FI120574B - Anti-inflammatorinen tekijä, menetelmä sen eristämiseksi ja sen käyttö - Google Patents

Description

Anti-inflammatorinen tekijä, menetelmä sen eristämiseksi ja sen käyttö Keksinnön tausta 5 Keksinnön aihepiiri Tämä keksintö koskee anti-inflammatorista tekijää, prosesseja sen tuottamiseksi olennaisesti puhtaassa tai erittäin puhtaassa muodossa ja sen käyttöä lääkkeiden valmistamiseksi tulehduksen hoitoon.

10 Tekniikan tason kuvaus

Tulehdus, kuten Dorland's Medical Dictionaryssa määritellään, on "kudosten vaurioitumisen tai tuhoutumisen esiin nostama paikallinen suojaava reaktio, joka palvelee tuhoten, laimentaen tai eristäen sekä vaurioittavan tekijän että vaurioituneen kudoksen." Tulehdukselle on ominaista aukkojen syntyminen hiusverisuonistoon, veren rakenneosien vuotami-15 nen välitiloihin ja leukosyyttien kulkeutuminen tulehtuneeseen kudokseen. Makroskooppisella tasolla tähän liittyvät yleensä tavalliset kliiniset merkit, punoitus (eryteema), turvotus (edeema), aristaminen (hyperalgesia) ja kipu. Tämän monimutkaisen reaktion aikana vapautuu paikallisesti kemiallisia välittäjäaineita, kuten histamiinia, 5-hydroksitryptamiinia, erilaisia kemotaktisia tekijöitä, bradykiniiniä, leukotrieenejä ja prostaglandiineja. Fa- • · ·.· · 20 gosyyttisiä soluja kulkeutuu alueelle ja solujen lysosomien kalvot voivat repeillä, vapautta- en lyyttisiä entsyymejä. Kaikki nämä tapahtumat voivat edistää osaltaan tulehdusreaktiota.

• · • · · • · · • · ***· Nivelreumaa sairastavilla potilailla tulehdukseen kuuluu oletettavasti antigeenin (gamma- • · • · ...

: ** globulnm) ja vasta-aineen (reumatekijä) sekä komplementin liittyminen, mikä aiheuttaa • · · • · · *.1 1 25 leukosyyttejä houkuttelevien kemotaktisten tekijöiden vapautumisen paikallisesti. Leu kosyytit fagosytoivat antigeeni-vasta-aine ja komplementti -komplekseja ja myös vapaut- • 1 • · : ** tavat monia entsyymejä, joita niiden lysosomit sisältävät. Nämä lysosomaaliset entsyymit • · *···1 aiheuttavat sitten vaurioita rustoon ja muihin kudoksiin, ja tämä lisää tulehduksen määrää.

Soluvälitteiset immuunireaktiot voivat myös osallistua. Tämän prosessin aikana vapautuu "·"· 30 myös prostaglandiineja.

♦ · • · · • · · ♦ · · 2

Prostaglandiini!, joita todennäköisesti syntyy tulehduksessa, aiheuttavat punoitusta ja lisäävät paikallista veren virtausta. Prostaglandiineilla on kaksi sellaista tärkeää vaikutusta verisuoniin, joita muilla tulehduksen välittäjäaineilla ei yleensä ole - pitkäkestoinen verisuonia laajentava vaikutus ja kyky kumota sellaisten aineiden kuin norepinefriini ja an-5 giotensiini verisuonia supistavat vaikutukset.

Useat tulehduksen välittäjäaineet lisäävät verisuonten läpäisevyyttä (vuotoa) kapillaarien jälkeisissä ja keräävissä pikkulaskimoissa. Lisäksi leukosyyttien kulkeutuminen tulehtuneelle alueelle on tärkeä tekijä tulehdusprosessissa.

10

Arthusin reaktio on tulehdusreaktio, joka aiheutuu immuunikompleksien muodostumisesta ihonalaisiin kohtiin, joissa antigeeni muodostaa kompleksin vasta-aineensa kanssa. Neutro-fiilit kiinnittyvät niille luonteenomaisesti ihonalaiseen injektiokohtaan muodostuvan immunoglobuliinikompleksin Fc-osaan, ja vapauttavat kohtaan pilkkovia entsyymejä, aihe- . .·, 15 uttaen näkyvän akuutin tulehduksen. Näin ollen reaktio on pääasiassa neutrofiilien välittä- • · · • · · · .:. mää ja aineet, jotka vaikuttavat reaktion kehittymiseen, tekevät sen vaikuttamalla näihin

Ml» : soluihin.

• · • · • · : ’·., On olemassa useita reaktioteitä, joiden avulla aine voisi häiritä neutrofiilien kulkeutumista • · · :.·1 ·’ 20 verisuonista tulehduskohtaan. Eräs todennäköinen tie on estää marginaatiota, tulehdussolujen palautuvaa "liimautumista" verisuonen seinämän endoteelisoluverhoukseen. Normaali- • · ·1 1 · tilassa noin 50 % neutrofiileistä on takertunut palautuvasta mutta akuutin tulehdusreaktion • · · • · · ‘ ·' 1 aikana takertuminen tulee paljon voimakkaammaksi ja on ratkaiseva vaihe neutrofiilien • · ;.· · kulkeutumisprosessissa. Vaikka prostaglandiinit eivät todennäköisesti osallistu suoraan «»· .. · 25 kemotaktiseen reaktioon, toinen arakidonihappoaineenvaihdunnan tuote, leukotrieeni, on : erittäin tehokas kemotaktinen aine.

• · · • · · • · · • ·

Anti-inflammatorinen reaktio on mikä tahansa reaktio, jolle edellä määritellyn kaltainen tulehdus on ominainen. Lääketieteen alaan perehtyneet tietävät hyvin, että tulehdusreaktio 30 aiheuttaa suuren osan erilaisiin sairauksiin ja vammoihin liittyvästä fyysisestä epämukavuudesta, ts. kivusta ja toimintakyvyn menetyksestä. Näin ollen on yleinen lääketieteellinen käytäntö määrätä farmakologisia aineita, joilla on tulehdusreaktiota neutraloiva vaiku- 3 tus. Aineet, joilla on näitä ominaisuuksia, luokitellaan anti-inflammatorisiksi lääkkeiksi. Anti-inflammatorisia lääkkeitä käytetään hoidettaessa laajaa kiijoa erilaisia häiriötiloja, ja samoja lääkkeitä käytetään usein hoidettaessa eri sairauksia. Hoito anti-inflammatorisilla lääkkeillä ei ole sairauden hoitamista, vaan useimmiten oireen, ts. tulehduksen hoitamista.

5

Anti-inflammatoriset, analgeettiset ja antipyreettiset lääkkeet ovat heterogeeninen joukko yhdisteitä, kemiallisesti usein toistensa kanssa erilaisia, joilla kuitenkin on tiettyjä samoja terapeuttisia vaikutuksia ja sivuvaikutuksia. Kortikosteroidit edustavat laajimmin käytettyä yhdisteiden luokkaa anti-inflammatorisen reaktion hoitamiseksi. Proteolyyttiset entsyymit 10 edustavat toista yhdisteluokkaa, jolla ajatellaan olevan anti-inflammatorisia vaikutuksia.

Hormonit, jotka suoraan tai epäsuorasti saavat lisämunuaisen kuorikerroksen tuottamaan ja erittämään steroideja, edustavat vielä erästä anti-inflammatoristen yhdisteiden luokkaa. On kuvattu joukko ei-hormonaalisia anti-inflammatorisia aineita. Näiden joukosta laajimmin käytettyjä ovat salisylaarit. Asetyylisalisyylihappo, tai aspiriini, on yleisimmin määrätty • .*,15 analgeettinen-antipyreettinen ja anti-inflammatorinen aine. Esimerkkejä steroidisista ja ei • · · • ·· · .:. steroidisista anti-inflammatorisista aineista on luetteloitu j ulkaisussa Physician's Desk

IMI

:*· j Reference, 1987 (katso s. 207 ja 208 tällaisten valmisteiden hakemistosta).

• · • · • · • ‘. Luonnolliset ja synteettiset kortikosteroidivalmisteet aiheuttavat useita vakavia sivuvaiku- * · · V ; 20 tuksia, joihin kuuluvat verenpaineen nousu, suolan ja veden pidättyminen ja kaliumin ja kalsiumin erittyminen. Lisäksi kortikosteroidit saattavat peittää infektion merkit ja edistää • · • · • * * infektiokykyisten mikro-organismien leviämistä. Näiden hormonien käyttöä ei pidetä tur- • · · • · · *·’ vallisena raskaana oleville naisille, ja pitkäaikainen kortikosteroidihoito on liitetty mahan • · :.: : hyperaktiivisuuteen j a/tai peptisiin haavoihin. Hoito näillä yhdisteillä voi myös pahentaa • · · • · * ·.. · 25 diabetes mellitusta, j oka vaatii suurempia insuliiniannoksia, ja voi saada aikaan psykootti- • · v\·' siä häiriötiloja. Hormonaalisilla anti-inflammatorisilla aineilla, jotka lisäävät epäsuorasti • · :‘ : endogeenisten kortikosteroidien tuotantoa, on sama taipumus aiheuttaa haitallisia sivuvai kutuksia. 1

Ei-hormonaaliset anti-inflammatoriset aineet ovat synteettisiä biokemiallisia yhdisteitä, jotka voivat olla toksisia suurina annoksina, jolloin niillä on laaja kirjo ei-toivottavia sivuvaikutuksia. Esimerkiksi salisylaatit myötävaikuttavat vakaviin happo-emästasapainon häi- 4 riöihin, jotka luonnehtivat tämän yhdisteluokan aiheuttamia myrkytyksiä. Salisylaatit stimuloivat hengitystä suoraan ja epäsuorasti. Toksiset annokset salisylaatteja aiheuttavat hengityskeskuksen halvauksen, samoin kuin verenkierron lainautumisen vasomotorisen lamautumisen seurauksena. Salisylaatin nauttiminen saattaa johtaa sydänalan ahdistukseen, 5 pahoinvointiin ja ylenantamiseen. Salisylaatin indusoima mahan verenvuoto on hyvin tunnettua. Salisylaatit voivat aiheuttaa maksavaurioita, ja johtaa veren hyytymisajan pidentymiseen. Sen vuoksi aspiriinin käyttöä tulisi välttää potilailla, joilla on vaikea maksavaurio, hypoprotrombinemia, K-vitamiinin puutos tai hemofilia, koska salisylaattien aiheuttama verihiutaleiden hemostaasin inhibitio voi johtaa verenvuotoon. Salisylaattimyrkytys on 10 yleinen ja Yhdysvalloissa tavataan yli 10,000 vaikeaa salisylaattimyrkytystapausta joka vuosi; jotkin näistä johtavat kuolemaan, ja monet esiintyvät lapsilla. Katso Goodmanin ja Gilmanin The Pharmacological Basis of Therapeutics, 7. painos 1985. Näin ollen huolimatta suuresta määrästä anti-inflammatorisia aineita, joita on saatavilla nykyisin, on yhä olemassa tarve turvalliselle, tehokkaalle anti-inflammatoriselle tuotteelle, joka ei aiheuta • . ·, 15 sivuvaikutuksia j a haitallisia reaktioita.

• · · ··· · • · · • · ·· . ·. : Jos voitaisiin saada luonnollinen ravintona käytettävä tuote, kuten esimerkiksi maidosta • · •:· · · saatu tuote, jolla olisi anti-inflammatorisia vaikutuksia, se olisi helposti annettavissa oleva, : * ·., helposti saatavissa oleva, turvallinen terapeuttinen koostumus.

•V‘: 20

Alalla on aikaisemmin tunnettua tuottaa maitoja, joilla on joukko terapeuttisia vaikutuksia.

• m : *· · Esimerkiksi Beck on kuvannut maidon, joka sisältää vasta-ainetta Streptococcus mutansia • · · • · · ’·' ' vastaan, ja jolla on hammaskariesta inhiboivaa vaikutusta (US-patentti nro 4,324,782).

• · ·. · · Maito saadaan immunisoimalla lehmä S. mutans -antigeenillä kahdessa vaiheessa ja otta- • · · :... · 25 maila lehmästä terapeuttinen maito.

• · · · • · · • · • · :: Stolle et ai. ovat kuvanneet menetelmän tupakointiin liittyvien verisuonisairauksien tai keuhkosairauksien hoitamiseksi eläimellä, jolloin menetelmässä annetaan eläimelle maitoa, joka on kerätty lehmästä, jota on pidetty hyperimmuunitilassa (US-patentti nro 4,636,384). 30 Beck on kuvannut menetelmän tulehduksen hoitamiseksi eläimessä, jolloin menetelmässä annetaan eläimelle anti-inflammatorisesti tehokas määrä maitoa, joka on kerätty lehmästä, jota on pidetty anti-inflammatorista tekijää tuottavassa tilassa (US-patentti nro 4,284,623).

5

Heinbach, US-patentti nro 3,128,230, on kuvannut maidon, joka sisältää alfa-, beeta- ja gammaglobuliinien komponentteja, kun lehmään on siirrostettu antigeenisiä seoksia. Peterson et ai. (US-patentti nro 3,376,198), Holm (US-patenttihakemus (julkinen) sarjanumero 628,987), Tunnah et ai. (GB-patentti nro 1,211,876) ja Biokema S.A. (GB-patentti 5 1,442,283) ovat myös kuvanneet vasta-aineita sisältäviä maitoja.

Yhdessäkään edellä mainituista viitteistä ei kuitenkaan ole tunnistettu terapeuttisten maitojen sitä yhdistettä tai niitä yhdisteitä, jotka saavat aikaan halutut terapeuttiset vaikutukset. Esimerkiksi Beckin US-patentissa nro 4,284,623 terapeuttisina välineinä käytetyt maito-10 tuotteet koostuvat joko nestemäisestä kokomaidosta, nestemäisestä rasvattomasta herasta tai kokomaitojauheista. Vaikka kullakin näistä maitotuotteista on anti-inflammatorisia ominaisuuksia, tekijää tai tekijöitä, jotka todellisuudessa saavat aikaan terapeuttiset edut, ei ole vielä eristetty tai tunnistettu tai puhdistettu homogeeniseksi.

15 Julkaisuissa WO 92/04035 ja WO 94/09799 kuvataan anti-inflammatorisen tekijän eristämistä maidosta ja kyseisen tekijän käyttöä.

Erityinen vaikeus saada maidon anti-inflammatorinen tekijä (tekijät) (MAIF) erittäin puhtaina valmisteina on kyvyttömyys poistaa tiukasti sitoutuneet suolat MAIFrista nykyisin 20 käytetyillä puhdistusmenetelmillä. Yksi ongelmista, johon tämä keksintö kohdistuu, inter alia, on MAIF:in valmistaminen suuressa mittakaavassa, jolloin tiukasti sitoutuneet suolat poistetaan MAIF-valmisteesta, mikä saa aikaan hyvin puhdistetun MAIF: in. Lisäksi aikaisemmin on noussut esiin ongelmia erittäin puhtaiden laboratoriomittakaavan valmisteiden saamiseksi MAIF:ista, aloitettaessa suurista tilavuuksista aloitusmateriaaleja (esim. 90 lit-25 rasta kuorittua maitoa). Tämä keksintö taijoaa ratkaisut näihin ongelmiin.

Yhteenveto keksinnöstä Tämä keksintö kohdistuu maidossa olevaan anti-inflammatoriseen tekijään ja erilaisiin maidossa olevan anti-inflammatorisen tekijän käyttöihin. Erityisesti keksintö suuntautuu 30 anti-inflammatoriseen tekijään, joka valmistetaan maidosta poistamalla siitä rasva; suodattamalla maito, jotta poistetaan molekyylit, joiden molekyylipaino on suurempi kuin noin 10,000 daltonia, fraktioimalla ioninvaihdolla suodos, joka sisältää pienen molekyylipainon omaavat molekyylit; rikastamalla lisää tekijän ioninvaihtofraktioita geeli-suodatuksella ja rikastamalla vielä geelisuodatusfraktioita affiniteettikromatografialla 6 käyttäen kromatografiaväliainetta, jolla on affiniteetti samantasoisiin vierekkäisiin cis-hydroksyy 1 i ryhm iin.

Keksintö suuntautuu lisäksi menetelmiin maidon anti-inflammatorisen tekijän puhdistami-5 seksi lisää käyttäen, inter alia, HPLC-kokoekskluusiokromatografiaa ja orgaanisen partitio-uuton protokollia.

Keksintö suuntautuu lisäksi maidon anti-inflammatorisen tekijän käyttöä lääkkeiden valmistamiseksi estämään neutrofiilien takertumista pikkulaskimoiden endoteeliin tai 10 irrottamaan neutrofiilit, jotka jo ovat takertuneet endoteelisoluihin, jotka reunustavat pikkulaskimoiden seiniä. Tällä tavalla tekijää käytetään vähentämään kudosvauriota, joka liittyy tulehdusvasteeseen.

Keksintö suuntautuu myös maidon anti-inflammatorisen tekijän käyttöön lääkkeiden 15 valmistamiseksi estämään vuorovaikutuksia CD18-solupinta-antigeenien ja muiden molekyylien välillä. On tunnettua, että tällaiset vuorovaikutukset ovat välttämättömiä solujen poistumiselle verisuonistosta, ja että tällainen poistuminen johtaa lisääntyneeseen kudosvaurioon eläimillä tulehdusreaktion aikana. CD 18-antigeenien tiedetään myös olevan tärkeitä isäntäorganismin immunologiselle reaktiolle vieraita antigeenejä vastaan.

• 20 • · · · ··· Keksintöön kuuluu myös anti-inflammatorisen tekijän käyttö nisäkkäillä estämään solujen • · · · kulkeutuminen ulos verisuonistosta, ja tukahduttamaan lymfosyyttien mitogeenistä reak- *:·*: tiota vieraisiin antigeeneihin.

