium (se<p>ublication 73/74 fra FlowLaboratories, Irvine Ayrshire, K.A. 12 8 NB, .Skottland) , men ethvert annet medium som understøtter veksten av cancercellene, kan også anvendes. Det har vist seg at de. beste utbyttene avClIACoppnås når dyrkningsmediet inneholder tilsatt glutamin i en mengde som overstiger ca. 285 mg/l, fortrinnsvis over 290 mg/l. For tiden har den optimale mengde av tilsatt glutamin vist seg å være ca. 294 mg/l, og tilsetning av større mengder synes ikke å gi noen ytterligere fordel. En normal fremgangsmåte■for dyrkning av cancerceller utnytter en vekstfase i "Eagle minimum essential medium", som er beriket med tilsatt glutamin , og en produksjonsfase i RPMI-medium med tilsatt glutamin. Hver fase kan omfatte noen døgn, f.eks. 3-7 døgn, og for tiden utgjør 3 døgn en foretrukket periode.

Som nevnt ovenfor antas Cl IAC å spille en betydelig rolle i cancercellenes forsvar mot ødeleggelse av det humane immunsystemet. Cl IAC, som er et sialoprotein (neuraminoglykoprotein), oppviser lav antigenisitet, og det antas at Cl IAC, sammen med andre proteiner som man finner i cancercelledyrkningsmedier og i kroppsvæsker fra cancerpasienter, spesielt orosomukiod, o^HS-glykoprotein og Zn-o^-glykoprotein (også foreldet betegnet Zn-o-^-glykoprotein) , "maskerer" cancercellene mot identifisering som "ikke egne" av humanimmunsystemet. Som nevnt ovenfor har dessuten Cl IACevne til å hemme aktivering av C4 ved hjelp av Cl, og dette antas og være en av hovedårsakene til hvorfor cancercellene ikke effektivt angripes av immunsystemet.

Uttrykt på en annen måte kan . cancercellenes evne til å produsere Cl IAC som et membranprotein, være en av hovedårsakene til hvorfor disse cancerceller oppviser evnen til å blokkere både den afferente grenen og den efferehte grenen av immunsvaret. Den affe-rerite grenen blokkeres åpenbart hovedsakelig på grunn av den maskerende effekten av Cl IAC (symstoff-effekt) og den efferente grenen synes å blokkeres både på humoral immunforsvarsnivå og på cellulært' immunforsvarsnivå, idet førstnevnte er en blokkering av komplementsystemet på ovennevnte nivå, og sistnevnte kan innføres til den kraftig negative elektriske ladningen av cancercellemembranet som følge av den negativt ladede Cl IAC og andre' kraftig negativt ladede sialo-forbindelser , som frastøter, de negativt ladede lymfocytter. •

En skjematisk representering av humankomplementsystemet og den blokkerende og hemmende (inhiberende) virkning avCl-inaktivator på dette er gjengitt på fig. 1. Når en komplementreaksjon er igang-satt av Fc-fragmentet av et immunoglobulin , kommer aktivertCl, ved det normale forløp av en komplementreaksjon eller - kaskade, til å aktivere komplementkomponentene C4 ogC2, hvoretter komplementreaksjonen skjer videre til sluttproduktet og lyse av det "ikke egne" ' materialet eller antigenet med hvilket immunoglobulinet hadde reagert, men Cl-inaktivatoren kan hemmeCl's aktivering av c4, i hvilket tilfelle C4 ikke kommer til å festes til antigenet, og de ytterligere komplementreaksjonene kommer ikke til å fortsette.

Kroppsvæskene hos friske mennesker inneholderCl IA som en nødvendig kontroll av komplementsystemet. Det er klart fastlagt at den kontrollerende virkning av Cl IA hos den friske organismen (nevnte kontrollerende virkning viser seg ved hemning avClr ogCls, hvilket resulterer i manglendeSl-aktivering avC4) er knyttet til konsentrasjonen av Cl IA og at den inaktiverende virkning avCl IA på cl-molekylet normalt er begrenset til en inaktivering av en eventuelt overdrevet aktivering avCl, som ellers ville føre til en komplerhentkaskade i serumfasen, resulterende i Quinckes ødem. Normale verdier forCl IA i serumfasen er opp til 40-50 mg%. Ifølge foreliggende oppfinnelse har det nu vist seg at pasienter som lider av fastslåtte cancersykdommer, ofte oppviser unormalt høye serumni-våer avCl-inaktivator, hvilken forhøyning sannsynligvis skylles

nærvær avClIACi pasientens serum.

For å fastlegge i hvilken utstrekning pasienter som lider av fastlagt cancer, oppviser forhøyede nivåer av Cl-inaktivator ' (Cl IA + Cl IAC) har et hundretall av pasienter som lider av cancer av forskjellig opprinnelse, dvs. karcinom, sarkom, lymfom, leukemi, blitt undersøkt med hensyn til serumkonsentrasjonen avCl-inaktivator under anvendelse avLaurells raketteknikk med antihuman kanin-Cl.IA. Kontrollforsøk omfattet en ekvivalent undersøkelse av serum fra friske personer og fra pasienter som led av fastlagte ikke-maligne sykdommer. Resultatene er gjengitt på fig. 2. Det fremgår at middelverdiene forCl-inaktivator hos friske personer er meget lavere enn fra pasienter som led av cancer. pasienter som led av ikke-maligne sykdommer, oppviste ogsåCl-inaktivatornivåer med middelverdier langt under cancerpasientenes middelverdier og omtrentlig innenfor det normale område. De forhøyede konsentrasjoner av Cl-inaktivator i serum fra pasienter som lider av cancer, antas hovedsakelig å bero'på nærvær avCl IAC, som frigjøres fra cancercellekolonier. Med hjelp av Ouchterlonys teknikk ble det fastslått at de cancerpasienter som hadde vist seg å ha forhøyede verdier for cl-inaktivator, oppviste utfelningslinjer for bådeCl IA og Cl IAC, og at pasienter som led av ikke-maligne sykdommer, og friske personer ikke viste nærvær avCl IAC(begge målt mot oligospesifik antihuman saue-Cl IA/Cl IAC). Et typisk eksempel på en Ochterlony-serumundersøkelse av denne.type er vist på fig. 3.

Undersøkelse av nivået av komplementkomponentenC4, utført på samme gruppe pasienter, visté praktisk talt samme middelverdi for friske personer og pasienter som led av ikke-maligne sykdommer, mens pasienter som ]ed av cancer, oppviste, betydelig forhøyede C4-nivåer, hvilket fremgår av fig. 2.

Det har vist seg at verdiene for "Cl-inaktivator" (cl IA +Cl IAC) som overstiger konsentrasjoner på ca. 50 mg% (50 mg/100 ml)

(som konstatert ved hjelp av.rakettelektroforese under anvendelse av antihuman kanin-Cl IA), ofte faller sammen med en forhøyelse av C4, hvilket antyder at komplementsystemet blokkeres ved c4-trinnet, dvs.'det trinn- derCl-aktivering avC4 normalt skulle skje med ledsagende forbruk av C4 (aktivertC4 festes til membranen av de celler som skal lyseres av komplementsystemet). Ved undersøkelse av stadig voksende cancer- har det vist seg at "Cl-inaktivator" ogC4 stiger kontinuerlig

til pasientens død. Det har også vist seg at subterminale og termina-le verdier påC4 når verdier opp til 160 mg% ogCl-inaktivatorverdier opptil.ca. 120 mg%. I serum fra visse pasienter med fastlagt cancer med primære små cancercellekolonier, har man konstatert verdier på

ca. 40-50 mg% Cl-inaktivator (Cl IA + Cl IAC) uten noen tegn på unormalt forhøyede C4-nivåer. Når disse pasienter imidlertid er underkastet kirurgisk inngrep, synker enten Cl-inaktivatornivåene efter en periode på ca. 3 uker og forblir innenfor det normale området med ledsagende c4-nivåer innenfor det normale området (hvilket tyder på en fremgangsrik radikal operasjon), eller også finner man en forhøyel-se avCl-inaktivatornivåene, ledsaget av forhøyede c4-nivåer. For-klaringen på sistnevnte fenomen kan være at en antatt radikal operasjon kan ha fremkalt en forhøyet konsentrasjon av Cl-inaktivator

i serumfasen som følge av frigjøring av Cl IAC fra skadede cancerceller og fra cancerceller som slynges inn i blodbanene, og at denne økning i Cl-inaktivatorkonsentrasjonen har forårsaket blokering av komplementsystemet som forklart nærmere ovenfor.

på bakgrunn av den ovenfor angitte forklaring vil det forståes at en radikal økning av sjangsene for effektiv behandling av cancer skulle oppnåes hvis den hemning av immunsvaret som finner sted ved cancer, kunne nøytraliseres, dvs. om blokkeringen av immunforsvaret kunne unngås, og om cancercellene kunne "avmaskeres" slik at de lettere kunne igjenkjennes av immunovervåkningen i

humanimmunsystemet. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en slik avblokkering og avmaskering.

Som nevnt ovenfor har det vist seg at immunsystemet hos visse dyr, innbefattet de grise- og saueraser og typer som er angitt ovenfor, har evne til å skille mellom human Cl IA og human Ci IAC når de innføres som antigener i dyrene, og er følgelig i stand til å produsere antistoffer med determinanter med spesifisitet overforCl IAC. Et vesentlig aspekt ved foreliggende oppfinnelse angår derfor antisera eller antistoffer med spesifisitet mot Cl IAC. Slike antisera kan fremstilles ved selektiv immunisering av immunni-serbare dyr, f.eks. griser eller sauer av f.eks. de ovennevnte raser og typer, med vaksiner inneholdende cl IAC som antigen komponent, og utvinning av serum fra de immuniserte dyr. på grunnlag av den oppdagelse at orosomukoid, a^HS-glykoprotein og zn-a^-glykoprotein er proteiner som kan isoleres fra cancercelledyrkningsmedier, spesielt på et tidlig trinn av dyrkningen (før trypsinering og dyrkning av underkulturer), at disse tre proteiner er notoriske proteiner med meget lav antigenisitet , og at orosomukoid er tilstede i høye konsentrasjoner i pleura-eksudat fra cancerpasienter, antas at disse tre ytterligere proteiner deltar ved "maskeringen" av cancerceller, og det foretrekkes.derfor at også disse tre proteiner omfattes av de vaksiner som skal administreres til vertsdyret for fremstilling av antisera for cancerterapeutiske formål, slik at antisera kommer til å inneholde antistoffer også mot disse tre proteiner. Eftersom det dessuten ikke kan utelukkes atCl IA i flere tilfeller er den dominerendeCl-inaktivatoren i væskefase , mens Cl IAC er den Cl-inaktivator som er tilstede på cancercellene, kan det antas at det mest effektivt antiserum er et slikt som er i stand til å angripe både Cl IACog Cl IA.

Virkningen av antiserumet eller antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse skal forklares nærmere i det følgende. For, enkelhetens og oversiktlighetens skyld vil uttrykket. "INA" (immun-nøytraliserende-avblokkerende antiserum) anvendes for å be-. tegne både de antisera som er spesifikke overfor cl IAC og eventu-. elt mot cl IA, orosomukoid,c^-HS-glykoprotein og Zn-c^-glykoprotein og de mer konsentrerte og rensede immunoglobulinfraks.jonene derav.

De antihumane Cl IAC-antistoffene reagerer med Cl IAC på cancercellemembranen ved en antigen-antistoffreaksjon.Vekselvirk-ningen mellom INA og cancercellene kan f.eks. vises ved merkning av INA (f .eks. med FITC (Fluorescein-isotiocyanat)) og inkubering av humancancercellene med den merkede INA.Cancercellene kommer til å vise positiv merkning. Celler fra samme kultur, som er forinkubert med neuraminidase, oppviser ikke noen merkning efter . inkubering med merket INA-antiserum, hvilket antyder at de antigene determinanter . av Cl IAC ødelegges av neuraminidase. Når INA blokkerer. determinantene avCl IACpå cancercellemembranene, blir cancercellene tilgjengelige for angrep av det humane humoralimmunfor-svarssystemet, hvilket f.eks. kan vises på følgende måte: Humancancerceller inkuberes med INA og inkuberes derefter med serum fra samme pasient eller fra andre pasienter med samme.type cancer. Efter inkubering i f.eks. 6 timer fjernes cancercellene fra dyrkningskolben, og efter f.eks. 18 timer er samtlige cancerceller døde. Mesotelceller og fibroplaster, som er behandlet på samme måte, fortset-ter å vokse i dyrkningskolben uten å bli forstyrret av inkuberinge-ne, og i kontrollkulturer uten inkubering med INA påvirker inkuberingen med serum ikke cancercellene. Dette beviser atCl IAC virker som en hemmende faktor og deltar i blokkeringen av virkningen av iminunsysts.net mot cancer og viser også at INA er i stand til å nøytralisere denne blokkeringsvirkning in vitro. Når Cl IAC nøy-traliseres av INA in vitro, nøytraliseres dens hemmende virkning påCl-aktiveringen av C4, hvilket innebærer at blokkeringen av virkningen av immunsystemet opphører, atC4 festes til cancercellemembranene og at en ytterligere virkning av komplementsystemet finner sted og resulterer i lyse av cancercellene. Efter aktiveringen av C4 kan komplementreaksjonen ikke avbrytes ved påvirkning fra Cl IA eller cl IAC(se fig. 1) .

En annen måte til illustrering av den cytotoksiske virk-n ing av INA in vitro og den samme pasients serum og isolerte lymfocytter mot pasientens dyrkede cancerceller eller leukemiceller, er ved anvendelse av den metode som er beskrevet av Hirschberg , H. et

51

al.: Nature 255 , (197 5) 62, ifølge hvilken man innfører cr- i cancer-51 •

eller leukemicellenes cytoplasma. Frigjøring av Cr i det medium hvor de nsoplastiske cellene inkuberes med INA og samme pasients serum og lymfocytter (isolert ved hjelp av Isopaque Ficoll-metoden som beskrevet av Osther, K. ogDybkjær, E.: Scand. J.Haematol. 1_3

(1974) 24), ble målt ved anvendelse av scintillasjonstéknikk. Man kunne vise at evnen til cancercellecytolyse ble øket når cellene,

i tillegg til INA-inkubering, ble underkastet inkubering med både humoralt og cellulært immunforsvarssystem. Forsøket er gjengitt i det følgende: Materiale: INA-griseimmunoglobulin, fremstilt som angitt

under rubrikken "Vaksinasjon av vertsdyr".

<51>Cr i form avNa2CrO^fraBehringwerke.

Metoder: Modellen var humanleukemiceller . Neoplast.iske celler og lymfofytter ble isolert fra samme pasient, serum ble ny-

fremstilt fra samme pasient, lymfocytter isolert fra donator,

og serum ble nyfremstilt fra donator, idet donatoren hadde samme ABO-type som pasienten; ingen leukocyttantistoffer mot donatorleuko-cyttene kunne påvises i pasientens serum. Hvis leukocyttantistoffer mot doriatorleukocyttene var påvist hos pasienten, hadde det vært nødvendig å utskifte donatoren med en annen, mot hvilken pasienten ikke har noen leukocyttantistoffer.

51

Kontrollprøve: Negativ kontroll: Cr-merkede leukemiceller i "Eagle minimum essential medium".

Positiv kontroll: svarende til 100 % cytolyse (dvs. cytolyse av både normale celler og cancerceller) oppnås ved tilsetning av cetavelon til<51>Cr-merkede celler.

Testmateriale: Fra pasienten fikk man venøst blod i 3 citrat- eller heparinglass og 1 glass uten tilsetninger. Fra donatoren fikk man venøst blod i 2 citrat- eller heparinglass og 1 glass uten tilsetninger.

Fremstilling av leukemiceller og normale celler (- lymfocytter) : Fremstillingen ble utført i henhold til Ficoll-Isopaque-metoden.

Merkning av leukemiceller. (+ eventuelt tilstedeværende

n ormale lymfocytter)

Merkning av lymfocytter fra donatoren: Til ca. 2 x 108 celler ble satt 200^,u 51Cr + 1 ml "Eagle minimum essential medium" , og blandingen ble deretter omrørt og inkubert, i vann ved 37°C i 30 minutter. Deretter ble cellene vasket til man fikk minimal fri-gjøring av ^cr (4 ganger). Vaskingene ble utført i koksaltoppløs-ning eller i "Eagle minimum essential medium".

Inkubasjonstest: Cellene ble først inkubert med 0,2 ml INA-immunoglobulin (hvis dette passet)' og derefter med 0,1 ml serum og 0,1 ml lymfocyttsuspénsjon (hvis dette passet) (den overliggende væsken var dekantert fra lymfocyttene, som var suspendert påny i 2,0 ml "Eagle minimum essential medium"). Samtlige glass inneholdt samme volum - 1,4 ml; dette ble oppnådd ved tilsetning av ekstra "Eagle minimum essential medium".

"Eagle minimum essential medium" ble blandet med 100 enheter penicillin G og 10 yvg streptomycin/ml.

Den positive kontrollprøven ble blandet med 0,4 ml

"Cetavelon + 1 ml merkede celler.

Den negative kontrollprøven ble blandet med 0,4 ml "Eagle minimum essential medium" + 2 ml merkede celler.

Inkuberingen ble utført ved 37°C i 18 timer.

Målninger: Efter fullført inkubering ble prøvene sentri-fugert i 10 minutter ved 1800 omdreininger pr. minutt. Deretter ble porsjoner på 1 ml av den overliggende væsken underkastet bestemmel-51 .

se med hensyn til frigjøring av Cr, under anvendelse av en scin-tillasjonsteller. De erholdte verdier ble korrigert for bakgrunn.

Før fjernelse av den overliggende væsken hadde man bestemt antall pulser for det totale innhold av glassene (1,4 ml).

Resultat -.

1) Pasient som led av myelpmatose.

Antall pulser efter inkubering, pulser pr. minutt.

De ovenstående resultater viser at tilsetningen av INA-immunoglobulin gir en økning av cytolysen sammenlignet med forsøkene uten tilsetning av INA-immunoglobuliner. 2) Pasient som led av CML (kronisk myeloid leukemi).

Antall pulser efter inkubering, pulser pr. minutt

De ovenfor beskrevne forsøk in vitro viser at pasientens serum virkelig inneholder antistoffer mot pasientens egne neoplastiske celler og viser også den cytotoksiske virkning som utøves av både det humorale og det cellulære immunsystemet (det cellulære immunsystemet er i dette tilfelle de lymfocytter og monocytter som ble isolert ved hjelp av Ficoll-Isopaque-metoden). (Det faktum at pasientens serum inneholder antistoffer mot de neoplastiske cellene kan kanskje synes paradoksalt på bakgrunn av det ovennevnte faktum at cancercellene hemmer den afférente.grenen av immunforsvaret ved "maskering" av seg selv medCl IACog andre proteiner med ekstremt lav antigenisitet , men det finnes mange mulige forklaringer på hvorfor et visst innhold av antistoffer mot cancercelleproteiner er tilstede, f.eks., kjemiske likevekts- og konsentrasjonsfaktorer, frigjø-ring av cancercelleproteiner fra cancerceller omfattende cancercel-'ler som er døende eller er blitt nekrotiske eller som er ødelagt som følge av kirurgisk inngrep, bestrålning, cytostatisk behandling osv.). Det er ikke mulig på grunnlag av disse forsøk å avgjøre hvor vidt

en viss belegning av emmunoglobuliner på cancercelleflaten var tilstede opprinnelig. Under' alle forhold gir nærvær av INA sammen med først og fremst det immunforsvarssystem som skyldes cancerpasienten og for det andre det immunsystem som skyldes donatoren (komplementkilde) , opphav til betydelig cytolyse av de neoplastiske cellene.

■Videre kan man konstatere at bare en viss andel av det totale antall av cellene som er inkubert på beskrevet måte, ble cytolysert, slik' som det fremgår av en sammenligning med den cytolyse som oppnås med Cetavelon, hvilket kan antyde at ikke-maligne celler overlever INA-behandlingen.

Under anvendelse av ikke-maligne celler istedenfor de neoplastiske cellene har det vist seg at noen betydelig cytolyse ikke finner sted ved'INA-inkubering.

Ifølge oppfinnelsen har det nu vist seg at det er mulig ved administrering av INA til cancerpasienter å oppnå utmerkede resultater in vivo når det gjelder å kontrollere og senke antallet av cancerceller. Forskjellige oppdagelser antyder at INA i de meget mer kompliserte biologiske systemer som man finner in vivo, er i. stand til å utøve virkninger som ligner på de som man har konstatert in vitro.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således frem-gangsmåter og preparater for terapeutisk behandling av cancer ved passiv immunisering mot cancercelle-maskerende og immunforsvars-systemblokkerende. proteiner, hvilket innebærer et helt nytt prinsipp, ikke bare innen cancerterapeien, men også, så vidt kjent,

. innen hele medisinen.

