DK175473B1

DK175473B1 - Antiinflammatorisk faktor, fremgangsmåde til isolation og anvendelse heraf

Info

Publication number: DK175473B1
Application number: DK198906103A
Authority: DK
Inventors: Lee R Beck
Original assignee: Stolle Milk Biolog Inc
Priority date: 1988-04-04
Filing date: 1989-12-04
Publication date: 2004-11-08
Also published as: EP0336694A2; JPH02503802A; KR900700111A; EP0336694A3; MX165968B; GR3017509T3; DE68923310T2; US4956349A; NO894784D0; DK610389D0; FI895751A0; FI98269C; JP2834244B2; DE68923310D1; CA1339724C; DK610389A; NO180568C; KR0131014B1; WO1989009602A1; NZ228587A

Description

DK 175473 B1 I

i I

Oen foreliggende opfindelse angår en antiinflammatorisk faktor I

(AF), en fremgangsmåde til dens fremstilling i i alt væsent- I

ligt ren form samt en fremgangsmåde til anvendelse heraf ved I

behandling af inflammation. I

5 I

Inflammation, som defineret i Dorland's Medical Dictionary, er I

"et lokaliseret, beskyttende respons fremkaldt ved beskadi- I

gelse eller ødelæggelse af væv, hvilket respons tjener til at I

ødelægge, fortynde eller afskære både det skadelige middel og I

10 det beskadigede væv". Den karakteriseres ved fenestration af I

mikrovaskulaturen, udsivninger af blodlegemer i de intersti- I

tielle rum og migrering af leukocytter ind i det betændte væv. I

På makroskopisk plan ledsages dette sædvanligvis af de vel- I

kendte, kliniske tegn erytem (hudrødme), ødem, ømskindethed I

15 (hyperalgesi) og smerte. Under dette komplekse respons frigi- I

ves lokalt kemiske mediatorer, såsom histamin, 5-hydroxytryp- I

tamin, forskellige kemotaktiske faktorer, bradykinin, leuko- I

triener og prostaglandiner. Fagocyterende celler migrerer ind I

i området, og cellulære, lysosome membraner kan sprænges, I

20 hvilket frigiver lytiske enzymer. Alle disse begivenheder kan I

bidrage til det inflammatoriske respons. I

I Inflammation i patienter med rheumatoid arthritis involverer I

I sandsynligvis kombinationen af et antigen (gammaglobulin) med 25 et antistof (rheumatoid faktor) og komplement, hvilket bevir- ker den lokale frigivelse af kemotaktiske faktorer, som til- I trækker leukocytter. Leukocytterne fagocyterer komplekserne af antigen-antistof og komplement og frigiver også de mange I enzymer, som er indeholdt i deres lysosomer. Disse lysosome I 30 enzymer forårsager derefter beskadigelse på brusk og andre I væv, og dette fremmer inflammationsgraden. Celle-medierede I immunreakt ioner kan også være involverede. Prostaglandiner I frigives også under denne proces.

35 Prostaglandiner, som sandsynligvis vil dannes ved inflam- I mation, forårsager erytem og øger den lokale blodgennemstrøm- I ning. To vigtige vaskulære virkninger af prostaglandiner de- I DK 175473 B1 les generelt ikke af andre i nf 1 ammat i onsmed i atorer - en 1 ang- H varig vasodi1atatorisk virkning og en evne til at modvirke de vasokonstriktori ske virkninger af substanser, såsom norepine- H phrine og angiotensin.

H 5

En række inflammationsmediatorer øger vaskulære permeabilitet (utæthed) i de post-kap i 1 lære og samlende venoler. Endvidere H er migrering af leukocytter i et betændt område et vigtigt H aspekt ved den inflammatoriske proces. Medens prostaglandiner H 10 usandsynligt direkte er involveret i det kemotaktiske respons, H er et andet produkt af metabolismen af arachidonsyre, leuko- H trien, en meget potent, kemotaktisk substans.

H Det antiinflammatoriske respons er ethvert respons, som er H 15 karakteriseret ved inflammation som defineret ovenfor. Det er velkendt for fagfolk inden for det medicinske område, at det H inflammatoriske respons forårsager meget af det fysiske ube- hag, dvs. smerte og funktionstab, som er blevet forbundet med forskellige sygdomme og skader. Følgelig er det en almindelig, 20 medicinsk praksis at indgive farmakologiske midler, som har virkning til neutralisation af det inflammatoriske respons.

Midler med disse egenskaber er klassificeret som antiinflam- matoriske lægemidler. Ant i i nf 1ammator i ske lægemidler anvendes til behandling af et vidt spektrum af lidelser, og de samme I 25 lægemidler anvendes ofte til behandling af forskellige syg- domme. Behandling med antiinflammatoriske lægemidler er ikke I for sygdommen, men som oftest for symptomet, dvs. inflam- I mation.

I 30 De antiinflammatoriske, analgetiske og antipyretiske læge- I midler er en heterogen gruppe af forbindelser, som ofte ikke I er beslægtet kemisk, men som ikke desto mindre har visse tera- I peutiske virkninger og bivirkninger tilfælles. Kortikostero- ider repræsenterer den mest almindeligt anvendte gruppe af 35 forbindelser til behandling af det anti inf 1 animator i ske I respons. Proteolytiske enzymer repræsenterer en anden gruppe I af forbindelser, som påstås at have antiinflammatoriske

DK 175473 B1 I

virkninger. Hormoner, som direkte eller indirekte bevirker, at I

binyrebarken producerer og udskiller steroider, repræsenterer I

en anden gruppe af antiinflammator i ske forbindelser. En række I

ikke-hormonale antiinflammatoriske midler er blevet beskrevet. I

5 Blandt disse er de mest almindeligt anvendte salicylaterne. I

Acetylsalicylsyre eller aspirin er det mest almindeligt ordi- I

nerede analgetiske/antipyretiske og ant i i nf 1 animator i ske mid- I

del. Eksempler på steroide og ikke-steroide anti i nf laminato- I

riske midler er anført i Physician's Desk Reference, 1987 (se I

10 side 207 og 208 vedrørende et index over sådanne præparater). I

Oe naturlige og syntetiske kortikosteroidpræparater forårsager I

en række alvorlige bivirkninger, herunder forhøjelse af blod- I

tryk, salt- og vandtilbageholdelse og forøget kalium- og I

15 calciumudskillelse. Endvidere kan kortikosteroider maskere I

tegnene på infektion og forstærke udbredelse af infektiøse I

mikroorganismer. Disse hormoner anses ikke for at være sikre I

til anvendelse til gravide kvinder, og langvarig kortikoste- I

roid behandling er blevet forbundet med mavehyperaktivitet I

20 og/eller mavesår. Behandling med disse forbindelser kan også I

forværre diabetes mellitus med behov for højere insulindoser I

som følge og give psykotiske lidelser. Hormonale antiinflam- I

matoriske midler, som indirekte øger produktionen af endogene kortikosteroider har det samme potentiale for uheldige bi-25 virkninger.

I Ikke-hormonale ant i i nf 1 animator i ske midler er syntetiske, I biokemiske forbindelser, som kan være toksiske i høje doser I med et bredt spektrum af uønskede bivirkninger. P.eks. med- I 30 virker salicylater til alvorlige forstyrrelser af syre-base- I balancen, hvilke forstyrrelser karakteriserer forgiftning med I denne gruppe af forbi ndel ser. Salicylater stimulerer respira- I tion direkte og indirekte. Toksiske doser af salicylater I forårsager central respiratorisk paralyse såvel som kreds- I 35 løbskollaps sekundært til vasomotor-depression. Indtagelsen af I salicylat kan resultere i epigastrisk lidelse, kvalme og I opkastning. Salicylat-induceret maveblødning er velkendt.