• · • · • · · • · · V · 25 Kuvioiden selitykset lyhyesti

Keksinnön ja siihen kuuluvien monien etujen täydellisempi arviointi saavutetaan helposti, • · • *·· kun keksintö tulee paremmin ymmärretyksi seuraavan yksityiskohtaisen kuvauksen avulla, * · · *...· tarkasteltuna mukaan liitettyjen kuvioiden kanssa, joissa: ·;··: Kuvio 1. Anti-inflammatorisen tekijän eristäminen ioninvaihtokromatografialla DEAE- ·:**: 30 selluloosapylväässä.

: Kuvio 2. DEAE-selluloosakromatografiasta (kuvio 1) saadun anti-inflammatorisen tekijän • · sisältävän huipun (toinen) fraktiointi Sephadex G-10-molekyylisiiviläpylväässä.

Kuvio 3. Immuunimaidon vaikutus karrageenanilla indusoituun turvotukseen rotilla (käpä län paino, % kontrollikäpälästä, keskiarvo ± keskiarvon keskivirhe, n = 10).

7

Kuvio 4. Anti-inflammatorisen tekijän intraperitoneaalisen annon vaikutus polkuanturan turvotukseen rotilla (μΐ, keskiarvo ± keskihajonta (SD), n = 6).

5 Kuvio 5. Intraperitoneaalinen annos-vaste-käyrä anti-inflammatoriselle tekijälle rotan käpälän turvotustestissä (% kontrollista, keskiarvo ± SD, n = 6).

Kuvio 6. Hyperimmuunimaidon tekijän vaikutus verrattuna plaseboon (laktoosi) polkuanturan turvotukseen rotilla (% kontrollista, keskiarvo ± SD, n = 6).

Kuvio 7. Intravenaalisen ja oraalisen MAIF:in vaikutus polkuanturan turvotukseen rotilla 10 (% kontrollista, keskiarvo ± SD, n = 6).

Kuvio 8. MAIF:n pienen intravenaalisen annoksen vaikutus polkuanturan turvotukseen rotilla (% kontrollista, keskiarvo ± SD, n = 6).

Kuvio 9. Intravenaalisen MAIF:in annos-vaste-käyrä rotan käpälän turvotustestissä (% kontrollista, keskiarvo ± SD, n = 6).

. .15 Kuvio 10. Erä 1, kaksoskaija/ultrasuodatuskokeet (% keskimääräisestä kontrolliturvotuk-• « • » « * *'. * sesta, keskiarvo ± SD, n = 6).

·· · ' » *·.*: Kuvio 11. Erä 2, kaksoskaija/ultrasuodatuskokeet (% keskimääräisestä kontrolliturvotuk- • « • · ....: sesta, keskiarvo ± SD, n = 6).

j\4 Kuvio 12. Erä 3, kaksoskaija/ultrasuodatuskokeet (% keskimääräisestä kontrolliturvotuk- • 20 sesta, keskiarvo ± SD, n = 6).

m

Kuvio 13. Eri MAIF-käsittelyjen vaikutus polkuanturan turvotuksen estämiseen rotilla (μΐ • 4 • *·· polkuanturan edeemaa, keskiarvo ± SD, n = 6).

• · · V · Kuvio 14. MAIF-fraktioiden ja immuuni-wpc:n vaikutus polkuanturan turvotuksen estämi- ί4seen rotilla (μΐ polkuanturan edeemaa, keskiarvo ± SD, n = 6).

25 Kuvio 15. Viiden eri anestesia-aineen vaikutus karrageenanin aiheuttamaan reaktioon rotan • *.· polkuanturassa. Edeeman kertymistä seurattiin tietyin ajanjaksoin samoissa eläimissä, n = • · : * ·.: 6 kussakin aineiston pisteessä.

• 4

Kuvio 16. Karrageenanin rotan polkuanturalle aiheuttaman reaktion kaksivaiheisen luonteen osoittaminen, n = 5 kussakin aineiston pisteessä. Anestesia-aineena käytettiin eetteriä. 30 Kuvio 17(A - B). MAIF, annettuna joko 5 mg rottaa kohti (A) tai 40 mg rottaa kohti (B) ei inhiboi karrageenanin aiheuttamaa tulehdusreaktiota eetterillä nukutetuissa rotissa, n = 4 kaikissa aineiston pisteissä.

8

Kuvio 18. Karrageenanin indusoiman turvotuksen kertymisen tukahduttaminen sekundäärisen, fagosyyttisten solujen välittämän reaktion aikana, reaktio 40 mg:aan MAIF:ia injektoituna intravenaalisesti karrageenan-altistuksen ajankohtana (aika 0). n = 12 kullekin aineiston pisteelle kontrolliryhmässä ja n = 10 kullekin aineiston pisteelle MAIF:illa käsitel-5 lyssä ryhmässä.

Kuvio 19. MAIF:in vaikutus, annettuna intravenaalisesti 4 mg kullekin rotalle eri aikoina, karrageenanin aiheuttamaan reaktioon rotan polkuanturassa. Kaikissa tapauksissa turvotusta arvioitiin 4 tunnin kuluttua altistuksesta, n = 12 kullekin aineiston pisteelle.

Kuvio 20. 20 mg:n MAIF:ia vaikutus injektoituna intravenaalisesti käänteisessä passii-10 visessa Arthusin reaktiossa. * = p < 0,01; ** = p < 0,05.

Kuvio 21. Vähenevien MAIF-annosten vaikutus neutrofiilien kykyyn kulkea ulos verisuonistosta ihon alle siirrostettuihin steriileihin sieniin. * = p < 0,01.

Kuvio 22. MAIF:in vaikutus, annettuna annoksena 20 mg kullekin rotalle, inhiboimaan tulehdussolujen kykyä kerääntyä ihon alle siirrostettuihin sieniin, annettuna siirrostuksen 15 ajankohtana tai aina 120 minuuttiin saakka siirrostuksen jälkeen. * = p < 0,01.

Kuvio 23. Tulehdukseen liittyvän solujen tihkumisen eteneminen ajan kuluessa ihon alle siirrostettuihin sieniin normaaleilla eläimillä.

Kuvio 24. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmisteiden vaikutus verihiutaleita aktivoivan tekijän (PAF) indusoimaan neutrofiilien takertumiseen pikkulaskimoihin.

20 Kuvio 25. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmisteiden vaikutus PAF:n indusoimaan neutrofiilien emigraatioon.

Kuvio 26. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmisteiden vaikutus PAF:n indusoimaan neutrofiilien virtaukseen pikkulaskimoiden läpi.

Kuvio 27. Neutrofiilien takertumisen kumoaminen anti-inflammatorista tekijää sisältävillä 25 valmisteilla. 27a osoittaa MAIF-valmisteen vaikutuksen (40 mg/rotta) vähentää PAF:in aiheuttamana reaktiona pikkulaskimoihin takertuvien neutrofiilien lukumäärää. 27b osoittaa MAIF-valmisteen vaikutuksen (40 mg/rotta) uusiin neutrofiili-endoteelisoluadheesioihin. Kuvio 28. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmisteiden vaikutus neutrofiilien liikkuvuuteen pikkulaskimoissa.

30 Kuvio 29. Anti-inflammatorista tekijää sisältävien valmisteiden vaikutus punasolujen liikkuvuuteen pikkulaskimoissa.

Kuvio 30. Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus leukosyyttien virtaukseen pikkulaski- moissa.

9

Kuvio 31.40 mg:n MAIF-valmistetta vaikutus, annettuna intravenaalisesti, kiertävien neutrofiilien ja lymfosyyttien lukumäärään 24 tunnin kuluessa injektion jälkeen.

5 Kuvio 32. Annos-vaste-suhde MAIF-valmisteen intravenaalisen annon ja kiertävien leukosyyttien lukumäärän välillä (p < 0,01).

Kuvio 33(A - E). Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus lymfosyyttien toiminnan eri näkökohtiin. 33a osoittaa tekijän aikaisemman annon vaikutuksen isännän T-lymfosyyttien reaktioon vieraisiin histokompatibiliteettiantigeeneihin. 33b osoittaa tulokset, jotka saatiin 10 kun MAIF:illa käsitellyistä rotista peräisin olevia lymfosyyttejä injektoidaan käsittelemättömiin rottiin. 33C ja 33D osoittavat MAIF-käsittelyn vaikutuksen pernan painoon ja pernasolujen lukumäärään rotissa. 33E osoittaa MAIF-käsittelyn vaikutuksen konkanavaliini-A:lla stimuloituun lymfosyyttien mitogeeniseen reaktioon.

Kuvio 34. Infektion indusoiman turvotuksen tukahduttaminen 40 mg:lla MAIF:ia injektoi-15 tuna intravenaalisesti. Kahden ryhmän keskiarvot olivat: kontrollit, 87 ± 22 μΐ, MAIF, 45 ± 17 μΐ; p<0,01.

Kuvio 35. Intravenaalisesti kullekin rotalle annetun 40 mg.an MAIF: ia vaikutus bakteerien replikaatioon ja ihon alle siirrostettuihin, E. colilla infektoituihin sieniin.

Kuvio 36(A · B). MAIF:in (40 mg kullekin rotalle, intravenaalisesti) vaikutus tulehdusso-20 lujen tihkumiseen infektoituihin sieniin.

Kuvio 37. MAIF: in vaikutus (40 mg kullekin rotalle, intravenaalisesti) tulehdusnesteen kertymisen välivaiheen (4 -16 tuntia) estämiseen E. colilla infektoiduissa sienissä.

Kuvio 38.40 mg:n MAIF:ia vaikutus, annettuna intravenaalisesti altistusajankohtana ja 48 tuntia myöhemmin, kokeellisen pyelonefriitin patogeneesiin. Katkoviiva vasemmanpuolei-25 sessa kaaviossa edustaa munuaisten keskimääräistä painoa (tausta). * =p<0,01; ** =p<0,02. Kuvio 39. Standardoidun hyperimmuuni- ja kontrolli-MAIF:in vertailu. Standardoiduilla menetelmillä valmistetun MAIF:in kyky inhiboida neutrofiilien kulkeutumista tulehdus-kohtaan testattiin annoksina 0,5,1,5,3,5 ja 8 mg/120 - 150 g painava naarasrotta. Viittaus "kaupallinen" tarkoittaa kaupasta ostettua kuoritusta maidosta valmistettua maitojauhetta. 30 Kuvio 40. MAIF:in ja muiden maidon aineosien vertailu. Standardoidun, hyperim- muunimaidosta valmistetun MAIF:in aktiivisuutta verrattiin siaalihapon ja oroottihapon 10 aktiivisuuteen, maidon tunnettujen aineosien, joilla uskotaan olevan anti-inflammatorista aktiivisuutta.

Kuvio 41. Hyperimmuunimaidosta peräisin olevan standardoidun MAIF:in ja anti-inflam-matoristen lääkkeiden (indometasiini ja aspiriini) vertailu.

5 Kuvio 42. DEAE:sta saadun MAIF:in koostumuksen analyysi kokoekskluusio-HPLC: llä. Kuvio 43. Kuivatun etyyliasetaattifraktion analyysi neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määrityksessä osoitti voimakasta MAIF-aktiivisuutta.

Kuvio 44(A - B). MAIF-yhdisteen analyysi heikon anionin vaihdon aminopropyylipyl-väässä ennen ja jälkeen uuton. "Ennen" (kuvio 44A) ja "jälkeen" (kuvio 44B) viittaavat 10 valmisteisiin ennen ja jälkeen orgaanisen partitiokromatografian. Huomaa reunuksen "A":n merkitsevä häviäminen kuvion 44B siirtyneessä eluutiokuviossa.

Yksityiskohtainen kuvaus edullisista suoritusmuodoista Tämä keksintö käsittää anti-inflammatorisen tekijän eristämisen ja puhdistamisen maidos-15 ta, ja mainitun tekijän käyttöä lääkkeiden valmistamiseksi annettavaksi eläimelle, tarkoituksena hoitaa anti-inflammatorisia häiriötiloja. Jollei toisin ilmoiteta, käytetään seu-raavia määritelmiä: Määritelmällä "maidon anti-inflammatorinen tekijä" tarkoitetaan tekijää, joka saadaan joko 20 hyperimmuunimaidosta tai normaalista lehmänmaidosta. Määritelmällä "olennaisesti puhdas maidon anti-inflammatorinen tekijä" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten anti-inflammatorista tekijää, joka eluoituu yhtenä symmetrisenä päähuippuna HPLC-kro-matografiassa suurimolekyylipainoisten aineiden poistamisen jälkeen (> 10,000 daltonia) ja pienimolekyylipainoisten negatiivisesti varautuneiden molekyylilajien eristämisen jäl-25 keen ioninvaihtokromatografialla. Määritelmällä "hyvin puhdistettu" tai "erittäin puhdas" tarkoitetaan anti-inflammatorista tekijää, jonka eluutiokuvio on samanlainen, vaikka ei välttämättä identtinen kuvion 44B eluutiokuvion kanssa, heikon anionin vaihdon amino-propyylipylväässä. Erityisen luonteenomaista tällaiselle eluutioprofiilille on reunuksen A (joka on nähtävissä kuviossa 44A) merkitsevä häviäminen, kuten nähdään kuvion 44B siir-30 tyneessä profiilissa. Sekä normaalimaitoa että hyperimmuunimaitoa voidaan prosessoida tässä kuvatuilla menetelmillä, jotta saadaan anti-inflammatorinen tekijä.

11 Määritelmällä "hyperimmuunimaito" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten maitoa, joka saadaan maitoa tuottavista eläimistä, joita on pidetty hyperimmuunitilassa; hyperimmunisaation yksityiskohdat kuvataan jäljempänä.

5 Määritelmällä "hera" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten maitoa, josta on poistettu kerma.

Määritelmällä "normaali maito" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten maitoa, joka saadaan maitoa tuottavista eläimistä tavanomaisilla keinoilla ja maitotalouden käytän-10 töj en mukaisesti.

Määritelmällä "maitoa tuottava eläin" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten nisäkkäitä, jotka tuottavat maitoa kaupallisesti käyttökelpoisina määrinä, edullisesti lehmiä, lampaita ja vuohia, edullisemmin maitotalouslehmiä, jotka kuuluvat sukuun Bos (nau-15 ta), erityisesti niitä rotuja, jotka antavat suurimmat saannot maitoa, kuten Holstein.

• · • · *·· · Määritelmällä "bakteeriantigeeni" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten lyofi- • · · * * * *. lisoitua valmistetta lämpötapetuista bakteerisoluista.

• · · • · • · • · ;·. 20 Määritelmällä "mikrokapseloitu muoto" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten • · · . ·: ·. polymeerisiä mikropartikkeleita, joihin kapseloidaan yksi tai useampi bakteeriantigeeni « · · annettavaksi maitoa tuottaville eläimille.

• · • · • · ♦ ♦ Määritelmällä "tulehdus" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten paikallista suo- : .*. 25 jaavaa reaktiota, jonka kudosten vaurioituminen tai tuhoutuminen nostaa esiin, ja joka pal-• · · · j’**: velee tuhoten, laimentaen tai eristäen sekä vaurioittavan aineen että vaurioituneen kudok- • mm . · ] ·. sen, j a j olle on akuutissa muodossa luonteenomaista klassinen kivun, kuumotuksen, punoi- • · · • · .·. : tuksen, turvotuksen ja toiminnan menetyksen sarja, ja joka histologisesti sisältää monimut- • ·· • · kaisen sarjan tapahtumia, joihin kuuluvat pikkuvaltimoiden, hiussuonten ja pikkulaskimoi-30 den laajeneminen, mihin liittyy lisääntynyt läpäisevyys ja veren virtaus, plasmaproteiineja sisältävien nesteiden tihkuminen ja leukosyyttien kulkeutuminen tulehduskohtaan.

12 Määritelmällä "hoito" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten sitä, että häiriötilan ja/tai häiriötilan patogeenisen syyn oireita voidaan helpottaa tai ne voidaan poistaa kokonaan.

5 Määritelmällä "antaa" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten mitä tahansa menetelmää yksilön hoitamiseksi aineella, kuten oraalisesti, intranasaalisesti, parenteraalisesti (intravenaalisesti, intramuskulaarisesti tai subkutaanisesti), tai rektaalisesti. Määritelmällä "eläin" tarkoitetaan tämän keksinnön tarkoituksia varten mitä tahansa elävää olentoa, joka on alttiina tulehdukselle, mukaanluettuna ihmiset, maatalouseläimet, kotieläimet tai eläin-10 tarhaeläimet.

Esimerkkejä tulehdustiloista, joita voidaan hoitaa tämän keksinnön mukaisella eristetyllä ja puhdistetulla maitotuotteella, ovat tilat, jotka valitaan joukosta, johon kuuluvat akuutti ja subakuutti limapussintulehdus (bursitis), akuutti epäspesifinen jännetulehdus (tendinitis), 15 systeeminen punahukka (lupus erythematosus), systeeminen ihon ja ihonalaiskudoksen . . tulehdustauti lihastulehduksineen (dermatomyositis), akuutti reumaattinen sydäntulehdus, • · · ’ * V rakkulaihottuma, rakkulainen ihotulehdus, rokahtumat, vakava punoitus, monimuotoinen *#·· : hilseilevä ihotulehdus, kirroosi, kausittainen monivuotinen nuha, keuhkoastma, • · • · ....: virhepaikkainen ihotulehdus (ectopic dermatitis), seerumisairaus, sarveiskalvontulehdus, !*·.. 20 silmän värikalvon tulehdus, diffuusi virtsatietulehdus, äänihuulen tulehdus, silmähermon tulehdus, silmän myötätulehdus, oireellinen sarkoidoosi, Löfflerin syndrooma, beryllium-myrkytys, hemolyyttinen anemia, nisätulehdus, kosketusihottuma, allerginen sidekalvontu- • · ; * · · lehdus, psoriasikseen liittyvä niveltulehdus, j äykistävä nikamatulehdus, akuutti kihti j a • · * *.: * vyöruusu. Lisäksi eristettyä ja puhdistettua maitotuotetta voidaan käyttää niiden yksilöiden ) 25 hoitoon, jotka altistuvat mahdollisille tulehduksen aiheuttajille.