Blant de virkninger som er observert efter administrering av INA til huracancerpasienter, kan nevnes: 1) Minskning av serumkonsentrasjonen av "Cl-inaktivator" (summen av Cl IAC +■ Cl IA ved bestemmelse ved hjelp av antiserum, som ikke skiller mellom Cl IAC og Cl IA, f.eks. antihuman kanin-Cl IA) og minskning av serumkonsentrasjonen av Cl IAC ved bestemmelse ved hjelp av monospesifikt antiserum mot Cl IAC. I de tilfeller når man anvender INA, som er monospesifikt mot Cl IAC, må naturligvis minskningen antas å skyldes spesifikt en neutralisering av Cl IAC, men som nevnt ovenfor, foretrekkes å anvende INA, som inneholder både anti-Cl. IAC og anti-Cl IA. Nevnte minskning av Cl-inakt ivatoren inntrer vanligvis efter en rask økning i begynnelsen.

2) Minskning av serumkonsentrasjonen av C4.

Dessuten har man konstatert flere remisjonsmanifestasjo-ner, såsom en minskning av tumormassen og i visse tilfeller total forsvinning av cancerceller.Ovennevnte nivåer avCl-inaktivator, spesielt av Cl IAC, og C4 er imidlertid betydelige og lett bestem-bare indikatorer på forløpet av sykdommen før, under og efter administrering av INA og dessuten på hver type av cancerterapi, slik som forklart ovenfor. Som en ytterligere remisjonsmanifestasjon har man konstatert at den lave mengde (lave prosentvise mengde) av T-lymfocytter sd m man ofte finner hos pasienter som lider av cancer, spesielt ved cytostatisk behandling eller ved bestråling, stiger til normale verdier innen noen få uker fra igangsétning av INA-behandlingen. -

Fremstillingen av spesifikke antistoffer mot Cl IAC, hvilket muliggjøres ved hjelp av foreliggende oppfinnelse, gir også en mulighet til å fastlegge en utvetydig diagnose av cancer. Ifølge foreliggende oppfinnelse baserer denne diagnose seg på konstatering av nærvær eller fravær avCl IACi humankroppsvæsker, av praktiske grunner spesielt i humanserum. Ifølge oppfinnelsen fastslåes nærvær eller fravær avCl IACved at man underkaster prøven immunologisk reaksjon med antihumanClIACunder slike betingelser at at resultatet av den immunologiske reaksjonen lett kan skilles fra eventuelt svar på Cl IA i prøven. Dette betyr at INA-antiserum og andre materialer som inneholder antistoffer eller immunologisk aktive modifikasjoner eller derivater derav, utgjør ytterst verdifulle diagnostiske materialer. En nærmere redegjørelse for den diagnostiske side av foreliggende oppfinnelse er gitt i det følgende.

For fremstilling av antisera ifølge foreliggende oppfinnelse er det vesentlig å anvende vertsdyr som i sitt immunsystem er i stand til å skille, mellom Cl IACog Cl IA eller, uttrykt på en annen måte, som er i stand til å danne spesifikke antistoffer mot Cl IAC, og eksempler på slike dyr er nevnt ovenfor. Det skal legges merke til at ikke alle grise- og saueraser og -typer synes å være i stand til å produsere anvendbare antisera. ifølge foreliggende oppfinnelse. En gris av ren Yorkshire-rase ga således f.eks. ikke noen betydnings-full titer av antistoff. Kaniner og små gnagere har vist seg' å være ute av stand til å skille mellomCl IACog Cl IA. På den annen side kan man anta at det blant hester og kuer er typer eller raser som er i stand til.å skille mellom Cl IAC og Cl IA og gi rimelige antistoff-titere. Hester og kuer er alminnelig kjent for å være godt produserende dyr for fremstilling av antisera og har den fordel i forhold til griser at de kan dreneres flere ganger, mens griser ikke er egnet for drenering men tappes vanligvis for blod. Ifølge prinsippene for foreliggende oppfinnelse er det krav man stiller til et vertsdyr for anvendelse ved fremstilling av et INA-antiserum ifølge oppfinnelsen, at vertsdyret gir spesifikt svar på Cl IAC. Vertsdyret bør videre fortrinnsvis være et slikt hvis antistoffer i alminnelighet tolereres godt av mennesker. I denne sammenheng er griser foretrukne vertsdyr,, og særlig har rene grise-IgG-immunoglobuliner (hovedsakelig ikke-agglutinerte og hovedsakelig frie for andre griseproteiner) vist seg å tolereres fullstendig av mennesker og kan åpenbart klassifiseres som ikke-heterogene av den menneskelige organisme,

(de rene grise-IgG-immunoglobulinene transporteres åpenbart ikke i noen større utstrekning til å spaltes i leveren, hvilket tilfellet ville være med et heterogent protein).

Nærmere detaljer vedrørende fremstillingen av antisera

og antistoffer ifølge oppfinnelsen er gitt nedenfor under rubrikken "Vaksinasjon av, vertsdyr". De anvendte vaksinene bør være sammen-satt slik at de gir en høy antistofftiter i vedKommende vertsdyr, innbefattet en høy antihumanCl-IAC-titer. Foretrukne vaksiner for fremstilling av antisera i griser og sauer er angitt under rubrikken

"Vaksinasjon av vertsdyr", og fremstillingen av de aktive komponen-ter i vaksinene er angitt under rubrikkene "Fremstilling av Cl IAC", "Rensning av Cl IAC/Cl IA fra pleural/askitesvæske fra cancerpasienter" og "Rensning av Cl IA/cl IAC med et innhold av orosomukoid, o^HS-glykoprotein og Zn-o^-glykoprotein fra pleural/askites-væske" nedenfor.

De antisera som fremstilles som beskrevet ovenfor,.kjen-netegnes ved at de inneholder antihuman Cl IAC, dvs. antistoffer som er i stand til å reagere spesifikt medCl IAC-determinanter. En slik . spesifikk reaksjon kan illustreres ved hjelp av flere kjente immunologiske metoder.Prinsipielt skulle det være mulig å underkaste de spesifikke antihumane Cl IAC-antistoffene, f.eks. én antihuman Cl IAC-IgG, velkjente antistoffspaltningsbehandlinger, som bibeholder antistoffenes spesifisitet, f.eks. for fremstilling av F (ab) 2-fragmentet derav. Avhengig av spaltningsbehandlingen kommer eller kommer ikke antistoffene til å beholde sin evne til å få i stand

komplementsystemreaksjonen.Prinsipielt har hver slik modifikasjon, derivat eller fragment av antistoffene ifølge oppfinnelsen som har beholdt sin spesifikke evne til å blokkereCl IAC-determinantene, anvendelighet ved cancerterapi og -diagnose på grunn av deres evne til å oppspore cancerceller og identifisere Cl IACog nøytralisere den blokkerende virkning avCl IAC. I overensstemmelse med dette kan antistoffene , antistoffragmentene, antistoffderivatene eller anti-stoffmodifikasjonene ifølge oppfinnelsen defineres som antistoffer, fragmenter, modifikasjoner eller derivater som er i stand til å reagere med dyrkede cancerceller på en slik måte at cancerceller, inkubert med merket anti-cl. IAC eller merkede fragmenter, modif ikas jo-ner eller derivater derav,.kommer til å oppvise positiv merkning,

méns celler fra samme kultur, som er forinkubert med neuraminidase, ikke kommer til å oppvise noen merkning efter inkubering med det merkede materialet, og forhåndsmetning med umerket antiserum motCl IAC, fulgt av inkubering med det.merkede immunoglobulinet eller immunoglobulinfraksjonen eller immunoglobulinderivatet eller immuno globulinmodifikasjonen ifølge den metode som er beskrevet i Acta microbiol. scand., Seksjon B, 81_ (1973) 365-372, gir ikke opphav til noen merkning av cancercellene. Som eksempler på modifikasjo-nar av antistoffer ifølge oppfinnelsen kan nevnes isotopmerkede IgG-antistoffer (fortrinnsvis merket med en isotop med kort halveringstid ved anvendelse i vivo for diagnostiske formål, f.eks. merket med teknetium), som på grunn av sin evné til å oppspore cancerceller

kan være anvendbare diagnostiske materialer for å fastslå lokali-seringen av tumorer eller metastaser under anvendelse av f.eks. et gamma-kamera, og Cl IAC-spesifikke IgG-antistoffer, merket med en isotop med noe lengere halveringstid, f.eks. en ( 3-utstrålende isotop såsom 131I, for terapeutisk bruk, eller Cl IAC-spesifikke IgG-antistoffer, kjemisk kombinert med cytostatisk aktive molekyler, f.eks. derivater av kjente cytostatika, hvilkeCl IAC-spesifikke antistoffer, som har ( 3 -emitterende isotop eller cytostat ikum, gir en mulighet til å anvende ( 3-emitterende isotoper eller cytostatika på en meget mer effektiv og sikrere måte ved at de ( 3 -emitterende isotopene og cytostatika transporteres selektivt til cancercellene (det skal minnes om at normale celler tilsynelatende ikke produserer Ci IAC)

Et foretrukket preparat ifølge oppfinnelsen for terapeutisk behandling av humancancer er en grise-IgG-løsning inneholdende 1000 mg IgG oppløst i ca. 200 ml isotonisk saltløsning (eller ekvivalent derav, f.eks. isotonisk glukose). Slike preparater kan i praksis tilveiebringes i f.eks. 10 ml flasker for anvendelse ved in-travenøs infusjon, fortynnet i de normale mengder av isotonisk salt-løsning eller likeverdig middel. Et annet foretrukket preparat er et lyofilisert grise-IgG-immunoglobulin for rekonstituering. Foretrukne administreringsmengder er ca. 20-30 mg immunoglobulin pr. kg pasientkroppsvekt pr. døgn i de første ca. 5 døgn og derefter ca. lo mg/kg kroppsvekt pr. døgn i ca. 2-3 uker. I det tilfellet at pasienten begynner å produsere antistoffer mot det tilførte vertsdyr-'immunoglobulinet, bør cortison administreres, og anafylaktisk sjokk-terapi bør utføres. Noen anafylaksimanifestasjoner er imidlertid ikke konstatert ved anvendelse av grise-IgG-immunoglobuliner, ikke én gang efter lengere perioder med intravenøs administrering med en mellomliggende pause på 14 dager.

Under behandling med INA-antiserum eller -antistoffer overvåkes pasienten omhyggelig slik som beskrevet under rubrikken "Cancerterapi med immunserum ifølge oppfinnelsen", og spesielt vik-tige målte parametere er serumnivåene for Cl IAC og C4. Ved fremgangsrik behandling børCl IAC forsvinne ogC4 senkes til normale verdier. Samtidig behandling med cytostatika kan ikke anbefales i-følge foreliggende oppfinnelse som følge av cytostatikas immunounder-trykkende virkning. Hvis imidlértid.cytostatisk behandling anvendes, bør pasienten fortrinnsvis behandles med INA i f.eks. de siste 14 dager av den cytostatiske behandlingen og derefter kontinuerlig i en tidsperiode på 1 eller 2 måneder efter opphørt cytostatisk behandling for å normalisere det forbrukte immunsystemet,' innbefattet gjenetablering av de normale verdier for T-lymfocytter.Cytosta-tika koplet til . antihuman Cl I/AC som selektive bærere , kan imidlertid vise seg å være nyttige , eftersom de kan administreres i meget mindre mengder enn konvensjonelle cytostatika.

For å overvåke og innstille pasientens immunoglobulinnivå må- spesielt IgG bestemmes kontinuerlig, eftersom IgG-konsentrasjonen gjengir innholdet av både human IgG og grise-IgG i serum. Formålet med en slik overvåkning og innstilling er å sikre at en tilstrekkelig mengde INA-antiserum administreres for kontroll og nøytralisering av de immunforsvarsblokkerende og -maskerende proteiner, særligCl IAC, både i den humorale fase og på cancercellemembranene. Den nødvendi-ge mengde av INA-antiserum er således avhengig av både cancercellenes totale mengde.og cancercellenes aktivitet (Cl IAC-produserende evne).

Den terapierfåring som man hittil har fått , antyder at behandlingen av INA vanligvis er tilstrekkelig for å oppnå remisjon. Man kan imidlertid ikke utelukke at det,■i det minste i visse tilfeller der pasientens evne til å produsere antistoffer er nedsatt, vil være fordelaktig å kombinere behandlingen med INA med en behandling med grise-IgG-immunoglobuliner med spesifisitet overfor andre relevante cancerassosierte proteiner enn Cl IAC, f.eks. kjente cancerassosierte proteiner såsom fetoproteiner,CEA eller polypeptider såsom CAPA, osv. (når de finnes å være tilstede), eller grise-IgG-immunoglobuliner fra griser som er immunisert med homogenisater av cancerceller eller cancervev fra vedkommend'' pasient eller fra andre pasienter som lider av samme type cancer.

Under behandlingen med INA bør pasienten kontrolleres med hensyn til utvikling av antistoffer mot INA ved hjelp av kjente metoder, som benytter en korttrollprøve av grise-IgG (fra ikke-immuniserte griser av samme stamme), under anvendelse av en hemagglutinasjonstest, og hvis man konstaterer antistoffdannelse kan den videre behandling med INA utføres i henhold til et nytt prinsipp iføl-ge oppfinnelsen, dvs. immunoadherens til immobilisert INA.

Ifølge dette prinsipp kan INA-antiserum eller -antistoffer påføres på og immobiliseres med et matrisemateriale, hvorefter pasientens serum får passere en kolonne inneholdende slik matriseimmobilisert INA. Prinsippet med å fjerne proteiner fra pasientens serum ved immunoadherens til matriseimmobiliserte antistoffer antas å være ny og utgjør et trekk ved foreliggende oppfinnelse.Ytterli-gere detaljer vedrørende behandling med immobilisert INA er gjengitt nedenfor under rubrikken "Ekstrakorporal avblokkering og avmaskering av cancerpasientserum" nedenfor. Selv om en slik ekstrakorporal behandling ikke nøytraliserer Cl IAC som er tilstede på cancercelle - membranene, vil den senke det generelle nivå avCl-inaktivator (og fortrinnsvis av orosomukoid, a^HS-glykoprotein og Zn-a^-glykoprotein) i serum og forbedrer således mulighetene til å ødelegge cancercellene ved hjelp åv immunsystemet. I denne sammenheng og også

i samband med den ovenstående redegjørelse for den terapeutiske be-. handling med INA må man huske på at konsentrasjonsbetingelser og kjemiske likevekter formodentlig må spille en vesentlig•rolle ved de beskrevne reaksjoner.

Bevis for at anti-Cl IAC i INA-serum er i stand til å kombinere seg med cancerceller in vivo, er oppnådd på følgende måte: I ekspektorat fra en pasient som led av lungemetastaser fra mammakracinom og var behandlet med grise-INA, ble det påvist cancerceller ved hjelp av histologiske metoder. Disse celler'ble kontrollert med henblikk på griseglobuliner under anvendelse av an-ti-griseglobulin, som var FITC-merket. Ved hjelp av denne metode ble cellehe identifisert som immunofluorescenspositive. Dette viser at INA frembragt i pasienten, var i stand til å belegge proteiner på pasientens cancerceller. Videre kunne man ikke påvise noen typisk spesifikk immunofluorescens under anvendelse av antihuman Cl IAC-FITC. Dette er av spesiell betydning eftersom cancer-'celler, oppsamlet fra pasientens pleura før behandlingen, viste positiv merkning med antihuman kanin-Cl IA-FITC. Disse observa-sjoner antyder også at isotopmerket INA, som injiseres til en pasient, er i stand til å oppspore cancerceller.

For fremstilling av et antiserum- eller immunoglobulin-produkt for diagnostisk anvendelse in vivo, efter isotopmerkning f.eks. fortrinnsvis med technetium, som har en meget, kort halveringstid (4 timer), er den anvendte vaksinen fortrinnsvis ert slik som ikke inneholder Cl IA.

Foretrukne utførelsesformer for et diagnostisk middel ifølge oppfinnelsen er gitt nedenfor under rubrikken "Diagnostiske midler".Diagnostiske midler ifølge oppfinnelsen inneholder et antihumant Cl IAC-materiale, hvis reaksjon med human Cl IAC ved immunologiske testmetoder lett kan skilles fra reaksjonen med human Cl IA. Et slikt materiale er monospesifikk antihuman.Cl IAC

(f.eks. antihuman Cl IAC [absorbert]), som gir immunologisk reak-s jon med Cl IAC, men ikke med Cl IA. Et annet materiale er f.eks. saueantiserum, som inneholder antihumanCl IAC og antihuman Cl IA, som ved forskjellige immunologiske metoder gir to utfellinger med cancerpasientserum og bare en utfelling med ikke-cancerserum. Antisera av de her beskrevne typer kan anvendes for en rekke immunologiske testmetoder innbefattet hemagglutinasjonstest eller RIA, Ouchterlony- og Mancini-immunodiffusjon, immunoelektroforese, immunogelautoradiografi, osv. Den spesielle sammensetning åv slike diagnostiske preparater, materialer eller midler er åpenbare for fagmannen så snart det er slått fast at det eksisterer materiale

som skiller mellom Cl IA og Cl IAC.

Under anvendelse av det sammenlignende diagnostiske immunodiffusjonsmidlet som er beskrevet nedenfor under rubrikken "Diagnostiske midler", er flere hundre serumundersøkelser utført, og på grunnlag av de hittil oppnådde resultater kan man si følgende-.

<p>ålitelighet.

Testen viser en meget høy grad av reproduserbarhet, av størrelsesorden 96 % eller mer, hvilket innebærer at ved anvendelse av én og samme serumprøve for to uavhengite tester, kommer testavles-ningehe til å være identiske i 96 % eller mer av tilfellene. på grunnlag-av denne meget høye reproduserbarhetsgrad må det konstate-res at testen ifølge oppfinnelsen er meget pålitelig. Når "påliteligheten" hos det diagnostiske midlet ifølge oppfinnelsen defineres på en annen måte, kan lavere "pålitelighets"-verdier oppnås. Erfaringen har således vist at hvis man' undersøker serum fra et "ikke-utvalgt pasientmateriale", kommer- i alminnelighet ca. 80% av test-resultatene til å være i overensstemmelse med den fastslåtte diagnosen. Denne tilsynelatende lavere overensstemmelsesgrad antas.imidlertid ikke å være et uttrykk for noen mangel ved testen. En eventuell ikke-overensstemmelse med den fastslåtte diagnosen kan være en følge av det velkjente faktum at følsomheten ved en immunodiffusjonstest er avhengig av et synlig bunnfall, dvs. at en tilstrekkelig konsentrasjon av antigen må være tilstede i den undersøkte prø-ven for å danne en synlig feining. Videre kan en alt for høy konsentrasjon av antigen i.den undersøkte prøven gjenoppløse et bunnfall, og likevekten mellom antigen og antistoff kan ligge langt fra titeren for antiserum mot vedkommende antigen. Disse problemer kan imidlertid løses i hvert spesielle tilfelle der man har mistanke om at de opptrer, enten ved konsentrering av prøven (i førstnevnte til felle) eller ved fortynning av prøven (i det andre tilfellet). En tilsynelatende ikke-overensstemmelse kan også delvis forklares på følgende måte: Man må huske på at det testen gjør er å gjengi nærvær eller, fravær av Cl IAC i pasientens serum (og i den sammenlignende immunodiffusjonsutførelsesform som beskrives under rubrikken "Diagnostiske midler" nedenfor, muliggjør den positive Cl IAC-reaksjonen også en halvkvantitativ béstemmelse). Basert, på en riktig forstå-else av foreliggende oppfinnelse må det antas at en positiv Cl IAC-reaks jon påvist ved den diagnostiske test, er en indikasjon på en aktiv tilstand avCl IAC-produksjon hos pasienten, og en slik aktiv tilstand av Cl IAC-produksjon kan påvises ved hjelp av testen ifølge oppfinnelsen på et så tidlig trinn av cancer at det ikke er mulig å fastslå eller verifisere cancer ved hjelp av noen'annen kjent metode. Dette kan være en forklaring på testresultater som ved første øyekast kan synes som "falsk positive". Erfaringen har vist at til og med blant serumprøvér fra ca. 200 blodgivere viste 2% av prøvene, dvs. 4 prøver, seg å være cl IAC-positive, og 5%, dvs. 10 serumprø- vér, viste seg å være tvilsomt positive. En slik oppdagelse innebærer naturligvis at vedkommende blodgiver ikke lenger bør anvendes som blodgiver, men bør undersøkes med hensyn til årsaken til' at man har funnet Cl IAC i dennes serum ved hjelp av testen ifølge oppfinnelsen, og i virkeligheten -innebærer en foretrukket behandling ifølge foreliggende oppfinnelse en INA-behandling på dette tidlige trinn til pasienten ikke lenger oppviser noen positiv Cl IAC-reaksjon, dvs. en behandling basert på oppdagelsen av en positiv Cl IAC-test, før noen cancer eller annen tilstand har rukket å utvikle seg. Det er alltid t Urådelig at en Cl IAC-positiv pasient uten noen andre tegn på påvisbar cancer, kontrolleres kontinuerlig med testen ifølge oppfinnelsen. Erfaringen har også vist at visse typer av virus, f.eks. mononukleosevirus, er i stand til å produsere cl IAC. Ved mononukleose kommer cl IAC-testen på pasienten til å være negativ når mono-nukleosen med hell er helbredet. Dette synes å antyde at mononukleosevirus produsererClIAC, og det er ikke usannsynlig at en behandling med anti-Cl IAC-grise-IgG skulle innebære en effektiv terapeutisk behandling av mononukleose. Andre tilfeller der en test utført ifølge prinsippene i henhold til oppfinnelsen ved første øyekast kan oppvise en ikke-overensstemmelse med den fastslåtte situasjonen, er tilfeller der cancerpasientene oppviser en negativ Cl IAC-reaksjon. Problematikken ligger i dette tilfelle imidlertid i definisjonen av hva som er en "cancerpasient". Hvis en pasient er underkastet et vellykket kirurgisk inngrep med fjernelse av primære tumorer ved et tidspunkt da metastaser ikke er utviklet, kommer en slik pasient ikke til å ha noen reminisenser fra den opprinnelige cancertilstand, og pasientens organisme inneholder ikke noen celler som produsererCl IAC. Naturligvis kommer en slik pasient til å oppvise et negativtCl IAC-svar selv om han i sykehusjournalene er angitt å være en cancerpasient. Andre tilfeller der negativt Cl IAC-tester ved førs-te øyekast kan synes å være uriktige resultater, er tilfeller der cancerpasienten er i bedring, slik at deres cancerceller ikke lenger produserer Cl IAC. Cancerpasienter med benmetastaser som har vært

i stasjonær tilstand i mange år, har også ofte vist seg å gi negativt svar ved immunodiffusjonstesten ifølge oppfinnelsen. Slik som testen er utformet for påvisning av nærvær av Cl IAC i pasientmate-rialet , gir testen ikke noe positivt resultat når Cl IAC ikke er tilstede i pasientens serum. En tilstand hvorCl IAC ikke er tilstede i pasientens serum, er på den annen side en tilstand der pasientens cancer ikke er aktiv. på grunnlag av disse betraktnin-ger kan det sies at den diagnostiskeCl IAC-testen ifølge oppfinnelsen gir positive resultater for aktive cancertyper, som i aktiv tilstand produsererClIAC, og dette synes å gjelde for de aller feiste cancertyper som forklart nærmere nedenfor. Eftersom testen kan be-traktes ikke bare som kvalitativ, men også som halvkvantitativ (og kan videreutvikles til en kvantitativ test), understryker disse fakta betydningen av testen ved at testen påviser serumkonsentrasjonen av akkurat det protein som i flere cancertyper synes å være ett av hovedelementene i cancercellenes evne til å unnslippe eller forsvare seg mot ødeleggelse av immunsystemet.