I DK 175473 B1

Salicylater kan give leverskade og føre til en forlængelse af størkningstid. Derfor bør aspirin undgås til patienter med alvorlig leverskade, hypoprotrombinæmi, vitamin K-mangel eller hæmofili, idet salicylaters inhibering af blodpiadehæmo- 5 stase kan resultere i blødning. Salicylatintoksikation er al-

mindelig, og over 10.000 tilfælde af alvorlig salicyltoksika- I

tion ses i U.S.A. hvert år, hvoraf nogle er fatale og mange I

forekommer hos børn. Se Goodman og Gilman's The Pharmacologi- I

cal Basis of Therapeutics, 7. udgave, 1985. Trods det store I

10 antal antiinflammatoriske midler, som i øjeblikket er tilgæn- I

gelige, eksisterer der følgelig stadig et behov for et sik- I

kert, effektivt ant i i nf 1ammatori sk produkt, som er fri for bi- I

virkninger og uheldige reaktioner. I

15 Hvis et naturligt fødemiddelprodukt, såsom et, der f.eks. I

hidrører fra mælk, kunne opnås med antiinflammatoriske virk- I

ninger, ville det være et let administrerbart, let tilgænge- I

I ligt og sikkert terapeutisk middel. I

I 20 Det er kendt inden for området at fremstille mælkeprodukter I

I med en varietet af terapeutiske virkninger. Beck beskriver I

I f.eks. et mælkeprodukt indeholdende antistof over for Strep- I

I tococcus mutans, hvilket mælkeprodukt har dental-caries-inhi- I

berende virkning (US patentskrift nr. 4.324.782). Mælken opnås I

25 ved at immunisere en ko med S. mutans-anti gen i to trin og få I

I den terapeutiske mælke derfra. I

Stolle et al. har beskrevet en metode til behandling af vas- I

I kulære 1 ideiser el ler lungelidelser forbundet med rygning i et I

I 30 dyr, hvilken metode omfatter indgivelse til et dyr af mælk, I

I som er opsamlet fra en ko, der holdes i en hyperimmun tilstand I

I (US patentskrift nr. 4.636.384). Beck har beskrevet en metode I

I til behandling af inflammation i dyr, hvilken metode omfatter I

I indgivelse til dyret af en ant i i nf 1ammatori sk effektiv mængde I

I 35 af mælk, som er opsamlet fra en ko, der holdes i en antiin- I

flammatorisk faktor-producerende tilstand (US patentskrift nr. I

4.284.623). Heinbach har i US patentskrift nr. 3.128.230 I

DK 175473 B1 5 beskrevet mælk indeholdende globuliner af alfa-, beta- og gam-mabestandde1e ved at indpode eller vaccinere en ko med antigenblandinger. Peterson et al. {US patentskrift nr.

3.376.198), Holm (US patentansøgning (publiceret) nr.

5 628.987), Tunnah et al. (britisk patentskrift nr. 1.211.876) og S.A. Biokema (britisk patentskrift nr. 1.442.283) har også I beskrevet antistof-holdige mælkeprodukter.

I I ingen af de før omtalte referencer beskrives imidlertid I 10 identiteten af den eller de bestanddele i de terapeutiske I mælkeprodukter, som giver de ønskede terapeutiske virkninger.

I I US patentskriftet nr, 4.284.623 (Beck) består mælkeproduk- I terne, som anvendes som et terapeutisk middel, af enten fly- I dende sødmælk, flydende fedtfri valle eller sødmælkspulvere.

I 15 Selvom hvert af disse mælkeproduker har antiinflammatoriske I egenskaber, er den faktor eller de faktorer, som aktuelt I tilvejebringer de terapeutiske fordele, endnu ikke blevet iso- I leret eller identificeret.

I 20 Den foreliggende opfindelse er baseret på den betragtning, at I et isoleret og oprenset ant i i nf 1 animator i sk mælkeprodukt ville I være mest anvendeligt til behandling af antiinflammatoriske I lidelser i et dyr.

I 25 Med dette i tankerne er der blevet isoleret og delvis oprenset I og karakteriseret en antiinflammatorisk faktor fra hyperimmun I bovid-mælk, som i det efterfølgende betegnes mælke-anti i nf 1a- I mmatorisk-faktor (MAIF).

I 30 Yderligere forskning påviste, at dette mælkeprodukt forhin- I drede eller lindrede de kliniske symptomer på inflammation.

I Følgelig byder den foreliggende opfindelse på den opdagelse, I at anti inflammatorisk faktor., som er isoleret fra mælk fra I mælkeproducerende dyr, som tidligere er hyper immuniserede over I 35 for særlige polyvalente antigener, er effektiv over for in- I f1ammatori ske tilstande, når denne isolerede og oprensede I ant i i nf 1ammatori ske faktor indgives i en mængde og under en I DK 175473 B1 I kur, som er tilstrækkelig til at give ant i i nf 1 animator i ske B virkninger. Denne opdagelse er særligt overraskende i lyset af B den kendsgerning, at selve den polyvalente antigenvaccine ikke B indeholder MAIF. Isolationen af den aktive faktor fra mælk af B 5 hyper immuniserede bovinarter ferer til det uventede resultat, B at MAIF forekommer i små mængder i mælken hos normale bovin- B arter. Denne opdagelse har været skjult af den kendsgerning, B at koncentrationen af MAIF i normal bovin-mælk er for lav til B at tildele mælken skelnelige antiinflammatoriske egenskaber B 10 MAIF i normal mælk kan imidlertid koncentreres ved isolations- B fremgangsmåden ifølge opfindelsen og kan derefter anvendes på B effektiv måde til behandling af inflammation.

B En mere fuldstændig forståelse af opfindelsen og mange af de I

B 15 ledsagende fordele deraf vil let opnås i takt med, at den B samme bliver bedre forstået ved reference til den følgende,

B detaljerede beskrivelse ved betragtning sammen med den led- I

B sagende tegning, hvor: I

20 fig. 1 viser isolation af MAIF véd ionbytterkromatografi på en I

I søjle af DEAE-cellulose i trin 2 af den foretrukne fremgangs- måde,

fig. 2 fraktionering af MAIF-toppen (nr. 2) fra DEAE-cellulo- I

I 25 sekromatografi (fig. 1) på en Sephadex G-10-molekylsigtesøjle I

I i trin 3, af den foretrukne fremgangsmåde. I

Opfindelsen angår isolation og oprensning af MAIF og indgi- I velse af denne MAIF til et dyr med det formål at behandle

30 antiinflammatoriske lidelser. I

Med betegnelsen "mælke-anti i nf 1ammatorisk-faktor (MAIF)” I

menes en faktor, der enten opnås fra hyperimmun mælk eller I normal komælk. Med betegnelsen "i alt væsentligt ren MAIF"

I 35 menes for så vidt angår opfindelsen en ant i i nf 1ammatorisk I

I faktor, der elueres som en enkelt, større symmetrisk top ved I

I HPLC-kromatografi efter fjernelse af højmb lekyl ære substanser I

DK 175473 B1 I

(over 10.000 dalton) og isolation af de 1 avmolekylære, nega - I

tivt ladede arter ved ionbytterkromatografi. Både normal mælk I

og hyperimmun mælk kan forarbejdes ved de heri beskrevne meto- I

der til opnåelse af MAIF. I

5 I

Med betegnelsen "hyperimmun mælk" menes for så vidt angår den I

foreliggende opfindelse mælk, som er opnået fra mælkeproduce- I

rende dyr, der holdes i en hyperimmun tilstand, idet detaljer- I

ne vedrørende hyperimmunisering beskrives mere detaljeret I

10 nedenfor. I

Med betegnelsen "skummetmælk" menes for så vidt angår den fo- I

religgende opfindelse mælk, hvorfra fløde er blevet fjernet. I

15 Med betegnelsen "valle" menes for så vist angår den forelig- I

gende opfindelse mælk, hvorfra fløde og kaseinholdigt mate- I

riale er belevet fjernet. I

Med betegnelsen "normal mælk” menes for så vidt angår den I

20 foreliggende opfindelse mælk, hvorfra fløde er blevet fjernet. I

Med betegnelsen "normal mælk" menes for så vidt angår opfin- I

delsen mælk, som opnås fra mælkeproducerende dyr på konventio- I

nel måde og ifølge mejeripraksis. I

25 I

Med betegnelsen "mælkeproducerende dyr" menes for så vidt angår den foreliggende opfindelse pattedyr, som producerer mælk i kommercielt gennemførlige mængder, fortrinsvis køer, får og geder og mere foretrukket malkekøer af slægten Bos (bovid), og 30 især de racer, som giver de højeste udbytter af mælk, såsom

Holstein.