• · · i : • · · :': *; Keksintö perustuu osaksi siihen havaintoon, että kun maitoa tuottava eläin, kuten nauta, • · : ’ *.: saatetaan erityiseen hyperimmunisaatiotilaan, eläin tuottaa maitoa, j ossa on supranormaalit tasot erittäin hyödyllistä anti-inflammatorista tekijää, joka paitsi tukahduttaa tulehduksen 30 oireita ihmisellä ja muilla eläimillä, on myös profylaktinen aine, joka ennakoi tulehdusta aiheuttavien aineiden läsnäoloa vastaanottajassa. Määritelmällä "supranormaalit tasot" tarkoitetaan tasoja, jotka ylittävät ei-hyperimmunisoitujen eläinten maidosta havaittavat tasot.

13

Immuuniherkkyyden induktio on yksin riittämätön aiheuttamaan MAIF:in supranormaalien tasojen esiintymisen maidossa, kuten se tosiseikka osoittaa, että normaali lehmänmaito ei sisällä näitä supranormaaleja tasoja, vaikka lehmät on herkistetty erilaisia antigeenejä vastaan normaalin immunisaation aikana lehmän sairauksia vastaan, ja ympäristön aiheutta-5 man normaalin altistuksen aikana. Maidossa on toivotut supranormaalit tasot ainoastaan erityisissä hyperimmuunitiloissa.

Tämä erityinen tila voidaan saavuttaa antamalla alkuimmunisointi, jota seuraavat ajoittaiset tehosteet, jotka sisältävät riittävän suuret annokset spesifisiä antigeenejä. Tehosteen edulli-10 sen annoksen tulisi olla yhtä suuri tai suurempi kuin 50 % annoksesta, joka on välttämätön saamaan aikaan primäärisen immunisaation naudalle. Näin ollen on olemassa tehosteannoksen kynnysarvo, jonka alapuolella maidossa ei tuoteta ominaisuuksia, vaikka lehmä on tilassa, jota normaalisti kutsuttaisiin immuunitilaksi. Jotta saavutettaisiin tarvittava hype-rimmuunitila, on olennaista testata hyperimmuunimaito ensimmäisen tehosteiden antosar-15 jän jälkeen. Jos maidossa ei ole näitä hyödyllisiä tekijöitä, annetaan lisätehosteita suurina annoksina, kunnes ominaisuudet ilmenevät maidossa.

Menetelmä supranormaalit tasot anti-inflammatorista tekijää sisältävän hyperim-muunimaidon tuottamiseksi on kuvattu yhtä aikaa vireillä olevassa US-patenttihakemuk-20 sessa, jonka sarjanumero on 580,382, hakemispäivä 11.9.1990, ja myös US-patenttihake-muksessa, jonka sarjanumero on 355,786, hakemispäivä 22.5.1989 (nykyisin US-patentti nro 5,106,618, jatkoa US-patenttihakemukselle, jonka sarjanumero on 069,139, hakemispäivä 2.7.1987) ja US-patenttihakemuksessa, jonka sarjanumero on 910,297, hakemispäivä 17.9.1986 (nykyisin US-patentti nro 4,919,929, jatkoa US-patenttihakemukselle 25 sarjanumerolla 576,001, hakemispäivä 1.2.1983); nämä kaikki sisällytetään tähän kirjallisuusviitteiksi kokonaisuudessaan. Yhteenvetona, yksi menetelmä supranormaalit tasot anti-inflammatorista tekijää sisältävän hyperimmuunimaidon valmistamiseksi käsittää seuraavat vaiheet: (1) antigeenin valinta; (2) naudan primäärinen immunisaatio; (3) seerumin testaus herkkyyden induktion varmistamiseksi; (4) hyperimmunisaatio tehosteilla 30 oikeilla annoksilla ja haluttaessa (5) maidon anti-inflammatoristen ominaisuuksien testaus; (6) maidon kerääminen hyperimmuuninaudasta ja (7) maidon prosessointi MAIF:in eristämiseksi.

14

Vaihe 1: Voidaan käyttää mitä tahansa antigeenejä tai antigeenien yhdistelmää. Antigeenit voivat olla bakteeri-, virus-, alkueläin-, sieni- tai soluantigeenejä tai mitä tahansa muita aineita, joihin maitoa tuottavan eläimen immuunijärjestelmä reagoi. Tämän vaiheen kriittinen kohta on siinä, että antigeenin (antigeenien) tulee kyetä, ei ainoastaan indusoimaan 5 immuuni- ja hyperimmuunitilat maitoa tuottavassa eläimessä, vaan myös tuottamaan supranormaalit tasot maidon anti-inflammatorista tekijää. Mitä tahansa antigeeniä voidaan käyttää tuottamaan tekijän supranormaalit tasot. Eräs edullinen rokote on sekoitus polyvalenttisista bakteeriantigeeneistä, jota kutsutaan Series 100 -rokotteeksi, ja joka on kuvattu yksityiskohtaisesti esimerkissä IA jäljempänä.

10

Vaihe 2: Antigeeni (antigeenit) voidaan antaa millä tahansa menetelmällä, joka aiheuttaa herkistymisen. Eräässä menetelmässä rokote, joka koostuu antigeenistä, joka on saatu 1 X 106 - 1 X 1020:stä, edullisesti 108 - 10IO:stä, edullisimmin 2 X 108:sta lämpötapetusta bakteerista, annetaan injektoimalla se lihakseen. Muita menetelmiä, kuten intravenaalinen in-15 jektio, intraperitoneaalinen injektio, peräpuikko tai oraalinen antotapa, voidaan kuitenkin käyttää.

• ♦ • · · ··· · « ♦ · ♦ 7*. Vaihe 3: On välttämätöntä määritellä, onko maitoa tuottava eläin herkistynyt antigeenille.

• * · • · ^ J Herkkyyden testaamiseksi on olemassa joukko menetelmiä, jotka ovat immunologian alan • · ; ·. 20 ammattilaisen tuntemia (Methods in Immunology and Immunochemistry, William, C. A. ja * · · Λ". Chase, W. M., Academic Press, New York, osat 1 -5 (1975)). Edullinen menetelmä on käyttää polyvalenttista rokotetta, joka käsittää monia bakteerilajeja antigeeninä, ja testata : ’ ·.. agglutinoivien vasta-aineiden läsnäolo eläimen seerumissa ennen j a j älkeen rokoteärsyk- • · · ί.ί : keen. Maidon vasta-aineiden ilmentyminen rokotteella immunisoinnin jälkeen osoittaa • 25 herkkyyttä; tässä pisteessä on mahdollista edetä vaiheeseen 4.

• M · • · · x : • · · . ·. ·. Vaihe 4. Tämä käsittää hyperimmuunitilan induktion ja ylläpidon herkistetyssä eläimessä.

• · * .'. j Tämä tehdään toistuvilla tehosterokotusten annoilla tiettyinä ajanjaksoina samalla polyva- • · lenttisella rokotteella, jota käytettiin primääriherkistyksen aikaansaamiseksi. Kahden vii-30 kon tehosteväli on optimaalinen polyvalenttisille bakteeriantigeeneille. On kuitenkin välttämätöntä varmistaa, ettei eläin joudu hyperimmuunitilasta immuunitoleranssin tilaan antigeenin suhteen.

15

Edullisessa suoritusmuodossa nautojen hyperimmunisaatio voidaan saada aikaan antamalla yksi mikrokapseloitu rokote, joka on valmistettu, kuten esimerkissä IB jäljempänä on kuvattu yksityiskohtaisesti. Etuna hyperimmunisaation antamisesta kontrolloidussa vapautu-mismuodossa on, että jatkuva altistuminen antigeenille varmistaa, että eläin pysyy hyper-5 immuunitilassa.

Vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa on myös mahdollista yhdistää eri immunisointi-menetelmiä, esim. antamalla samanaikaisesti mikrokapseloitua ja nestemäistä antigeeniä tai intramuskulaarinen anto primaari-immunisaatioksi ja tehosteannokset oraalisesti tai pa-10 renteraalisesti mikrokapseloituna. Alan ammattilaiset tuntevat primaarisen ja hyperimmunisaation monia eri yhdistelmiä.

Vaihe 5: On välttämätöntä testata maidosta anti-inflammatorisen aktiivisuuden tasot. Tämä voidaan tehdä millä tahansa tutkimustekniikalla, jolla testataan joko hyperimmuunimaidon 15 tai siitä johdettujen tuotteiden vaikutuksia tulehduksen jälkeen. Rotan käpälään kemialli- • · • · ···' : sesti indusoitu tulehdus on standardimääritys anti-inflammatorisille lääkkeille.

··* • · ·· • · • · · * · Vaihe 6: Tämä käsittää maidon keräämisen ja prosessoinnin. Maito voidaan kerätä talteen ····* • · tavanomaisilla tavoilla. Maidon prosessointi anti-inflammatorisen tekijän eristämiseksi on ... 20 kuvattu jäljempänä.

J * * : ·. Yksinkertaisin menetelmä anti-inflammatorisen tekij än eristämiseksi, puhdistamiseksi j a : * · ’ · testaamiseksi käsittää seuraavat vaiheet: * · « • · • · · • · »

• · · I

, * · ·. 25 1. poistetaan hyperimmuunimaidosta rasva, jotta tuotetaan kuorittua maitoa, ·*»* * • · • mm • · · ,*/; 2. poistetaan kaseiini kuoritusta maidosta, jotta tuotetaan heraa, • ·· 3. poistetaan ultrasuodattamalla herasta makromolekyylit, joiden molekyylipaino on suu-_ 30 rempi kuin noin 10,000 daltonia, 16 4. fraktioidaan vaiheesta 3 saatu tuote käyttämällä ioninvaihtohartsipylvästä, jotta eristetään negatiivisesti varautuneet anti-inflammatoriset molekyylilajit, joiden molekyylipaino on vähemmän kuin noin 10,000 daltonia, 5 5. erotellaan vaiheesta 4 saadut negatiivisesti varautuneet molekyylilaj it molekyylisiivilä- kromatografialla ja, 6. analysoidaan biologisesti vaiheesta 5 saatu anti-inflammatorinen tekijä.

10 Vaihtoehtoisessa edullisessa suoritusmuodossa ne fraktiot molekyylisiiviläkromatografias- ta, joilla on biologista aktiivisuutta, puhdistetaan vielä suodattamalla membraanin läpi, joka pidättää makromolekyylit, joiden molekyylipaino on suurempi kuin noin 5,000 daltonia.

Vielä eräs edullinen suoritusmuoto käsittää lisäksi MAIF:in lisäpuhdistuksen HPLC-ko-15 koekskluusiokromatografialla j a orgaanisella partitiouutolla.

7. Maidon tekijän anti-inflammatorinen vaikutus testataan turvotukseen, joka aiheutetaan injektoimalla karrageenan-liuosta rottien käpäliin. Rotan käpälätesti on standardinomainen eläinkoe anti-inflammatorisille lääkkeille. Winter, C. A., Risley, G. A., Nuss, A. W., 20 "Carrageenan-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-Inflammatory Drugs," Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 3: 544 (1967). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää keuhkopussin neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määritystä, kuten esimerkissä 24 on kuvattu. Vinegar et ai., "Some Quantitative Characteristics of Carrageenan-induced Pleurisy in the Rat," Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 143: 711 - 714 (1973); Ammendola, G. et 25 al., "Leukocyte Migration and Lysozomal Enzymes Release in Rat Carrageenan Pleurisy", Agents and Actions 5: 250 - 255 (1975); Vinegar, R. et al., "Quantitative Studies of the Pathway to Acute Carrageenan Inflammation.", Fed. Proc. 35: 2447 - 2456 (1976). Joukkoa muita testejä voidaan käyttää. Wetnick, A. S. ja Sabin, C, "The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalo-30 myelitis in Rats," Jap. J. Pharm. 22: 741 (1972). Rotan käpälätesti on kuitenkin yksinkertaisin ja suorin saatavilla olevista testeistä, ja sen on osoitettu olevan tyydyttävä kaikille anti-inflammatorisille lääkkeille. Tämä testi on kuvattu yksityiskohtaisesti Beckin US-patentissa 17 4,284,623, joka sisällytetään tähän viitteeksi siinä määrin kuin se kuvaa rotan käpälätestiä. Lyhyesti sanottuna testissä injektoidaan pieni määrä karrageenania täysikasvuisten valkoisten rottien jalan polkuanturaan. Tämän tiedetään indusoivan tulehdusreaktion. Tästä seurannut turvotuksen määrä voidaan kvantifioida. Anti-inflammatorisen tekijän sisältävät 5 näytteet annetaan rotalle sopivaa reittiä, edullisesti injektoimalla intraperitoneaalisesti, ja tulehdusreaktion estymisen tai parantumisen määrä mitataan joko volumetrisilla tai gravi-metrisilla menetelmillä.

Yhteenvetona voidaan sanoa, että anti-inflammatorinen tekijä voidaan eristää hyperim-10 munisoidusta maidosta menetelmän mukaisesti, j ossa poistetaan maidosta rasva, poistetaan kaseiini, poistetaan makromolekyylit, jotka ovat suurempia kuin 10,000 daltonia ja jatketaan ioninvaihto-ja molekyylisiiviläkromatografialla. Anti-inflammatorisen tekijän sopivien valmisteiden biologinen aktiivisuus voidaan testata tekemällä annos-vaste-koe rotilla, kuten tässä on kuvattu.

15 . . Vielä eräässä tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa hyperimmunisoidussa mai- • · • · · * 1 V dossa oleva anti-inflammatorinen tekij ä puhdistetaan käyttämällä yhdistelmää vaiheista, *12. joihin kuuluvat: suodatus membraanilla, joka kykenee erottelemaan molekyylejä niiden • · « · .,..: molekyylipainoj en perusteella, ioninvaihtokromatografia, molekyylisiiviläkromatografia j a • · Λ 20 affiniteettikromatografia (esimerkki 15). Edullinen ensimmäinen vaihe käsittää edellä ku-j 1 · ‘; vatulla tavalla tuotetun hyperimmuunimaidon suodattamisen membraanin läpi, joka pidät- tää molekyylit, joiden molekyylipainot ovat noin 10,000 daltonia tai enemmän. Membraa- • · • ’·· nin läpi kulkenut materiaali (ts. suodos tai läpäissyt materiaali) kerätään talteen ja sitä käy- • t · V ; tetään lisäpuhdistusvaiheissa. Välineet ja membraanit tällaisten suodatusten suorittamiseksi : 25 ovat alalla hyvin tunnettuja.

• « « · • « · t : ··« . V. Edullinen vaihe suodatuksen j älkeen on ioninvaihtokromatografia anioninvaihtaj alla. Vaih- • · 1 ·. · tajien, joissa on dietyyliaminoetyyliryhmiä, on havaittu toteuttavan hyviä erotteluja, mutta 2 • · on oletettavaa, että muita anioninvaihtaj ia voitaisiin käyttää yhtä hyvin. On edullista, että 30 ioninvaihtajan kiinteä kantaja kykenee pitämään yllä suuria virtausnopeuksia. Sepharosen on havaittu olevan sopiva tähän tarkoitukseen.

18

Edullinen vaihe ioninvaihtokromatografian jälkeen on geelisuodatuskromatografia. Tämän vaiheen pylvääseen tulisi valita täyte, joka kykenee fraktioimaan molekyylejä, joiden mole-kyylipainot ovat vähemmän kuin 10,000 daltonia. Edullinen täyte on Toyopearl HW-40 (Rohm and Haas), mutta muita alalla hyvin tunnettuja täytteitä voitaisiin käyttää yhtä hy-5 vin. Esimerkkejä muista täytteistä, joita voitaisiin käyttää, ja jotka ovat kaupallisesti saatavilla, ovat polymeerisiin hiilihydraatteihin perustuvat täytteet, esim. Sephadex G-10 tai G-25 (Pharmacia) tai polyakryyliamidiin perustuvat täytteet, esim. Biogel P-2, P-4, P-6, P-10 tai P-30 (Bio-Rad).

10 Edullinen vaihe geelisuodatuskromatografian jälkeen on affiniteettikromatografia boronaattiaffiniteettikantajalla. Näiden kantajien on havaittu olevan tehokkaita fraktioimaan alhaisen molekyylipainon omaavia yhdisteitä, joissa on cis-dioliryhmiä. Edullinen kantaja on AffiGel 601 (Bio-Rad). Tämä on polyakryyliamidigeelisuodatuskantajan Bio-Gel P-6 (jota Bio-Rad myy myös) boronaattijohdannainen.

15 . . Edullinen säilytystapa valmisteille ioninvaihto-, geelisuodatus- tai affiniteettikromatogra- • · • < » *'V fiavaiheiden jälkeen on lyofilisoituna jauheena. Ensimmäisestä puhdistusvaiheesta kerätty , *. : suodos voidaan säilyttää jääkaapissa ennen sen käyttöä. Puhdistuksen tuloksena saadun • · • · anti-inflammatorisen tekijän aktiivisuus voidaan määrittää käyttämällä edellä kuvattua ro- j’*(i 20 tankäpälätestiä.

·«« • · · ♦ · · «

Vielä eräässä tämän keksinnön edullisessa suoritusmuodossa hyperimmunisoidussa mai- • · • *·· dossa oleva anti-inflammatorinen tekijä puhdistetaan analyyttisesti tai preparatiivisesti ··· '.· · käyttäen vaiheiden yhdistelmää, johon kuuluvat: ultrasuodatus membraanilla, jonka mole- | j': 25 kyylipainon katkaisuraja (cut-off) on 10,000 daltonia, ioninvaihtokromatografia, kokoeks- i>>t! kluusiokromatografia preparatiivisessa HPLC-kolonnissa ja orgaaninen partitiouutto.