Erfaring fra de hittil utførte serumundersøkelser under anvendelse av det diagnostiske immunodiffusjonsmidlet er nærmere bestemt følgende: Følgende cancertyper har vist seg å være relativt konstant Cl IAC-positive: karcinomer såsom carcinoma mammae (brystkarcinom), carcinoma corporis uteri (livmorkarcinom), cancer pulmonis (lunge-karcinom), cancer pancreatis (pankreascancer), cancer ventriculi

(mavecancer), hepatom (primær levercancer), cancer coli (endetarm-cancer), cancer renis (nyrecancer) innbefattet nyrebekkenkarcinom (carcinoma' pelvis renis) , og carcinoma vesicae urinariae (urinblære-karcinom), sarkomer (noen osteosarkomer og fibrosesarkomer er under-søkt og har vist seg å være svakt Ci IAC-positive). Osteosarkomer i

bedring (ett' tilfelle) er nu negativ efter vellykket cytostatisk behandling-, før behandling var det svakt positivt. Testikkelterato-mer er kraftig cl IAC-positive. Melanomer:ikke alle melanomer har vist seg å være Cl IAC-positive. ■ Noen undersøkte tilfeller av Hodgkins har vist' seg å være cl IAC-positive.Neoplasma hos barn: nefroblastom har vist seg Cl IAC-positiv. Neuroblastom har vist seg å være Cl IAC-positiv. Tumorer i sentralnervesystemet, f.eks. astro-cytom og glioblastom, manifisterte seg ikke ved positiv Cl IAC-test på serum. Maligne sykdommer i blod og lymfesystem: akutt myeloblas-.tisk leukemi (AML) og kronisk myelod leukemi (CML) har vist seg å væ-reCl IAC-positive, med unntagelse for remisjonsfasen. Myelomatose har også vist seg å væreCl IAC-positiv. Akutt lymfoblastisk leukemi (ALL) og kronisk lymfoblastisk leukemi har vist seg å være Cl IAC-positive i 5-20% av de totalt bekreftede tilfeller; det skal imidlertid legges merke til at de fleste av de hittil undersøkte tilfeller av ALL befant seg i bedring, mens et fåtall tilfeller av undersøkte aktive stadier av ALL viste seg å være betydelig Cl IAC-positive.

Et tilfelle av akutt lymf os.arkomleukemi har vist seg å væreCl IAC-negativt. ' Lymforner har vist seg å være svakt positive eller i visse tilfeller betydelig positive.

Det skal legges merke til at et verdifullt trekk ved den diagnostiske test ifølge oppfinnelsen, er at den muliggjør en menings-full overvåkning av pasienten under hvert forsøk på terapi. Erfaringen har vist at cytostatisk behandling, av alvorlige sykdommer ikke senker Cl IAC-titeren hos pasienten hvis tumorene ikke remisjoneres ved behandlingen. Med andre ord, hvis testen ifølge oppfinnelsen viser at man ikke oppnår noen senkning av Cl IAC i serum under et for-søk på terapi, antyder dette at terapien ikke er effektiv. Det kan også sies, basert på ovenstående redegjørelse for oppfinnelsen, at de cancertyper og -stadier som er Cl IAC-positive må antas å være slike som kan underkastes vellykket terapi med anti-Cl-IAC-antiserum ifølge oppfinnelsen.

Det er interessant å konstatere at en<n>autoimmun"-sykdom såsom LED (lupus erythromatosus disseminatus) viser en positiv Cl IAC-reaksjon i omtrentlig 30 % av tilfellene. Dette er spesielt bemerkelsesverdig på bakgrunn av det faktum at eksperimentelt innført LED-virus i mus resulterer i utvikling av LED hos en del av de podede musene og i dannelse av lymfom i resten av de podede musene. Ved undersøkelse av serum fra ca. 200 pasienter fra en neurologisk avde-ling som oppviste en rekke forskjellige sykdommer fra cerebral trom-bose og cerebralt infarkt til sykdommer såsom multipel sclerose ,. ga ca. 2% positive resultater, dvs. nøyaktig som i blodgivergruppen.Blodgivergruppen bestod av 200 blodgivere, og som nevnt ovenfor, viste 4 serumprøver seg å være Cl IAC-positive <og 10 serumprøver tvilsomt positive. Sera fra visse av disse Cl IAC-positive blodgivere er undersøkt påny efter noen uker, og ved den nye undersøkel-sen viste noen av de tidligere positive sera fra blodgiverne seg senere å væreCl IAC-negat ive. Sera fra ca. 50 pasienter' med forskjellige typer av allergiske sykdommer fra astma og eksem til neslefeber (med unntagelse av Quincke-typen) viste seg å væreCl IAC-negative.

Totalt ni gravide kvinner er unders"økt og funnet å være negative med unntagelse av ett tilfelle, der pasienten var tvilsomt positiv

I sitt bredeste aspekt angår oppfinnelsen det som antas å være nytt, nemlig prinsippet med å danne antisera og antistoffer med . spesifisitet mot cancercellemembranproteiner, ved isolering av slike cancercellemembranproteiner fra dyrkningsmedier fra dyrkningen av cancerceller, eller å isolere de identiske proteiner, når de blir funnet å være tilstede, fra kroppsvæsker fra cancerpasienter og utnytte slike cellemembranproteiner som antigener ved immunisering av vertsdyr og derefter oppsamle serum fra vertsdyret., idet serumet oppviser spesifisitet mot de aktuelle cancercellemembranproteiner. Kjente forsøk på å danne antisera og antistoffer mot cancerproteiner har omfattet enten immunisering av vertsdyr med levende cancerceller eller med homogeniserte cancerceller eller -vev, og ingen av disse kjente metoder resulterer i antisera eller' antistoffer med spesifisitet mot cancerproduserehde eller cancerassosierte cancercellemembranproteiner med svak antigenisitet. Ytterligere aspekter ved oppfinnelsen i dens videste aspekt omfatter anvendelse av slike antistoffer eller antisera som diagnostiske reagenser' eller materialer eller som terapeutiske midler for passive immuniseringsbehandlinger.

Foruten ovennevnte diagnostiske metoder, som omfatter påvisning av nærvær eller fravær av Cl IAC i humankroppsvæsker, bør også diagnostiske metoder, som baserer seg på påvisning av nærvær eller fravær av biologiskClIAC-aktivitet, nevnes (det skal minnes om atCl IAChar biologiske virkninger som ligner på virkningen av Cl IA). Slike metoder innebærer f.eks. at man underkaster en kroppsvæskeprø-ve en behandling for fjernelse av biologisk Cl IA-aktivitet, f.eks. ved absorpsjon under anvendelse av en spesifikk antihuman Cl IA (kan fremstilles analogt med antihuman Cl IAC i vertsdyr som kan immuniseres spesifikt mot cl IA under' anvendelse av en vaksine inneholdendeCl IA som antigen) og derefter utfører i og for seg fra litteraturen kjente analysemetoder vedrørende cl IA for å fastslå, eventuelt kvan-titativt, karakteristisk biologisk Cl IAC/Cl IA-aktivitet, f.eks. den hemmende virkning på Cl-esterase-hydrolyserende virkning (under anvendelse av f.eks. den AAME-metode som er beskrevet nedenfor under rubrikken "Karakterisering avCl IAC").

Det faktum atCl IACoppviser biologisk virkning som ligner på den hosCl IA, medfører også muligheten til å overvåke forløpet av cancersykdommer ved kvantitativ bestemmelse av den biologiske Cl-inaktivator (cl IAC + Cl IA)-virkning i pasientkroppsvæsker.

En slik overvåkning som kan utnytte metoder eller prinsip-per som er kjent fra litteraturen i samband med Cl IA, f.eks. for bestemmelse av den hemmende virkning avCl-esterase-hydrolyserende virkning, gir samme vesentlige kvantitative informasjon om det totale Cl-inaktivatornivå som kan oppnås ved overvåkning av cl-inaktiva-tornivået under anvendelse av antihuman-kanin-Cl IA.

I det følgende skal forklares nærmere forskjellige fakta og utførelsesformer for foreliggende oppfinnelse.

FREMSTILLING AV Cl IAC

Oppnåelse av humancancerceller for dyrkning Humancancerceller kan oppnås fra pleural eller askites-væske fra pasienter som lider av cancer med metastaser i pleura og/ eller askites. Pleura-/askites-væsken bør håndteres under sterile betingelser, og infektiøse pleura-/askites-væsker bør utelukkes. Separering av cellene fra væsken kan oppnås ved sentrifugering ved 1000 omdr. pr. minutt i 10 minutter ved romtemperatur. Bunnfallet inneholder cellene. Den overliggende væske dekanteres og oppbevares ved -209C for senere isolering av immunogenisk verdifulle proteiner derfra som beskrevet nærmere nedenfor.

En annen kilde er faste humantumorer, som er fjernet fra cancerpasienter ved operasjon, f.eks. maligne hjernetumorer fra pasienter som liger av primære maligne hjernetumorer. Cancercellene kan oppnåes fra slike tumorer ved trypsinering. Hjerneprøvene vaskes f.eks. flere ganger i "Eagle minimum essential medium" (MEM), hvorefter vevet.skjæres i 1-2 mm terninger og suspenderes påny i mediet efter ytterligere vaskninger og sentrif ugeringer, f ..eks. i 10 minutter ved 900 omdr. pr. minutt,trypsinløsningen kan tilsettes, hvoretter inkuberingen utføres i f.eks. 30 minutter ved 25°C , og cellesuspensjonen kan filtreres gjennom steril gas blandet med en minst mulig mengde av Eagle MEM, tilsatt 15 % bovinserum, og sentrifugeres som nevnt ovenfor.Bunnfallet inneholder cellene, og den overliggende væske dekanteres.

Hvert av de ovennevnte bunnfall kan anvendes separat ved efterfølgende behandlinger, eller også kan bunnfallene samles. Videre, kan humankanserceller erholdt fra andre kilder, behandles analogt og anvendes som sådanne eller blandes med cancerceller, som er erholdt som beskrevet ovenfor.

Dyrkning av cancercellene.

Cancerceller som er oppnådd som beskrevet ovenfor, eksplanteres i 1000 ml Roux-kolber inneholdende Eagle MEM, tilsatt glutamin (ca. 294 mg/liter) og inneholdende 15% inaktivert fetalt kalveserum, og inkuberes i inkubator uten CC^-tilsetning. For parallell-testkulturer eksplanteres ca. 0,5 ml av cellesuspensjonen direkte på objektglass i et Leighton-rør for å undersøke nærvær av Cl IAC på cellemembranen ved immunofluorescenscytofotometri (Osther et al.: Acta.path .microbiol. scand .B 81_ (1973) ,365) . Når testkulturene viser nærvær avCl IAC, anvendes hovedkulturen som produksjonskultur: mediet fjernes, cellekulturen vaskes med PBS-buffer med pH 7,3 og syntetisk RPMI-aminosyremedium fra Flow, Skottland, beriket med glutamin (ca. 294 mg/liter), men uten noen annen tilsetning, innføres og inkubering utføres i 3 døgn ved 37°C , hvorefter mediet oppsamles under sterile betingelser og sentrifugeres ved 1000 omdr./minutt i 15 minutter ved romtemperatur, hvorefter den overliggende væsken oppbevares i lukkede flasker ved -20°C inntil isolering av Cl IAC utføres. Cancercellekulturen dyrkes ytterligere i ovennevnte modifiserte Eagle MEM-medium, og efter 3 døgns inkubering utbyttes mediet påny med glutaminanriket RPMI-medium, som påny oppsamles efter 3 døgns inkubering og behandles og fryses som beskrevet ovenfor for senere isolering. på denne måte utføres vekselvis dyrkning i modifisert Eagle MEM-medium og glutaminanriket RPMI-medium og oppsamling fra sistnevnte så lenge cancercellekulturen er produktiv. Når det er særlig god vekst (langt over ca. 2 x 10^ celler pr. Roux-kolbe) skjer eksplanteringen i ytterligere Roux-dyrkningskolber, og de resulterende nye cellekulturene anvendes også for produksjon på samme måte som beskrevet ovenfor. Under hele dyrkningsprosessen overvåkes kulturcellenes Cl IAC-produktivitet ved hjelp av testkulturene i Leighton-rørene og til dyrkningsmediene settes peni-cilling og streptomycin i passende konsentrasjoner før anvendelse.

Isolering av Cl IAC

Det glutaminanrikede RPMI-medium som er oppsamlet fra cancercellekulturer som beskrevet ovenfor, utsaltes for utfeining av forurensende proteiner, hensiktsmessig til 40% metning med mettet (NH^^SO^ ved 0°C under omrøring . Det på denne måte behandlede medium sentrifugeres ved 4000 omdr./minutt i 15 minutter ved romtemperatur. Også andre sentrifugeringsprosesser kan anvendes, men nevnte fremgangsmåte har vist seg å gi særlig gode resultater. Bunnfallet kasseres, og den overliggende væsken dialyseres i ca. 48 timer ved 4°C mot tallrike utskiftninger av destillert vann og sentrifugeres derefter ved 3500 omdr./minutt ved romtemperatur i 15 minutter. Også andre sentrifugeringsprosesser er egnet, f.eks. under anvendelse av en avkjølt sentrifuge. Særlig god rensning oppnås i en avkjølt preparativ ultrasentrifuge.

Ved den videre opparbeidelse av Cl IAC fra den klare overliggende væsken utgjør kolonnekromatografiabsorpsjon det første trinn. En foretrukket anionebytterharpiks for dette formål er Dowex 2x8, mesh 200 — 400, men også andre jonebyttematerialer kan anvendes. Ione-bytterharpiksen forbehandles ved kokning i vannbad i 2 timer, behandles derefter 5 ganger 2 timer hver gang med 0,1 M HCl, og bringes derefter til likevekt under omrøring tallrike ganger med Tris-buffer 0,06 M, pH 7,3 til dens pH stabiliseres ved ca. 7,3. Også andre Tris-buffere og fosfatbuffere med forskjellige pH-verdier og ionestyrke har vært anvendt, men ovennevnte buffer har vist seg å være optimal.

Den ovennevnte klare overliggende væsken tilføres til

Dowex 2x8 anionebytterharpikskolonnen (K 50/100 med adaptorer) med en strøm av ovennevnte Tris-buffer, pH 7,3, slik at strømningshastig-. heten er .100 ml/time ved romtemperatur. Det beste utbytte avCl IACoppnås under anvendelse av 160 ml RPMI-medium pr. 1500 ml kolonnema-.teriale. Eluatet fra kolonnen passerer gjennom en mikrogj.ennomstrøm-ningskuvette i et spektrofotometer, som grafisk registrerer den optiske tetthet hos eluatet ved 580 nanometer (et Isco-^pektrofotometer anvendes) og oppbevares i 10 ml fraksjoner i en fraksjonssamler. Ved denne og etterfølgende fraksjoneringer kontrolleres eluerte proteiner, påvist som optiske densitet stopper i spektrof otometeret., med hensyn til Cl IAC ved rakettimmunoelektroforese under anvendelse av antihuman kanin-Cl IA, antihuman grise-Cl IACeller antihuman (absorbert) saue-Cl IAC (fremstilt som beskrevet nærmere nedenfor) i gelen og med hensyn til forurensende proteiner ved hjelp av Freemanns krysse-de immunoelektroforese under anvendelse av antihumant helproteinserum i gelen ogGrabars immunoelektroforese under anvendelse av ovennevnte to typer antisera. De forurensende proteiner kontrolleres hensiktsmessig med hensyn til tilstedeværelse av orosomukoid, transe ferrin c^HS-glykoprotein, inter-a-trypsin-inhibitor, prealbumin og albumin.

Hovedmengden av Cl IAC absorberes på ionebytteren. Ved gjentatt passasje gjennom ionebytteren i Tris-buffer kan resten absorberes.

Mesteparten av de forurensende proteiner kommer i en første hovedelueringstopp ved eluering med Tris-buffer. Et typisk spekt.ro-fotometrisk diagram for denne eluering er vist på fig. 5. Efter et passende antall fraksjoner som følger efter at toppen har vist seg, settes en lineært stigende konsentrasjon av NaCl til kolonnen til et sluttpunkt på 0,09 M NaCl. ovennevnte "passende antall fraksjoner er det antall fraksjoner som sikrer en riktig separering av den første topp og det efterfølgende eluerte proteinet. Også andre, mo-deller av tilsatt saltkonsentras jon , innbefattet trinnvis økning, kan anvendes men uten noen ytterligere fordel.

Cl IAC frigjøres fra ionebytteren ved sluttpunktet på ca. 0,09 M NaCl (som angis ved hjelp av en mindre topp i det spektrofotometriske diagrammet på fig'. 5) , og fraksjonene inneholdende Cl IAC samles og dialyseres mot destillert vann ved 4°c i ca. 24 timer. Derefter lyofiliseres det dialyserte produkt (skallyofilisering under anvendelse av vakuum og forsiktig ytre oppvarmning ved 40°C har vist seg å være en passende metode).

Lyofilisatet suspenderes påny i 0,06 M Tris-buffer, pH 8,6, og tilføres til en "Sephadex" G 75 Superfine gelfiltreringsdekstran-kolonne såsom enPharmacia K 15/50-kolonne under anvendelse av Tris-bufferen , pH 8,6, som elueringsbuffer. Strømningshastigheten er hensiktsmessig ca. 10 ml/time. Eluatet overvåkes med spektrofotometeret og undersøkes ved hjelp av de ovenfor beskrevne immunoelektroforese-teknikker. En typisk spektrofotometrisk registrering av eluatets optiske tetthet er gjengitt på fig. 6, hvor den første toppen representerer Cl IAC. De fraksjoner som er rike på Cl IAC oppsamles, dialyseres fullstendig mot destillert vann (48 timer) og lyofiliseres som beskrevet ovenfor. I det følgende vil dette produkt bli betegnet som "ClIAC ("Sephadex" G75 Superf.)" eller "Cl IACren". Ifølge immunoelektroforetisk bedømmelse er dette produkt rent og ikke-aggregert.