Med betegnelsen "bakterie-antigen" menes for så vidt angår den I foreliggende opfindelse et lyofiliseret præparat af varme- 35 dræbte bakterieceller.

Med betegnelsen "mikroindkapslet form" menes for så vidt angår I den foreliggende opfindelse polymere mi kropartikler, som ind- I DK 175473 B1 Η H kapsler en eller flere bakterieantigener, til indgivelse til H mælkeproducerende dyr.

H Med betegnelsen "inflammation" menes for så vidt angår den H 5 foreliggende opfindelse et lokaliseret, beskyttende respons, H som udløses ved beskadigelse eller ødelæggelse af væv, hvilket respons tjener til at ødelægge, fortynde eller afskære både H det skadelige middel og det beskadigede væv, og som er karak- H teriseret i den akutte form ved den klassiske sekvens med H jo smerte, varme, rødme, hævelse og funktionstab, og som histologi gisk involverer en kompleks række af begivenheder, herunder H dilatation af arter i olerne, kapillærerne og venolerne med H forøget permeabilitet og blodgennemstrømning, udsondring af H væsker, herunder plasmaproteiner, og leukocytmigrering ind i

15 det inflammatoriske fokus. I

Med betegnelsen "behandling" menes for så vidt angår den fore- liggende opfindelse, at symptomerne på lidelsen og/eller pato- gen oprindelse af lidelsen forbedres eller fuldstændigt elimi- I 20 neres.

I Med betegnelsen "indgive" menes for så vidt angår den fore- liggende opfindelse, en hvilken som helst metode til behandling af en patient med en substans, såsom oralt, intranasalt, pa- 25 renteralt (intravenøst, intramuskulært eller subkutant) eller I rektalt.

I Med betegnelsen "dyr" menes for så vidt angår den foreliggende I opfindelse, et hvilket som helst levende væsen, som er udsat I 30 for inflammation, herunder mennesker, landbrugsdyr, husdyr I eller dyr i zoologisk have.

Eksempler på inflammatoriske tilstande, som kan behandles med det isolerede og oprensede mælkeprodukt ifølge den forelig- I 35 gende opfindelse, er tilstande valgt blandt akut og subakut I bursitis, akut ikke-specifik tendonitis, systemisk lupu- I s erythematosus, systemisk dermatomyositis, akut rheumatisk 9 DK 175473 B1 carditis, pemphigus, bisreformet dermatitis, herpeteformis, alvorligt erytem, mangeartet eksfoliativ dermatitis, cirrose, sæsonbestemt stadig tilbagevendende rhinitis, bronkial astma, ektop dermatitis, serum-sygdom, keratitis, opthalmicus iritis, 5 diffus ureitis, choriditis, optisk neuritis, sympathetisk op-thal mi a, symptomatisk sarcoidosis, Loeffler's syndrom, berylliosis, hsmolytisk anæmi, mastitis, mastoiditis, kontaktderma-titis, allergisk conjunctivitis, arthritis-psoriatica, ankylo-serende spondylitis, akut gigtagtig arthritis og herpes zost-10 er. Endvidere kan det isolerede og oprensede mælkeprodukt anvendes til behandling af individer, som er udsat for potentielle, inflammatoriske midler.

Opf i ndel sen er delvis baseret på den opdagelse, at når et 15 mælkeproducerende dyr, såsom en bovid bringes til en specifik tilstand af hyper immunisering, vil dyret producere mælk, som har supranormale niveauer af den meget gavnlige MAIF, hvilken MAIF ikke kun undertrykker symptomerne på inflammation hos mennesket og andre dyr, men også er et profylaktisk middel i 20 forventning om tilstedeværelse af inflammatoriske midler i den modtagende part. Med betegnelsen "supranormale niveauer" menes niveauer, som er højere, end hvad der findes i mælk fra ikke-hyperimmuniserede dyr. Fremkaldelse af immunsensitivitet alene er ut i 1 s trække 1 ig til at bevirke forekomsten af supra-25 normale niveauer af MAIF i mælk, hvilket ses af den kends gerning, at normal komælk ikke indeholder disse supranormale niveauer, selvom køerne er blevet sensibiliseret over for forskellige antigener under normal immunisering over for kosygdomme og under normal udsættelse for omgivelserne. Det er 30 kun i specifikke hyperimmune tilstande, at mælken har de ønskede supranormale niveauer.

Denne specielle tilstand kan opnås ved at give en indledende immunisering efterfulgt af periodiske booster-injektioner med 35 tilstrækkeligt høje doser af specifikke antigener. Den fore trukne dosis af booster skal være lig med eller større end 50% af den dosis, som er nødvendig til at producere primær immu- v I DK 175473 B1 I 10 I nisering af bovi den. Oer er således en tær skel-booster-dosi s,