* • · ♦ * · • · t V ·

Edullisessa ensimmäisessä vaiheessa suuri tilavuus (esim. 90 litraa kuorittua maitoa) vie- • · dään 10,000 daltonin katkaisurajan omaavan ultrasuodatusmembraanin läpi. Saatu perme-30 aatti (<10K-permeaatti) kerätään lisäpuhdistusvaiheita varten.

19

Edullinen vaihe edellä esitetyn ultrasuodatuksen jälkeen on lisätä suuri tilavuus (esim. 60 litraa) permeaattia aikaisemmasta vaiheesta ioninvaihtopylvääseen. Eluaatti voidaan sitten lyofilisoida. Dietyyli-aminoetyyli (DEAE) -Sepharose Fast Flow -vaihtohartsin on havaittu toteuttavan hyvän erottelun.

5

Edullinen vaihe edellä esitetyn ioninvaihtokromatografian jälkeen on lisätä preparatiiviseen HPLC-kolonniin suuri määrä (esim. 100 mg) puhdistettua, ioninvaihtopylväästä saatua valmistetta. Jopa suuremmat määrät voidaan saada erottamalla monta näytettä, joista kukin on 100 mg, HPLC-kolonnissa ja keräämällä ne samaan koeputkisaijaan. Koeputket voidaan 10 sitten yhdistää ja lyofilisoida niiden sisältö.

Seuraava edullinen vaihe on orgaaninen partitiouutto, joka edellyttää, että otetaan 50 -100 mg lyofilisoituja HPLC-kolonnin näytteitä, ja uutetaan ne n-heksaanilla neutraalien lipidien poistamiseksi, tehdään happamaksi ja sen jälkeen uutetaan uudelleen etyyliasetaatilla.

15 Valmisteen analyysi heikon anionin vaihdon aminopropyylipylväässä ennen ja jälkeen or- . . gaanisen partitiouuton on esitetty kuviossa 44.

* t · *·· · • » * ; Esimerkissä 16 kuvattujen kokeiden tulokset osoittavat, että eläinten esikäsittely anti-in- « * ·..·{ flammatorisen tekijän sisältävillä valmisteilla vähentää verihiutaleita aktivoivan tekijän Γ ·.. 20 (P AF) stimuloimaa neutrofiilien takertumista endoteelisoluihin, j otka reunustavat t V: pikkulaskimoita, j a vähentää nopeutta, j olla neutrofiilit poistuvat pikkulaskimoista. Lisäksi tekijän valmisteiden antamisen sen jälkeen, kun eläimet oli käsitelty PAFilla, havaittiin 4 · : '· · vähentävän endoteelisoluihin tarttuvien neutrofiilien lukumäärää. Siinä määrin kuin poti- *. ’ : laat tai eläimet voivat hyötyä näistä vaikutuksista, tämä keksintö kattaa anti-inflammatori- « : j 25 sen tekijän sisältävien valmisteiden käytön. Tämä pitää paikkansa riippumatta kulloinkin * φ f kyseessä olevasta erityisestä sairaudesta. Samoin esimerkin 16 tulokset osoittavat, että anti-j V; inflammatorinen tekijä saa aikaan vaikutuksensa tarttumiseen ja soluista poistumiseen ole- J \ i maila suoraan vuorovaikutuksessa solujen pinnan CD 18-antigeenien kanssa ja estämällä muiden molekyylien vuorovaikutuksen tämän glykoproteiinikompleksin kanssa. Tämä 30 keksintö sisältää anti-inflammatorisen tekijän valmisteiden käytön yhtä hyvin tähän tarkoitukseen.

20

Kuten esimerkissä 18 on esitetty, anti-inflammatorisen tekijän valmisteiden antaminen eläimille suppressoi isännän reaktiota siirrännäistä vastaan, mutta ei siirrännäisen reaktiota isäntää vastaan, ja aiheuttaa pernan painon nousua ja pernan lymfosyyttien lukumäärän kasvua. Valmisteen havaittiin myös estävän lymfosyyttien reaktiota konkanavaliini A:han. 5 Nämä tulokset osoittavat, että anti-inflammatorinen tekijä on hyödyllinen inhiboimaan kudoksia tuhoavia infektioprosesseja ja tilanteissa, joissa lymfosyyttien toiminnan suppres-sio on toivottavaa.

Kuten kuviossa 43 on esitetty, MAIF:in suolanpoisto (saavutetaan orgaanisella partitiouu-10 tolia) johtaa puhdistumisen parantumiseen dramaattisesti, mitä osoittaa niin paljon kuin 10,000 kertaa pienemmän MAIF-annoksen tarve, jotta saavutetaan samanlaiset rotan keuh-kopussin leukosyyttien kulkeutumisen inhibition tasot.

Tämän keksinnön mukaiset koostumukset voidaan antaa millä tahansa tavalla, joka tarjoaa 15 käyttöön anti-inflammatorisen aktiivisuuden. Antotapa voi olla esimerkiksi parenteraali-, , nen, subkutaaninen, intravenaalinen, intramuskulaarinen, intraperitoneaalinen tai oraalinen.

ft m » * · ·*« · ft ••ft ft ,**.”· Oraalisen antotavan kiinteisiin annosmuotoihin kuuluvat kapselit, tabletit, pillerit, jauheet • · « « ja jyväset. Tällaisissa kiinteissä annosmuodoissa aktiivinen yhdiste sekoitetaan vähintään .‘ f 20 yhden inertin laimennusaineen, kuten sakkaroosin, laktoosin tai tärkkelyksen kanssa. Täi- ft j':': laiset annosmuodot voivat myös käsittää, kuten on normaali käytäntö, muitakin aineita kuin inertin laimennusaineen. Kapseleiden, tablettien ja pillerien tapauksessa annosmuodot ft · • ’ ·. voivat käsittää myös puskurointiaineita. Tabletit ja pillerit voidaan lisäksi varustaa suolessa * ftft V : liukenevalla päällystyksellä, ί 25 4 · « 4rJ 4 ft· · i>i(! Nestemäisiin annosmuotoihin oraalista antoa varten kuuluvat farmaseuttisesti hyväksyttä- . V. vät emulsiot, liuokset, suspensiot, siirapit j a eliksiirit, j otka sisältävät inerttej ä laimennusai- 4 f ;'«. · neita, joita käytetään tavallisesti farmasian alalla. Paitsi inerttejä laimennusaineita, tällaiset t · koostumukset voivat sisältää myös adjuvantteja, kuten kostutusaineita, emulgointi- ja sus-3 0 pendointiaineita j a makeutusaineita.

21 Tämän keksinnön mukaisiin parenteraalista antoa varten oleviin valmisteisiin kuuluvat steriilit vesipitoiset tai vedettömät liuokset, suspensiot tai emulsiot. Esimerkkejä vedettömistä liuottimista tai vehikkeleistä ovat propyleeniglykoli, polyetyleeniglykoli, kasviöljyt kuten oliiviöljyjä injektoitavat orgaaniset esterit kuten etyylioleaatti.

5

Aktiivisten aineosien annos tämän keksinnön mukaisessa koostumuksessa voi vaihdella; on kuitenkin välttämätöntä, että aktiivisen aineosan määrä on sellainen, että saadaan sopiva annosmuoto. Valittu annosmuoto riippuu halutusta terapeuttisesta vaikutuksesta, antotavasta ja hoidon kestoajasta.

10

Annettava annos ja annon toistumistiheys riippuu potilaan iästä ja yleisestä terveydentilasta, ottaen huomioon mahdolliset sivuvaikutukset. Anto riippuu myös samanaikaisesta hoidosta muilla lääkkeillä ja potilaan siedosta annetulle lääkkeelle.

15 Nyt kun keksintö on kuvattu yleisesti, se tullaan kuvaamaan vielä tiettyjen erityisten esimerkkien yhteydessä, jotka tarjotaan tässä ainoastaan tarkoituksessa selvittää keksintöä, ja ψ · • · :·· · joiden ei tarkoiteta rajoittavan keksintöä, jollei toisin esitetä.

• · · ···· • · • ·. ·

* ; Esimerkki 1 A

• · .. 20 S-100-rokotteen valmistus • · • · ·

Taulukossa 1 esitetyn joukon bakteereja, jotka oli saatu talletuslaitoksesta the American • · ·

Type Culture Collection, sisältävä bakteeriviljelmä elvytettiin sekoittamalla siihen 15 ml |‘.f ravintoalustaa ja sitä inkuboitiin yli yön 37 °C:ssa. Kun oli saavutettu hyvä kasvu, noin « ; 1; 1; puolet bakteerisuspensiosta käytettiin yhden litran nestemäistä alustaa siirrostamiseen ja ♦ : 25 inkuboitiin ymppiä 37 °C:ssa. Jäljelle jäänyt suspensio siirrettiin steriileihin glykoliputkiin • ♦ · ♦ · ♦ · .1··. ja varastoitiin -20 °C:seen jopa kuudeksi kuukaudeksi.

• · · · • · · • · · • · . ·. : Kun viljelmässä oli nähtävissä hyvä kasvu, bakteerisolut kerättiin talteen sentrifugoimalla • ·· 9 9 suspensiota 20 minuuttia ravintoalustan poistamiseksi. Saatu bakteeripelletti suspendoitiin 30 uudelleen steriiliin suolaliuokseen ja bakteerinäyte sentrifugoitiin kolme kertaa ravinto- alustan pesemiseksi soluista. Kolmannen steriilin suolaliuospesun jälkeen sentrifugoimalla saatu pelletti suspendoitiin uudelleen pieneen määrän kaksi kertaa tislattua vettä.

22

Ravintoalustasta puhdas bakteerisuspensio lämpötapettiin laittamalla suspensio lasipullossa 80 °C:een vesihauteeseen yöksi. Nestemäisen viljelmän elinkykyisyys testattiin pienellä määrällä lämpötapettuja bakteereita. Nestemäistä ravintoalustaa siirrostettiin lämpötape-tuilla bakteereilla, inkuboitiin 37 °C:ssa viisi vuorokautta ja tarkastettiin päivittäin kasvu, 5 koska bakteerien täytyi olla tapettuja käytettäväksi rokotteessa.

Lämpötapettuja bakteereja lyofilisoitiin, kunnes ne olivat kuivia. Kuivat bakteerit sekoitettiin sitten steriilin suolaliuoksen kanssa konsentraatioon 2,2 x 108 bakteerisolua/ml suolaliuosta (1,0 optinen tiheyslukema 660 nm: 11a).

10 i=__======_=^==_=^============_i

_TAULUKKO 1_ S-100 B AKTEERILUETTELO

Nimi Alusta Gram + ATTC

tai - nro 1. Staph, aureus BHI + 11631 2. Staph, epidermidis__BHI__+_ 155 15 3. Strep, pvogenes. A. tyyppi 1__APT__+__8671 ;.· · 4. Strep, pvogenes. A. tyyppi 3 APT + 10389 5. Strep, pvogenes. A. tyyppi 5 APT + 12347 *· j 6. Strep, pvoeenes. A. tyyppi 8__APT__+__12349 .. 7. Strep, pvogenes. A. tyyppi 12 APT + 11434 • · · 20 8. Strep, pvoeenes. A. tyyppi 14 APT + 12972 9. Strep, pvogenes. A. tyyppi 18__APT + 12357 ·*·.. 10. Strep, pvogenes. A. tyyppi 22 APT + 10403 :l : 11. Aerobacter aerogenes BHI - 884 • 12. Escherichia coli BHI - 26 25 13. Salmonella enteritidis BHI - 13076 • · · 14. Pseudomonas aeruginosa BHI - 7700 15. Klebsiella pneumoniae__BHI__-_ 9590 16. Salmonella tvphimurium__BHI__-__13311 17. Haemophilus influenzae BHI - 9333 30 _l_81S^gs=aiik__APT__+__6249 23 19. Proteus vulgaris__BHI__-__13315 20. Shigella dvsenteriae__BHI__-__11835 21. Diplococcus pneumoniae__APT__+__6303 22. Propionibacter acnes__Liemi__+__11827 5 23. Strep, sanguis__APT__+__10556 24. Strep, salivarius__APT__+__13419 25. Strep, mutans__BHI__+__25175 26. Strep, asalactiae__APT +__13813

sssssaaasBsssassssBssssssBsss=sss=a:B:^=s^ss=ass8B

10

Lehmille annettiin päivittäisinä injektioina 5 ml erät polyvalenttista nestemäistä rokotetta. Injektoidun karjan vasta-aine (IgG) -tiitteritasot määritettiin määräajoin käyttämällä entsyymiin liitettyä immunoanalyysiä naudan vasta-aineelle polyvalenttista antigeeniä vastaan.

15 * Esimerkki 1B ··· · ··· Immunisointimenetelmät ···· • · '·/ : Lämpötapetut bakteent valmistettiin edellä kuvatulla tavalla. Saatu polyvalenttinen anti- *: : geeninäyte (S-100) mikrokapseloitiin tavanomaisella faasierottelumenetelmällä polyvalent- • · : *·* 20 tisen antigeenin sisältävän mikropartikkelituotteen valmistamiseksi. Antigeenin sisältävät • · · • · · *·* ’ muotoillut matriisimateriaalit muodostetaan yleisesti biologisesti yhteensopivien materiaalien polymeereistä, edullisesti biologisesti hajoavista tai biologisesti erodoituvista materi- • · • · · *... aaleista, edullisesti polymaitohaposta, poly glykolihaposta, maito- j a glykolihappoj en kopo- • · · • · · lymeereistä, polykaptolaktonista, kopolyoksalaateista, proteiineista, kuten kollageeni, gly- • · * · · • ·: : 25 serolin rasvahappoestereistä j a selluloosaestereistä. Nämä polymeerit ovat alalla hyvin tun- • · ·”* nettuja ja niitä on kuvattu esimerkiksi US-patentissa 3,773,919, US-patentissa 3,887,699, • t *.·.· US-patentissa 4,118,470 ja US-patentissa 4,076,798, jotka kaikki liitetään tähän kirjaili- · • · · *· " suusviitteiksi. Käytetty polymeerimatriisimateriaali oli biologisesti hajoavaa laktidi-glyko- lidikopolymeeriä.

30 24 Lämpötapetut bakteeriantigeenit kapseloidaan tällaisiin matriisimateriaaleihin, edullisesti mikropallosina, joiden läpimitta on välillä 1 - 500 mikronia, edullisesti 10 - 250 mikronia. Kapselointimenetelmät ovat tavanomaisia ja käsittävät faasierottelumenetelmiä, jakopinta-reaktioita ja fysikaalisia menetelmiä. Voidaan käyttää monia matriisien yhdistelmiä ja mo-5 nia konsentraatioita valikoiduista antigeeneistä, jotta saadaan aikaan bakteeriantigeenien optimaaliset vapautumistasot isännän kehoon mikropartikkeleista. Nämä yhdistelmät voi alan ammattilainen määritellä ilman kohtuutonta kokeiden tekoa.

Esimerkin mikropartikkelit olivat läpimitaltaan vähemmän kuin 250 mikronia. Noin 750 10 mg mikropartikkeleita, jotka sisälsivät 22 % (16,5 mg) polyvalenttista antigeeniä, suspen-doitiin sitten noin 3 cm3:iin vehikkeliä (1 painoprosentti Tween 20:ta ja 2 painoprosenttia karboksimetyyliselluloosaa vedessä).

Pieni joukko nautakarjaa valittiin suuremmasta karjalaumasta. Viisi näistä umpimähkään 15 valituista naudoista valittiin kontrolleiksi. Neljään nautaan injektoitiin intramuskulaarisesti mikropartikkeleita, jotka sisälsivät polyvalenttista antigeeniä. Mikropartikkelinäytteet steri- • · • · ··· : loitiin 2,0 mRad:lla gammasäteilyä. Vasta-aine (IgG) -tiitteritasot määritettiin määräajoin • · · lehmänmaitonäytteistä, jotka saatiin siirrännäisen saaneista lehmistä, samoin kuin kontrol- • · · • · ' | lilehmistä.

.! ’ 20 • · • It

Esimerkki 2 • · · MAIF-tekijän eristäminen hyperimmunisoidusta maidosta • * · Vaihe 1: Maitosuodoksen valmistus * ·« : ’: ‘: Kaksikymmentä litraa tuoretta maitoa hyperimmunisoiduista lehmistä ajettiin kermasepa- : 25 raattorin läpi (DeLaval malli 102) rasvan poistamiseksi.

• · · • · · · • · · : : • · · .. |# Jäljelle jäänyt kuusitoista litraa kuorittua maitoa ultrasuodatettiin suurimolekyylipainoisten • · « • · : molekyyliluokkien (yli 10,000 daltonia) poistamiseksi käyttämällä onttokuitudiasuodatta- • · · • · jaa/konsentroijaa (amicon DL-10L). Konsentroija on varustettu kahdella 10,000 daltonin 30 molekyylipainon cut-off-patruunalla (Amicon H5PI(M3). Kuorittu maito ajettiin pumpun nopeudella 80 mittarissa ja sisääntulo-ja ulostulopaineella 210 Kpa ja vastaavasti 170 Kpa.

Kaksitoista litraa suodosta (< 10,000 daltonia), joka tuli ulos patruunoista virtausnopeudel la neljä litraa tunnissa, jäädytettiin tai lyofilisoitiin varastointia varten ja lisäpuhdistusta varten.

25 5 Vaihe 2: ionmvaihtokromatografia

Maidon anti-inflammatorinen tekijä suodoksessa eristettiin ensin anioninvaihtopylväässä.

Tässä menettelytavassa käytettiin DEAE-Sepharose CL-6B-geeliä (Pharmacia) pakattaessa 5 x 10 cm lasipylvästä, joka tasapainotettiin steriilillä kahteen kertaan tislatulla vedellä, pH 10 7,0.