Ved en alternativ rensningsprosess suspenderes påny ovennevnte lyofilisat av de dialyserteClIAC-holdige fraksjoner fra

Dowex 2 x 8-ionebytteren i 0,06 M Tris-buffer, pH 8,6, og tilføres

på enWhatman DE-52-cellulose-anionebytterkolonne (f.eks. K 25/60) med adaptorer. Anionebytteren elueres med en lineært stigende gra-dient av natriumklorid fra 0 til 0,15 M NaCl. Gjentatte passasjer gjennom whatman-ionebytteren utføres til optimal rensning er oppnådd hvilket kan fastslås ved hjelp av ovenfor beskrevne metoder.

Cl IAC som er renset på denne måte, er til en viss grad aggregert, hvilket kan fastslås ved immunoelektrofore.se, se fig. 7.

For anvendelse som immunogent middel i en vaksine som er egnet for den første vaksinasjonen av egnede vertsdyr, sammenføres de Cl IAC-rike fraksjonene fra Whatman-ionebytteren med fraksjonene fra "Sephadex" G75Superfine-kolonnen, og de sammenførte fraksjonene dialyseres og lyofiliseres derefter som beskrevet ovenfor. I det

følgende betegnes dette kombinerte produkt "Cl IAC , protein

^ r ^ r aggregertc

+ Cl IAC"Sephadex" G75 Superf.". Dette produkt er klart for suspen-sjon påny for eventuell blanding med andre proteiner som beskrevet nedenfor og/eller blanding medCl IA alene for å gi et spesifikt antiserum med optimal funksjon.

KARAKTERISERING AV Cl IAC

Materialer og metoder anvendt ved karakteriseringen og ved. de øvrige, nedenfor beskrevne prosesser.

Ahtisera

Antihuman kanin-Cl IA (antistoffinnhold 0,7 mg/mi), antihuman kanin-c4 (antistoffinnhold 1 ,0 mg/ml) , antihuman kanin-C3 (antistoffinnhold 1,2 mg/ml), antihuman kanin-c3-aktivator (antistoff innhold 0,5 mg/ml), antihuman kanin-a^HS-glykoprotein (antistoff innhold 0,35 mg/ml), antihuman kanin-inter-a-trypsin-inhibitor (antistoffinnhold 1,0 mg/ml), antihuman kanin-orosomukoid (antistoffinnhold 0,9 mg/ml), antihumant kanin-transferrin (antistoffinnhold 2,5 mg/ml), antihumant kanin-albumin (antistoffinnhold 1,1 mg/ml), antihumant kanin-prealbumin (antistoffinnhold 0,25 mg/ml), antihumant kanin-cv^-fétoprotein (0,2 mg/ml) og antihuman kanin-plasminogen (antistoffinnhold 0,25 mg/ml) var fra Behringwerke. Antihuman kanin-IgG (antistoffinnhold 0,4 mg/ml), antihuman kanin-IgM (antistoffinnhold 0,4 mg/ml) og antihumant kanin—:helserum fra Dakapatts.

Streptokinase

Streptase inneholdende 100 000 enheter streptokinase, svarende til 30 mg, i 10 mg glutamin og 10 mg hyaluronidase.

Oppløst i 400 mikroliter 0;15 M saltløsning svarende til 75 mikro-gram streptokinase pr. ml. Fremstilles i løpet av 1 time før anvendelse .

Plasma

Oppnådd fersk frå friske individer i rør (14/15 mm) inneholdende 1 ml ACDog 9 ml blod.

Serum

Humanblod fikk man ved venepunksjon uten antikoagulerings-midler fra friske donatorer. Fikk koagulere ved romtemperatur i 1 time og ble holdt natten over ved 4°C.Serum ble fraskilt ved .. o sentrifugering ved 4200 omdr./minutt i 10 minutter ved 4 C.

Bovinfibrinogen

Levert fra Behringwerke, inneholdende 60 mg lyofilisert Bovinfibrinogen, nyfremstilt i en konsentrasjon av 0,4% for diffu-sjonsfibrinolyse og 0,6% for fibrinagaroseelektroforese.

Neuraminidase

Fra Vibrio cholerae inneholdende 500 enheter pr. ml;

fått fraBehringwerke.

Immunoelektroforese

Indubiose A 37 agarosegel oppnådd, fraL<J>Industrie Biochemique Francaise.

Buffere

Diemalbuffer, pH 8,6, ionestyrke 0,02.Barbitalsaltbuffer bestod av 0,025 M barbital og 0,125 M natriumklorid ved pH 7,5

(Ratnoff, O.D., Davie, E.W. og Mallet: "Studies on the Action ofHageman Factor: Evidence thatActivatedHageman Factor in Turn Activate.s Plasma Thromboplastin Antecedent." J. Clin . Invest. 40

(1963), 803). Veronalbuf f er pH 7,3-7,4, tilsatt MgCl2-6li20 og CaCl2-2H20.

Human Cl

Cl-esterase ble fremstilt fra euglobulinfraksjonen ved DEAE-cellulosekromatografi under anvendelse avLepow-buffer inneholdende Na^HEDTA som beskrevet av Bing. De fraksjoner som inneholdt urene løsninger av Clq, Clr og Cls ble ført sammen og dialysert mot natriumfosfatbuffer, pH 7,4, 0,006 M, inneholdende 0,0015 M EDTA, og ble lyofilisert.

N-acetyl-L-arginin-metylester-hydroklorid (AAME) ble erholdt fra CycloChemicalCorp., Los Angeles, California. AAME ble oppløst i en konsentrasjon av 0,015 M i fosfatsaltbuffer, innstilt på pH 7,4 ved tilsetning av0,15 M natriumhydroksyd.

EA

Saueblod i et likt volum Alsevers løsning, lagret ved 40 C, og amboceptor (hemolysin), lagret ved -20°C, ble oppnådd fra

Serum Institute, København, og anvendt og standardisert spektrofoto-iretrisk som beskrevet av Mayer (Mayer, MM: "Complement and ComplementFixation in Experimental Immunochemistry" (E.A.Kabat&MM Mayer,

Eds.) Springfield, Illinois, Charles C. Thomas, 2nd ed., side 133, 1961) .

EACl

Dette kompleks mellomClq, Clr og Cls sammen med EA ble fremstilt for å danne EACl. Konsentrasjonen av ca<++>ble holdt ved 10 -3M. Aktiviteten hos dette kompleks ble kvantifisert ved målning av

den hemolysegrad som ble oppnådd ved passende fortynning av humanserum inneholdende 16 x 10 M Na^MgEDTA for a kelatere Ca , for å blokkere ytterligere virkning av cl men tillate reaksjon av C2 ,

■ C4 osv.

Eksperimentelle metoder

Immunoelektroforese

Kvantitativ elektroforese i antistoffholdig 1%-ig agarose (1,5 mm tykk) ble kjørt med 2,5 V/cm i 18-20 timer ved 20°C (Laurell C.B.: "Quantitative Estimation of<p>roteins by Electrophoreses in Agarose GelContaining Antibodies." Ann. Biochem. 15_ (1968)

44-52). Kvalitativ immunoelektroforese ble kjørt ifølge den metode

som er beskrevet av Grabar&Scheidegger. Antigen-antistoff-krysset elektroforese ble kjørt ifølge Freeman (Clarke , HC & Freeman, T.: "A Quantitative Immunoelectrophoreses Method (Laurell Electrophoresis)", side 503-509 i "Protidesbf the Biological Fluids", Vol. 14, Elsevier, Amsterdam, 1966.; Laurell, C.B.: "Antigen-antibody Crossed Electro-phoréses." Ann. Biochem. 10 (1965) 358-361. Første separering ved hjelp av elektroforese i agarose med 10 V/cm i 1,5 timer ved 20°C.

Efter vridning av det elektriske feltet 90° ble elektroforese foretatt i antistoffholdig agarosegel med 2,5 V/cm i 18-20 timer ved 20°C.

Immunodiffus jon■

Ble kjørt i 1%-ig agarose ifølge Ouchterlonys geldiffusjons-teknikk (Ouchterlony , 0 . :Progr. Allergy 6_ (1962) 30.. Diffusjonen ble utført ved romtemperatur i 3 døgn.

T andemkrysset immunoelektroforese.

Ble kjørt ifølge Krøll (Krøll, J.: "Tandem-crossed Immunoelectrophoreses" i "A Manual ofQuantitative .Immunoelectrophoreses"

(Eds. Axelsen, NH, Krøll, j. , Weeke, B.) Universitetsforlaget, Oslo, 1973, side 57-59). Prinsippet er en innledende elektroforese av to antigenprøver i samme separeringskjøring i agarosegel med 10 V/cm i 1,5 timer. Efter vridning av det elektriske feltet 90° kjøres

elektroforesen i antistoffholdig gel med 2,5V/crti i 18-20 timer ved 20 °c.

Fibrinagarosegel- elektroforese

Ble kjørt som en modifikasjon av fibrinagarelektroforese (Heimburger, N et al).Bovinfribrinogenløsning, 0,4%, fremstilt i 0,9% saltløsning. 9 deler av den 0,4%-ige fibrinogenløsning ble satt til 2 deler 0,1 N.CatH^PO^.H^. F ibrinogenlø sn ingen ble gjort fullstendig viskøs uten innhold av fortynnet fibrinogen ved inkubering ved 37°C. 2 deler 1%-ig agarose fortynnet i diemalbuffer ble tilsatt og løsningen ble holdt ved 45°C til den ble anvendt. Gelen ble helt på mikroobjektglass, ble koagulert ved romtemperatur og derefter oppvarmet på vannbad ved 80°C i 60 minutter. Prøvene som ble plasert i hullene i fibrinagaroseelektroforeseanordningen, ble kjørt ved 160 V i 1,5 timer ved romtemperatur. Efter kjøringen ble det angitte reagens satt til sporene. Diffusjonen ble derefter fremkalt ved 37°C natten over. Fibrinagarosegelen ble derefter holdt i vannbad ved romtemperatur i 0,9% saltløsning i 24 timer og ble derefter vasket i 1 time med destillert vann. Objektglassene ble derefter farvet medCoomasie brilliant blue.

Biologiske egenskaper hos Cl IAC

1) Inhibering avCl-esterasehydrolyserende virkning.

Cl-esterase ble regenerert fra urene, dialyserte og lyo-

f iliserte f aksjoner av Clq, Clr og Cls, suspendert påhy til en konsentrasjon svarende til ca. 5 mg/ml. SomCa<++->kilde for regenere-ringen ble anvendt 0,1 ml 0,033 M Ca(H2P04)2pr. ml.

Inhiberingen (hemningen) av de esterolytiske egenskapene hosCl-esterase ble testet ved inkubering av 0,5 mlcl-esterase med 0,25 ml Cl IA eller Cl IAC (proteinkonsentrasjon 10 mg/ml) eller som kontrollprøve en natriumfosfatbuffer, ionestyrke 0,15, pH 7,45. 0,75 ml av ovennevnte buffer ble satt til samtlige rør. Rørene ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter.

Som substrat ble anvendt AAME (N-acetyl-L-arginin-metyl-esterhydroklorid) i et volum på 1 ml 0,015 M og substratet ble satt til rørene -for ytterligere inkubering i 60 minutter ved 37°C.

Umiddelbart efter tilsetningen av AAME og 60 minutter senere ble det tatt ut 1 ml porsjoner, som.ble blandet med 1 ml 37%-ig formaldehyd. Den titrerbare surheten i den første porsjon og i den porsjon som var inkubert i 60 minutter, ble målt ved tilsetning av 0,05 N natriumhydroksyd til et sluttpunkt på pH 7,8. Titreringene ble utført med et Radiometer pH meter 26 (Radiometer, København).

Hydrolysen av AAME ble delvis hemmet av så lite som 0,25 enheter/ml avCl IAC,- hvilke resultater kan sammenlignes med den hemmende virkning avCl IA som er rapportert av flere forfattere i litteraturen.

2) Inhiberende virkning av Cl IAC på Cl- aktivering av

C4, som det fremgår av inhiberingen av komplementhemolyse.

Saue-erytrocytter ble belagt med amboceptor og renset første komponent av humankomplement under anvendelse av den metode som er beskrevet av Ruddy et al. Den overliggende serumvæsken, som var fattig på Cl, ble anvendt som komplementkilde C2-C9. Saue-erytrocytter ble anvendt i en konsentrasjon av 2% i VBS-buffer uten gelatin. Amboceptor ble anvendt i en fortynning av 1:400, bestemt ved hemolysin-titrering. Komplement-titreringen ble utført i seriefortynninger.i mikrotiter-plater. 100 mikroliter EACl (konsentrasjonen avCl refererte til det opprinnelige volum og ble seriefortynnet på samme måte som serum ble fortynnet), 100 mikroliter serum, som var fattig påCl, i seriefortynninger og 50 mikroliter VBS-buffer inneholdende 3 mg Cl IAC eller 50 mikroliter VBS-buffer som kontroll-prøve ble blandet og inkubert ved 37°C i 30 minutter. Hemolyse ble avlest på et Carl Zeiss PMQ II spektrofotometer, bølgelengde 541 nm, i kvartsmikrokuvetter. C4, C3 og Cl IAC fra seriefortynningene ble kontrollert ved hjelp av rakettimmunoelektroforese. Som det fremgår av fig. 8 oppviser løsningene inneholdende Cl IAC inhibering av hemolyse sammenlignet med løsningene uten noe innhold av Cl IAC. 3) Fravær av virkning avCl IA ogCl IACpå koaguleringstiden for plasma. Virkningen av renset Cl IA og Cl IAC på blodkoaguleringsti-den ble undersøkt ved en modifikasjon av den teknikk som beskrives .av Ratnoff et al. (Ratnof f , O.D., Copoly , J.E.&Pritchard , J.A.: "The blood Clotting Mechanism during Normal ■parturition". J.Lab. Clin. Med. 44 (1954) 408.

Cl IA og Cl IAC sammen med en bufferkontrollprøve (0,005

M f osf atbu.f f er) i en konsentrasjon på 10 mg pr. ml ble blandet med

1 ml citrat-tilsatt plasma-som inneholdt 0,025 M kalsiumfosfat i polystyrenrør. 200 mikroliterClIA',ClIACeller buf f erkontrollprø-ve ble satt samtidig til rørene.

Blandingene ble inkubert ved 37°C i vannbad. Den tid som gikk fra inkuberingen til koaguleringen fant sted, ble registrert som koaguleringstiden.

Cl IA og Cl IACi en konsentrasjon av 1 mg/ml hadde ingen

innvirkning på den rekalsifiserte koaguleringstiden for blodplate-fattig plasma ved målning i polystyrenrør (tabell I).

Regenereringssystemet var 0,5 ml plasma sammen med 0,025

M Ca (H2P04) 2 .

Bufferen var 0,005 M fosfatbuffer, pH 7,4.

Konsentrasjonen av Cl IAC og Cl IA ble holdt omtrentlig konstant, basert på•den ved hjelp av rakettimmunoelektroforese funne konsentrasjon og det rensede proteinets tørrvekt.

Koaguleringstiden for bådeCl IAC-tilsatt og cl IA-tilsatt plasma liksom for plasme med et innhold avCl IA på ca. 30 mg/100 ml

varierte med 60 sekunder uten noen betydelig forskjell for plasma blandet medCl IAC eller cl IA og ublandet plasma. Den gjennomsnittlige koaguleringstiden i dette system er i overensstemmelse

ned den gjennomsnittlige koaguleringstid som er påvist av Ratnoff

et al., loe.eit.

4)Inhiberende virkning avCl IACpå fibrinolyse

Den inhiberende virkning avClIACble studert på et rege-nereringssystem bestående av plasma, rekalsifisert med kalsiumfosfat.

Koaglene ble veiet før lyse ble fremkalt ved hjelp av streptokinase (streptase, 20yug) , 100 000 enheter pr ml. Vekten

av de enkelte koaglene efter en inkuberingsperiode på 6 timer (lukkede rør) ved 37°C ble registrert og sammenlignet med den opprinnelige vekten hos de individuelle koaglene før igangsettelse av lyse. Før igangsettelse av lyse ble Cl IAC eller Cl IA i en konsentrasjon av 10 mg/ml eller bufferkontroll satt til den koaguler-te plasma. Resultatene fremgår av den følgende tabell II.

Regenereringssystemet bestod av plasma og CatE^PO^^-Lyse ble indusert med streptase bestående av 100 000 enheter streptokinase pr. ml. Konsentrasjonen av Cl IAC eller Cl IA ble holdt omtrentlig konstant, basert på rakettimmunoelektroforese og det rensede proteinets tørrvekt.

Av tabell II fremgår at lyse av koagelene i en viss utstrekning hemmes av Cl IAC. 5) ' Inhiberende virkning av Cl IAC på plasmafibrinolyse-systemet som det fremgår av fibrinagaroseelektroforese.

Fremgangsmåten er beskrevet i detalj ovenfor. De materialer som ble innført i hullene og satt til sporene, fremgår av den følgende tabell III.

Analyse av de resterende blandingene av Cl IAC- og streptokinase-aktivert humanplasmin viste atCl IACi en sluttkonsentra-sjon på 1 mg/ml hemmet plasminaktiviteten. En klar sone, som dannes i fibrinnettet , viser fibrinolysen. Det viste seg at den klare sone som representerte serum blandet medClIAC, var mindre enn den klare sone som representerte kontrollserumet med buffer.

Undersøkelse av elektroforese i fibrinagarosegel av strep-tokinaseaktivert plasma med antiplasminogen i ett spor og ClIACi . det andre sporet, viste en hemmet sone av fibrinforbruk i den sone som svarte til plasminogenbunnfallet og det spor som inneholdt Cl IAC.

Fibrinagarosegel av humanserum, blandet medCl IAC i en konsentrasjon av 1 mg/ml og underkastet elektroforese og ujmiddel-bart derefter aktivert med streptokinase■i sporene, viste intet forbruk av fibrinagaren, mens et forbruk ved elektroforesen på serum uten noe innhold av Cl IAC kunne fastslås. 6) Innvirkning av pH på Cl IAC' s inhibering av Cl- esterase- hydrolyserende virkning.

Innvirkning av pH på den biologiske aktiviteten hosCl IAC ble undersøkt innenfor pH-området 3-11. Renset Cl IACble fortynnet, til en konsentrasjon på ca.' 30 mg%. 2,0 ml porsjoner av cl IACløsningen ble undersøkt ved titrering til. den ønskede pH-verdi med 0,5 N HCl eller 0,5 M NaOH.Blandingene ble holdt ved 4°c i 18 timer og ble derefter titrert til pH 7,4 + 0,1. Volumene av hver blanding ble innstilt på 3,0 ml med 0,15 M NaCl og til slutt på 4,0 ml med 1,0 ml natriumfosfat, pH 4,7, ionestyrke 0,15. Porsjoner på 0,25 og 0,5 ml ble tatt fra hver blanding for bestemmelse av Cl IAC-inh.ibitoren. Den metode som ble anvendt ved inhiberingsbestemmel-sen, innebar blokkering av Cl-esterasevirkning på AAME.

Aktiviteten av Cl IAC avtok suksessivt under pH 5,5 og

over pH 10,5.

7) Innvirkning av varme på Cl IAC:s inhibering av Cl-esterase- hydrolyserende virkning

Cl IAC ' s varmestabilitet ble undersøkt ved inkubering. av renset Cl IAC i 0,15 M NaCl, som ble holdt ved en pH på 7,1 i 30 •minutter ved forskjellige temperaturer varierende fra 0 til 60°C. Den biologiske aktiviteten ble bestemt som Cl IAC's inhiberende virkning påCl-ester'ase-hydrolyserende virkning på AAME. 0,5 ml porsjoner ble anvendt. Det viste seg at aktiviteten hos Cl IAC sank dras-tisk ved inkubering ved temperaturer over 56°C.

IMMUNOLOGISKE EGENSKAPER HOS Cl IAC

8) Grabar- Scheidegger- immunoelektroforese Ved Grabar-Scheidegger-immunoelektroforese på antihuman kanin-Cl IA ble det oppnådd et "måkevinge"-bunnfal1 av Cl IA, mens Cl IAC ikke viser noe "måkevinge"-bunnfall (se fig. 9). ["Måkevingen" beskrives av Hirschfeld (1960)]. Cl IAC-bunnfallet strekker seg inn i /?-sonen når immunoelektroforesen kjøres i nærvær av kalsiumlaktat

(se fig. 9).