I under hvilken egenskaberne ikke produceres i mælken, selvom I

koen er i, hvad man normalt ville kalde en immun tilstand. Med I

henblik på at opnå den fornødne hyperimmune tilstand, er det I

5 vigtigt at undersøge den hyperimmune mælk efter en første I

række booster-indgivelser. Hvis de gavnlige faktorer ikke er I

I til stede i mælken, indgives yderligere booster-injekti oner I

med høj dosis, indtil egenskaberne optræder i mælken. I

10 Metoden til fremstilling af hyperimmun mælk indeholdende su- I

I pranormale niveauer af MAIF er beskrevet i US-patentansøgning I

I nr. 069.139, indleveret 2. juli 1987, og i US-patentansøgning I

I nr. 910.297, indleveret 17. september 1986, og U$-patentan- I

I søgning nr. 576.001, indleveret 1. februar 1983, som er inkor- I

I 15 poreret heri ved reference. Kort beskrevet omfatter en metode I

I til fremstilling af hyperimmun mælk indeholdende supranormale I

I niveauer af MAIF følgende trin: (1) ant igen-udvælgel se; (2) I

I primær immunisering af boviden; (3) undersøgelse af serummen I

I til at bekræfte fremkaldelse af sensibilitet; (4) hyper im- I

I 20 munisering med booster-injektioner med passende dosis; og I

I eventuelt (5) undersøgelse af mælken for antiinflammatoriske I

I egenskaber; (6) opsamling af mælken fra den hyperimmune bovid; I

og (7) forarbejdning af mælken til isolering af MAIF. I

25 Trin 1: Hvilke som helst antigener eller kombinationer af I

antigener kan anvendes. Antigenerne kan være bakterielle, I

I vi rale, protozopiske, fungale, cellulære eller hvilke som I

I helst andre substanser, hvortil et mælkeproducerende dyrs I

immunsystem vil give respons. Det kritiske punkt i dette trin I

I 30 er at antigenet eller antigenerne ikke kun skal være i stand I

I til at inducere immune og hyperimmune tilstande i det mælke- I

I producerende dyr, men også til at producere supranormale I

I niveauer af MAIF i mælken. Et hvilket som helst antigen kan I

I anvendes til at producere supranormale niveauer af MAIF. En I

I 35 foretrukket vaccine er en blanding af polyvalente bakteriean- I

I tigener, der refereres til som serie 100-vaccine, og som er I

I beskrevet detaljeret i eksempel 1A nedenfor. I

DK 175473 B1 I

11 I

Trin 2: Antigenet eller antigenerne kan indgives på en hvilken I

som helst måde, som bevirker sensibilisering. Ved en metode I

indgives en vaccine, som er sammensat af antigen hidrørende I

fra 1x10® til 1x10*° fortrinsvis 10® til 10*® og mest fore- I

5 trukket 2x10® varmedræbte bakterier ved intramuskulær injek- I

tion. Andre metoder, såsom intravenøs injektion, intraperito- I

neal injektion, rektal administration ved hjælp af supposito- I

rier eller oral administration kan imidlertid anvendes. I

10 Trin 3: Det er nødvendigt at bestemme, hvorvidt det mælkepro- I

ducerende dyr er blevet sensibiliseret over for antigenet. Der I

I er en række metoder, der kendes af fagfolk inden for immunolo- I

I giområdet, til at undersøge for sensibilisering (Methods in I

I Immunology and Immunochemistry, C.A. William og W.M. Chase, I

I 15 Academic Press, New York, bind 1-5 (1975)). Den foretrukne I

I metode er at anvende en polyvalent vaccine omfattende mang- I

foldige bakteriearter som antigenet og at undersøge for I

I tilstedeværelsen af agglutinerende antistoffer i dyrets serum I

I før og efter "udfordring" med vaccinen. Forekomsten af mælke- I

B 20 antistoffer efter immunisering med vaccinen indikerer sensibi- I

B lisering; på dette tidspunkt er det muligt at gå videre til I

I tri n 4. I

B Trin 4: dette involverer fremkaldelse og bevarelse af den I 25 hyperimmune tilstand i det sensibiliserede dyr. Dette gennem- I føres ved gentagne booster-administrationer med bestemte tids- B intervaller af den samme polyvalente vaccine, som blev anvendt I til opnåelse af den primære sensibilisering. Et to-ugers boo- I sterinterval er optimalt for polyvalente bakterieantigener.

30 Det er imidlertid nødvendigt at sikre, at dyret ikke går fra en hyperimmun tilstand til en tilstand med immuntolerance over B for antigenet.

B I en foretrukket udførelsesform kan hyperimmunisering af bo- B 35 vider opnås ved en enkelt indgift af mi kro indkapsl et vaccine, B som er fremstillet som beskrevet detaljeret i eksempel IB ne- B denfor. Fordelen ved hyperimmuniseringsformen med styret fri- I DK 175473 B1 H g i velse er, at den konstante udsættelse for antigenet sikrer, H at dyret forbliver i den hyperimmune tilstand.

I en alternativ udførelsesform er det også muligt at kombinere H 5 forskellige immuniseringsprocedurer, f.eks. samtidig indgift H af mikroindkapslet og flydende antigen eller intramuskulær H injektion til den primære immunisering og booster-doser ved oral eller parenteral administration ved hjælp af mikroind- H kapsl ingsmetoder. Mange forskellige kombinationer af primær og 10 hyper immunisering er kendt blandt fagfolk inden for området.

H Trin 5: Det er nødvendigt at undersøge mælken for antiinflam- matoriske aktivitetsniveauer. Dette kan gennemføres ved en hvilken som helst forskningsteknik, hvori virkningen af enten 15 den hyperimmune mælk eller produkter hidrørende derfra ved in- flammation undersøges. Kemisk induceret inflammation af rotte- poter er en standardprøve for ant i i nf 1ammatori ske lægemidler.

Trin 6: Dette involverer opsamling og forarbejdning af mælken.

20 Mælken kan opsamles ved hjælp af konventionelle metoder. Fo· rarbejdning af mælken til isolation af MAIF er beskrevet ne- I denfor.

H Den mest simple metode til isolation, oprensning og undersø· 25 gelse af MAIF omfatter følgende trin: I l. Fjernelse af fedt fra den hyperimmune mælk til fremstilling I af skummetmælk; 30 2. Fjernelse af kasein fra skummetmælken til fremstilling af I val le; I 3. Fjernelse af makromo1eky1 er med molekylvægt større end ca.

I 10.000 dalton fra vallen ved ultraf i 1 trering; I 35 I 4. Fraktionering af produktet fra trin 3 under anvendelse af en ionbytterharpikssøjle til isolation af en negativt ladet MAIF-art med molekylvægt mindre end ca. 10.000 dalton;

DK 175473 B1 I

13 I

5. Separation af den negativt ladede art fra trin 4 ved mole- I

kylsigtekromatografi; og I

6. Biologisk bestemmelse af MAIF fra trin 5; I

5 I

7. Den ant i inf 1ammatori ske virkning af mælkefaktoren undersø- I

ges på ødem, som er fremkaldt ved injektion af en opløsning af I

carragen i rottepoter. Rottepote-testen er en standarddyretest I

I for antiinflammatoriske lægemidler. C.A. Winter, 6.A. Risley, I

I 10 A.W. Nuss "Carrageenin-Induced Edema in the Hind Paw of the I

I Rat as an Assay for Anti-inf 1ammatory Drugs", Proc. Soc. Εκ- I

I per. Biol. Med. 3:544 (1967). En varietet af andre prøver kan I

I anvendes. A.S. Wetnick og C. Sabin "The Effects og Clonixin I

I and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experi- I

I 15 mental Allergic Encephalomyelitis in Rats", Jap. J. Pharm. I

I 22:741 (1972). Rottepotetesten er imidlertid den mest enkle og I

direkte test, der findes, og har vist sig at være tilfreds- I

I stillende for alle antii nflammatoriske lægemidler. Denne test I

I er blevet detaljeret beskrevet af Beck i US-patentskrift nr. I

20 4.284.623, som er inkorporeret heri ved reference til den ud- I

I strækning, hvori rottepotetesten beskrives. Kort fortalt in- I

volverer testen injektion af en lille mængde carragen i fod- I

I puden hos voksne, hvide rotter. Dette vides at inducere et in- I

I flammatorisk respons. Den resulterende grad af hævelse kan be- 25 stemmes kvantitativt. Prøver indeholdende en AF indgives til I rotten via en hens i gtsmæssig vej, fortrinsvis ved intraper i to- I neal injektion, og blokeringen eller forbedringen af den in- I f1ammatori ske proces bestemmes kvantitativt ved enten volume- I triske eller gravimetriske metoder.

I 30 I Sammenfattende kan man isolere den antiinflammatoriske faktor I fra hyperimmuniseret mælk ved at følge en fremgangsmåde omfat- I tende fjernelse af fedt fra mælk, fjernelse af kasein, fjer- I nelse af makromolekyler med molekylvægt større end 10.000 dal- I 35 ton og fortsættelse med ionbytning og molekylsigtekromatogra- I fi. Den biologiske aktivitet af de pågældende præparater af I antiinflammatorisk faktor kan undersøges ved at udføre et H dosis-responseksperiment på rotter som beskrevet heri.

H

I DK 175473 B1 H Opfindelsen er delvis baseret på den uventede opdagelse, at en H MAIF kan isoleres og oprenses, hvilken MAIF er effektiv til H behandling af en varietet af inflammatoriske processer i men- H nesker og dyr. I en foretrukket udførelsesform fremstilles H 5 MAIF ved at hyperimmunisere et malkeproducerende dyr over for H en bakteriel antigenvaccine. Den anvendte vaccine til hyperim- H munisering af dyrene indeholder ikke antiinflammatorisk akti- H vitet. Det er derfor overraskende, at behandling med en isol- H eret og oprenset faktor, som er opnået fra dyr, der er immuni- 10 serede over for en blandet bakteriel antigenvaccine, er effek- H tiv til at lindre eller eliminere inflammatoriske processer.

Idet opfindelsen nu er blevet beskrevet generelt, vil den blive yderligere beskrevet ved reference til visse specifikke 15 eksempler, som er givet heri kun med det formål at belyse op- H findelsen og ikke skal betragtes som varende begrænsende, med- H mindre andet er angivet.