Yksi litra suodosta (< 10,000) lisättiin pylvääseen ja eluoitiin steriilillä kahteen kertaan tislatulla vedellä, pH 7,0 virtausnopeudella 160 ml tunnissa. Kerättiin kymmenen millilit-ran fraktioita ja seurattiin niitä 280 nm:ssä LKB:n Uvicord 4700 absorptiometrillä, josta 15 optinen tiheys tulostettiin siihen yhdistetyllä piirturilla (Pharmacia REC-482).

• · • · : Anti-inflammatorisen tekijän lisäksi muut aineet, joilla on positiivisia ja neutraaleja va- • · · *; · \ rauksia, eivät sitoudu DEAE-Sepharose-geeliin. Ne eluoituvat läpivirtaavassa huipussa (en- • · · « · * ! simmäinen huippu). Anti-inflammatorinen tekijä, jolla on negatiivinen varaus, pidättäytyy • · .. 20 geelissä.

• 1 ♦ · • · · • · · • · ·

Tekijän eluoimiseksi pylvästä eluoitiin portaittaisella gradientilla käyttäen steriiliä fysiolo- gista suolaliuosta, pH 7,0. Tyypillinen profiili on esitetty kuviossa 1. Yksittäisten fraktioi- :1·1: den bioanalyysi osoitti, että toinen huippu sisältää tekijän. Toisen huipun ja sen reunukset : .·. 25 käsittäviä fraktioita käytetään lisäpuhdistuksessa. Saantotutkimukset osoittavat, että tällä • · · ♦ ♦ · · ,1··. menetelmällä saatiin 8,8 grammaa kuivattua jauhetta.

··· · • · · » · · • · .·. : Vaihe 3: geelisuodatuskromatografia • · · • ·

Vaiheesta 2 saatu toinen huippu sisältää anti-inflammatorisen tekijän ja muita negatiivisesti 30 varautuneita molekyylejä, sen vuoksi tarvittiin vielä lisäjalostusvaihe. Jotta saavutettaisiin parempi puhtaus, on tarkoituksenmukaista käyttää geelisuodatuspylvästä eri komponenttien erottamiseksi molekyylipainon perusteella.

26 Tässä prosessissa pakattiin Sephadex G-10-hartsia (Pharmacia) 2,5 x 80 cm:n lasipylvää-seen ja tasapainotettiin se steriilillä kaksi kertaa tislatulla vedellä, pH 7,0. Kaksi grammaa toista fraktiota vaiheesta 2 liuotettiin uudelleen steriiliin kahteen kertaan tislattuun veteen ja lisättiin pylvään päälle. Pylvästä eluoitiin virtausnopeudella 30 ml tunnissa. Kerättiin 5 fraktiot (3,3 ml) ja seurattiin niitä 254 nm:ssä ja 280 nm:ssä (Pharmacia Duo Optical Unit), josta optinen tiheys tulostettiin siihen yhdistetyllä piirturilla (Pharmacia REC-482).

Eluutioprofiilissa näkyi tyypillisesti 3 huippua, kuten kuviossa 2 on esitetty. Ensimmäinen ja toinen huippu sisälsivät anti-inflammatorisen aktiivisuuden.

10

Ensimmäinen huippu on aktiivisen tekijän sisältävä aggregaatti, joka muodostuu G-10-pyl-vääseen.

Toinen huippu sisältää tekijän ei-aggregoituneen muodon. Sekä aggregaattimuoto (huippu 15 1) että ei-aggregaattimuoto (huippu 2) ovat biologisesti aktiivisia eläinkokeessa rotilla.

• · • · : Esimerkki 3 • · · ·;·\ Maidon anti-inflammatorisen tekijän karakterisointi i t · • · ’ I Edellä kuvatulla menetelmällä valmistetun tekijän ei-aggregoituneen muodon molekyyli- • · .. ^ 20 painon havaittiin olevan vähemmän kuin 10,000 daltonia. Tämä pääteltiin siitä tosiseikasta, . ·: ·. että ensimmäinen vaihe tekij än eristämisessä herasta oli ultrasuodatus käyttäen membraa- • · · nia, joka ei salli > 10,000 daltonin molekyylipainoisten molekyylilajien läpikulkua.

• · * · « · · : * ·': Tekijällä on negatiivinen varaus. Tämä määritettiin lisäämällä maidon ultrasuodosta • _ _ : 25 DEAE-selluloosaioninvaihtopylvääseen. Anti-inflammatorinen aktiivisuus ei eluoitunut a · · ··· · pylväästä vedellä. Eluointiliuoksen vaihtaminen natriumkloridiksi (0,9 % pH) aiheutti usei- • · · den huippujen eluoitumisen (kuvio 1). Neutraalisti ja positiivisesti varautuneet molekyyli- • · · • · . ·. : lajit eivät kiinnity ioninvaihtohartsiin ja negatiivisesti varautuneet molekyylilajit eluoituvat • ·· • · lisäämällä suolakonsentraatiota. Kun läpäissyt pienempien kuin 10,000 daltonin molekyyli-30 painoisten osuus lisättiin DEAE-pylvääseen, neutraalit suolat ja sokerit eluoituivat veden kanssa (huippu 1, kuvio 1). Kolme erillistä huippua eluoitui, kun puskuri vaihdettiin suolaliuokseksi (huiput 2 - 4). Toinen huippuja sen reunus sisälsivät anti-inflammatorisen bio- logisen aktiivisuuden kokeessa rotilla. Näin ollen on päätelty, että tekijällä on negatiivinen varaus.

27

Tekijän toinen kemiallinen ominaisuus on se, että se muodostaa aggregaatin suolanpoisto-5 menettelyn aikana. Tämä ominaisuus kävi ilmeiseksi kun läpäissyt < 10,000 daltonin mole-kyylipainoinen osuus laitettiin Sephadex G-10 -pylvääseen, pylväs tasapainotettiin kahteen kertaan tislatulla vedellä ja eluoitiin vedellä pH:ssa 7 (kuvio 2). G-10-pylväästä eluoitui kolme huippua; ensimmäinen huippu eluoitui välisijatilavuuden kanssa, antaen olettaa molekyylipainon olevan 10,000 daltonia tai enemmän. Tämä oli odottamatonta, koska suu-10 remmat kuin 10,000 daltonin molekyylit oli poistettu aikaisemmin tästä näytteestä ult- rasuodatuksella. Toinen huippu eluoitui asemassa, joka oli odotettavaa anti-inflammatori-selle tekijälle. Sekä ensimmäiset että toiset huiput osoittivat anti-inflammatorista biologista aktiivisuutta rotan käpälätestissä, kun taas kolmannesta huipusta puuttui aktiivisuus. Oli hämmästyttävää havaita, että sekä ensimmäisellä että toisella huipulla oli anti-inflammato-15 rista biologista aktiivisuutta. G-10-pylvään (vaihe 3) ensimmäisestä huipusta talteen otettu materiaali lyofilisoitiin ja lisättiin G-100-pylvääseen; yksi huippu eluoitui välisijatilavuu- • · • · ··· · den kanssa, antaen olettaa molekyylipainoksi 100,000 daltonia tai enemmän. Vaiheen 3 G- • · · *" *, 10-pylväs poistaa suolan samanaikaisesti kun se erottaa eri molekyylipainoiset molekyy- • · ♦ • · * i lilajit. Näin ollen on päätelty, että kulkiessaan G-l 0-pylväässä ja suolan poistumisen seu- • · m·' 20 rauksena tekijä muodosti suurimolekyylipainoisen aggregaatin. Aggregaatioaste vaihteli • · · , ·: ·. suolakonsentraation mukaan.

• · · * \. Aggregaatio-ominaisuus antaa olettaa mahdollisuuden, että voi muodostua suuri j oukko : *: *: molekyylipainoltaan erilaisia molekyylilaj ej a, j oilla on anti-inflammatorista biologista ak- : .·. 25 tiivisuutta anti-inflammatorisen tekijän läsnäolon vuoksi. Tämän ominaisuuden havaitse- * · t * · · · j *' *. minen antaa olettaa mahdollisuuden tuottaa maidon anti-inflammatorisia tekij öitä, j oilla on • · · # φ suuri määrä erilaisia biokemiallisia ominaisuuksia riippuen lopullisen tuotteen aggregaati- • · · • · ; on määrästä. Saatettaisiin esimerkiksi tuottaa koostumuksia, joilla on pitempi tai lyhyempi • ·· • · biologinen puoliintumisaika, käyttämällä suuremman tai pienemmän molekyylipainon 30 omaavia aggregaatteja, jolloin molekyylipainon jakaantumista kontrolloitaisiin suolakon- sentraatiolla prosessoinnin aikana. Tässä kuvattu pylväskromatografiamenetelmä saa aikaan pienimmän molekyylipainon omaavia lajeja, mitä on saatu, joilla on biologista aktii- 28 visuutta (ts. huipun 2 vaiheen 3 G-10-pylvästä). Tämä havainto antaa aihetta käyttää muita menetelmiä aggregaattien muodostamiseen. Esimerkiksi laimentaminen vedellä saa aikaan aggregoitumisen. Kemialliset aineet, jotka sitovat suoloja, erityisesti kalsiumia, voivat aiheuttaa aggregaatin muodostusta. Kim tämä havainto on tehty, muut menetelmät aggregaa-5 tin muodostamiseksi ja tekijän erottamiseksi ovat ilmeisiä alaan perehtyneille.

Esimerkki 4

Biologisen aktiivisuuden määrittäminen

Puhdistetun anti-inflammatorisen tekijän anti-inflammatorinen toiminta testattiin turvotuk-10 siin, jotka aiheutettiin injektoimalla karrageenan-liuosta rottien polkuanturoihin. Maidon anti-inflammatorisen tekijän lyofilisoitu näyte liuotettiin sopivaan vehikkeliin ja annettiin intraperitoneaalisesti koerotille. Karrageenan annettiin sen jälkeen rotille määränä 0,1 ml 1-prosenttista suolaliuosta kuhunkin takajalan polkuanturaan. Polkuanturat mitattiin ennen injektioiden antamista ja 2,5 tuntia injektioiden jälkeen käyttämällä paksuustulkkia. Tulok-15 set on esitetty taulukoissa 2 ja 3. Näissä taulukoissa lyhenne MAIF tarkoittaa maidon anti-inflammatorisen tekijän valmistetta, joka on saatu käyttämällä esimerkeissä 1 ja 2 edellä » · · kuvattuja menetelmiä.

• f·· • · • · · • · t [ l Tekijän aggregoitumaton muoto (huippu 2 G-10-pylväästä) kontrolli- j a hyperim- • *« : *. 20 muunimaidosta aiheutti tulehduksen vähenemisen rotan käpälässä annoksina välillä 1 - Ϊ * * 0,25 mg (taulukko 2). Sekä hyperimmuunimaito että tavallinen maito osoittivat aktiivisuut- ta; hyperimmuunimaito oli kuitenkin tehokkaampaa. Me päättelimme tästä, että anti-in- flammatorista tekijää esiintyy suurempana konsentraationa hyperimmuunien lehmien mai- : dossa.

: .·. 25 • · · «i» · i ’ * *: Töinen huippu DEAE-pylväästä osoitti aktiivisuutta eristettynä j oko hyperim- • · · , V. muunimaidosta tai tavallisesta maidosta. Aktiivisuus on oleellisesti suurempaa • · · • · : hyperimmuunimaidossa (taulukko 3).

• · 1 G-10-pylväästä tullut ensimmäinen huippu, joka on tekijän aggregoitunut muoto, osoitti aktiivisuutta rotan käpälätesteissä (taulukko 2). Aggregoitunut muoto ei ole kuitenkaan yhtä tehokas kuin ei-aggregoitunut muoto verrattaessa niitä samanpainoisina.

29 Näistä tutkimuksista on päätelty, että anti-inflammatorinen tekijä esiintyy luonnostaan lehmän maidossa. Lehmien hyperimmunisaatio saa aikaan tekijän suuremman konsentraation maidossa. Tekijä on pieni, negatiivisesti varautunut molekyyli, joka voidaan erottaa maidosta monella erilaisella menetelmällä. Tekijä voi muodostaa suuren molekyylipainon 5 omaavia aggregaatteja, joita ei luonnostaan esiinny maidossa, vaan muodostuu prosessoinnin aikana.

4 I * ♦ • 4 · *«#4 4 Ψ • 4 4 • *»1♦ ·» 9 4 4 4 4 4 4 9 • • · • « « 4 « r· 9

• M

4 4 4 4 « · • « 9 Ψ 4 14 « »»« 4 4 4 • 4 · • · • · · * 4 4 * 4« · • 9 4 : ; • · 1 4 · 4 « · *99 9 9 4 * 9 * ·· 4 9 30 TAULUKKO 2

MAIDON ANTI-INFLAMMATORISEN TEKIJÄN (MAIF) VAIKUTUS TULEHDUKSEN VÄHENEMISEEN ROTISSA

5 VALMISTETTU HYPERIMMUUNIMAIDOSTA

Polkuanturan mittaukset (mm)

Ennen Injektion % MAIF annos injektiota jälkeen Erotus Tulehdus 2.0 mg/rotta 3,43 5,01 1,58 46 10 1,0 mg/rotta 3,49 5,39 1,90 54 0,5 mg/rotta 3,42 5,51 2,09 61 0,1 mg/rotta 3,43 5,86 2,43 71

Kontrolli / 3,43 5,82 2,39 70 suolaliuos

15 VALMISTETTU NORMAALISTA LEHMÄNMAIDOSTA

2.0 mg/rotta 3,30 5,24 1,94 59 1.0 mg/rotta 3,31 5,22 1,91 58 » « ~~ " “ “ : 0,5 mg/rotta 3,32 5,33 2,01 61 »Il '[··' 0,25 mg/rotta 3,31 5,42 2,11 64 ·. : 20 t »•Ml • · « *

• M

• ·1 * : : I I t · • 1· ♦ * ♦« • · · • · ·

• J

• · · • 1 ♦ 91· · ♦ 1· t : «·· • « i i · ♦ · · • « ♦ < · * 4· • Φ 31 TAULUKKO 3 MAIF.-IN PUOLIKSI PUHDISTETTUJEN FRAKTIOIDEN VAIKUTUS TULEHDUKSEN VÄHENEMISEEN ROTISSA (VALMISTETTU HYPERIMMUUNI- JA TAVALLISESTA MAIDOSTA) 5 Polkuanturan mittaukset (mm) 2,5 h

Ennen injektion % injektiota jälkeen Erotus Tulehdus DEAE pylväs 10 toinen huippu hyper immuuni- 3,25 5,04 1,79 55 maito 2 mg/rotta DEAE pylväs 15 toinen huippu tavallinen 3,30 5,24 1,94 59 maito 2 mg/rotta G-10 pylväs 20 ensimmäinen 3,31 4,98 1,67 50 huippu I :*: 2 mg/ml ..*·* Kontrolli / : suolaliuos 3,34 5,63 2,29 69 ....:25 • ♦ • « • « • · · :*:*: Esimerkki 5

Anti-inflammatorisen tekijän kemiallinen analyysi • · • ’·· Näytteet anti-inflammatorisesta tekijästä analysoitiin kemiallisesti. Tekijä ei ole rakenteel- ♦ · · ·.· *30 taan kiteinen, määritettynä röntgendif&aktiotutkimuksilla. MAIF-valmisteista saatiin alku-aineanalyysi, joka oli yhtäpitävä hiilihydraattikoostumuksen kanssa. C, H, O -suhteet olivat • · · yhtäpitävät polymeerisessä ja oligomeerisessä materiaalissa, joidenkin karbinoliryhmien hapettuessa karboksyyliksi. Vähäinen kalsiumekvivalenttien ylimäärä kloori-ioneihin • · : * ♦.: nähden voi j ohtua osaltaan karboksylaattisuoloista. Loppu voi olla natrium- tai kalium- • · 35 suoloja. Sulamiskäyttäytyminen, tai ennemmin ei-sulamiskäyttäytyminen antoi suuntaa kuitenkin suolan kaltaiselle ja/tai suurempimolekyylipainoisille koostumuksille. Nykyises- 32 sä puhtauden tasossaan materiaali sisältää ilmeisesti vaihtelevan määrän kalsiumin ja kloorin suoloja, luultavasti CaCl2:ia.

Mikään valmiste ei sisältänyt merkittävää määrää typpeä, mikä sulkee pois kaikki peptidi-5 komponentit sen koostumuksessa. Samoin merkittävän määrän typpeä puuttuminen voi jättää pois laskuista aminosokereiden ja muiden typpeä sisältävien materiaalien läsnäolon, kuten erilaisten monimutkaisten lipidien, pääkomponenttina (-komponentteina).

Pyrolyyttinen massaspektri osoitti huomattavia merkkejä 18-hiilen rasvahapoista. Tämä 10 tosiseikka, laskettuna yhteen merkkien N: stä j a P: stä kanssa, antaa olettaa monimutkaisen lipidin läsnäoloa valmisteessa.

Infrapunaspektroskopia osoitti absorptioita, jotka vastasivat funktionaalisia karbinoli- ja karboksylaattiryhmiä. Ultravioletti-, näkyvän valon ja fluoresenssispektroskopia eivät 15 osoittaneet kromoforien huomattavaa määrää infrapunan osoittamien lisäksi.

. ^: Kemialliset testit ovat yhtenevät oligomeerisen hiilihydraatin kanssa, j ossa funktionaalinen .. | * karbonyyliryhmä (aldehydi tai ketoni) on sidottu alayksikköliitoksiin. Oligomeerinen hiili- • · *. * : hydraatti sisältää myös j onkin verran sivuketj uj en hapettumista karboksylaatiksi.

20 • · • · · MAIF-valmiste on olennaisesti, mutta ei täysin puhdas.