9) Laure11- rakettimmunoelektroforese

Ved Laurell-rakettimmunoelektroforese på antihuman kanin-Cl IA får man en liten forskjell mellom cl IA og Cl IAC med hensyn til konfigurasjonen av rakettene, som er noe mer avstumpet for cl IAC enn forCl IA, omtrentlig som vist på fig. 7. 10) Tandemkrysset immunoelektroforese ifølge Krøll Under anvendelse av antihuman kanin-Cl IA kunne man konstatere fullstendig identitit mellom cl IA ogCl IAC ved tandemkrysset immunoelektroforese som det fremgår av figurene 11 og 12.

11) Krysset Freeman- immunoelektroforese

Under anvendelse av antihumant kaninhelproteinserum gir renset Cl IA og renset Cl IAC identiske bunnfall ved krysset Freeman-immunoelektroforese (med et utseende lik det som fremgår av fig. 14, andre toppen). (12) Neuraminidase- virkning på de immunologiske egenskapene hos Ci IAC

1 ml renset Cl IAC i en konsentrasjon av ca. 1,0 mg/ml

ble inkubert med 0,2 ml Vibrio choleraeneuraminidase (V.C.N.) svarende til 100 enheter neuraminidase (en neuraminidase-enhet er den mengde enzym som er tilstrekkelig til å frigjøre 1 ng N-acetylneu-raminsyre fra humant cv-glukoprotein) . • Blandingen ble omrørt og inkubert ved 37°C i 15 minutter.Kontrollprøvene inneholdt 0,2 ml 0,09 M fosfatbuffer.

Den på denne måte behandlede rensedeCl IACble underkastet tandemkrysset immunoelektroforese mot antihuman kanin-Cl IA;

se fig.- 13, som oppviser bare én kurve som stammer fra Cl IAC; neura-minidasebehandletClIACer ikke i stand til å danne bunnfall. (Kur-ven er meget høy som følge av overskuddskonsentrasjonen av antihuman kanin-cl IA i forhold tilClIACi dette spesielle forsøk).

Ved Grabar-Scheidegger-immunoelektroforese mot antihuman kanin-Cl IA (se fig. 10) kunne man konstatere at cl IAC, behandlet med neuraminidase som beskrevet ovenfor, ikke gir noe bunnfall. 13) Ouchterlony- immunodiffusjon mot oligospesifikt antiserum.

Ved Ouchterlony-immunodiffusjon mot antiserum, fremstilt

på griser av "dansk landrase" eller "Yorkshire-rase" blandet med "dansk landrase" eller på sauer avTexel-typen eller blandingsrase omfattendeShropshire og Oxford Down, hvilke vertsdyr er vaksinert med vaksiner inneholdendeClIACogCl IA, f.eks. vaksinetypene 1 eller 2 som beskrevet under rubrikken "Vaksinasjon av vertsdyr", eller mot antiserum fra et hvilket som helst annet dyr som er i stand til å skille mellom clIACogCl IA og som er vaksinert med vaksiner inneholdendeCl IACogCl IA i respektive immunogene mengder, girCl IAC et bunnfall som kan skilles fra Cl IA-bunnfall.Serum fra cancerpasienter gir f.eks. to bunnfall som kan skilles fra hverandre , mens serum fra friske donatorer (eller pasienter med ikke-rraligne sykdommer) bare gir ett precipitat , som erCl IA-precipitatet . Ett av bunnfallene fra cancerpasientserum svarer til Cl IA-bunnfallet fra cancerpasientserumet. En' immunodiffusjon av denne type er vist

på fig. 3. Ved de to sentrale hull ble oligospesifikt antiserum anbragt , og i de sirkulært omgivende hull serum fra friske donatorer

("DONATOR") og forskjellige pasienter.Serum fra hver prøve ble'anbragt i hvert av to motsatte hull. I foreliggende tilfelle var det anvendte antiserum ett som var oppnådd fra en sau, vaksinert med vaksinetype 1 (se under rubrikken "Vaksinasjon av vertsdyr").

Av fig. 3 fremgår det at et kraftig indre bunnfall ble dannet, hvilket var identisk for donator og for samtlige pasienter. Dette er bunnfallet avCl IA. Serum fra pasient 3 (fastlagt cancer) gav imidlertid et ekstra precipitat, som lett kunne skilles fra cl IA-precipitatet. Dette er cl IAC-bunnfallet. Samtlige serumprøver gav dessuten et felles svakere ytre bunnfall , som er orosomukoid-bunnfallet/precipitatet) .

Det er åpenbart at bunnfallet dannet avClIAC lett kan skilles fra Cl IA-bunnfallet. Mens den immunodiffusjon som er vist på fig. 3, i virkeligheten var forsøk utført for diagnostisk formål, er naturligvis analoge utfelningsmønstre påvist med blandinger av ren Cl IA og cl IAC , og det vil forståes at .Ouchterlony-teknikken bare er et eksempel på de immunologiske identifiserings- eller analysemetoder (Laurell,Mancini etc. etc.)' som skiller'mellom Cl IA og Cl IAC når oligospesifikt antiserum anvendes.

Andre. egenskaper hos Cl IAC

14) Bestemmelse av molekylvekten hos Cl IAC ved hjelp

av gelfiltreringsteknikk

En "Sephadex" G200 gelfiltreringskolonne (Pharmacia K 25/50) ble bragt i likevekt med Tris-buffer, pH 8,6. En løsning av Cl IAC "Sephadex" G75Superf., renset humanalbumin (kromatogra-fert og kontrollert med hensyn til renhet ved hjelp av immunoelektro-fcrese), hemoglobin (fremstilt ved hemolyse av erytrocytter og .renset og kontrollert med hensyn til renhet) og rensetIgG(molekylvekt 130 000 - 150 000) ble tilført til kolonnen, og eluatet ble. overvå-ket spektrofotometrisk, idet toppenes identitet ble fastlagt ved immunoelektroforese. Den første toppen bestod avIgG, og før denne var fullstendig forsvunnet begynte den andre toppen (Cl IAC) å vise seg. Da Cl IAC-toppen hadde passert, kunne man konstatere et antall hovedsakelig tomme^ fraksjoner, hvorefter neste topp.viste seg, hvilken inneholdt albuminet. Praktisk talt umiddelbart efter albumintop-pen kom hemoglobintoppen.

På grunnlag av det spektrofotometriske diagrammet er det åpenbart at molekylvekten hosClIACmå være større enn molekylvekten hos albuminet, som er 60000, og like under molekylvekten for IgG. Eftersom molekylvekten for IgG ikke kan angis mer nøyaktig

enn til 130 000 - 150 000, gjelder en lignende usikkerhet for bestemmelsen av molekylvekten forCl IAC, som basert på stillingen for Cl IAC-toppen, er 110 000 - 130 000. 15) Sedimentasjonskonstant for Cl IAC bestemt på grunnlag åv sedimentasjonshastigheten ved ultrasentrifugering.

Forsøksbetingelser:

Ultrasentrifuge: MSE analytisk ultrasentrifuge Mk2.

Optik: Schlieren.

Ultrasentrifugecelle: 10 mm syntetisk dobbeltsektor-grenseoverfyllingscelle.

Prøve: ren Cl IAC, oppsamlet fra humanmammakarcinomcelle-kultur i RPMI-medium.

Resultat:

1. forsøk ( c = 0, 55 %)1, ln r Foto nr. Tid efter holdehastighet (s ) = ~ -,—z nr. ^ y c' app u> 2/\_ t

Resultatene av første forsøk er gjengitt grafisk på fig. 15,

diagram 1.

Ved ekstrapolering (lineær regresjon gjennom punktene) til

ordinaten (rT) får man (se diagram 1) : sc= S-^g ^ sQ^ = 5,28 S.

2. forsøk ( c = 0, 94 %)

1/X ln r Foto nr. Tid efter holdehastighet (s ) = ,— nr. (scapp ^ 2 t

Resultatene av 2. forsøket er gjengitt grafisk på fig. 15, diagram 2.

Ved ekstrapolering (lineær regresjon gjennom punktene) til ordinaten (rTQ) erholdes (se diagram 2): sc= S2Q 2 s0l<=><4,9>7 s-Omvandling til standardbetingelser:

1. forsøk ( c = 0, 55 %)

2 . forsøk ( c = 0, 94 %)

Det skal legges merke til at ved omvandlingen til standardbetingelser er det ikke tatt hensyn til korreksjon for • spesifikk vekt eller til korreksjon for det partielle spesifikke volum av Cl IAC. Den korreksjonsfaktor som skyldes disse parametere, ligger sannsynligvis meget nær 1.

Ekstrapolering til c 0. Se diagram 3 på fig. 15. Av diagram 3 fremgår at S2Q 2w = 6,2 S.

Figurene 16 og 17 viser fotoene nr. 4, 6 og 8 fra første forsøk og fotoene nr. 7, 9 og 11 fra andre forsøk. Videre viser fig. 18 fotoene ved t^O sek. (tatt under akselerasjon ved 30 000 omdr./minutt) og ved t = 1206 respektive 1608 sekunder.

DEMONSTRASJON AV Cl IAC' S CANCERASSOSIASJON

Materiale og metoder anvendt ved disse forsøk, var de som er beskrevet ovenfor.

Pleura- eller askitéseksudat fra pasienter som led av langt fremskredne karcinomer, ble anvendt som kilder for karcinom-celledyrkning. Forurensede væsker ble utelukket.Cellekulturene som hadde fått vokse i Roux-kolber og i Falcon-plastkolber, ble fordelt i klonvekst eller mer diffus vekst. Morfologin hos klone-ne, viste celle- og kjernepolymorfi, en stor eller flere nukleoler; mange celler hadde flere kjerner. Mange mitoser kunne sees. Av disse mitoser var flere atypiske.Bindingen av cellene til plast og glass var tilstrekkelig. 27 av de 37 humankarcinomkulturene. ble dyrket som underkulturer 1-4 ganger. Gjennomsnittet var 1,8 underkulturer av 27 kulturer.Cellelinjene ble i henhold til dette dyrket og anvendt, for produksjon av Cl IACi en tid på 2-5 måneder. 10 karcinomcellekul-turer ble ikke dyrket som underkulturer og ble i. henhold til dette anvendt for produksjon avCl IACi ca. 2 måneder.

Cellefri Cl IAC ble oppsamlet omtrentlig én gang pr. uke, vekselvis frigjort i MEM-medium inneholdende 15% inaktivert kalvefetalserum og'i RPMI-aminosyremedium. Det var derfor mulig å opp^

samle 4 ganger pr. måned fra samme cellekultur. Totalt ble det fremstilt 235 isolater av. ClIAC. Av disse isolater ble 37 oppnådd direkte fra de cellefrie pleura- og askitesvæskene.

101 isolater ble oppnådd fra MEM-médium inneholdende 15% inaktivert kalvetetalserum, og 97 isolater ble oppnådd fra RPMI-medium. Fra karcinomcellekultur bleCl IACisolert 2-14 ganger.Middeltallet var 5,4 isolater pr. cellekultur. Under vekstperioden i RPMI-medium ble celleveksten undertrykket, mens i perioden i MEM-medium, som inneholdt inaktivert kalvefetalserum, gjenvant cellene sin normale vekstcykel in vitro. I flere cellekulturer var det nød-vendig å la cellekulturen utvikles mer tilstrekkelig før man igjen byttet til RPMI-medium. Mengden av celler i en kultur ble holdt optimalt ved ca. 2 x 10^ celler pr. Roux-kolbe. Cellekulturene ble kontrollert kontinuerlig med hensyn til utviklingen av de individuelle celletypene.Celletypene fra pleura og askites bestod av karcinomceller, fibroblaster og mesotelceller. I kolber med klonvekst av karcinomcellene var det ikke vanskelig å fastslå den omtrentlige mengde av disse celler. Men i relativt diffust voksende cellekulturer var det vanskeligere å fastslå den omtrentlige mengde av karcinomceller. Mengden av celler som produserte Cl IAC hadde sammenheng med den mengde céller som var belagt med Cl IAC, som det fremgikk av cytofotometri, fra samme cellekulturlinjer.

Totalt 37 pasienter ble anvendt som donatorer. Pasiente-nes alder varierte fra 33 til 80 år. pasientgruppen bestod av 34 kvinner og 3 menn. De 37. pasientene oppsøkte sykehus for å fjerne pleura- og askitesvæsker. Samtlige pasienter hadde langt fremskredne karcinomer av forskjellige opprinnelser. Samtlige pasienter hadde tidligere under sin sykdom blitt behandlet med strålning i 1-3 se-rier. Samtlige pasienter var behandlet med cytostatika og cortison eller prednison, og 25 av pasientene ble under giverperioden behandlet med cortison eller prednison.

Humankontrollcellekulturer

Pleura- og askitestransudat fra pasienter som led av ikke-neoplastiske sykdommer, tjente som ikke-malgin cellekilde. Denne, form for cellekilde for dyrkning in vitro viste seg å være en tilstrekkelig kilde. Vedhefting til Falcon-kolber var tilstrekkelig, men dårligere til glass.kolber av Roux-typen. Utveksten viste seg å kreve en lehger tidsperiode for at man skulle oppnå en tilstrekkelig mengde celler før proteinproduksjon, sammenlignet med en malign cellestruktur. Det ble ikke oppnådd noen klonvekst, men samtlige cellestrukturer ble utviklet diffust.

De.celler som heftet seg til kolbene, var fibroplaster og mesotelcelier. Totale ble det fremstilt 28 kontrollisolater av protein for påvisning avCl.IA-lignende eller clIAC-lignende protein. Liksom for karcinomcellekulturene ble det cellefrie proteinet oppsamlet omtrentlig 1 gang i uken og ble frigjort vekselvis i MEM-medium, som inneholdt 15% inaktivert kalvefetalserum, og i RPMI-aminosyremedium. Kontrollceliekulturene ble kontrollert videre med immunofluorescens og cytofotometri for påvisning av Cl-inaktivator-belégg som vist nærmere nedenfor.

Immunofluorescens- cytofotometri

Cytofotometrimålningene ble utført på 36 primærcellekultu-rer fra karcinompasienter og fra 10 kontrollcellekulturer av ikke-maligne celle-linjer. Totalt ble anvendt 25 underkulturer fra karcinomcellelinjer for cytofotometriske målninger for å bestemme Cl IAC-belegget på de som underkulturer dyrkede karcinomcellelinjene.

Cl IAC-belegget er membranassosiert som.det fremgår av fotografier av de celler som oppviser positiv immunofluorescens.

Av karcinomprimærcellelinjene oppviste gjennomsnittlig 51,3% av cellene spesifikk immunofluorescens med anti-Cl IA-FITC ved måling ved hjelp av cytofotometri. Den gjennomsnittlige forde-ling av immunofluorescensmålingene av kårcinomcellekulturer er vist på fig. 19. Verdier under 40 w.u. defineres som ikke-spesifikke signaler.

Gjennomsnittlig 58,4% av cellene fra de som underkultur dyrkede cellelinjene oppviser spesifikk immunofluorescens. Når man sammenlignerde primært dyrkede karcinomcellene med de tilsvarende, som underkultur dyrkede cellelinjer, varierer mengden av celler, som oppviser Cl IAC-belegg,betydelig.

I noen av de som underkultur dyrkede cellelinjer er mengden av ClIAC-belagte celler større sammenlignet med deres utgangs-kultur.

Spesifikk kontrollimmunofluorescens, som ble utført ved formetning av cellekulturene med umerket anti-Cl IA, fulgt av inkubering med anti-Cl IA-FITC, og nøytralisert anti-Cl IA-FITC (med renset ClIA) viste ikke noen verdier, som overskred grenselinjen, og således fant man ikke en eneste celle som oppviste spesifikk immunofluorescens.Kontrollceliekulturene (ikke-maligne celler) viste ved målning ved hjelp av cytofotometri ikke noe Cl-inaktiva-. torbelegg. De målte verdier hos de noterte celler lå samtlige under 40 w.u. Verdiene for kontrollceliekulturene er ujevnt fordelt liksom

verdiene for kontrollprøven med hensyn til immunofluorescensspesifi-sitet. Kontrollceliekulturene.viste en pålitelighet på minst 63%

og de maligne cellekulturene en pålitelighet på minst 90%. Den

signifikante forskjellen er mindre enn 0,002 (Fischers nøyaktige test).

MEM-kontrollmedier, som inneholdt 15% inaktivert fetalt kalveserum, og RPMI-kontrollmedier (ikke anvendt for celledyrkning) ble underkastet immunoelektroforese før og efter en Dowex-eluering. De undersøkte medier avslørte ikke noen utfelningslinjer mot antihumant Cl IA-antiserum fra kanin. De eneste påviste utfelningslinjer ble oppnådd mot antihumant albuminantiserum fra kanin. Disse kontrollforsøk beviste følgelig at de medier som anvendes for celledyrkning, ikke inneholdt noen proteiner som reagerer med anti-cl IA før de anvendes for celledyrkning.

MEM-medier og RPMI-medier, oppsamlet fra ikke-maligne cellelinjer og underkastet immunoelektroforese, avslørte ikke noen utfelningslinjer mot antihumant cl IA-antiserum fra kanin. Ved anvendelse av Ouchterlony-immunodiffus jon ble det ikke påvist noen utfelningslinjer mot antihumant cl IA-antiserum fra kanin.

Følgelig ble det ikke frigjort noen påvisbar mengde Cl IA fra de ikke-maligne kontrollcellekulturer i mediene, når man utnytter immunoelektroforese- og immunodiffusjonsmetoder for påvisning.

RENSNING AV Cl IAC/ Cl IA FRA PLEURA/ ASKITES- VÆSKE

FRA CANCERPASIENTER.

Pleura-/askites-væske fra pasienter som lider av cancer med metastaser i pleura og/eller askites, sentrifugeres slik som beskrevet ovenfor under rubrikken "Fremstilling avCl IAC", og bunnfallet eksplanteres til cancercellekulturer som beskrevet ovenfor. Den overliggende væske får, eventuelt efter oppbevaring ved -20°C (se ovenfor), koagulere sponatant i 2 timer ved romtemperatur og får derefter stå natten over i kjøleskap for å fullføre den spontant koaguleringen. Den overliggende væsken sentrifugeres påny for fjernelse av fibrin og fryses til -20°Ctil den ytterligere, rensningen finner sted. 2 ml av den således behandlede pleura/askites-væsken blandes med 2 ,5 g DEAE "Sephadex" A50 ■ anionebytter, som på forhånd er oppvarmet til 100°C i 30 minutter og derefter avkjølt til romtemperatur. Blandingen omrøres 1 time ved 8°C. Derefter■innføres blandingen i en kolonne og vaskes med" 5 x 40 ml 0,15 M NaCl med sug fra kolonnebunnen. Cl IAC/Cl IA-proteinmaterialet absorberes på ionebytteren.Ionebyttermaterialet i kolonnen vaskes med 200. ml 2 M NaCl og trinatriumcitrat, 0,01 M, pH 7,0.

Det sistnevnte eluatet, som inneholderCl IAC/Cl IA, blandes med mettet (NH4)2S04_ (pH innstilt på 7,0 med NaOH) til 50%-ig metning ved 8°C i løpet av 1 time. Derefter utføres sentrifugering (10 min. ved 3000 omdr./min. ved romtemperatur), og til den overliggende væsken settes (NH4) 2S04 '(som ovenfor, pH 7,0) til 65% metning ved 8°C i løpet av 1 time. påny utføres sentrifugering (10 minutter ved 3000 omdr./min ved romtemperatur) og bunnfallet, som inneholder Cl IAC/Cl IA, dialyseres natten over mot destillert vann-ved 4-6°C og gjenoppløses derefter i 0,15 M NaCl.

Løsningen lyofiliseres, enten ved skallyofilisering eller ved iyofilisering i vakuum med ytre oppvarmning som beskrevet ovenfor under rubrikken "Fremstilling avCl IAC".

Produktet, som i det følgende betegnes "Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex"A50", er ferdig for anvendelse i vaksiner, enten i blanding med ovenfor beskrevne Cl IAC/Cl IA, a2.HS , Zn-a^, orosom. , eller separat.

RENSNING AV Cl IA/ Cl IAC MED ET INNHOLD AV OROSOMUKOID,

g^ HS- GLYKOPROTEIN OG Zn- o^- GLYKOPROTEIN FRA PLEURA-/ ASKITES- VÆSKE

Pleura/askites-væske fra pasienter som liger av cancer med metastaser i pleura og/eller askites, sentrifugeres som beskrevet ovenfor under rubrikken "Fremstilling av cl IAC" , og bunnfallet eksplanteres til cancercellekulturer som beskrevet ovenfor. Den overliggende væsken får, eventuelt efter oppbevaring ved -20°C

(se ovenfor), koagulere i 2 timer ved romtemperatur. Koagelet fjernes, og væsken sentrifugeres påny ved 1200 omdr./minutt i 10 minutter ved romtemperatur. Derefter utsaltes væsken for utfeining av forurensende proteiner, hensiktsmessig til 40% metning med mettet (NH^) ve<^ <~)°<~'un<^er omrøring. Derefter skjer opparbeidelsen på samme- måte og samme betingelser som opparbeidelsen efter den utsaltning som er beskrevet ovenfor under rubrikken "Fremstilling av Cl IAC", underrubrikken "Isolering av Cl IAC", under anvendelse av Whatman DE-52 celluloseanionebytterkolonne for den sluttelige rensning.