H Fremstilling af mælkeprodukter

H 2 0 Eksempel 1A

Fremstilling af S-100 vaccine I En bakteriekultur indeholdende det i tabel 1 neden for viste I 25 spektrum af bakterier, som er opnået fra "American Type Cul- ture Collection", blev genfortyndet med 15 ml medium og inku- I beret natten over ved 37eC. Når først god vakst blev opnået, I blev ca. halvdelen af bakteriesuspensionen anvendt til at pode en liter kødafkog, idet podningen inkuberes ved 37eC . Den re- I 30 sterende suspension blev overført til sterile glycolrør og op- I bevaret ved -20*C i op til seks måneder.

I Efter at god vækst var synlig i kulturen, blev bakteriecel- I lerne høstet ved centrifugering af suspensionen i 20 minutter I 35 til fjernelse af mediet. Den opnåede bakteriepellet blev gen- I suspenderet i steril saltvandopløsning, og bakterieprøven blev centrifugeret 3 gange for at vaske mediet fra cellerne.

DK 175473 Bl I

15 I

Efter den tredie vask roed sterilt saltvand blev den ved een- I

trifugering opnåede bakteriepellet gensuspenderet i en lille I

mængde af dobbe1tdesti 1 leret vand. I

5 Den medium-frie bakteriesuspension blev varroedræbt ved at an- I

bringe suspensionen i en glaskolbe i et 80°C varmt vandbad I

natten over. Kødafkogskulturens levedygtighed blev undersøgt I

med en lille mængde af varmedræbte bakterier. Kødafkog blev I

podet med varmedræbte bakterier, inkuberet ved 3 7 “C i fero I

10 dage og dagligt kontrolleret for vækst, idet bakterierne skal I

I være dræbt for at kunne anvendes i vaccinen. I

I De varmedræbte bakterier blev lyofiliseret indtil tørhed. Oe I

I tørre bakterier blev derefter blandet roed steril saltvands- I

I 15 opløsning til en koncentration på 2,2 χ 108 bakterieceller/ral I

I saltvand (1,0 optisk densitet-aflæsning ved 660 nm). I

I 20 I

30 DK 175473 B1 H Tabel 1 S-100 Bakterieliste

Gram 5 Navn Hed i um + eller- ATTC nr.

H 1. Staph, aureus BHI + 11631 H 2. Staph, epidermidis BHI + X55 3. Strep, pyogenes, A. Type 1 APT + 8671 10 4. Strep, pyogenes, A. Type 3 APT + 10389 H 5. Strep, pyogenes, A. Type 5 APT + 12347 6. Strep, pyogenes, A. Type 8 APT + 12349 7. Strep, pyogenes, A. Type 12 APT + 11434 8. Strep, pyogenes, A. Type 14 APT + 12972 H 15 9. Strep, pyogenes, A. Type 18 APT + 12357 10. Strep, pyogenes, A. Type 22 APT + 10403 H 11. Aerobacter aerogenes BHI - 884 12. Escherichia coli BHI - 26 13. Salmonella enteritidis BHI - 13076 20 14. Pseudomona.s aeruginosa BHI - 7700 15. Klebsiella pneumoniae BHI - 9590 16. Salmonella typhimurium BHI - 13311 17. Haemophilus typhimurium BHI - 9333 I 18. Strep, mitis APT + 6249 I 25 19. Proteus vulgaris BHI - 13315 I 20. Shigella dysenteriae BHI - 11835 I 21. Oiplococcus pneumoniae APT + 6303 I 22. Propionibacter acnes

Actinomyces (anaerobe) Kødafkog + 11827 I 30 23. Strep, sanguis APT + 10556 I 24. Strep, salivarius APT + 13419 I 25. Strep, mutans BHI + 25175 I 26. Strep, agalactiae APT + 13813 35 Køer modtog daglige injektioner af 5 ml prøver af den polyva- 1 ente, flydende vaccine. Antistof (IgG)-titerniveauer for de injicerede kvæg blev bestemt periodisk under anvendelse af en DK 175473 B1 17 enzym-bundet immunoassay for bovin-antistof over for det poly-valente antigen.

Eksempel IB 5

Varmedrabte bakterier blev fremstillet på den ovenfor beskrevne måde. Den opnåede polyvalente antigenprøve (S—100) blev mikroindkapslet ved en konventionel faseseparationsproces til fremstilling af et polyvalent, antigenholdigt, mikroparti-10 kelformet produkt. Generelt dannes de antigenholdige, formede matriksmaterialer ud fra polymerer af bioforligeligt materiale, fortrinsvis bionedbrydelige eller bioeroderbare materialer, fortrinsvis po1ymælkesyre, polyglycolsyre, copolymerer af mælke- og glycolsyre, polycaptolacton, copolyoxalater, 15 proteiner, såsom kollagen, fedtsyreestere af glycerol og celluloseestere. Oisse polymerer er kendte inden for området og er f.eks. beskrevet i US-patentskrift nr. 3. 773.919, 3.887.699, 4.118.470 og 4.076.798, som alle er inkorporeret ved reference heri. Det anvendte polymere matriksmateriale var 20 en bionedbrydelig lactid-glycolidcopolymer.

Varmedrabte bakterieantigener indkapsles i sådanne matriksma-terialer, fortrinsvis som mi krosfærer med en diameter mellem 1-500 pmeter, fortrinsvis 10-250 pmeter. Indkapslingsprocessen I 25 er konventionel og omfatter faseseparationsmetoder, interfa- I ciale reaktioner og fysiske metoder. Mange kombinationer af I matrikser og mange koncentrationer af blandede antigener kan I anvendes med henblik på at tilvejebringe optimale hastigheder I for frigivelse af bakterieantigener til værtskroppen fra I 30 mikropartiklerne. Disse kombinationer kan bestemmes af fagfolk I inden for området uden unødig eksperimenteren.

I Mikropartiklerne i dette eksempel havde di ametre mindre end I 250 pmeter. Ca. 750 mg mikropartikler indeholdende 22% (16,5 I 35 mg) polyvalent antigen blev suspenderet i ca. 3 cm^ af et I vehikel ( 1 vagt% Tween 20 og 2 vægt% carboxymethy1 cel 1ulose I i vand).