• · · • · »

Esimerkki 6 • · • · · [... Rotan käpälän turvotustestit: oraalinen anto * · # *· 25 • · • · · * * *

Anti-inflammatorisen tekijän tehokkuuden testaamiseksi anti-inflammatorisena tekijänä in • · • · ’ * * vivo käytettiin karrageenanilla tehtyä rotan polkuanturatestiä. Kolmekymmentä täysikas- • · • · · ’ · * · | vuista valkoista rottaa j aettiin umpimähkään kolmeen ryhmään, kymmenen rottaa kuhun- • · · • · · * * kin ryhmään. Ryhmät saivat viitenä peräkkäisinä käsittelyinä päivittäin joko 10 mg hype- 30 rimmunisoiduista eläimistä peräisin olevan kuoritun maidon jauhetta, 10 mg ei-im- munisoiduista eläimistä peräisin olevan kuoritun maidon jauhetta tai ei lainkaan käsittelyä (ainoastaan 20 ml vettä päivässä). Jauheet annettiin oraalisesti 20 ml:ssa vettä. Viidentenä 33 päivänä kunkin rotan oikeaan käpälään injektoitiin 0,1 ml 1-prosenttista karrageenania suolaliuoksessa. Tämän menettelyn tiedetään aiheuttavan akuutin tulehduksen (turvotuksen). Kaksikymmentäneljä tuntia injektion jälkeen rotat tapettiin, käpälät irrotettiin ja vasemman (kontrolli) ja oikean (turvonnut) käpälän painoja verrattiin. Määrityksen tulokset 5 on esitetty taulukossa 4 (ilmaisimia painoina grammoissa) ja kuviossa 3 (ilmaistuna prosentteina kontrollikäpälien keskimääräisestä painosta).

TAULUKKO 4

10 ROTAN KÄPÄLÄN TURVOTUSTESTIN TULOKSET

(käpälän paino grammoina ± sem, n = 10)

Hoito Karrageenan Kontrolli Erotus käpälä käpälä (g) (paino, g) (paino, g)

Immuunimaito 1,78 + 0,03 1,71 + 0,02 0,06 + 0,02

Kontrollimaito 1,88 + 0,06 1,64 + 0,03 0,24 + 0,05 15 Vesi 1,86 + 0,03 1,65 + 0,03 0,22 + 0,02 • · • · • · · • · · · • · · "*Tulehdusreaktio karrageenan-injektiosta väheni merkitsevästi immuunimaidolla käsitellyis-• · · • · sä rotissa verrattuna ei-immuunimaito- ja vesikontrolliryhmiin. Mitään todisteita sivuvai- • · : ·. 20 kutuksista tai haitallisista vaikutuksista rottien yleiseen terveydentilaan ei havaittu. Näistä • · · . ·: *. tuloksista voidaan päätellä, että hyperimmunisoiduista eläimistä peräisin olevan kuoritun maidon jauheen päivittäinen käyttäminen esti melkein täysin karrageenan-injektion ini’ ·.. dusoiman tulehdusreaktion rottien jalan polkuanturassa.

• · · • · · • · · : 25 Esimerkki 7 • · · • · · · : ‘ : Kvantitatiiviset rotan käpälän turvotustestit • · · . ·. ·. Hyperimmuunimaitofraktiolla tehtiin saij a kokeita. Kokeet suunniteltiin varmistamaan 1*1 • · maidon anti-inflammatorisen tekijän anti-inflammatorinen aktiivisuus, kun sitä annettiin • · intraperitoneaalisesti, ja saamaan aikaan annos-vaste-käyrä, tutkimaan vaihtoehtoisia anto-3 0 reittej ä j a tutkimaan annosteluohj elmia, j otka voisivat muodostaa perustan lisätutkimuksil le.

34

Huippu I G-10-pylväästä, hankittu yrityksestä Stolle Milk Biologies International, valmistettiin patentissa nro 4,956,349 kuvattujen menetelmien mukaisesti. Plasebona käytettiin laktoosia, joka hankittiin kaupallisista lähteistä. Positiivisena kontrollina käytettiin aspiriinia. Aspiriini liuotettiin veteen ja annettiin oraalisesti mahaletkulla määränä 200 mg kiloa 5 kohti, tämän annoksen tiedetään olevan aktiivinen kokeessa. 2-prosenttisen liuoksen kappa-karrageenania (Sigma C-1263) on havaittu saavan aikaan toistettavimmat tulokset, ja niin sitä käytettiin näissä kokeissa. Jalan polkuanturakoetta muunnettiin käyttämällä iso-tooppisesti leimattua ihmisen seerumin albumiinia (125I-HSA), joka sijoittuu paikallisesti karrageenanin indusoimaan vaurioon suorassa suhteessa tulehdusnesteen tilavuuteen.

10 Määrittämällä radioaktiivisuuden kokonaismäärä polkuanturasta ja vertaamalla tätä lukuihin tietystä plasmatilavuudesta injektoidusta eläimestä, saadaan suoraan turvotuksen mitta mikrolitroinaplasmaekvivalentteja. 125I-HSA injektoitiin intravenaalisesti annoksena 1,0 mikrocurieta rottaa kohti. Käytettiin naaraspuolisia Dark Agouti -rottia. Rotat olivat noin 12 viikon ikäisiä, painoivat 160 - 200 grammaa ja saatiin omassa talossa sisäsiitetystä kan- 15 nasta.

• · :.· · Karrageenanilla tehtävän polkuanturatestin suorittamiseksi 0,1 ml 2-prosenttista karra- geenania injektoitiin subkutaanisesti nukutetun rotan kuhunkin takajalan polkuanturaan.

• · *· : Tätä injektiota seurasi välittömästi 1,0 mikrocurien 125I-HSA:ta injektoiminen suolaliuok- ^ '20 sessa häntälaskimoon. Neljän tunnin kuluttua kukin rotta punnittiin, otettiin verinäytteet ja • · ♦ I | ’.,. rotta tapettiin. Kumpikin takaj aika irrotettiin j a radioaktiivisuuden taso kussakin j alassa j a • · · • · · 200 pl:ssa plasmastandardia mitattiin automaattisella gammalaskijalla. Näistä mittauksista .. # laskettiin turvotuksen tilavuus kussakin jalassa ja ilmaistiin se mikrolitroina.

• · ·

• M

• · · • · · . 1. 25 Koe 1: Intraperitoneaalinen annos-vaste.

• · · • · · '! I. 1 Kuviossa 4 on esitetty puhdistetun MAIF-valmisteen intraperitoneaalisen annon vaikutus "1 verrattuna laktoosiin (KONTR.), aspiriiniin ja ilman käsittelyä jättämiseen (EI Rx). Kaikki • · · \ käsittelyt (laktoosi, aspiriini, MAIF) annettiin 30 minuuttia ennen karrageenan-injektiota.

( 1 # • · · • · 30 Karrageenan-injektio johti turvotukseen, joka oli keskimäärin 250 μΐ (EI Rx). Aspiriini ja kaikki MAIF-valmisteen annokset inhiboivat turvotusta, mutta laktoosi ei inhiboinut sitä. MAIF-valmisteella saatu intraperitoneaalinen annos-vaste-käyrä, joka saatiin ilmaisemalla 35 tulokset prosentteina kontrolliturvotuksen (ei käsittelyä) keskiarvosta on esitetty kuviossa 5.

Koe 2: MAIF:in eri antoreittien vaikutukset.

5 Kuviossa 6 esitetään laktoosin ja puhdistetusta MAIF:ista tehdyn valmisteen annon vaikutus jalan polkuanturan turvotukseen, annettuna oraalisesti (ORAALINEN), intramusku-laarisesti (IM), subkutaanisesti (SUBKUT.) ja intravenaalisesti (IV). Esitettynä ovat myös positiivinen kontrolli (aspiriini) ja käsittelemätön kontrolli (EI Rx).

10 Valmisteet annettiin ennen altistusta karrageenanille seuraavan aikataulun mukaisesti: aspi riini: oraalisesti 30 minuuttia ennen; subkutaaninen MAIF: 1 tunti ennen; oraalinen MAIF: 24,16 ja 1 tunti ennen; intramuskulaarinen MAIF: 30 minuuttia ennen; intravenaalinen MAIF: altistuksen ajankohtana (isotooppi injektoitiin myös).

15 Tulokset osoittavat, että ilmaistuna prosentteina keskimääräisestä kontrolliturvotuksesta kussakin erillisessä kokeessa, anti-inflammatorinen tekijä inhiboi turvotuksen muodostu- • · ;.· j mistä kaikilla antotavoilla. 40 mg MAIF-valmistetta annettuna intravenaalisesti kumosi .. I: * melkein täysin tulehdusreaktion karrageenaniin. Nämä tulokset osoittavat MAIF: in anti- • · i inflammatorisen aktiivisuuden ja edellä esitetyn kokeen 1 tulosten valossa antavat olettaa, [ ’ 20 että tehokkuuden järjestys eri antoreiteille on IV > IP > IM > SUBKUT. > ORAALINEN.

t’\.

(*· * · · * · · * Koe 3: Intravenaalisen ja pidennetyn oraalisen annon vaikutus turvotukseen: annos- .. vaste.

• · • · · \ . Kuviossa 7 esitetään anti-inflammatorista tekij ää sisältävän puhdistetun valmisteen antami- • i « . ·. 25 sen IV.sti ja oraalisesti vaikutus jalan polkuanturan turvotukseen rotilla. Oraalinen käsittely • · · • · · ' * I. * MAIF :illa (40 mg kullekin rotalle päivässä) annettiin päivittäin kuuden päivän ajan j a *·* myös yksi tunti ennen altistusta karrageenanille (PO). Intravenaaliset käsittelyt (5,10,20 • · · ; ’ · [ mg) annettiin karrageenan-altistuksen (IV) aj ankohtana. Esitettynä ovat myös postittivinen • · · * i» * * kontrolli (aspiriini) ja negatiivinen kontrolli (ei käsittelyä).

Kuviossa 7 esitetyt tulokset osoittavat, että kaikki kolme MAIF-valmisteannosta saavat aikaan anti-inflammatorisen aktiivisuuden, joka ylittää jopa aspiriinin aktiivisuuden ko- 30 36 keessa, kun taas pidennetty oraalinen anto johtaa selvään mutta rajoittuneeseen aktiivisuuteen.

Tutkimus laajennettiin sen vuoksi selvittämään anti-inflammatorisen tekijän vielä pienen-5 nettyjen intravenaalisten annosten vaikutuksia. Intravenaaliset annokset laktoosi-plaseboa sisällytettiin kontrolliksi. Tulokset näistä tutkimuksista on esitetty kuviossa 8. Intravenaaliset annokset 2,5 ja 1 mg MAIF-valmistetta (IV) indusoivat anti-inflammatorisen aktiivisuuden aspiriinin indusoimalla aktiivisuusalueella. 10 ml intravenaalista laktoosiplaseboa (10 mg PLAS. IV) ei indusoinut aktiivisuutta tällä alueella.

10

Intravenaalinen annos-vaste-käyrä johdettiin yhdistämällä kokeiden 2 ja 3 tulokset ja ilmaisemalla nämä tulokset prosentteina keskimääräisestä kontrolliturvotuksesta (ei käsittelyä) kussakin erillisessä kokeessa. Käyrä on esitetty kuviossa 9.

15 Johtopäätökset, jotka voidaan vetää kvantitatiivisista rotan käpälän turvotustesteistä ovat seuraavat: maidon fraktion huippu I G-10-pylväästä, uutettuna ja puhdistettuna kuten pa- t * : tentissä nro 4,956,349 on kuvattu, osoittaa johdonmukaisesti anti-inflammatorista aktiivi- .suutta testattaessa sitä rotan käpälän turvotusmallilla. 4 mg:n annos MAIF-valmistetta kul-• · * · · *· : lekin rotalle annettuna intravenaalisesti karrageenan-injektion ajankohtana on riittävä inhi- .. *20 boimaan turvotusta voimakkaasti, ja se valittiin sen vuoksi standardiksi, jota vastaan muita t ·..

*,,. valmisteita voitaisiin verrata jatkokokeissa.

* » · • » · :·. Esimerkki 8 « · · . *: ·. Identtisistä kaksoslehmistä saadun hyperimmuunimaidon valmisteiden anti-inflam- , *. 25 matoriset ominaisuudet • « « • · · * Il.* Rokotuksen vaikutusta maidon anti-inflammatoriseen aktiivisuuteen tutkittiin testaamalla : : • · · identtisistä kaksoslehmistä saatujen eri maitofraktioiden biologista aktiivisuutta. Patentissa • · · • · · | *. nro 4,956,349 kuvattuihin uuttomenetelmiin perustuen suunniteltiin uuttojäijestelmä, jossa • ♦ ♦ * · · käytettiin ultrasuodatusta. Käsittelyjärjestys oli seuraava: raakamaito kuorittu maito 30 37 pastöroitu maito juoksute kaseiini (poistetaan) hera 5 ultrasuodatus pidättynyt osa (Rj) läpäissyt osa (P,) laimennus 1:4 ultrasuodatus läpäissyt osa (P2) pidättynyt osa (R2) 10

Valmistettiin maitonäytteet, jotka olivat peräisin immunisoiduista kaksoslehmistä, ei-im-munisoiduista kontrollikaksoslehmistä ja kuoritun maidon jauheesta, johon oli lisätty vettä uudelleen, ja joka oli aikaisemmin immunisoiduista lehmistä peräisin. Näyteryhmä koostui 45 parista identtisiä kaksoslehmiä. Yksi lehmä kustakin kaksosparista rokotettiin joka toi-15 nen viikko Stolle S100 sekabakteereilla (kuvattu patentissa nro 4,956,349). Eri fraktioiden biologinen aktiivisuus testattiin intravenaalisella injektiolla käyttäen edellä kuvattua karra- » * ;.· * geenantestiä rotan polkuanturoilla.

9 ·»· • • 9 99 • 9 t * *· · Testattavat oletukset olivat, että (a) hyperimmunisaatio vastasi edellä kuvatusta anti-in- r · 99 9 * * 20 flammatorisesta aktiivisuudesta, (b) MAIF voitiin uuttaa kaupallisella mittakaavalla ult-i rasuodattamalla ja (c) läpäisseen osan laimentaminen aiheuttaisi anti-inflammatorisen teki- i t · * * · jän aggregoitumista, saaden aikaan, että se pidättyisi 30,000 molekyylipainon ultrasuoda- •'. tusmembraaniin.

* · · • i* • « * * » · * . *. 25 Kuviossa 10 esitetään tulokset kaksoskaija-ultrasuodatuskokeesta, joka suunniteltiin testaa- i i i * 9 9 ‘!.V maan biologista aktiivisuutta eri fraktioista, jotka oli tehty rokottamattomien kontrollikak-

S I

sosten maidosta ja immunisoiduista lehmistä peräisin olevasta maitojauheesta, johon lisät- * t * 9 9* * tiin uudelleen vettä. Testattavat fraktiot olivat seuraavat: Huippu I, G-10-pylvään valmiste, t i f * «» 4 ml (OHIO MAIF STD); R2 lopullinen pidättynyt osa rokottamattomasta kaksosesta 30 (KONTROLLIKAKSONEN R2); P2 lopullinen läpäissyt osa uudelleen liuotetusta maitojauheesta (UUD. LIUOT. S100 P2); dialysoitu R2 lopullinen pidättynyt osa rokottamatto- masta kaksosesta (KONTR. DIALYSOITU R2); dialysoitu lopullinen pidättynyt osa uudel leen liuotetusta maitojauheesta (S 100 DIALYSOITU R2).

38

Anti-inflammatorista aktiivisuutta ei voitu havaita lopullisessa pidättyneessä fraktiossa R2, 5 joka oli valmistettu immunisoimattomista lehmistä, ei myöskään dialysoinnin jälkeen.

Anti -inflammatorista aktiivisuutta ei havaittu lopullisessa läpäisseessä osassa P2-fraktiossa, joka oli valmistettu uudelleen liuotetusta maitojauheesta. Uudelleen liuotetun maitojauheen pidättynyt osa, R2-fraktio, osoitti dialyysin jälkeen anti-inflammatorista aktiivisuutta MAIF-standardin aktiivisuuden alueella.

10

Kuviossa 11 on esitetty tulokset kaksoskaija-ultrasuodatuskokeista, jotka suunniteltiin testaamaan rokotetuista ja rokottamattomista kaksoslehmistä peräisin olevien eri maitofrakti-oiden ja immunisoiduista lehmistä peräisin olevan uudelleen liuotetun maitojauheen biologista aktiivisuutta. Testattavat fraktiot olivat seuraavat: huippu I, G-10-pylvään valmiste, 4 15 ml (OHIO MAIF STD); dialysoitu lopullinen pidättynyt osa R2 rokottamattomista kaksosista (KONTR. DIALYSOITU R2); lopullinen pidättynyt osa R2 uudelleen liuotetusta mai- • i ·,: · tojauheesta (UUD. LIUOT. S100 R2); lopullinen pidättynyt osa R2 rokotetuista kaksosista » . .!:* (IMMUUNIKAKSONEN R2); ensimmäinen pidättynyt osa Rl uudelleen liuotetusta maito- * # • f * *· I jauheesta, laimennos: 1 (S100 laimennettu Rl).

T* 20 i

Vain vähän anti-inflammatorista aktiivisuutta havaittiin dialysoidussa pidättyneessä osassa i » t * · R2 rokottamattomista kontrollikaksosista tai dialysoimattomassa pidättyneessä osassa R2 j·4 rokotetuista kaksosista. Jonkin verran aktiivisuutta on osoitettavissa hajontakuviolla. R2- « n « . * **. retentaatti, joka on valmistettu ilman dialyysiä uudelleen liuotetusta Stolle-maitojauheesta, * . *. 25 joka oli peräisin immunisoiduista lehmistä, oli voimakkaasti anti-inflammatorinen. Valmis-< · « tl/ te, joka oli tehty laimentamalla uudelleen liuotettua maitoa ennen ultrasuodatusta, eikä lai- f i • · 9 * < mentamalla heraa, joka oli tehty maidosta, oli vain juuri ja juuri aktiivinen. Tämä tulos #*· · > « · • \ osoittaa, että anti-inflammatorinen aktiivisuus uuttuu tehokkaammin herafraktiosta.