Et eksempel på en Freeman-krysset immunoelektroforese mot antihumant helproteinserum er vist på fig. 14, der "1. toppen" ble oppnådd før behandling av pleuravæske, mens "2. toppen" ble oppnådd fra en Ci IA + Cl IAC-rik fraksjon fra Dowex-kjøringen. Fra immuno-elektrof orese av "1. toppen" fremgår det at den topp som representerer Cl IAC + Cl IAC, er relativ høy sammenlignet med de fleste andre proteiner (den meget høye toppen er albumin), hvilket er en indikasjon på den maligne tilstanden. I den del som stammer fra "2. toppen" kan topper for orosomukoid og o^HS-glykoprotein, riktignok lave, også påvises (identiteten av proteiner i hver topp fastslåes ved parallellkjørt krysset immunoelektroforese mot spesifikke antisera).

Et eksempel på et første Whatman DE-52 elueringsdiagram

er vist på fig. 20. Kolonnen var en Pharmacia K 26/70 med et lagvolum på 2,6 x 70 cm med strømningsadaptor. Cl IAC + Cl IA-toppen er topp 6.

De fraksjoner som er rike på Cl IA/Cl IAC og de tre øvrige ovennevnte proteiner (som kunne fastslåes ved hjelp av rakett- og Grabar-Scheidegger-immunoelektroforese under anvendelse av kommersielt tilgjengelige antisera mot c^HS-glykoprotein, Zn-o^-glykoprotein og orosomukoid og antihuman kanin-Cl IA (et eksempel på rakettimmunoelektroforese mot anti-orosomukoid er vist på fig. 21)), samles, dialyseres og lyofiliseres som beskrevet i avsnittet ovenfor. I det følgende betegnes det resulterende produkt "Cl IAC/

Cl IA, o^HS, Zn-a^,orosom." Dette produkt er egnet for anvendelse som immunogent middel i vaksine som er egnet til forsterknings-vaksinasjoner (andre og tredje vaksinasjoner av vertsdyr), fortrinnsvis i blanding med andre her beskrevne proteiner.

Vaksinasjon av vertsdyr

Forskjellige dyr kan velges for vaksinasjon med vaksiner som inneholder de ovenfor beskrevne immunologiske midler, for fremstilling av antisera. Det har vist seg at griser av "dansk landrase" eller blandinger av Yorkshire-rase og dansk landrase og sauer av "Jysk.Hederase" og Oxford Down-rase gir optimal spesifisitet av antistoffer'mot de ovenfor beskrevne proteiner. Av spesiell interesse er en type av griser for anvendelse som vertsdyr for foreliggende formål, de s.k. SpF-grisene, dvs. griser som er født og vokset opp under sterile betingelser, eftersom slike griser ikke i

forveien kommer til å inneholde antistoffer mot de antigener som ellers normalt opptrer under begynnelsesstadiene i grisens liv,

hvilket innebærer at det ved hjelp'av den immunisering som utføres ifølge foreliggende oppfinnelse, er mulig å få en IgG-fraksjon med en høy andel av spesifisitet mot det antigen eller de antigener som inngår i den anvendte vaksine.

Grisene utvelges i en alder av. 4 måneder, og en første subkutan vaksinasjon utføres på den ene side av halsen, hvorefter grisene kontrolleres med hensyn til svar på vaksinasjonen. Et riktig svar innebærer at vaksinasjonsstedet blir hovent og eventuelt varig (i likhet med sår) og ligner et positivt svar på koppe-vaksinasjon.

Videre utføres titerbestemmelse og IgG-bestemmelse på

griseserumet på følgende måte:

Anti-Cl IA-titer: Et standard humanserum med kjent Cl IA-konsentrasjon'(30 mg/ml 1.0%) underkastes rakettimmunoelektroforese mot 2% antihuman kanin-Cl IA (2 mg/ml) i gelen. De oppnådde raketter anvendes som standard for sammenligning av immunoelektro-foreseraketter av standardhumanserumet med fortynninger av griseantiserumet i geler. Den fortynning av griseantiserumet som gir samme raketthøyde som den gel som inneholder 2% antihuman kanin-

Cl IA, inneholder 2 mg/ml antihuman grise-Cl IA, og ved multiplika-sjon med den korreksjonsf.aktor som tilsvarer fortynningen, beregnes den antihumane grise-Cl IA-titeren.

Anti-Cl IAC-titer: Samme fremgangsmåte følges, men denne gang under anvendelse av en standardløsning av-Cl IAC "Sephadex" G75

Superfine istedenfor standardhumanserumet. En gelfortynning av griseserumet som gir samme raketthøyde som 2%ig antihuman kanin-Cl IA, blir gitt en titer på 2 mg/ml, og beregninger for korrigering av fortynningsfaktorer utføres.

IgG: Middelkonsentrasjonen av IgG i griseserumet bestemmes ved rakettimmunoelektroforese på samme måte som beskrevet ovenfor under anvendelse av 4% antihuman kanin-IgG i gelen. Som standard anvendes standardhumanserumsats 974 Behringwerke. 3 uker efter den første vaksinasjonen administreres en forsterkningsdose av vaksine.subkutant på den andre side av halsen. Påny kontrolleres grisene, og deres serum undersøkes som beskrevet ovenfor.

En andre forsterkningsdose gis på ryggen, delvis dypt intramuskulært, delvis subkutant, 4 uker efter den første for-sterkningsvaksinasjonen. Ca. 6 døgn efter den andre forsterknings-vaksinasjonen kontrolleres grisene påny som beskrevet ovenfor,

og deres blodantistof f titer og spesifisitet undersøkes som beskrevet", ovenfor. Normale middelverdier efter den andre forsterknings-vaksinasjonen er ca. 2 mg/ml anti-Cl IA, 2 mg/ml anti-Cl IAC og ca. 1200 mg% IgG.

9-14 døgn efter den siste vaksinasjonen tappes grisene for blod efter elektrosjokk i et sanitært slakteri, som beskrevet nærmere nedenfor.

Sauer vaksineres i halsen, som beskrevet for griser. Disse dyr kan dreneres som donator og kan med fordel gjenvaksineres og dreneres flere ganger. Normale middeltiterverdier fra sauen (bestemt analogt med ovenfor beskrevne metode) er ca. 1 mg/ml anti-Cl IA, 3 mg/ml anti-Cl IAC og ca. 1500 mg% IgG.

Eksempler på foretrukne vaksineprodukter

Type 1:

Cl IACaggregert.protein + ClIAC "Sephadex" G75 Superf.

aggregertc r-tr

gis som en første vaksinasjon i en total mengde på 20 mg, oppløst i 1 ml 0,15 M NaCl, og overført til en vann-i-oljé-emulsjon med et like stort volum av Freunds komplette adjuvans.

Som forsterkningsdose blandes 20 mq ClIAC . protein ^ ^ aggregertc

+ Cl IAC "Sephadex" G75 Superfine med 20 mg Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50 + 20 mg Cl IAC/Cl IA, a2HS, Zn-a2, orosom. Blandingen suspenderes påny i 1 ml 0,15 M NaCl og overføres til vann-i-olje-emulsjon med like stort volum av Freunds komplette adjuvans. Denne forsterkningsdose er egnet som første og andre forsterkningsdose for griser og sauer.

Type 2:

Cl IAC , protein + Cl IAC "Sephadex" G75 Superf. gis aggregert rc.c3 som første vaksinasjon til produksjonsdyr av typen sauer og griser for anvendelse ved fremstilling av antiserum for diagnostiske eller terapeutiske formål.

Som forsterkningsdose anvendes Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50, resuspendert i 1 ml 0,15 M NaCl og overført til vann-i-olje-emulsjon med et like stort volum av Freunds komplette adjuvans. Denne vaksine kan anvendes for forsterkningsdoser.

Blodtapningen av griser utføres på følgende måte. Først

gis dyrene et elektrosjokk, hvorefter de i bevisstløs tilstand tappes for blod ved hjelp av traktformige dreneringsrør i sterile 5-liters Pyrex-flasker som inneholder 1 liter citrat av typen ACD som antikoagulasjonsmiddel. Det er.mulig å anvende andre anti-koagulasjonsmidler, f.eks. heparin, men på grunn av den meget ut-pregede koagulasjonstilbøyelighet hos griseblod representerer ACD det foretrukne antikoagulasjonsmiddel. Derefter oppbevares blodet i kald tilstand til det skal opparbeides.

Ved opparbeidelse utføres plasmasentrifugering i en MSE Mistral 6L avkjølt sentrifuge ved 4000 omdr./minutt. Plasmaen fryses umiddelbart hard til -20°Cog oppbevares ved -20°C inntil ytterligere fraksjonering til immunoglobuliner utføres.

Før immunoglobulinfraksjonering steriltUtreres grise-plasmaen, f.eks. under anvendelse av et Millipore-filter med en porestørrelse som avtar til 0,22 y.

Opparbeidelsen av griseserumet for oppnåelse av et produkt som omfatter IgG-immunoglobulinene og hovedsakelig intet annet griseprotein, kan utføres i henhold til velkjente metoder, f.eks. kombinert Rivanol- og ammoniumutfeining, og eksempler på egnede metoder er beskrevet av Schwick et al.: Progress Immunobiol. Standard _4, 96, Basel, Munchen, New York (1968) (Karger) , av Horejsi, J. og Smetana, R.: Acta Med. Scand. 155 (1956) 65 og av Dietzel, E. et al.: Behringwerke Mitteilungen 4_3 (1964) 129.

De grise-IgG-immunoglobuliner som er fremstilt som beskrevet ovenfor, er administrert daglig i 4 måneder til en mannlig cancerpasient, med et avbrudd på 14 dager (ferie) efter 1 1/2 måned regnet fra behandlingens begynnelse. Pasienten ble kontrollert kontinuerlig immunologisk med hensyn til eventuelle tegn på utvikling av immunsvar på grise-IgG-immunoglobulinene, innbefattet undersøkelser med hensyn til utfelning ved vekselvirkning av pasientserumet med grise-IgG-immunoglobulinene (annen utfelning enn den utfelning som er en følge av nærvær i pasientserumet av de proteiner som grisen var immunisert mot (også under anvendelse av IgG fra en ikke-immunisert gris som kontrollprøve)), undersøkelser med hensyn til produksjon av IgG, undersøkelser med hensyn til vekselvirkning mellom pasientserum og andre griseproteiner, osv. Den immunologiske kontrollen avslørte ikke noen utvikling av immunsvar mot grise-IgG hos pasienten, ikke engang efter oppholdet på 14 dager. Heller ikke ble det funnet noen klinisk indikasjon på ikke-tolererbarhet med hensyn til grise-IgG.

Diagnostiske midler

For å oppnå et anvendelig og pålitelig diagnostisk middel, som muliggjør differensialdiagnose mellom maligne og ikke-maligne sykdommer og forløpet' av en malign sykdom, både i forhold til det ubehandlede stadiet og i forhold til forskjellige behandlinger og efterbehandlingsperioden (sistnevnte for å fastslå hvorvidt cancer-recidiv opptrer), er et diagnostisk middel ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis et slikt som omfatter antihuman Cl IAC eller en immunologisk aktiv modifikasjon eller derivat derav og er utformet og anvendes på en slik måte at den immunologiske reaksjonen med Cl IAC i en prøve lett kan skilles fra eventuelt svar på Cl IA i prøven. Dette er et grunnkrav som må oppfylles av hvert diagnostisk middel ifølge foreliggende oppfinnelse, eftersom det er nærvær av Cl IAC i prøven fra en pasient som utgjør den utvetydige indikasjon på at pasienten lider av cancer.

Som forklart ovenfor er serumnivåene av Cl-inaktivator

(Cl IA + Cl IAC) og C4 anvendelige som indikasjoner på forløpet av verifiserte cancersykdommer og forløpet av efterbehandlingsperioden, og dessuten representerer et høyt nivå av Cl-inaktivator en indikasjon på en cancersykdom (se fig. 2), og et trekk ved oppfinnelsen angår diagnostiske midler for anvendelse ved overvåkning av forløpet av cancersykdommer, idet slike diagnostiske midler inneholder anti-Cl IA og anti-C4. Et høyt nivå av Cl-inaktivator er imidlertid ikke et avgjørende bevis på en cancersykdom, eftersom også visse virusinfeksjoner kan gi opphav til høye Cl-inaktivator-nivåer, som dessuten kan ledsages av høye C4-nivåer. Når det gjelder slike ikke-maligne virus-sykdommer, skulle nivået av Cl-inaktivator, selv om det er høyt, ikke omfatte eventuell Cl IAC.

Et diagnostisk middel som på en sikker måte skiller mellom slike ikke-maligne sykdommer og cancer, er således et slikt som er istand til å påvise selektivt nærvær av Cl IAC i en prøve.

En utførelsesform for et foretrukket diagnostisk middel ifølge oppfinnelsen og som oppfyller ovennevnte tre krav, er illustrert på fig. 4. Midlet omfatter en glassplate eller annet egnet underlag 1, på hvilket tre seksjoner gelskikt (2, 3 og 4) med forskjellige antisera er påført. I gelskiktene lages hull 5 ved stansning eller annen egnet teknikk. I gelskiktet 2 innarbeides et materiale som inneholder antihuman Cl IAC. Dette materiale kan være et oligospesifikt serum som gir svar på både Cl IAC og Cl IA, men som skiller mellom dem (f.eks. fremstilt på sauer under anvendelse av vaksinetype 2 som beskrevet ovenfor under rubrikken "vaksinasjon av vertsdyr"), i hvilket tilfelle en serumprøve fra en frisk donator eller en pasient som lider av en ikke-malign sykdom, bare gir opphav til en utfelningsring, mens serum fra pasienter som lider av cancer, kommer til å gi opphav til to utfelningsringer. Fortrinnsvis er imidlertid det antihumane Cl IAC-holdige materiale som innarbeides i gelen i seksjon 2, et monospesifikt -antihumant Cl IAC-materiale, f.eks. et som er fremstilt ved absorpsjon av antistoffer mot noen andre humanserumproteiner fra et antihumant Cl IAC-holdig materiale ved inkubering med helserum fra friske donatorer og påfølgende separering, som beskrevet nærmere nedenfor. Når det gjelder slikt monospesifikt antihumant Cl IAC-materiale i seksjon 2, kommer svaret på en cancerpasientserumprøve i seksjon 2 til å utgjøres av en eneste ring rundt det stansede hullet hvor prøven er anbragt, mens svaret på en frisk donator eller pasient som lider av en ikke-malign sykdom, kommer til å utgjøres av fullstendig fravær av noen utfelningsring rundt det hull hvor prøven er anbragt. Dette ansees som den mest karakteristiske og utvetydige reaksjon som kan oppnås. I fig. 4 angir "FS INA" et slikt mono-spesif ikt antihumant Cl IAC-holdig materiale, som er fremstilt ved absorpsjon fra antiserum produsert i sauer.

I den seksjon som er betegnet 3, er et antihumant C4-holdig materiale innarbeidet i gelen, f.eks. kommersielt antihuman kanin-C4. I den seksjon som betegnes 4, er antihuman Cl-inaktivator innarbeidet i gelen; dvs. f.eks. antihuman kanin-Cl IA, som, som beskrevet ovenfor, ikke er istand til å skille mellom Cl IAC og Cl IA og som. derfor gir utfelning med summen av Cl IA og eventuelt tilstedeværende Cl IAC i den påførte serumprøve. Naturligvis kan det immunologisk aktive materiale i de seksjoner som betegnes 3 og 4 og som oppviser denønskede reaksjon, utgjøres av en modifikasjon eller et derivat av det native antistoff, idet kravet er at modifikasjonen eller derivatet oppviser de karakteristiske' immunologiske reaksjoner med henholdsvis C4 og Cl IA. De seksjoner som betegnes 3 og 4, anvendes for kvantitative bestemmelser av nivåene av henholdsvis C4- og Cl-inaktivator.

Som det fremgår av fig. 4 gir blod fra en frisk donator

ikke noen utfelningsring i FS INA-seksjonen, mens utfelningsringer av. forholdsvis liten diameter oppnås i anti-C4- og anti-Cl IA-seksjonene, svarende til normale lave verdier for C4 og Cl IA.

Serum fra pasient nr. 1 har gitt en utfelningsring i FS INA-seksjonen, hvilket beviser at pasienten lider av cancer. I anti-C4-seksjonen har utfelningsringen stor diameter, hvilket tyder på at serumnivåene av C4 er høye, og også i anti-Cl IA-seksjonen finnes en stor utfelningsring, hvilket antyder at nivået av Cl-inaktivator (Cl IA + Cl IAC) i pasientserumet er høyt. Serum fra pasient nr. 2 har gitt store utfelningsringer i anti-C4- og ånti-Cl IA-seksjonene, men ikke noen utfelningsring i FS INA-seksjonen. Dette viser at pasienten ikke lider av cancer, men at pasientens C4- og Cl-inaktivatornivåer er abnormt høye, hvilket kan være en følge av f.eks. en virusinfeksjon.

Et foretrukket diagnostisk middel av den type som er illustrert på fig. 4, fremstilles på følgende måte: 1% agarose i diemalbuffer, pH 8,6, oppvarmes til flytning (andre geler, f.eks. agar, og andre buffere kan anvendes, men den umiddelbart ovenfor nevnte kombinasjon har vist seg å gi særlig gode resultater). Derefter avkjøles gelen til 45°C og antiserumet tilsettes. Et

egnet antiserum for anti-C4-seksjonen er antihuman kanin-C4, som fortrinnsvis ti-lsettes i en mengde på 1%. For anti-Cl IA-seks jonen gir antihuman kanin-Cl IA meget gode resultater ved anvendelse i en mengde på fortrinnsvis 1%. For anti-Cl IAC-seksjonen er det foretrukne materiale (som gir en utfelningsring bare ved cancer) antihuman saue-Cl IAC (absorbert, hvis nødvendig), tilsatt i en mengde på 0,25% (fremstillingen av antihuman saue-Cl IAC (absorbert) beskrives nærmere nedenfor).

Efter tilsetning av antistoffet eller antiserumet støpes hver separat gelporsjon i ønsket konfigurasjon på underlaget, hvorefter gelen får stivne ved romtemperatur. Når gelen er stivnet, stanses hull i ønsket antall og ønsket mønster, f.eks. som det fremgår av fig. 4, og gelseksjonene merkes på passende måte, hvis dette ønskes. De diagnostiske midler innpakkes på passende måte og for-synes fortrinnsvis med instruksjoner for anvendelse og méd fotografier som viser karakteristiske svar, liksom standardkalibreringskurver for bestemmelse av serumnivået av C4- og Cl-inaktivator på grunnlag av utfelningsringens diameter.

Naturligvis kan flere modifikasjoner forekomme med hensyn

til utformning og fremgangsmåte. Således kan f.eks. hver av gelene leveres på separate underlag, og flere andre utformninger, enn den som er vist på figuren, kan anvendes; disse utgjør trivielle modifikasjoner og er åpenbare for fagmannen. Likeledes kan andre bærermaterialer enn den beskrevne gelen anvendes. Den beskrevne utførelsesformen hår imidlertid vist seg å gi ualmindelig gode og utvetydige resultater ved praktisk anvendelse.

Antihuman saue-Cl IAC (absorbert), som anvendes ved den ovenfor angitte fremgangsmåte, fremstilles på følgende måte: Til 10 ml antihuman saue-Cl IAC, som er fremstilt i henhold til hva som er beskrevet under rubrikken "Vaksinasjon av vertsdyr" (under anvendelse av vaksinetype 2) og med en immunoglobulinkonsentrasjon på 1500 mg% IgG og en spesifikk antistofftiter på 3 mg/3 ml, settes 400 \ il humandonatorserum (som naturligvis ikke er varmeinaktivert) , og blandingen inkuberes ved 37°C i 30 minutter. Derefter utføres sentrifugering ved 3000 omdr./minutt, og den overliggende væsken inkuberes ved 4°C og sentrifugeres påny. Den overliggende væsken fra den siste sentrifugeringen anvendes som antihuman saue-Cl IAC (absorbert).