I DK 175473 B1 I 18

En lille gruppe kvæg blev udvalgt fra en større kvægflok. Fera I

af disse tilfældigt udvalgte kvæg blev valgt som kontroldyr. I

Fire kvæg fik en intramuskulær injektion med mikropartikler I

indeholdende polyvalent antigen. Hi kropart i kel prøver blev ste- I

5 riliseret med 2,0 mRad y-stråling. Antistof (IgG)-ti term' veau- I

H er blev bestemt periodisk fra prøver af komælk, son var opnået I

fra de vaccinerede køer såvel som fra kontrolkøerne. I

Eksempel 2 I

I 10 I

I Isolation af MAIF-faktor fra hyper immuniseret mælk. I

I Trin 1: Mælkef i 11ratfremst i 11 i ng I

15 20 1 frisk mælk fra hyper immuniserede køer blev kørt igennem I

I en f1 ødeseparator (DeLaval model 102) til fjernelse af fedtet. I

I De resulterende 16 1 skummetmælk blev ultrafil treret til I

I fjernelse af højmolekylære arter (over 10.000 dalton) under I

I 20 anvendelse af.en hul fiber-di af i 11rer ing/koncentrator (Amicon I

DL-10L). Koncentratoren er udstyret med to indsatser eller pa- I

troner med molekylvægt-cut-off-værdier på 10.000 dalton I

I (Amicon H5P10-43)· Skummetmælken blev kørt ved en pumpehastig- I

hed på 80 på måleren og indførings- og udføringstryk på hen- I

I 25 holdsvis 30 psi og 25 psi. I

12 1 af filtratet (<10.000 dalton), som kommer ud af patroner- I

I ne ved en strømningshastighed på 4 1 pr. time blev frosset I

eller lyofiliseret til lagring og yderligere oprensning. I

30 I

Trin 2: Ionbytterkromatografi. I

Den mælke-antiinf 1ammatorisk-faktor, MAIF, i filtratet blev I

først isoleret ved hjælp af en anionbytterkromatografi søj1e. I

35 I

Ved denne metode blev en DEAE-Sepharose CL-6B gel (Pharmacia) I

anvendt til at pakke en 5xl0cm glassøjle, som var ækvilibreret I

med sterilt, dobbeltdesti 11eret vand med en pH-værdi på 7,0. I

DK 175473 B1 I

19 I

En 1 af filtratet (<10.000) blev sat på søjlen og elueret med I

sterilt, dobbeltdesti1 leret vand med en pH-værdi på 7,0 ved en I

strømningshastighed på 160 ml pr. time. Ti milliliter-fraktio- I

ner blev opsamlet og undersøgt ved 280 nm i et LKB Uvicord I

I 5 4700-absorptiometer med en optisk densitet, der udskrives på I

I en tilsluttet recorder (Pharmacia REC-482). I

I Substanser ud over MAIF med positive og neutrale ladninger I

I bindes ikke til DEAE-Sepharose-gelen. De elueres ved gennem- I

I iq faidstoppen (eng.: fallthrough peak) første top). MAIF bæ- I

I rende en negativ ladning tilbageholdes på gelen. I

I Til udtømning af MAIF blev søjlen elueret med entrinvisgra- I

I dient under anvendelse af sterilt, fysiologisk saltvand med en I

I 15 pH-værdi på 7,0. En typisk profil er vist i fig. 1. 8iobestem- I

I melse af de enkelte fraktioner viste, at den anden top inde- I

I holder MAIF. Fraktioner omfattende den anden top og dens skul- I

I der anvendes til yderligere oprensning. Udvindingsundersøgel- I

I ser viser, at 8,8 g tørt pulver blev opnået ved denne metode. I

I 20 I

I Trin 3: Oelf iltrer inqskromatoqraf i I

I Den anden top opnået fra trin 2 indeholder MAIF og andre nega- I

I tivt ladede molekyler, og derfor var et yderligere rensetrin I

I 25 påkrævet. Til opnåelse af yderligere oprensning er det hen- I

I sigtsmæssigt at anvende en gelfiltreringssøjle til at separere I forskellige bestanddele på basis af molekylvægten.

Ved denne metode blev Sephadex G-10 harpiks (Pharmacia) pakket I 30 i en 2,5 x 80cm glassøjle og ækvilibreret med sterilt, dobbelt- I destilleret vand med en pH-værdi på 7,0. To gram af den anden I fraktion fra trin 2 blev genopløst i sterilt, dobbeltdesti 1- I leret vand og påført på søjlens top. Søjlen blev elueret ved I en strømningshastighed på 30 ml pr. time. Fraktioner (3,3 ml) I 35 blev opsamlet og undersøgt ved 254 nm og 280 nm (Pharmacia Duo I Optical Unit), idet optisk densitet udskrives på en tilsluttet I recorder (Pharmacia REC-482).

I DK 175473 B1

Typisk viste der sig 3 toppe i elueringsprofi len som illu- I

streret i fig. 2. Oen første og anden top indeholdt MAIF-ak- I

tivitet. I

5 Den første top er et aggregat, som dannes på 6-10-søjlen, og I

som indeholder den aktive MAIF.

Den anden top indeholder den ikke-aggregerede form af MAIF. I

Både aggregatformen {top 1) og den ikke-aggregerede form (top I

10 2) er biologisk aktive i rottebioprøve. I

I KARAKTER I SAT ION AF MÆLKE-ΑΝΤΙINFLAMMATORISK-FAKTOR I

Molekylvægten af den ikke-aggregerede form af MAIF, som var I

15 fremstillet ved den ovenfor beskrevne metode, blev fundet til I

at være mindre end 10.000 dalton. Dette blev udledt fra den I

I kendsgerning, at det første trin i isolationen af MAIF fra I

valle foregik ved ultrafiltrering under anvendelse af en mem- I

bran, som ikke tillader passagen af arter med molekylvægte > I

20 10.000 dalton.. I

I MAIF har en negativ ladning. Dette blev bestemt ved at påføre I

I mæ1keu1 traf i 11ratet til en DEAE-ce11u1 ose ionbyttersøj 1 e. MAIF I

I eluerede ikke fra søjlen med vand. Ændring af elueringsmediet I

I 25 til natriumch1 or id (0,9% pH) bevirkede eluering af adskillige I

I toppe (fig. 1). Neutrale og positivt ladede arter vedhæfter I

I ikke til ionbytterharpiksen, og negativt ladede arter elueres I

I ved forhøjelse af saltkoncentrationen. Når permeatet med mole- I

I kylvægt mindre end 10.000 dalton blev påført på DEAE-søjlen, I

I 30 eluerede neutrale salte og sukkerarter med vand (top 1, fig. I

I 1). Tre adskilte toppe eluerede, da pufferen blev ændret til I

I saltvand (toppe 2-4), Den anden top og dens skulder indeholdt I

I MA IF-bio1 og i sk aktivitet ved rotteprøven. Det konkluderes der- I

I for, at MAIF har en negativ ladning. I

I 35 I

I En anden kemisk egenskab hos MAIF er, at den danner et aggre- I

I gatunder processen til fjernelse af salt. Denne egenskab I

DK 175473 B1 I

21 I

bliver tydelig, når permeat med molekylvægt < 10.000 dalton I

blev ført over en Sephadex G-10-søjle, som var ækvilibreret I

I med dobbeltdestilleret vand, og elueres med vand ved en pH- I

I værdi på 7 (fig. 2). Tre toppe eluerede fra G-10-søjlen; den I

I 5 første top eluerede sammen med dødvolumenet {eng.: void I

I volume), hvilket antyder en molekylvægt lig med eller større I

I end 10.000 dalton. Oette var uventet, fordi molekyler større I

I end 10.000 dalton tidligere var blevet fjernet fra denne prøve I

I ved u1 traf i 1 trer ing. Den anden top eluerede i den forventede I

I 10 stilling for den ant i i nf 1ammatori sk faktor. Både den første og I

I anden top udviste antiinflammatorisk biologisk aktivitet ved I

I rottepoteprøven, hvorimod den tredie top manglede aktivitet. I

I Det var overraskende at finde, at både første og anden top I

I havde antiinflammatorisk biologisk aktivitet. Materialet, som I

I 15 blev udvundet fra den første top af G-10-søjlen (trin 3), blev I

I lyofiliseret og påført på en G-100 søjle; en enkelt top blev I

I elueret sammen med dødvolumenet, hvilket antyder en molekyl- I

I vægt på 100.000 dalton eller større. G-10-søjlen, som anvendes I

I i trin 3 fjerner salt og separerer på samme tid arter med I

I 20 forskellige molekylvægte. Det konkluderes derfor, at under I

I passage gennem G-10-søjlen og resulterende fjernelse af salt I

H dannede den antiinflammatori ske faktor et aggregat med høj mo- I

I lekylvægt. Aggregeringsgraden varierede med saltkoncentratio- I

nen. I

I 25 I

Aggregeringsegenskaberne antyder den mulighed, at et bredt spektrum af arter roed forskellige molekylvægte kan dannes, som I har antiinflammatorisk, biologisk aktivitet på grund af til- stedeværelsen af den antiinflammatoriske faktor. Opdagelsen af H 30 denne egenskab antyder muligheden for, at producere mælke-anti i nf 1 aromatori ske-faktorer roed et bredt spektrum af forskellige biokemiske egenskaber afhængig af graden af aggre- gation i det færdige produkt. F.eks. kan formuleringen med længere eller kortere biologiske halveringstider fremstilles 35 under anvendelse af aggregater med større eller mindre mole- kylvægte, idet raolekylvægtfordelingen styres ved hjælp af saltkoncentrationen under forarbejdning. Den heri beskrevne ® -- . . _ I DK 175473 B1 søjlekromatografimetode resulterer i de mest lavmolekylære H arter, som er blevet opnået, og som har biologisk aktivitet H (dvs. top 2 fra trin 3-G-10-søjlen) . Denne iagttagelse antyder H også anvendelse af andre metoder til dannelse af aggregaterne.