< · f * «· • · 39

Kuviossa 12 esitetään tulokset kaksoskaijalla tehdyistä ultrasuodatuskokeista, jotka oli suunniteltu testaamaan biologista aktiivisuutta rokotetuista kaksoslehmistä peräisin olevasta dialysoidusta pidättyneestä osasta. Testatut fraktiot olivat seuraavat: huippu I, G-10-pyl-vään valmiste (OHIO MAIF STD); dialysoitu lopullinen pidättynyt osa R2 rokotetuista 5 kaksosista (IMM DIALYSOITU R2); dialysoitu lopullinen pidättynyt osa G-10-valmistees-ta (DIALYSOITU OHIO MAIF). Tulokset osoittavat, että immunisoiduista kaksosista peräisin olevassa R2-fraktiossa oli anti-inflammatorista aktiivisuutta dialyysin jälkeen. Dialysoitu MAIF oli aktiivisempi analyysissä kuin dialysoimaton MAIF-standardi. Tämä tulos antaa olettaa, että dialyysi on tehokas tapa konsentroida lisää maidon tekijää, joka vastaa 10 anti-inflammatorisesta aktiivisuudesta.

Edellä esitetyt ja kuvioissa 10-12 esitetyt tulokset tukevat seuraavia johtopäätöksiä: (1) anti-inflammatorinen aktiivisuus voidaan uuttaa uudelleen liuotetusta maidosta, joka on peräisin immunisoiduista lehmistä, laimennetun läpäisseen osan ultrasuodatuksella. (2) 15 Anti-inflammatorista aktiivisuutta ei osoitettu edellä esitetyissä valmisteissa, jotka oli tehty immunisoimattomien lehmien maidosta. (3) Anti-inflammatorista aktiivisuutta osoitettiin lopullisessa pidättyneessä osassa R2 immunisoitujen lehmien maidosta valmistetun laimen- ..' · 1 netun läpäisseen osan ultrasuodatuksen jälkeen, mutta dialyysi oli välttämätön osoittamaan • · V i aktiivisuuden.

20 « · : 2 Esimerkki 9 ·«« ♦ ♦ ♦ * 1 MAIFtin stabiilisuus, MAIF:in kuumennus ja proteinaasikäsittely .. Aikaisempi todiste, että maidon anti-inflammatorinen tekijä ei ole kemiallisesti proteiini tai • · • · · *... ^ peptidi, perustui suurelta osin kemiallisiin analyyseihin, jotka yhtäpitävästi osoittivat typen • · · ·_ 25 puuttumisen lähes täysin. Anti-inflammatorisen tekijän karakterisoimiseksi lisää useita vai-• # · • · · 4 misteita testattiin rotan käpälän turvotustestillä käyttäen 4 mg huipun I, G-10-py 1 vään vai- • · • · 30 l' mistetta intravenaalisesti standardina. Tehtiin seuraavat käsittelyt: kuuden tunnin pro- • 1 • 1 · ’·1·1 teinaasi (pronaasi) -käsittely, kontrollina kuusi tuntia ilman proteinaasia, käsittelemätön • · · 2 1: positiivinen kontrolli, kuumennus 100 °C:seen 30 minuutiksi.

40

Tulokset tästä määrityksestä on esitetty kuviossa 13. Tästä tutkimuksesta tehdyt johtopäätökset olivat, että anti-inflammatorinen aktiivisuus ei johdu proteiinista tai peptidistä, ja että keittäminen ei inaktivoi anti-inflammatorista tekijää. Pronaasikäsittelyn tehokkuus todistettiin havainnolla, että vastaavanlainen pronaasikäsittely denaturoi täysin maidon pro-5 teiinin.

Esimerkki 10

Immunisoiduista lehmistä peräisin olevien lisää puhdistetun MAIF:in ja heraprote-iinikonsentraatin anti-inflammatorinen aktiivisuus 10 Pidättyneestä osasta ja läpäisseestä osasta ultrasuodatuksesta, j oka oli tehty käyttäen Ami-con YM5-membraania, testattiin biologinen aktiivisuus käyttäen intravenaalista antotapaa rotan käpälän turvotustestissä. Tässä menetelmässä MAIF huipusta I G-10-pylväästä, valmistettu patentin nro 4,956,349 mukaisesti, puhdistettiin vielä ultrasuodattamalla Amicon YM5-membraanilla. Tämä membraani pidättää molekyylit, joiden molekyylipaino on 15 5,000 tai suurempi. Myöskin immunisoitujen eläinten maidosta valmistettiin heraprote- iinikonsentraatit (WPC:t) ja suodatettiin YM5-membraanin läpi. Kokeessa testattiin seuraani *: vat näytteet käyttäen 4 mg huippua I, G-10-pylvään valmistetta intravenaalisesti standardi- .. * · * na: läpäissyt osa Amicon YM5 ultrasuodatuksesta; pidättynyt osa Amicon YM5 uit- • · \ ’ i rasuodatuksesta; WPC immunisoiduista lehmistä, 30 mg kullekin rotalle; WPC kaupalli- ** : 20 sesti tuotetusta (immunisoimattomat lehmät), 30 mg kullekin rotalle.

• · • · • · · • · · • · · ’** Tämän analyysin tulokset on esitetty kuviossa 14. Näistä tuloksista on selvää, että kaikki .. aktiivisuus on pidättyneessä osassa, joka muodostaa noin 0,5 % YM5-suodattimeen lisätyn • · • · · ’... fraktion kokonaispainosta. Tässä kokeessa nähdyn turvotuksen väheneminen saavutettiin, * · · 25 kun annettiin 20 - 25 mikrogrammaa materiaalia.

• · · * « » • · · · ··· • · « ·

Mitä tulee WPC:n aktiivisuuteen, hyperimmunisoiduista eläimistä saatu WPC osoitti sei- • · • · · * · ’ ·' västi anti-inflammatorista aktiivisuutta, kuten oli odotettua. Mielenkiintoista oli, että im- • · • » · *· *: munisoimattomista eläimistä peräisin oleva WPC osoitti myöskin anti-inflammatorista ak- 1 tiivisuutta. Anti-inflammatorisen aktiivisuuden läsnäolo immunisoimattomien lehmien 41 maidossa ei ole hämmästyttävää, koska sen täytyy olla luonnollinen aine. Sen havaitseminen kuvastaa eläinkokeen herkkyyttä.

Esimerkki 11 5 Karrageenanilla indusoidun polkuanturan turvotuksen jatkuva seuranta

Oli tosiasia, että 4 mg MAIF-valmistetta annettuna intravenaalisesti karrageenan-injektion ajankohtana, vähensi turvotuksen kertymistä polkuanturaan välillä 40 - 50 %. Vaikka nämä tulokset taijoavat todisteita siitä, että materiaali sisälsi anti-inflammatorisen osan, oli vain vähän osoitusta MAIF:in vaikutuskohdasta tai farmakologisesta profiilista. Tällaisten tu-10 losten saamiseksi oli välttämätöntä luoda menetelmä, joka teki mahdolliseksi jalan polku- anturan turvotuksen jatkuvan seurannan läpi koko karrageenanin aiheuttaman reaktion. Tämä saavutettiin pitämällä rotan jalkaa siirrettävässä gammasäteilyn osoittimessa. Menettely edellytti eläinten nukuttamista jopa neljäksi tunniksi, ja koska nukutusaineiden tiedetään ehkäisevän tulehdusreaktiota oli välttämätöntä ensin määrittää nukutusaineiden vaikutus 15 karrageenanilla indusoituun turvotukseen. Sen vuoksi tehtiin arvio viidestä aineesta, joita käytetään yleisesti indusoimaan nukutus rotissa; nämä olivat eetteri, kloraalihydraatti, ! Innovar-vet, nembutaali ja uretaani. Tulokset on esitetty kuviossa 15.

«»· • · ·· • · :* I Näistä tuloksista oli selvää, että eetteri oli valittava nukutusaine, kun tulehdusreaktiota tuli * ' 20 arvioida tällä tekniikalla. Eetteriä käytettäessä saadun käyrän muoto osoitti kaksivaiheista • · " reaktiota. Reaktion kuvaamiseksi yksityiskohtaisemmin tehtiin lisätutkimus, jossa turvo- • * * * ’ tuksen tilavuutta mitattiin 12 ajankohtana 5 tunnin aikana. Tulokset varmistivat kaksivai- .. heisen reaktion. Varhainen reaktio tapahtui välillä 0 -1 tunti altistuksen jälkeen ja myöhäi- * · • · · ... sen vaiheen reaktio välillä 1,5-2 tuntia (kuvio 16).

• · · *· 25 • · • · · *’*.* Kaksi vaihetta, jotka toiset tutkijat ovat myös havainneet, on nimitetty ei-fagosytoottiseksi : : ’I' tulehdusreaktioksi (NPIR) ja vastaavasti fagosytoottiseksi tulehdusreaktioksi (PIR).

• · • · · • · · • · • · • · · * · • · NPIR alkaa, reaktiona vaurioon, liukoisilla välittäjäaineilla, kuten histamiinilla ja brady- 1 kiinillä, kun taas PIR riippuu neutrofiilien osallistumisesta. Protokolla oli sen vuoksi antaa 42 MAIF:ia ja seurata turvotuksen kertymistä jatkuvasti, jotta määritettäisiin, johtuivatko aineen anti-inflammatoriset ominaisuudet varhaisesta ei-sellulaarisesta (NPIR) tai myöhäisestä sellulaarisesta (PIR) vaiheesta. 5 mg tai 40 mg MAIF-valmistetta kullekin rotalle annettiin intravenaalisesti karrageenan-altistuksen ajankohtana ja turvotuksen kertymistä seu-5 rattiin säännöllisin välein neljän tunnin ajan. Kumpikaan annos ei vaikuttanut turvotuksen kertymiseen kummankaan vaiheen aikana (kuvio 17).

Tämä tulos oli hämmästyttävä, koska moni aikaisempi tutkimus, joissa määritettiin puhdistettujen MAIF-valmisteiden vaikutus karrageenanin indusoimaan turvotukseen 4 tuntia 10 altistuksen jälkeen, oli osoittanut huomattavaa anti-inflammatorista aktiivisuutta fraktiois sa. Sen vuoksi oli todennäköistä, että jatkuva altistus eetterille tukahdutti tai inaktivoi MAIF:in aktiivisen anti-inflammatorisen komponentin in vivo.

Aikaisemmat tutkimukset antoivat olettaa, että lyhytaikainen altistus eetterille ei vaikutta-15 nut anti-inflammatorisen tekijän aktiivisuuteen. Sen vuoksi tehtiin tutkimus, jossa määritet tiin MAIF:in vaikutus kehittyvän turvotuksen kertymiseen ainoastaan neljänä ajankohtana, ! 0,1, 3 ja 4 tuntia, rajoittaen siten eläinten altistusta eetterille. 1 tumiin ajankohta valittiin, • · · · *:1 jotta saataisiin arvioitua vaikutus varhaiseen, ei-fagosytoottiseen tulehdusreaktioon, kun • · :.’ · taas 3 ja 4 tunnin määritykset valittiin kvantifioimaan vaikutusta myöhäiseen fagosytootti- • · 1 1 · 20 seen tulehdusreaktioon. Tässä tutkimuksessa MAIF-valmiste annettuna 40 mg annoksena • ’1 johti turvotuksen kertymisen vähenemiseen sekundäärisessä, fagosytoottisten solujen välit- • · · 9 · · *·1 tämässä vaiheessa, mutta sillä ei ollut merkitsevää vaikutusta primaarisessa, liukoisen vä- littäj än ohj aamassa vaiheessa (kuvio 18).

• · • · · • · · • · · • · · 25 Tästä koesaijasta voidaan vetää seuraavat johtopäätökset.

• · · * · · • · · · • · · t : * I 1 1. Eetteri on edullinen nukutusaine käytettäväksi tutkimuksissa, joissa on tarkoitus seurata • · • · · · ’ · ’ karrageenanin aiheuttamaa tulehdusreaktiota jatkuvasti.

• · • · · • · · • · 43 2. Jatkuva eetterinukutus inhiboi anti-inflammatorisen tekijän anti-inflammatorista aktiivisuutta in vivo karrageenanilla tehdyssä jalan polkuanturatutkimuksessa.

3. MAIF parantaa tulehdusta inhiboimalla myöhäistä, fagosytoottisten solujen välittämää, 5 karrageenanin aiheuttamaa tulehdusreaktion vaihetta.

Esimerkki 12 MAIFcin vaikutus ajan kuluessa karrageenanin indusoimaan polkuanturan turvotukseen 10 Toteutettiin vielä sajja kokeita, joissa aine annettiin valittuina ajankohtina ennen karrageenan-injektiota tai sen jälkeen, ennemmin kuin altistuksen ajankohtana. Tutkimuksen tarkoitus oli tarjota tietoa (a) tehokkaimmasta ajasta MAIF:in antamiseksi suhteessa tulehdusstimulukseen.

15 (b) anti-inflammatorisen osan biologisesta puoliintumisajasta.

• · • · • · ·

• ·· I

.. ’ · ’ (c) MAIF: in vaikutuskohdat tulehdusreaktion kehittymisessä.

• « • · · • · • · * 20 Tutkimus tehtiin kolmessa osassa. MAIF-valmiste annettiin intravenaalisesti annoksena 4 \ mg/rotta yhtenä 11 ajankohdasta, jotka ulottuivat 150 minuuttiin ennen karrageenan-injek- j ; j * tiota j a 15 0 minuuttiin sen j älkeen. Tulokset tästä kokeesta on esitetty kuviossa 19 j a taulu- .. kossa5.

• · • ·· • « · • · « • 1 · • ·

• · I

• · ·

• · · I

• · · t : • · · • · 1 • · · • · · • · · • »· • · 44 TAULUKKO 5

Koe A:n aika Kontrolli- MAIF-ryh- Turvotuksen suhteessa ryhmien mien jalan inhibitio altistuk- jalan ti- tilavuuden MAIF:illa seen lavuuden keskiarvo (% kontrollin) keskiarvo (μΐ ± SD) litilavuu- (μΐ ± SD) desta ± SD) 3 -150 311 ± 65 246 ± 52 79 +17 2 -90 304 ± 71 211 ±33 73 ± 11 5 2 -60 304 ± 71 186 +34 61 ± 11 1 -30 391 ± 63 261 +49 67 ± 13 3 -15 311 ± 65 152 ±41 49 ± 13 1,2,3 0 336 ± 78 184 ± 42 55 ± 13 3 15 311 ± 65 218 ±30 70 ± 10 10 1 30 391 ± 63 218 ±30 56 ± 8 2 60 304 ± 71 212 ±40 69 ± 13 ! 2 90 304 ± 71 216 ± 37 70 ± 12 3 150__311 ± 65 261 ± 42__84 ± 14 • · · • · • · * ·'': 15 Huomattavaa turvotuksen inhibitiota havaittiin kaikissa tutkituissa aj ankohdissa; inhibition ! *·* taso oli kuitenkin pienempi ääripäissä (± 150 min). Kiinnostava syklinen reaktio MAIF:in • ·· j · · • ’ * antoon nähtiin niissä ryhmissä, joita käsiteltiin lähempänä altistuksen ajankohtaa. Se to siseikka, että MAIF oli tehokkaampi annettuna 30 minuuttia altistuksen jälkeen kuin annet- • ♦ i · # *... tuna 15 minuuttia altistuksen jälkeen tukee sitä käsitystä, että aine inhiboi sekundääristä, « · · • · · 20 fagosytoottisten solujen välittämää vaihetta reaktiossa. MAIF-valmiste inhiboi voimak- • · • » · ·’·: : kaasti reaktiota karrageenanille annettuna 15 minuuttia ennen altistusta tai juuri altis- i · ·;·' tusajankohtana. Lisäksi on ilmeistä, että aineella on suhteellisen pitkä puoliintumisaika • · V.; seerumissa (1 - 21) ja sen tehokkuus on suhteessa altistusaikaan ja tulehdusreaktion dynaa- • · f · » 1 25 *♦ miseen luonteeseen.

45 Täten oletetaan, että anti-inflammatorinen vaikutus johtuu vaikutuksesta tulehdussoluihin, todennäköisesti neutrofiileihin.

Esimerkki 13 5 MAIF:in vaikutus käänteiseen passiiviseen Arthusin reaktioon

Sitä mahdollisuutta, että anti-inflammatorinen tekijä saattaisi vaikuttaa neutrofiilien osallistumiseen, tutkittiin arvioimalla materiaalin kykyä muuntaa käänteistä passiivista Arthusin reaktiota (RPA). Tämä immuunikompleksin indusoima reaktio on pääasiassa neutrofiilien välittämä ja aineet, jotka vaikuttavat reaktion kehittymiseen tekevät niin näihin solui-10 hin kohdistuvan vaikutuksen välityksellä. RPA:n indusoimiseksi rottiin injektoitiin intra-dermaalisesti kaniinin ovalbumiinin vastaista vasta-ainetta ja intravenaalisesti natiivia ovalbumiinia. Ovalbumiini/ovalbiimiini-vasta-aine -immuunikompleksit muodostuvat ihon verisuonten seinämien sisään ja niiden ympärille, isännän neutrofiilit sitoutuvat vasta-aineen Fc-osaan ja voimakas tulehdusreaktio alkaa. Tulisi huomata, että vaikka im-15 muunikompleksit aloittavat reaktion, se tapahtuu riippumattomana isännän immuunijäijes-telmästä.

• · • · • · · ··· · • · · RPA:n kvantifioimiseksi käytetään kolmea parametria. Nämä ovat (1) turvotus - mitattuna • · · · : * · : käyttäen 125I-HSA:n kertymistä, (2) verenvuoto - arvioituna in vivo S9Fe:llä esileimatuilla *ϊ1ί 20 RBCiillä ja (3) neutrofiilien kertyminen - mitattuna määrittämällä neutrofiileille spesifisen ! ‘ · · entsyymin myeloperoksidaasi (MPO) tasot kudoksissa. Nämä määritykset ovat tunnettuja « » · * alan tavanomaiset taidot omaavalle.