En annen foretrukket utførelsesform av et diagnostisk middel ifølge oppfinnelsen er en sammenlignende immunodiffusjons-. (Weir: Handbook of Experimental Immunology, Vol. 1, Immunochemistry, Blackwell Scientific Publications, 1973 , sid." 19. 12) agarosegel

med stansede sett av hull, som vist på fig. 23 og 24. Et diagnostisk middel av denne type er egnet for "screening tests" og også i en viss utstrekning for halvkvantitativ overvåkning av Cl IAC-nivået i kroppsvæske fra pasienten, spesielt serum. Det diagnostiske, sammenlignende immunodiffusjonstestmiddel som.er illustrert på fig. 23 og 24, er fremstilt ved støpning av en antiserumholdig agarosegel på en glassplate og derefter stansning av parvise hull i gelen efter at denne er stivnet. En foretrukket gel for anvendelse i det diagnostiske, sammenlignende immunodiffusjonstestmidlet er en Litex-agårosegel eller Indubiose A 37 agarosegel, begge med

lav elektroendosmose. Samme gel kan også anvendes for fremstilling av diagnostiske midler inneholdende anti-Cl-inaktivator og anti-C4, men den gjennomsnittlige serumkonsentrasjon i forhold til standard-

serumkonsentrasjonen reduseres for anti-Cl-inaktivator og anti-C4 ved anvendelse av gel med lav elektroendosmose.

For fremstilling av det diganostiske sammenlignende immunodiffusjonstestmiddel oppløses Litex-agarosegel eller Indubiose A 37 agarosegel i diemalbuffer, pH 8,6, i en konsentrasjon av 1% gel. Løsningen autoklaveres ved 120°C og avkjøles derefter til 51°C.

Ved denne temperatur settes antiserumet (vanligvis ikke-absorbert saueåntiserum) til gelen i ønsket konsentrasjon, idet konsentrasjonen innstilles efter en første utfelningstest mot en porsjon av et "standardcancerserum" på en slik måte at fra ladning til ladning får utfelningsringen med nevnte standardserum alltid samme diameter. Dette letter den halvkvantitative avlesning av Cl IAC-bunnfallet,

og utgjør normal teknikk som anvendes ved utførelse av Mancini immunodiffusjonstester. Til gelen settes 1% natriumazid og 0,1% mertiolat som bakteriostatiske eller fungicide midler. Istedenfor ikke-absorbert saueåntiserum kan også absorbert saueåntiserum eller griseantiserum eller grise-IgG-immunoglobulinf raks jon '.anvendes ved denne sammenlignende immunodiffusjons- eller haloplate-teknikktest ifølge foreliggende oppfinnelse.

Det henvises til figurene 23 og 24. På fig. 23 vises tre positive Cl IAC-reaksjoner i den nedre rand av stansede hull. Det er åpenbart i samtlige tilfeller at utfelningen fullstendig kryss-• reagerer med Cl IAC-negativt (blodgiverserum eller samlet blodgiverserum) standardantigen, som er tilført i den øvre raden av hull.

I det midterste hullet er Cl IAC-ringen fullstendig rund uten noen reaksjon med det antigenholdige standardserumet. I det nederste venstre hullet er en større ring synlig, hvilket antyder en større konsentrasjon av Cl IAC. I det høyre hullet gjenfinnes to tydelige ringer, en uten hemning mot standardserum og den andre kryss-reagert med standardserum. En av disse ringer er en Cl IAC-utfelningsring, mens den annen er en CAAC-utfelningsring (se under rubrikken "CAAC").

På fig. 24 vises tre typiske eksempler på negative Cl IAC-undersøkelser. Av figuren fremgår det at i to av de tre tilfellene dannes fullstendig sammenfallende ringer mellom pasientens serum og det negative standardserumet, mens i den tredje raden finner man både en sammenfallende ring og hemning av ringen mellom standard-og pasientserum, hvilket antyder identitet mellom de to typer av antigener.

Ved anvendelse av det diagnostiske sammenlignende immuno diffusjonstestmidlet ifølge oppfinnelsen bør pasientens serum og det negative standardserumet også tilføres i samme mengder og i samme konsentrasjoner, fortrinnsvis 10 yl pr. hull og fortrinnsvis fortynnet, og inkuberingstiden er fortrinnsvis 48 timer ved romtemperatur eller 72 timer ved 4°C.

En optimal avstand mellom de stansede hull (det øvre hull for det negative standardserum og det nedre hull for pasientens serum) er 2mm mellom hullperiferiene, idet hullenes diameter er 5 mm.

De diagnostiske midler ifølge foreliggende oppfinnelse bør oppbevares under avkjølte betingelser (4-8°C) og i fuktig atmosfære eller i en lukket beholder.Livslengden hos de diagnostiske midler ifølge oppfinnelsen beregnes å være ca. 1 år under disse betingelser.

De beste avlesninger av det diagnostiske midlet ifølge oppfinnelsen oppnås efter farvning med f.eks. Coomasie Blue. Før

farvningen utsaltes gelen med saltløsning (0,15 M) over natten og skylles derefter i destillert vann i 1 time. Farvningen med Coomasie

Blue etterfølges av avfarvning med metanol/eddiksyre-løsning, og testmidlet tørres derefter ved romtemperatur til filmen har herdet.

Derefter er det mulig å avfarve ytterligere en gang med samme løsning for å oppnå en klarere bakgrunn.

Naturligvis bør de reagenser som anvendes for fremstilling av det diagnostiske midlet, kontrolleres omhyggelig med hensyn til

renhet og spesifisitet, og nøye kvalitetskontroll av det fremstilte testmidlet bør foretas.

Det pasientserum som anvendes for Cl IAC-immunodiffusjonstesten ifølge oppfinnelsen (eller for en hvilken som helst annen test i henhold til oppfinnelsen for påvisning av nærvær eller fravær av Cl IAC), bør fortrinnsvis ikke være mer enn 8 dager gammelt og bør oppbevares under avkjølte betingelser (fortrinnsvis ved 4-8°C,. mindre foretrukket i kjøleskap) inntil testen er utført. Hvis det er nødvendig å oppbevare serumprøven i lengere perioder før testen kan utføres, bør det imidlertid oppbevares ved -80°C eller, lavere, eftersom en begrenset lagringsperiode (av størrelsesorden ca. 14 dager) ved -20°C ikke innvirker alvorlig på påliteligheten av testresultatet.

Eh sammenlignende immunodiffusjonstest av den type som er beskrevet ovenfor, anvendes også for overvåkning av Cl IAC-spesifisiteten hos serumprøver, tatt fra vaksinerte dyr under immuniseringen. I dette tilfelle innarbeides antiserumprøven fra dyret med.gelen i varierende konsentrasjoner og en porsjon: av et

Cl IAC-positivt standardserum (av en Cl IAC-standardkonsentrasjon

som er den samme fra gang til gang), idet porsjonene holdes ved

-80°C under lagring, tilføres til det nedre hull, mens det negative standardserumet tilføres' til det øvre hull i samme konsentrasjon. Størrelsen av den oppnådde Cl IAC-ringen ved testen gir et mål på

Cl IAC-spesifisiteten hos dyreserumet.

Ekstrakorporal avblokkering og avmaskering av cancerpasientserum

Ved en avblokkeringssentral under anvendelse av immobiliserte INA-antistoffer fjernes blokkerings- og avmaskeringsproteiner fra cancerpasientens serum ved immunoadherens til antistoffene. Ifølge et foretrukket trekk ved foreliggende oppfinnelse omfatter de immobiliserte antistoffer minst antistoffer mot Cl IAC, eventuelt også mot Cl IA og fortrinnsvis også antistoffer mot orosomukoid, o^HS-glykoprotein og Zn-c^-glykoprotein. Mens det er innenfor rammen av foreliggende oppfinnelse å anvende som immobilisert antistoff mot Cl IAC og Cl IA et ikke-adskillende antistoff så som antihuman kanin-Cl IA, er det særlig foretrukket å anvende de spesifikke antistoffer mot Cl IAC og Cl IA, fremstilt som beskrevet ovenfor og på vertsdyr, hvis serum er kjent for å tolereres bedre av mennesker, og hittil har man ikke funnet noen tegn på at den samtidige anvendelse av antistoffer mot orosomukoid, o^HS-glykoprotein og Zn-o^-glykoprotein ikke skulle være fordelaktig, og foretrukket INA for anvendelse ved ekstrakorporal behandling av cancerpasientserum har derfor samme antistoffsammensetning som foretrukket INA

for intravenøs administrering.

Et foretrukket materiale for fremstilling av matrise-immobiliserende antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse er CNBr-"Sepharos" 4B fra Pharmacia. Dette materiale er beskrevet i publikasjonen "Affinity Chromatography, Principles and Methods", publisert av Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, oktober 1974, spesielt s. 8-15 og 57-58. Naturligvis kan man også anvende andre matrisematerialer som oppviser lignende gode egenskaper med hensyn

til immobilisering av antistoffene uten å påvirke deres aktivitet ugunstig og med hensyn til praktiske elueringsegenskaper.

Et eksempel på immobilisering av INA ved kobling til CNBr-"Sepharose" 4B og avblokkering og avmaskering av cancerpasientserum er gitt nedenfor: 30 mg lyofilisert og resuspendert INA, fremstilt på griser under anvendelse av vaksinetype 1 som beskrevet ovenfor under rubrikken "Vaksinasjon av vertsdyr", ble tilført til CNBr-"Sepharose"-

4B, idet man fulgte den prosedyrebeskrivelse som er gjengitt på

side 8-15 i ovennevnte publikasjon.

Den resulterende INA-aktiverte matrisegelen ble pakket i en Pharmacia K 15/25-kolonne. Kolonnen ble bragt i likevekt med Tris/HCl-bufferløsning (0,2M, pH 8 ) inneholdende 0,5M NaCl. 10 ml av serum fra en pasient som led av cancer, ble tilført til kolonnen, og eluering ble utført med Tris/HCl-bufferen, 0,2M,

pH 8,0, inneholdende 0,5M NaCl. De eluerte fraksjonene ble over-

våket elektrofotometrisk, og de fraksjoner som inneholdt proteiner,

ble tatt vare på. Identifisering og kvantitativ bestemmelse av Cl IAC/Cl IA ble utført.ved hjelp av Laurell rakettimmunoelektroforese på cancerserum før det ble påført på kolonnen og på de eluerte fraksjonene. Det viste seg at det opprinnelige Cl-inaktivator-

(Cl IAC + Cl IA) innholdet på 60 mg% i det opprinnelige serumet,

var sunket til en verdi på 15-20 mg% ved behandlingen. (Bestemmelsene ble utført på de fraksjoner som inngikk i Tris-eluatet, men ble korrigert for fortynning).

Efter elueringen ble kolonnen preparert for en ny kjøring

ved eluering med en glycin/HCl-løsning (0,2M, pH 2,8), som inneholdt 0,5M NaCl, og påfølgende gjennomstrømning av isotonisk saltløsning og likevektsinnstilling med Tris/HCl-buffer, 0,2M (pH 8,0), + 0,5M NaCl.

Ved praktisk cancerterapi under anvendelse av ekstrakorporal avblokkering ved hjelp av immobiliserte INA-antistoffer utføres hensiktsmessig behandlingen av pasientens serum i en sentral, til hvilken cancerpasientens plasma sendes efter plasmaferese av pasienten. På fig. 22 vises en utførelsesform for en avblokkeringssentral eller -anlegg ifølge oppfinnelsen. På fig. 22 tømmes en pose 1 med pasientcitratplasma (ACD-plasma) i en rekalsifiserings-beholder 2, i hvilken rekalsifiseringen utføres ved 37°C i 30 minutter. Serumet får passere et filter 3, som holder tilbake fibrinkoagel,

og en ledning 4, fra hvilken serumet føres inn på en kolonne 5,

som avkjøles til 8°C ved hjelp av en kjølekappe. Kolonnen inneholder matriseimmobilisert INA, f.eks. INA applisert på CNBr-"Sepharos" 4B, ladet med INA som beskrevet ovenfor. Antibiotika i passende mengde er satt til kolonnen. Kolonnestørrelsen og kolonnens innhold av INA avpasses på en slik måte at kolonnen inneholder et overskudd av immobiliserte antistoffer, sammenlignet med innholdet av tilsvarende antigener i serumet.

Eluering av kolonnen utføres med Tris/HCl-buffer, 0,2M

(pH 8,0) + 0,5M NaCl som beskrevet ovenfor, og eluatet får passere

én kuvette 6 i en beholder 7. Eluatets passasje gjennom kuvetten 6 overvåkes ved hjelp av et spektrofotometer 8 med en skriver 9.

Når serumproteinene er eluert (som kan fastslås ved hjelp av spektrofotometeret), pumpes eluatet fra beholderen 7 ved hjelp av en pumpe 10 inn i en trykkdialysator 11, f.eks. en enhet som virker i henhold til prinsippet for en nyremaskin. Fra trykkdialysatoren 11

■ føres serumet inn i en ledning 12 med en prøvetagningsventil 13 til

et sterilt filter 14, hvorfra det oppsamles i en steril pose 15

for igjen å bli infusert i pasienten. Prøver som tappes ut gjennom ventilen 13, undersøkes med hensyn til innholdet av Cl IAC/Cl IA

og orosomukoid, o^HS-glykoprotein og Zn-a^-glykoprotein ved immuno-elektrof orese og med hensyn til innholdet av forurensninger ved hjelp av egnede metoder, f.eks. ved gasskromatografi med hensyn til innholdet av CNBr. Lignende kontrollanalyse kan også utføres på andre trinn, f.eks. gasskromatografering før trykkdialysatoren. Fortrinnsvis utføres samtlige manipulasjoner av serumet før sterilfilteret, idet den eneste operasjon som utføres efter sterilfilteret, er kontroll med hensyn til sterilitet og pyrogeninnhold.

Efter serumkjøringen regenereres kolonnen selv med glycin/HCl og bringes i likevekt med Tris-buffer. Eluatet fra glycin/HCl-behandlingen og likevektsbehandlingen kasseres, f.eks. via ledning 16.

Forskjellige undersøkelser utføres i samband med av-blokkeringen. Således kontrolleres f.eks. plasma med hensyn til sterilitet og pyrogeninnhold når det kommer til sentralen, og pasienten undersøkes med hensyn til fibrin og fibrinspaltnings-produkter. Cl-inaktivator- og C4-nivåene bestemmes naturligvis også på serumprøver fra pasienten, og lymfocytter kontrolleres med hensyn til typene B, T og 0. Bortsett fra dette utføres laboratorie-standardundersøkelser på samme måte som ved behandling med cytostatika.

En vesentlig kontroll av pasienten utgjør bestemmelsen av koaguleringstaktoren, eftersom en del av koaguleringsproduktene fjernes ved omvandling av plasma til serum. Cancerpasienter har imidlertid ofte høye fibrinnivåer. Hvis det finnes nødvendig, til-føres koaguleringstaktoren til pasienten, f.eks. ved infusjon av donatorplasma eller i form av Lysofibrin (Novo).

Cancerterapi med immunserum ifølge oppfinnelsen

Avblokkerende immunsera

INA (immunnøytraliserende antiserum) - avblokkerende sera fremstilles på griser og sauer som beskrevet ovenfor. Griseserumet inneholdt antistoffer med en titer på 2 mg/ml mot Cl IAC i helserum, beregnet som beskrevet under rubrikken "Vaksinasjon av vertsdyr" ovenfor. Middelkonsentrasjonen av IgG i grisehelserumet var 1200 mg pr. 100 ml, beregnet under anvendelse av antihuman IgG. Antistoff-titeren mot Cl IAC i saueserumet var omtrentlig 3 mg/ml. Serumet ble fraksjonert på en steril "Sephadex" G200-kolonne under anvendelse av natriumfosfatbuffer ved. fysiologisk pH, og fraksjoner inneholdende immunoglobulin ble isolert, dialysert og lyofilisert. Ved behandlingens begynnelse ble det lyofiliserte protein resuspendert i isotonisk saltløsning. Det rensede INA-avblokkerende serumet ble beregnet å inneholde 10 mg IgG/ml (ved hjelp av rakettimmunoelektroforese under anvendelse av antihuman IgG).

Rutineundersøkelser av pasient under immunoterapi med INA

Overvåkning av pasienten med EKG, pulshastighet, utvortes

og innvortes temperaturkontroll.

Serumkonsentrasjonene av immunoglobuliner, komplement-komponent C4 og Cl-inaktivator (Cl IA + Cl IAC) ble bestemt i tur og orden før, under og efter behandling.. Serologiske undersøkelser ble utført ved anvendelse av rakettimmunoelektroforese i henhold

til metoden ifølge Laurell, C. B.: Analyt. Biochem..15 (1966) 45 under anvendelse av følgende testsera: antihuman kanin-Cl IA (antistoffinnhold 0,7 mg/ml), antihuman kanin-C4 (antistoffinnhold 1,0 mg/ml), begge fra Behringwerke, antihuman kanin-IgG (antistoffinnhold 0,5 mg/ml) og antihuman kanin-IgM (antistoffinnhold 0,4 mg/ml) fra Dakopatts, København. Immunoglobulinbelegg og

-sekresjon av pasientens lymfocytter ble undersøkt fortløpende i henhold til følgende metode: Lymfocytter skilles fra en citratholdig blodprøve fra pasienten ved hjelp av Isopaque-Ficoll-gradientsentrifugering,

fulgt av vaskninger i Hancks stamløsning med sentrifugering efter hver vaskning. Det resulterende lyitl&cyttmaterialet deles i to deler. En del undersøkes med hensyn til tilstedeværelse av belegg av immunoglobuliner som beskrevet av Osther, K. og Dybkjær, E.: Scand. J. Haemat. 13 (1974) 24 . Den andre delen trypsineres under anvendelse av Trypure-PBS-buffer i 2 minutter ved 37°C.. Trypsin-virkningen hemmes ved gjentatte vaskinger i Eagle MEM inneholdende 15% inaktivert fetalt kalveserum. Derefter kontrolleres lymfocyttene med hensyn til tilstedeværelse av immunoglobulin. Ved negativt resultat inkuberes lymfocyttene i Hancks stamløsning ved 4°C over natten. Derefter fraskilles lymfocyttene og inkuberes i FITC-merkede

antihumane .immunoglobuliner. FITC . (fluoresceinisotiocyanat) ble oppnådd fra BBL Cockeysville, Maryland, USA. Antiserumet'merkes med FITC ved metoden ifølge Fothergill, J.E. ("Properties of conjugated serum proteins" i Nairn, R.C., (ed.): Fluorescent Protein Tracing, side 5, 3 oppi. E. & S. Livingstone Ltd., Edinburgh og London (1969)). Umiddelbart derefter måles lymfocyttenes immunofluorescens ved hjelp av cytofotometri som beskrevet av Osther, K.

og Dybkjær, E.: Scand. J. Haemat. 1_3 (1974) 24 .

Naturligvis kontrolleres lymfocyttene i begge delene med hensyn til levedyktighet, ved hjelp av den velkjente trypanblått-teknikken, og beregningen av antall celler, belagt med immunoglobuliner, korrigeres for ikke-livskraftige celler.

Behandlingsprosedyre.

Intrakutan test med INA-avblokkerende serum i fortynningen 1:10 ble utført og eventuell reaksjon notert. Pasienten ble for-behandlet med antihistamin for å unngå en iatrogen histamin-frigjøring i pasienten.

Det INA-avblokkerende serumet, fortynnet med saltløsning,

ble administrert intravenøst. Dråpehastighet og total dose ble av-passet efter pasientens tilstand.

Tilfellebeskrivelse

Pasienten var en 51-årig mann med nyrecancer med lungemetastaser. Ved begynnelsen av INA-behandlingen oppviste pasienten suksessivt voksende tumorer. INA-behandlingen omfattet intravenøs administrering av 1000 mg grise-IgG-immunoglobuliner i 200 ml salt-løsning pr. døgn i de første 5 døgn og derefter 500 mg grise-IgG-immunoglobuliner pr. døgn. Behandling ble ikke utført på lørdager og søndager. I løpet av den første måneden av INA-behandlingen kunne man iaktta en reduksjon av tumorveksten, og i løpet av den siste måneden av den 4 måneder lange behandlingsperioden kunne man til og med notere regresjon, selv om lungemetastaser er vanskelige å måle. Pasienten ble ikke immunisert mot grise-IgG-immunoglobulinene, ikke engang efter et mellomliggende opphold på 14 dager (ferie).

En og en halv måned efter den siste INA-behandlingen var det ikke mulig å konstatere noen tumorvekst. Ved den sammenlignende immunodiffusjonstest ga pasientens serum en betydelig Cl TAC-ring

ved begynnelsen-av INA-behandlingen, mens samme test på en serum-prøve 1 1/2 måned efter avsluttet INA-behandling ga en tvilsom positiv Cl IAC-reaksjon.

Efter avsluttet INA-behandling ble pasienten ikke underkastet noen annen form for behandling mot cancer og ble heller ikke gitt corticosteroider. Til og med under disse betingelser er tumorveksten stanset, utelukkende som en følge av INA-behandlingen.

CAAC

Ved den sammenlignende immunodiffusjonstest som er beskrevet under rubrikken "Diagnostiske midler", er visse serumprøver funnet å oppvise, foruten en utfelning som skyldes Cl IAC, en utfelning som skiller seg klart fra nevnte Cl IAC-utfeining. Dette tyder på nærvær av et antigen som under visse betingelser synes å ledsage Cl IAC og som i foreliggende sammenheng betegnes CAAC (cancer-assosiert antigenkompleks).