H 5 F.eks. bevirker fortynding i vand, at aggregering forekommer.

H Kemiske midler, som binder salte, især calcium, kan bevirke II dannelse af aggregatet. I og med denne opdagelse er gjort, vil andre metoder til dannelse af aggregatet og separation af MAIF være nærliggende for fagfolk inden for området.

Eksempel 3 H Biologisk aktivitetsbestemmelse 15 Den antiinflammatoriske virkning af MAIF blev undersøgt på H ødemer, som var forårsaget af injektion af en opløsning af

carragen i fodpuderne på rotter. En lyofiliseret prøve af MAIF

blev opløst i det pågældende vehikel og indgivet intraperito- nealt til forsøgsrotter. Carragenet blev derefter indgivet til 20 rotter i en mængde på 0,1 ml af en 1% saltvandopløsning i hver bagbensfodpude. Fodpuderne blev målt før injektioner blev gi- vet og 2,5 time efter injektionerne under anvendelse af tyk- I kelsesmåling. Resultaterne er vist i tabel 2 og 3.

I 25 Den ikke-aggregerede form af MAIF (top 2 fra G-10-søjlen) fra I kontrolmælk og hyperimmun mælk forårsagede reduktion i inflam- mation af rottepoten ved doser mellem 1 mg og 0,25 mg (tabel I 2). Både den hyperimmune mælk og den almindelige mælk udviste I aktivitet; imidlertid var det hyperimmune materiale mere po- I 30 tent. Heraf konkluderes, at MAIF forekommer i større koncen- I tration i mælken fra hyperimmune køer.

I Den anden top fra DEAE-søjlen udviste aktvitet ved isolation I fra enten hyperimmun mælk eller almindelig mælk. Aktiviteten er I 35 væsentligt større i den hyperimmune mælk (tabel 3).

I Den første top fra G-10-søjlen, som er den aggregerede form af I MAIF, udviste aktivitet i rottepoteforsøg (tabel 2). Den ag-

DK 175473 B1 I

23 I

gregerede form er imidlertid ikke så potent som den ikke- I

aggregerede form på samme vægtbasis. I

Ud fra disse undersøgelser konkluderes, at MAIF-faktoren fore- I

S kommer naturligt i komælk. Hyperimmunisering af køerne forår- I

sager højere koncentration af MAIF i mælken. MAIF er et lille, I

negativt ladet molekyle, som kan separeres fra mælken ved en I

række metoder. MAIF-faktoren kan danne aggregater med høj mo- I

lekylvægt, hvilke aggregater ikke forekommer naturligt i mæl- I

10 ken, men dannes under forarbejdning. I

I 15 I

I 20 I

30 I DK 175473 B1 Η - H TA8EL 2 Η VIRKNING AF MÆLKE-ΑΝΤΙINFLAMMATORISK-FAKTOR (MAIF)

H TIL REDUKTION AF INFLAMMATION I ROTTER

IH 5 _Fremstillet ud fra hyperimmun malk_

Fodpudemå1 inger (mm) MAIF- 2,5 time dosis Før efter % 10 _i n iektion_in jektion_Forskel_Inflammation H 2,0 mg/ rotte 3,43 5,01 1,58 46 15 1.0 mg/ rotte 3,49 5,39 1,90 54 20 0,5 mg/ I rotte 3,42 5,51 2,09 61 0,1 mg/ I 25 rotte 3,43 5,86 2,43 71 I Kontrol/ I saltvand 3,43 5,82 2,39 70 I 30 I Fremstillet ud fra normal komælk I 2,0 mg/ I 35 rotte 3,30 5,24 1,94 59

DK 175473 B1 I

25 I

1,0 mg/ I

rotte 3,31 5,22 1,91 58 I

5 0,5 mg/ I

rotte 3,32 5,33 2,01 61 I

I 0,25 mg/ I

I 10 rotte 3,31 5,42 2,11 64 I

I TABEL 3 I

I 15 I

I SAMMENLIGNING AF HALVRENSEDE FRAKTIONER AF MAIF TIL I

I REDUKTION AF INFLAMMATION I ROTTER I

I (Fremstillet ud fra hyperimmun og almindelig malk) I

20 _Fodpudemå 1 i nqer (mm)________ I

I 2,5 time I

Før efter Inflamma- H 2 5 _ injektion injektion_Forskel _ t i on I DEAE-søjle I Anden top I Hyperimmun I 30 mælk 2 mg/rotte 3,25 5,04 1,79 55 I 35 I DK 175473 B1 Η DEAE-søjle Anden top H Almindelig mælk 5 2 mg/rotte 3,30 5,24 1,94 59 H G-10-søjle H Ferste top 10 2 mg/rotte 3,31 4,98 1,67 50

Kontrol/ saltvand 3,34 5,63 2,29 69 I 15 __

KEMISK ANALYSE AF ANTIINFLAMMATORISK FAKTOR

20 Prøver af anti inf 1ammatorisk faktor blev analyseret kémisk.

MA IF har ikke krystallinsk struktur, som bestemt ved røntgen- strålediffraktionsundersøgelser. MAIF-præparater gav grundstof- analyse i overensstemmelse med carbohydratsammensætning. C-, H- og O-forholdene svarede til et polymert eller oligomert ma- I 25 teriale, hvor nogle carbinolgrupper var oxideret til carboxyl.

Oet lille overskud af calciumskvi valenter i forhold til chlo- ridioner kan forklares delvis som carboxylatsa1 te. Resten kan være natrium- eller kaliumsalte. Smelteopførslen eller snarere I ikke-smelteopførslen pegede imidlertid på saltlignende 30 og/eller højmolekylære sammensætninger. Materialet i den fore- I liggende tilstand af renhed indeholder tilsyneladende en va- I rierende mængde af calcium- og chloridsalte, sandsynligvis

CaCl2.

I 35 Intet præparat indeholdt en signifikant mængde af nitrogen, I hvilket udelukker enhver peptidbestanddel i sammensætningen.

I Ligeledes kan fraværet af nitrogen udelukke tilstedeværelsen DK 175473 B1 27 af aminosukkerarter og andre nitrogenholdige materialer, såsom forskellige komplekse lipider, som den eller de største be- j standdele.

5 Pyrolytiske massespektre viste signifikante spor af C-18-fedt-I syrer. Denne kendsgerning peger sammen med spormængderne af N

I - og P på tilstedeværelsen af et komplekst lipid i faktoren. In- I frarød spektroskopi viste absorptioner i overensstemmelse med I carbinol- og carboxylatfunktionaliteter. Ultraviolet, synlig I 10 og fluorescerende spektroskopi viste ingen betydelig mængde af I kromoforer ud over dem, der var indikeret ved infrarød spek- I troskopi.

I De kemiske undersøgelser er i overensstemmelse med et oligo- I 15 mert carbohydrat, hvori carbony1funktionen (aldehyd eller ke- ton) er bundet (eng.: tied up) i underenhedsbindingerne. Det I oligomere carbohydrat indeholder også nogen sidekædeoxidation til carboxylat.

20 MAIF-præparatet er i alt væsentligt, men ikke fuldstændigt I rent.

I Idet opfindelsen nu er generelt beskrevet, vil det være meget åbenbart for fagfolk inden for området, at der kan foretages 25 mange ændringer og modifikationer uden at indvirke på opfin- delsens ånd eller rammer.