En av de forholdsvis lett konstaterbare forskjellene mellom Cl IAC og•CAAC er at mens Cl IAC taper sine immunologiske egenskaper (sin evne til å danne bunnfall med sitt antistoff ved immunologiske undersøkelser) ved varmebehandling, beholder CAAC sin evne til å danne bunnfall med antistoff selv efter oppvarmning ved 60°C i 30 minutter, slik som det fremgår av både immunoelektroforese og sammenlignende immunodiffusjon.

Nedenfor gjengis hittil tilgjengelige data med hensyn til

CAAC:

1) Grabar- agarosegel- immunoelektroforese

Ved Grabar-agarosegel-immunoelektrofbrese er stillingen for det totale CAAC^bunnfall fullstendig innenfor gamma-området.

Dette tyder på at CAAC oppviser en relativt kraftig negativ elektrisk ladning og ikke er et immunoglobulin (immunoglobuliner utfelles innenfor gamma- til beta-området) og er videre ikke identisk med Cl IAC/Cl IA, hvis presipitat ligger innenfor a-området.

2) Immunoelektroforese

Ved immunoelektroforese•utfelles CAAC med sitt tilsvarende antistoff selv efter en forutgående varmebehandling ved 60°C i 30 minutter, mens presipitatene av Cl IAC og Cl IA synes å forsvinne

allerede efter varmebehandling ved 56°C/30 minutter. Denne varmebehandling av CAAC synes imidlertid å forårsake dannelse av et nytt presipitat foruten presipitatet i CAAC-presipitatstillingen. Det nye presipitat som stammer fra CAAC, gjenfinnes i a-3_sonen. Ytterligere detaljer er gitt nedenfor med henvisning til figurene 2 5 og 26.

3) Temperaturcykelbehandling

Det har vist seg at CAAC er overlegen i forhold til Cl IAC med hensyn til bestandighet mot gjentatte frysnings-/opptinings-cykler og kan påvises til og med i visse sera som er oppbevart ved

-20°C i ca. 12 måneder.

4) Preparativ ultrasentrifugering

Ved preparativ ultrasentrifugering ved 4°C, gravitasjon

178 880 G, 4 timers kjøring, er CAAC tilstede i den overliggende væske, men ikke i lipoproteinfraksjonen. Dette gjelder forskjellige undersøkte væsker, dvs. pasientserum, plasma og pleura- eller askiteseksudat.

5) Behandling med neuraminidase hemmer ikke CAAC's evne til å utfelles med sitt tilsvarende antistoff. 6) CAAC bibeholder sin evne til å danne utfelning med sitt tilsvarende antistoff ved immunologiske undersøkelser efter å ha vært utsatt for pH-verdier .innenfor området 5,6-10,7. 7) Antisera, som gir utfelling med CAAC, men ikke med Cl IAC, kan produseres i vertsdyr ved immunisering av dyrene med varme-aktivert (56°C/30 minutter) Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50-antigen. Det resulterende antiserumet kan innarbeides i l%ig agarosegel for fremstilling av f.eks. CAAC-spesifikke, sammenlignende immuno-dif fus j onstestmidler av en type som svarer til de sammenlignende Cl IAC-immunodiffusjonstestmidler som er beskrevet under rubrikken "diagnostiske midler". Når ovennevnte varmebehandlede Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50-antigen tilføres i prøveserumhullet i det sammenlignende immunodiffusjonstestmidlet, får man en CAAC-utfelningsring, både med en immunodiffusjonsgel som.inneholder CAAC-spesifikt antiserum, fremstilt fra vertsdyr immunisert méd det varmebehandlede antigen, og med en immunodiffusjonsgel som inneholder Cl IAC- og CAAC-spesifikt antiserum fra vertsdyr, immunisert med det ikke-varmebehandlede antigen. Når pasientserum som inneholder både Cl IAC og CAAC eller bare CAAC, anvendes ved den CAAC-spesifikke sammenlignende immunodiffusjonstest, får man en CAAC-utfeining, mens samme pasients serum, hvis det inneholder både Cl IAC og CAAC, gir to utfelninger ved den test som svarer på Cl IAC (CAAC), og som er fremstilt under anvendelse av serum fra vertsdyr, immunisert med ikke-varmebehandlet antigen, og hvis det inneholder bare CAAC, kun gir en utfelningsring ved den test som svarer på Cl IAC (CAAC).

Det faktum at CAAC er påvist ved ovennevnte immunologiske utfelningstester, viser at det antiserum som ble anvendt ved for-søkene, inneholdt antistoffer med evne til å utfelles med CAAC. Dette antyder at CAAC må ha vært tilstede i den vaksine som opprinnelig ble administrert til vedkommende vertsdyr for fremstilling av antiserumet. Man kan med sikkerhet si at CAAC er. påvist under anvendelse av antisera, produsert i vertsdyr, som foruten ved vaksinasjJ on med Cl IACreneller andre kombinasjoner av Cl IAC/cl IA-antigener, også er immunisert med Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50, mens det ikke er sikkert hvorvidt vaksiner som ikke inneholder disse materialer, gir opphav til dannelse av antistoffer mot CAAC. Dette i sin tur tyder på at ved fremstilling av Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50, CAAC ledsager Cl IAC/Cl IA ved de forskjellige ionebytter- og utsaltningsprosesser som er beskrevet ovenfor under rubrikken "Rensning av Cl IAC/Cl IA fra peura-/askites-væske fra cancerpasienter", og således ikke kan være et immunoglobulin, eftersom immunoglobuliner er tilstede i den euglobulinfraksjon som utsaltes med mettet ammoniumsulfat ved tilsetning til serum i en mengde på under 33%, mens CAAC åpenbart ikke blir utsaltet.engang efter 50%ig tilsetning av mettet ammoniumsulfat til serumet.

Eftersom den ovenfor beskrevne vaksine ofte er fremstilt under anvendelse av cancercelledyrkningsmedium og pleura-/askiteseksudat fra et meget lite antall pasienter, og eftersom samtlige antisera fremstilt under anvendelse av Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50 som del av vaksinen, har vist seg å være istand til å gi den typiske CAAC-utfeining (som opptrer også efter varmebehandling av prøven ved 60°C i 30 minutter) med CAAC-holdige pasientserumprøver, synes dette å antyde atCAAC alltid er tilstede i vaksinen, hvilket i sin tur innebærer at CAAC med stor sannsynlighet er tilstede som en forholdsvis betydelig andel ay proteininnholdet i pleura-/askites-eksudatet. Som nevnt ovenfor oppviser ikke alle cancerpasientserum-prøver noe innhold av CAAC, i det minste ikke noe innhold som kan. påvises ved hjelp av de nuværende immunologiske testmetoder, men på grunnlag av de slutninger som er trukket ovenfor, synes pleura-/- askites-eksudat fra cancerpasienter med stor sannsynlighet alltid å inneholde CAAC. Det er derfor mulig at pasientvevsvæsker fra områder som er cancercelleinfiltrerte, inneholder CAAC. Dette synes også å antyde at jo mer aktiv en cancer er, desto mer CAAC kommer til å bli funnet i pasientens serum. De funn som hittil er gjort, synes å bekrefte dette: ved den sammenlignende immunodiffusjonen er en CAAC-utfelningsring med stor diameter ofte funnet å falle sammen med et aktivt stadium av cancer. På grunnlag av ovennevnte funn kan man si at CAAC er et cancerasspsiert antigen og det antas å være et protein eller et proteinlignende stoff (tilstede i pseudo-globulindelen) med lav antigenisitet i humansystemet. Det kan ikke utelukkes at CAAC er et antigen bestående av et Cl-molekyl med vedheftet Cl IAC; se i denne sammenheng Nagaki et al., loe. eit..

Eftersom varmebehandling (56°C i 30 minutter) av vaksine fremstilt uten ovennevnte innhold av Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50, resulterte i et materiale som i seg selv ikke er istand til å gi noen utfelning med antiserum fremstilt på griser eller sauer under anvendelse av en vaksine inneholdende Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50, mens .varmebehandling av vaksinetyper inneholdende. Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50 resulterer i et materiale som i seg selv i hvert enkelt tilfelle synes å være istand til å gi utfelning med antiserum, fremstilt under anvendelse av en ikke-varmebehandlet vaksine inneholdende Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50, er dette en ytterligere indikasjon på at det er Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50-delen av vaksinen som inneholder en betydelig andel CAAC og i vertsdyret gir opphav til dannelsen av antistoffer mot CAAC.

For fremstilling av et antiserum med spesifisitet mot

CAAC, men ikke mot Cl IAC/Cl IA kan man anvende en vaksine (for administrering til vertsdyrene), som er fremstilt med innarbeidelse av Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50, men som før administreringen til vertsdyret er varmebehandlet ved en slik temperatur i en slik tid som er kjent for å ødelegge utfelningsevnen hos Cl IAC/Cl IA,

f.eks. ved 56°C i 30 minutter. Slike antisera eller antistoffer med spesifisitet mot CAAC er verdifulle diagnostiske materialer og kan anvendes ved de forskjellige undersøkelser som er beskrevet for å skille mellom Cl IAC og CAAC i pasientserum. Det er også åpenbart at antistoffer med spesifisitet mot CAAC skulle kunne anvendes ved cancerterapi analogt med de ovenfor beskrevne Cl IAC-antistoffer.

På grunnlag av den erfaring man hittil har fått, kan det sies at en positiv CAAC-reaksjon ved immunodiffusjonstesten er en indikasjon på en malign sykdom eller en "autoimmun" sykdom såsom LED. Som angitt ovenfor synes det videre å være slik at positive CAAC-reaksjoner ofte finnes i tilfeller med meget aktive cancerformer. Hvis det er riktig at CAAC er et Cl-molekyl med vedheftet Cl IAC, ville det være i god overensstemmelse med slike funn.

Ved den sammenlignende immunodiffusjonen kan en CAAC-utfelning skilles fra en Cl IAC-utfeining ved varmeinaktivering

(60°C i 30 minutter) av serumprøven (må også utføres på det negative standardserum). Hvis utfelningen holder seg i det varmeinaktiverte serum, er det en CAAC-utfeining. I visse tilfeller finner man en tydelig Cl IAC-ring og en tydelig CAAC-ring ved immunodiffusjonstesten, men man har også konstatert nærvær av en CAAC-ring uten ledsagende. Cl IAC-ring.

Fig. 25 viser en Grabar-Scheidegger-immunoelektroforése av serum fra en pasient som led av cancer', sammenlignet med serum fra en blodgiver. Elektroforesen ble kjørt ved 150 V/80 minutter ved romtemperatur, fulgt av immunodiffusjon mot ufortynnet grise-(eller saue-) serum inneholdende antihuman Cl IAC/Cl IA i den øvre delen og antihuman kanin-Cl IA, fortynnet 1:4, i den nedre delen. Immuno-dif fus jonen ble utført ved romtemperatur i 24 timer. Efter eluering med saltløsning ble objektglasset farvet med Coomasie Blue. Objektglasset viser CAAC, beliggende i gamma-sonen, i serumet fra den pasient som led av cancer, men er ikke påvisbar i serumet fra blodgiveren (det mellomliggende hullet). Videre ser man Cl IA med sin typiske måkevingeform i o^-sonen. Cl IAC gjenfinner man i o^-sonen nær (3-sonen i cancerpasientserumet.

På fig. 26 er fortsatt en utfelning tilstede i varmeinaktivert cancerpasientserum i CAAC-stillingen i gamma-sonen (varmeinaktivering ved 56°C i 30 minutter). Dessuten blir en ytterligere utfelning synlig. Denne utfelning ligger i a-|3-sonen i cancerserum-delen. Det er ikke mulig å avgjøre hvorvidt utfelningen i denne sonen skyldes en spaltning av CAACeller av noe annet varmelabilt proteinkompleks. Trolig skyldes bunnfallet en spaltning av et proteinkompleks, hvilket forandrer stillingen for denne del av proteinkomplekset i denne sonen.

Under anvendelse av den sammenlignende immunodiffusjons-metoden med en gel som inneholdt antiserum fra en gris som var immunisert under anvendelse av varmebehandlet (56°C/30 minutter)

Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50, undersøkte man serumprøver fra

to pasienter som led av verifisert LED, to pasienter som led av cancer (CLL resp. teratom), og en blodgiver under anvendelse av negativt standardserum som referanse. Prøvene fra de to LED-pasientene ga CAAC-ringpresipitat. (C4-serumnivået ble funnet å være lavt i serum fra disse pasienter, hvilket vanligvis er tilfelle med LED). Noen CAAC-ring ble ikke utviklet ved de undersøkelser som ble utført med serumprøvene fra de to cancerpasienter og heller ikke med serumprøven fra blodgiveren, hvilket tyder på at CAAC ikke var tilstede i disse serumprøver.

Claims

1. Antisera og antistoffer med spesifisitet mot cancercellemembranproteiner med lav antigenisitet.

2. Antisera og antistoffer ifølge krav 1 med spesifisitet mot cancercellemembranproteiner, som inhiberer.de afferente og efferente grener av humanimmunsvaret.

3. Fremgangsmåte for fremstilling av antisera eller antistoffer ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at man immuniserer et ikke-humant dyr med en vaksine som inneholder humanimmunsystem-inhiberende cancercellemembranproteiner, og oppsamler serum fra det immuniserte dyret.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at minst en andel av de human-immunsysteminhiberende proteiner er oppnådd fra dyrkningsmediet fra dyrkningen av humancancerceller.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at minst en andel av de human-immunsysteminhiberende proteiner er oppnådd fra.kroppsvæsker fra humancancerpasienter.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at det immuniserte dyret er en gris som kan immuniseres spesifikt mot cancercellemembranproteinene.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at serumet fra grisen underkastes serumfraksjonering for oppnåelse av en hovedsakelig ren IgG-immunoglobulinfraksjon derav.

8. Antisera og antistoffer med spesifisitet mot et humancancercelleassosiert a-neuraminoglykoprotein med inhiberende virkning på Cl-esterasehydrolyserende effekt og inhiberende virkning på Cl-aktivering av C4 som det fremgår av inhiberingen av komplementhemolyse.

9. Fremgangsmåte for fremstilling.av antiserum ifølge krav 8, karakterisert ved at man immuniserer ikke-humåne vertsdyr med et humancancércelleassosiert a-neuraminogiykoprotein med de i krav 8 angitte egenskaper, og oppsamler serum fra det immuniserte dyr....

10. Fremgangsmåte for isolering, konsentrering eller rensning av cancercellemembranproteiner fra dyrkningsmedier fra dyrkningen av cancerceller.eller isolering, konsentrering eller rensning av de identiske proteiner fra kroppsvæsker fra cancerpasienter og anvendelse av slike isolerte, konsentrerte eller rensede cancercellemembranproteiner som antigener ved immunisering av ikke-humane vertsdyr med etterfølgende oppsamling av serum fra vertsdyret.

11. Humancancercelleassosiert protein, betegnet Cl IAC, hvilket protein er et a-neuraminoglykoprotein med følgende egenskaper: 1) inhiberende virkning på Cl-esterasehydrolyserende effekt; 2) inhiberende virkning på Cl-aktivering av C4 som det fremgår av inhiberingen av komplementhemolyse; 3) fravær av virkning på koaguleringstiden hos plasma; 4.) inhiberende virkning på f ibrinolyse 5) inhiberende virkning på det plasmafibrinolytiske systemet som det fremgår av fibrinagaroseelektroforese; 6) suksessivt tap av inhiberende virkning på Cl-esterase-hydrolyserende effekt ved pH under 5,5 og over 10,5; 7) fravær av inhiberende virkning på Cl-ésterasehydrolyserende effekt efter inkubering ved temperaturer over 56°C i 30 minutter; 8) ved Grabar-Scheidegger-immunoelektroforese mot antihuman kanin-Cl IA, et ikke-"måkevinge"-formet presipitat som strekker seg inn i 3-sonen når immunoelektroforesen kjø res i nærvær av kalsiumlaktat; 9) immunoelektroforetisk identitet med Cl IA ved tandemkrysset immunoelektroforese i gel som inneholder antihuman kanin-Cl IA; 10) tap av evne til å presipitere med antihuman kanin-Cl IA efter behandling med neuraminidase; 11) ved Ouchterlony-immunodiffusjon et presipitat som skiller seg fra Cl IA-presipitatet mot antiserum fra vertsdyr, som er istand til å skille mellom Cl IA og Cl IAC,- så som fra svin av dansk landrase; 12) en molekylvekt på 110 000 - 130 000 ved bestemmelse med gelfiltreringsteknikk; 13) en sedimentasjonskonstant20 ,w av 6,'2 S.

12. Protein betegnet Cl IAC ifølge krav 11 i vesentlig ren form.

13. Anvendelse av Cl IAC som antigen for immunisering av ikke-humane dyr, som kan immuniseres mot Cl IAC. "

14. Antisera, antistoffer, antistoff-fragmenter, antistoffmodifikasjoner og antistoffderivater med spesifisitet mot Cl IAC. ■

15. Diagnostiske materialer inneholdende anti-Cl IAC.

16. Diagnostiske midler inneholdende anti-Cl IAC.

17. Matriseimmobiliserte antisera og antistoffer med reaktivitet mot Cl IAC.

18. Antisera og antistoffer ifølge krav 14, inneholdende hovedsakelig rene grise-IgG-immunoglobuliner.

19. Antisera og antistoffer ifølge krav 14, merket med.en radioaktiv isotop.

20. Antisera og antistoffer ifølge krav 14, kjemisk bundet til et cytostatikum.

21. Antisera, antistoffer, antistoff-fragmenter, antistoffderivater eller antistoffmodifikasjoner som er istand til å reagere med dyrkede cancerceller på en slik måte at cancercellene, inkubert med de merkede antisera eller merkede antistoffer eller merkede fragmenter, modifikasjoner eller derivater derav, oppviser positiv merkning, mens celler fra samme kultur, som er forinkubert med neuraminidase, ikke oppviser noen merkning efter inkubering med det merkede materialet, og at formetning med umerket antiserum mot Cl IAC, fulgt av inkubering med de merkede antisera, antistoffer, antistoff-fragmenter, antistoffderivater eller antistoffmodifikasjoner ifølge den metode som er beskrevet i Acta path. microbiol. scand., Section B, 81 (1973) 365-372 , ikke gir opphav til noen merkning av cancercellene, med unntagelse av antihuman kanin-Cl IA.

22. Diagnostiske midler ifølge krav 16, i form av sammenlignende immunodiffusjonstestmidler.

23. Diagnostiske midler ifølge krav 22, karakterisert ved at anti-Cl IAC er innarbeidet i en agarosegel.

24. Diagnostiske midler for overvåkning av cancersykdommer, karakterisert ved at de inneholder antihuman kanin-Cl IA sammen med antihuman C4.

25. Anvendelse av antihuman kanin-Cl IA ved undersøkelser for overvåkning av cancersykdommer.

26. Anvendelse av antihuman C4 ved undersøkelser for overvåkning av cancersykdommer.

27. Anvendelse av anti-Cl IAC for passiv immuniseringsterapi av cancersykdommer.

28.. Humancancerassosiert protein, betegnet CAAC, med de kjennetegn som er angitt i beskrivelsen.

29. Antisera og antistoffer som er spesifikke mot CAAC

30. Diagnostiske materialer inneholdende spesifikk anti-CAAC.

31. Diagnostiske midler inneholdende spesifikk anti-CAAC.

32. Matriseimmobiliserte antisera og antistoffer med reaktivitet mot CAAC.

33. Fremgangsmåte for "fremstilling av antisera og antistoffer som er spesifikke mot CAAC, karakterisert ved at man immuniserer et ikke-humant dyr med en vaksine som inneholder effektive mengder av CAAC, og oppsamler serum fra det immuniserte dyr.

34. Fremgangsmåte som angitt i krav 33, karakterisert ved at vaksinen omfatter varmeinaktivert (56°C/30 minutter) Cl IAC/Cl IA DEAE "Sephadex" A50 eller antigener som er identiske dermed.

35. Diagnostisk fremgangsmåte, karakterisert ved at man fastslår nærvær eller fravær av Cl IAC i human-kroppsvæske.

36. Fremgangsmåte som angitt i krav 35,. karakterisert ved at den utføres in vitro.

37. Diagnostisk fremgangsmåte, karakterisert ved at man fastslår nærvær eller fravær av biologisk Cl IAC-aktivitet i en humankroppsvæskeprøve fra hvilken biologisk Cl IA-aktivitet er eliminert.

38. Fremgangsmåte til overvåkning av forløpet av huraan-cancersykdommer, karakterisert ved at man måler den biologiske Cl-inaktivator (Cl IAC/Cl IA)-aktiviteten i pasientkroppsvæsker.