H

Claims

1. Anti -inflammatorisk faktor i i alt væsentligt ren form, 5 kendetegnet ved, at den er fremstillet ved en frem-gangsmåde omfattende·. i) fjernelse af fedt fra mælk fra et mælkeproducerende dyr til fremstilling af skummetmælk; I 10 ii) fjernelse af kasein fra skummetmælken til fremstilling af valle; H i i i) fjernelse af makromolekyler med en molekylvægt større end 15 10.000 dalton fra denne valle, iv) fraktionering af det 1avmolekylære produkt fra det f ore- H gående trin ved ionbytterkromatografi; 20 v) yderligere oprensning af den antiinflammatoriske faktor fra det foregående trin ved molekylsigtekromatografi; og (vi) opsamling af den antiinflammatoriske faktor.

2. Antiinflammatorisk faktor ifølge krav 1, kende- tegnet ved, at det mælkeproducerende dyr er et bovint I dyr eller et ovint dyr.

3. Antiinflammatorisk faktor ifølge krav 1, kende- I 30 tegnet ved, at det mælkeproducerende dyr er i en hyper- I immuniseret tilstand.

4. Antiinflammatorisk faktor ifølge krav 3, kende- tegnet ved, at den hyper immuniserede tilstand induceres 35 ved indgivelse af en polyvalent blanding af bakterieantigener omfattende: Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermidis; Streptococcus pyogenes, A Type 1; Streptococcus pyogenes, A. I 29 DK 175473 B1 I Type 3; Streptococcus pyogenes, A. Type 5; Streptococcus pyo- I genes, A. Type 8; Streptococcus pyogenes, A. Type 12, Strepto- I coccus pyogenes, A. Type 14,- Streptococcus pyogenes, A. Type I 18,· Streptococcus pyogenes, A. Type 22; Aerobacter aerogenes; I 5 Escherichia coli; Pseudomonas aeruginosa; Klebsiella pneumo- I niae; Salmonella typhimurium; Haemophilus influenzae; Strepto- I coccus mitis; Proteus vulgaris; Shigella dysenteriae; Diplo- I coccus pneumoniae; Proprionibacter acnes Actinomyces (anaero- I bt); Streptococcus mutans; eller Streptococcus agalactiae. I 10

5. Anti inflammatorisk faktor ifølge krav 4, kende- I tegnet ved, at det polyvalente bakterieantigen indgives I oralt til dyret, eller at den polyvalente vaccine indgives I parenteralt.

6. Antiinflammatorisk faktor ifølge krav 1, kende- tegnet ved, at fjernelse af makromoleky1 erne med mole- kylvægt større end ca. 10.000 dalton sker ved ul traf i 1 trering af vallen gennem en molekylsigtemembran, som tilbageholder mo- H 20 lekyler med en størrelse på ca. 10.000 dalton, eller at ma- kromoleky1 erne med molekylvægt større end ca. 10.000 dalton fjernes ved molekylsigtekromatografi.

7. Antiinflammatorisk faktor ifølge krav 1, kende- 25 tegnet ved, at denne faktor har en relativ molekylvægt H mellem 0 og ca. 10.000 dalton.

8. Fremgangsmåde til isolation af en i alt væsentligt ren H antiinflammatorisk faktor fra mælk, kendetegnet H 30 ved, at den omfatter, at man: (i) fjerner fedt fra mælken fra et mælkeproducerende dyr til H fremstilling af skummetmælk; 3i> (ii) fjerner kasein fra skummetmælken til fremstilling af H valle; I DK 175473 B1 Η (iii) fjerner makromolekyler med molekylvægt større end ca. 10.000 dalton fra vallen; og H {iv) fraktionerer det lavmolekylære produkt fra det foregående H 5 trin ved ionbytterkromatografi; (v) yderligere oprenser den ant i i nf 1ammatori ske faktor fra det foregående trin ved molekylsigtekromatografi; og (vi) opsamler den ant i i nf 1ammatori ske faktor.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 8, kendetegnet ved, at det mælkeproducerende dyr er i en hyperimmuniseret til- H stand. I 15

10. Fremgangsmåde ifølge krav 9, kendetegnet ved, H at den hyper immuniserede tilstand fremkaldes ved indgivelse af H en blanding af bakterieantigener omfattende: Staphylococcus H aureus; Staphylococcus epidermidis,- Streptococcus pyogenes, A Η 20 Type 1; Streptococcus pyogenes, A. Type 3,- Streptococcus pyo- genes, A. Type 5; Streptococcus pyogenes, A. Type 8; Strepto- H coccus pyogenes, A. Type 12; Streptococcus pyogenes, A. Type 14; Streptococcus pyogenes, A. Type 18; Streptococcus pyoge- nes, A. Type 22; Aerobacter aerogenes; Escherichia coli; Pseu- 25 domonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae; Salmonella typhimu- I rium; Haemophilus influenzae; Streptococcus mitis; Proteus I vulgaris; Shigella dysenteriae; Oiplococcus pneumoniae; Pro- I prionibacter acnes Actinomyces (anaerob); Streptococcus mu- I tans; eller Streptococcus agalactiae.

11. Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, I at den polyvalente bakterieantigen indgives oralt til dyret, eller at den polyvalente vaccine indgives parenteralt. 1 Fremgangsmåde ifølge krav 10, kendetegnet ved, at fjernelse af makromolekylerne med molekylvægt større end ca. 10.000 dalton omfatter ultrafiltrering gennem en molekyl- I 31 DK 175473 B1 I s igtemembran, som tilbageholder molekyler større end ca. I 10.000 dalton, eller at makromoleky1 er større end ca. 10.000 I dalton fjernes ved molekylsigtekromatografi. I 5 13. En i alt væsentligt ren anti inflammatorisk faktor fra I mælk, kendetegnet ved, at den omfatter et oligomert I carbohydrat.

14. Antiinflammatorisk faktor ifølge krav 13, kende- I 1° tegnet ved, at carbohydratets carbonyl funkt i on er bundet I i underenhedsbindinger. j

15. Ant i i nf 1ammatori sk faktor ifølge krav 13, kende- tegnet ved, at carbohydratet indeholder sidekædeoxida- I 15 tion til carboxylationer.

16. Antiinflammatorisk faktor ifølge krav 13, kende- I tegnet ved, at carbohydratet er kompleksbundet til I calciumioner, eller at carbohydratet er kompleksbundet med 20 alifatiske syrer.

17. Antiinflammatorisk faktor ifølge krav 13, kende- tegnet ved, at carbohydratet er forenet med nitrogenhol- dige forbindelser, eller at carbohydratet er forenet med en 25 phosphorholdig forbindelse, eller at carbohydratet er forenet med et komplekst lipid.

18. Antiinflammatorisk faktor ifølge krav 13, kende- tegnet ved, at carbohydratet i alt væsentligt er fri for 30 en svovlforbindelse.

19. Anvendelse af en antiinflammatorisk effektiv mængde af en antiinflammatorisk faktor ifølge krav 1 eller krav 13 til fremstilling af et lægemiddel til behandling af inflammation 35. et dyr,

20. Anvendelse ifølge krav 19, kendetegnet ved, at inflammationen er forårsaget af en tilstand valgt blandt DK 175473 B1 ^R akut og subakut bursitis, akut ikke-specifik tendonitis, sy- stemisk lupus erythematosus, systemisk dermatomyosit i s, akut ^R rheumatisk carditis, pemphigus, blæreformet dermatitis, herpe- ^R teformis, alvorligt erytem, mangeartet eksfoliativ dermatitis, 5 cirrose, sæsonbestemt stadig tilbagevendende rhinitis, bron-^R kial astma, ektop dermatitis, serum-sygdom, keratitis, opthal- ^R micus iritis, diffus ureitis, chor i dit i s, optisk neuritis, sympatetisk opthalmia, symptomatisk sarcoidosis, Loeffler’s syndrom, berylliosis og hæmolytisk anæmi og mastitis. I 10 i 25 1 35