• · • · * 1 Kahdeksantoista rottaa jaettiin kolmeen kuuden rotan ryhmään. Kaniinin anti-ovalbumiinia • · · • · · 25 (40 μΐ) injektoitiin intradermaalisesti neljään kohtaan kunkin eläimen selässä ja 2 mg oval- • · • · · ' bumiinia injektoitiin intravenaalisesti välittömästi sen jälkeen. Yksi eläinryhmä ei saanut • · · | · ·;·’ mitään muuta käsittelyä ja palveli kontrollina. Toiseen ryhmään injektoitiin intravenaali- • · V. * sesti 20 mg laktoosivalmistetta, kun taas viimeiseen ryhmään injektoitiin intravenaalisesti • · *. *: 20 mg puhdistettua MAIF-valmistetta. Sekä laktoosi että MAIF-valmiste annettiin ovalbu- 2 2 miinin kanssa. Reaktion vakavuutta arvioitiin 3,5 tuntia altistuksen jälkeen. Kun MAIF- 46 valmiste annettiin intravenaalisesti annoksena 20 mg/rotta ennen RPA-reaktion alkamista, seurasi erittäin merkitsevä reaktion mittaamisessa käytetyn kolmen parametrin inhibitio (taulukko 6, kuvio 20). Laktoosi-kontrollimateriaali aiheutti myös vaatimattoman ja juuri ja juuri merkitsevän vähenemisen neutrofiilien kertymiseen ja verenvuotoon. Tämä antaa 5 olettaa, että normaalissa maidossa on olemassa pieni määrä anti-inflammatorista aktiivisuutta.

TAULUKKO 6

Ryhmä Neutrofiilien μΐ edeemaa Verenvuoto: kerääntyminen: μΐ RBC:tä

yksikköä MPO

10 Kontrolli 0,30 t 0,157 107 ± 29 4,8 ± 3,1

Laktoosi 0,214 ± 0,176** 104 ± 23 3,0 ± 1,5** MAIF 0,056 ± 0,013 60 ± 27* 1,5 ± 1,7* * = p < 0,01 ** = p < 0,05 15 . J j Koska neutrofiili on RPA:n pääasiallinen välittäjä, nämä tulokset tarjosivat lisätodisteita .. ’ · ’ siitä, että MAIF kykeni inhiboimaan tulehdusreaktiota vaikutuksen neutrofiilien toimintaan • · V : välityksellä.

* · • · • *’ 20 Esimerkki 14 • « « * » · • · · * MAIF:in vaikutus neutrofiilien kulkeutumiseen ,, Osallistuakseen tehokkaasti tulehdusreaktioon, neutrofiilien täytyy ensin kulkeutua ve- • * · · t · j ·. risuonistosta tulehduskohtaan. Sen määrittämiseksi, häiritsikö anti-inflammatorinen tekijä • · · e neutrofiilien kulkeutumista, käytettiin tulehdusmallia, jossa käytettiin steriilien • · · I « i * ‘ l. * 25 polyuretaanisienten subkutaanista siirrostamista. Sienet poistetaan tietyin välein siirrostuk-l · ‘ · ’ sen jälkeen ja punnitsemalla sienet ja uuttamalla ja laskemalla solut suodoksesta, voidaan * · · kvantifioida reaktion sekä neste- että soluvaihe. 24 tuntia siirrostuksen jälkeen >95% • · · • · · ' * sienissä havaituista soluista on neutrofiilejä.

47

On toteutettu kaksi koetta. Ensimmäisessä eläimet käsiteltiin joko 5,10,20 tai 40 mg:lla puhdistettua MAIF-valmistetta sienten siirrostuksen ajankohtana. Sienet poistettiin 24 tuntia siirrostuksen jälkeen. Kukin ryhmä käsitti 5-8 rottaa ja kuhunkin eläimeen siirrostettiin kaksi sientä. Tulokset on esitetty kuviossa 21.

5 20 tai 40 mg:lla MAIF-valmistetta annettuna intravenaalisesti sienten siirrostuksen ajankohtana oli huomattavaa vaikutusta tulehdussolujen kykyyn kulkeutua. Vähemmän huomattava, mutta samoin merkitsevä nesteen kertymisen inhibitio oli myös nähtävissä. Kahdella pienemmällä MAIF-annosksella ei ollut osoitettavaa vaikutusta tässä tulehdusmallis-10 sa.

Tehtiin toinen koe, joka oli suunniteltu kuvaamaan tulehdusaltistuksen (sienten siirrostus) ja MAIF:in antamisen ajallista suhdetta. Tässä tutkimuksessa annettiin intravenaalisesti 20 mg MAIF-valmistetta 30, 60 tai 120 minuuttia sienten siirrostamisen jälkeen. Neljäs, 15 kontrolliryhmä, jätettiin käsittelemättä. Kussakin ryhmässä oli viisi eläintä. Kuhunkin eläi meen siirrostettiin kaksi sientä ja ne poistettiin 24 tunnin kuluttua. Tulokset on esitetty ku-\ :‘l viossa 22. Tähän kaavioon on sisällytetty tulokset, jotka on saatu rottien näyteryhmästä, . joka sai 20 mg MAIF-valmistetta siirrostuksen ajankohtana (katso kuviosta 21).

• · * · t « · « * *** * 20 Tulokset MAIF:in vaikutuksesta ajan kuluessa karrageenanilla indusoituun polkuanturan • · • * * turvotukseen osoittavat MAIF :in olevan verrattain tehoton, kun se annetaan 60 minuutin ··♦ J I · • ’ * kuluttua altistuksesta tai myöhemmin. On merkillepantavaa, että vaikka tarvittiin 20 mg ,. MAIF-valmistetta suppressoimaan tulehdusta, joka liittyi sienten siirrostukseen, 4 mg oli * « - · · *... riittävä inhiboimaan karrageenanin indusoimaa turvotusta. Aikomatta sitoutua tähän tulkin- i i ! 25 taan, tämä erilaisuus saattaa liittyä näiden kahden ärsykkeen isännälle aiheuttamaan eri är- • * * "!. * sytystasoon. Sienisiirros on suhteellisen hyvänlaatuinen ärsyke, joka indusoi hitaan tuleh- i ’!’ dusreaktion ja solumassa kertyy 8-16 tunnissa siirrostuksen jälkeen (kuvio 23). Toisaalta » · * · * ' · * · * karrageenanin subkutaaninen injektio on erittäin voimakas stimulantti, joka indusoi verra- • · · * · ten voimakkaan reaktion suhteellisen lyhyessä ajassa (kuvio 16).

30 48

Esimerkki 15

Vaihtoehtoinen menetelmä anti-inflammatorisen tekijän puhdistamiseksi maidosta (valmiste "AIF")

Seuraavassa esimerkissä kuvataan menetelmää anti-inflammatorisen tekijän puhdistami-5 seksi maidosta molekyylipainoltaan pienimmässä, aggregoitumattomassa muodossa. Tässä kuvatuista puhdistusvaiheista saadulle valmisteelle on annettu nimitys "AIF", sen erottamiseksi valmisteesta, joka saatiin käyttämällä esimerkissä 2 kuvattua menetelmää. Tässä esimerkissä ja sitä seuraavassa esimerkissä (ts. esimerkissä 16) aktiivista tekijää valmisteissa kutsutaan yksinkertaisesti "anti-inflammatoriseksi tekijäksi". Kaikki puhdistusvaiheet teh-10 tiin minimoiden mahdollinen bakteerien tai pyrogeenien aiheuttama kontaminaatio. Liuosten valmistamiseen käytettiin steriiliä vettä ja kaikki lasitavara depyrogenoitiin.

Vaihe 1: < 10 00 molekyylipainon ("MW") ultrasuodatus

Tuoretta kuorittua S100 immuunimaitoa (katso esimerkistä 1 immuunimaidon saamiseksi 15 käytettävien menetelmien kuvausta) pumpattiin 10,000 MP:n katkaisurajan (cutoff) ult-rasuodatusmembraanin (Filtron) läpi paineella 207 kPa. Läpäissyt osa kerättiin depyro-' .*. genoituihin pulloihin, joita pidettiin jäissä. Läpäisseet osat steriilisuodatettiin ja säilytettiin »· · j ääkaapissa käyttöön saakka. < 10,000 MW:n läpäissyt osa sisältää maidon anti-inflamma- ·. ' j torisen tekijän, samoin kuin molekyylipainoltaan pieniä peptideitä, oligosakkarideja ja suu- r ί*’ ί 20 ren määrän laktoosia. Anti-inflammatorinen aktiivisuus läpäisseessä osassa on ; '** pienimolekyylipainoisessa, aggregoitumattomassa muodossa.

• ·· # ♦ · f · t

Vaihe 2: DEAE-Sepharose-kromatografia 4 *

Anti-inflammatorisen aktiivisuuden alkuffaktiointi tehtiin DEAE-Sepharosella. 5 x 50 cm • i t • « 25 pylväs, joka sisälsi 1 litran DEAE-Sepharosea tasapainotettiin permeaattipuskurilla. Per- • · t i « i meaattipuskuri on steriili, endotoksiineista puhdas liuos, joka sisältää diffundoituvia ioneja, 2 · * * * * j oita esiintyy bulkkimaidossa, sopivina konsentraatioina. Permeaattipuskuri sisältää * « V.’ CaCl2:ia, MgCl2:ia, NaCkia, Na-sitraattia jaNaH2P04:ia. Tyypillisesti noin 8 litraa < r · * * 4 * · *J 10,000 MP:n permeaattia pumpattiin DEAE-Sepharose-pylvääseen virtausnopeudella noin 1 500 ml tunnissa. Pylvään eluaattia seurattiin 280 nm:ssä. Pylvästä pestiin tislatulla vedellä 49 kunnes 280 nm:n absorbanssi palautui perustasolle (tyypillisesti vaadittiin noin 6-8 litraa tislattua vettä). Anti-inflammatorinen aktiivisuus sitoutui pylvääseen ja se eluoitiin noin 4 litralla 0,5 M ammoniumasetaattia vedessä, pH 7,4. Eluaatti lyofilisoitiin kuiviin ja punnittiin. Kahdeksasta litrasta läpäissyttä osaa saadun talteen otetun materiaalin paino oli tyypil-5 lisesti välillä 15-20 grammaa. Koska ammoniumasetaatti haihtuu täysin lyofilisoinnin aikana, jäännöspaino edustaa sitoutuneen materiaalin painoa. Anti-inflammatorinen aktiivisuus tutkittiin hiiren neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määrityksellä.

Vaihe 3: H-40-kromatografia 10 DEAE-Sepharose-pylväästä eluoitu materiaali fraktioitiin vielä lajittelupylväässä, jotta ero tettaisiin anti-inflammatorisesta aktiivisuudesta vastuussa oleva tekijä muista pienimole-kyylipainoisista komponenteista. Kahdeksan grammaa DEAE-näytettä liuotettiin 50 inhaan tislattua vettä ja lisättiin 2,5 x 150 cm.n pylvääseen, joka sisälsi 736 ml Toyopearl HW-40:ää (Rohm and Haas), joka oli tasapainotettu vedellä. Pylväs kehitettiin tislatulla vedellä 15 virtausnopeudella 40 ml tunnissa ja eluaattia seurattiin 280 nm:ssä. Kerättiin fraktiot ja analysoitiin niistä anti-inflammatorinen aktiivisuus hiiren neutrofiilien kulkeutumisen inhi- • · : bition määrityksellä. Fraktiot, jotka osoittivat aktiivisuutta ja minimiabsorbanssia 280 nm:ssä yhdistettiin ja lyofilisoitiin. Noin 80 mg materiaalia, joka sisälsi anti-inflammato- • · • · * *· : rista aktiivisuutta, otettiin talteen kahdeksasta litrasta läpäissyttä osaa.

20 *... Vaihe 4: Affigel 601 -kromatografia • · · o · ·

Lopulliseen puhdistusvaiheeseen kuului aktiivisen tekijän affiniteettikromatografia pyl- j ·, väässä, joka oli pakattu boronaatilla derivatisoidulla polyakryyliamidipohjaisella väliai- • · * . ·: ·. neella (AffiGel 601, Bio-Rad), jolla on affiniteettiä samantasoisiin vierekkäisiin cis-hyd- . *. 25 roksyyliryhmiin. 40 mg pienimolekyylipainoista HW-40:stä saatua materiaalia tasapaino-• · · • · · * * ’. [ tettiin 10 ml:lla 0,25 M ammoniumasetaattia, pH 7,0 ja lisättiin AffiGel-pylvääseen, joka • • · · oli myöskin tasapainotettu 0,25 M ammoniumasetaatilla. Eluaattia seurattiin 280 nm:ssä.

• · · • · · I *. Pylväs pestiin 400 ml :11a 0,25 M ammoniumasetaattia virtausnopeudella 50 ml tunnissa, • · · • · · kunnes 280 nm:n absorbanssi pieneni taustan tasolle. AffiGel-pylväs eluoitiin sitten 1600 1 ml:lla 0,1 M muurahaishappoa, pH 2,8. Eluaatista testattiin aktiivisuus hiiren neutrofiilien kulkeutumisen inhibitiomäärityksellä ja lyofilisoitiin kuiviin. Noin 8 - 10 mg sitoutunutta materiaalia, joka sisälsi anti-inflammatorista aktiivisuutta, otettiin talteen 8 litrasta läpäis syttä osaa.

50 5 Tällä menetelmällä saadulle valmisteelle annetaan nimi "AIF". Valmiste oli hyvin puhdistettu anti-inflammatorisen tekijän suhteen, mutta se ei ole homogeeninen. Valmiste osoittaa anti-inflammatorista aktiivisuutta hiiren neutrofiilien kulkeutumisen inhibitiomääritykses-sä, rotan käpälän turvotuskokeessa, rotan korvan paisumiskokeessa ja estää neutrofiilien sitoutumista rotan suoliliepeen pikkulaskimoiden endoteeliin (visualisoitu elintensisäisellä 10 mikroskoopilla). Perustuen vertaileviin analyyseihin hiiren neutrofiilien kulkeutumistestis-sä, AIF on noin 55,000 kertaa puhdistetumpi kuin alkuperäisen kuoritun maidon < 10,000 MW:n permeaatti.

Esimerkki 16 15 Anti-inflammatorisen tekijän valmisteiden vaikutus neutrofiilien adheesioon endotee-lisoluihin ja neutrofiilien kulkeutumiseen verisuonistossa • · :,· · Tutkittiin anti-inflammatorisen tekijän vaikutusta neutrofiilien adheesioon endoteelisolui- ..! Γ hin ja neutrofiilien kulkeutumiseen verisuonistosta. Käytettiin kahta eri valmistetta anti- • · • · · ’· : inflammatorisesta tekijästä. Yksi valmiste tehtiin käyttämällä esimerkissä 2 kuvattua '20 puhdistusmenetelmää. Tämän esimerkin tarkoituksia varten tätä valmistetta kutsutaan yk- i\.

sinkertaisesti "MAIF":iksi. Toinen anti-inflammatorisen tekijän valmiste tehtiin käyttämäl-lä esimerkissä 15 kuvattua puhdistusmenetelmää, ja sitä kutsutaan sekä siinä esimerkissä että tässä esimerkissä "AIF":iksi. Tulee ymmärtää, että sekä MAIF että AIF sisältävät anti- • · · . ·: ·. inflammatorisen tekij än puhtaudeltaan eri tasoisena.

• · · 25

• · I

Kemikaalit: t :

Ihmisen seerumin albumiinia, trypsiiniä, verihiutaleita aktivoivaa tekijää (PAF), forbolimy- • · · • · · * *. ristaattiasetaattia (PMA), propidiumjodidia ja Histopaqueta hankittiin Sigma Chemical • · · • · ·

Co.:sta, St. Louis, Mo. Ihmisen neutrofiilien elastaasi ostettiin Calbiochemistä. Hiiren anti- 1 ihmis CD18 -monoklonaalista vasta-ainetta (IgG,-alaluokka, FITC-konjugaatti) ja hiiren 51 anti-avaimenreikäkotilon hemosyaniinia (IgGralaluokka, FITC-konjugaatti), joita käytettiin negatiivisina kontrollivasta-aineina, ostettiin Beckton Dickinson Systems Inc.dta, Mountain View, Kalifornia. Simply Cellular™ mikrohelmiä ostettiin Flow Cytometry Standards Corp.:ilta, Research Triangle Park, NC. Toiset reagenssit olivat parasta kaupalli-5 sesti saatavilla olevaa laatua, ja niitä käytettiin ilman lisäpuhdistusta.

Menetelmät in vivo:

Elintensisäinen mikroskopiatutkimus. Kaksikymmentäneljä koiraspuolista Wistar-rottaa (180 - 250 g) pidettiin puhdistetulla laboratorioruokavaliolla ja paastotettiin 24 tuntia en-10 nen leikkausta. Eläimet nukutettiin aluksi pentobarbitaalilla (12 mg/100 g ruumiinpainoa). Oikeanpuoleinen päänvaltimo ja kaulalaskimo kanyloitiin systeemisen valtimopaineen laskemiseksi (Statham P23 A paineanturi ja Grass fysiologinen rekisteröintilaite) ja vastaavasti lääkkeen antamiseksi. Aukaistiin vatsa keskiviivaa pitkin ja eläimet asetettiin selälleen. Keskisuolesta vedettiin ulos segmentti aukileikatun vatsan kautta ja kaikki paljastunut ku-15 dos peitettiin suolaliuoksessa liotetulla vanutupolla kudosten kuivumisen estämiseksi. Suolilieve asetettiin varovasti optisesti kirkkaalle katselujalustalle, joka salli 2 cm2 kudosseg- • · :, · : mentin läpivalaisun. Jalustan lämpötila pidettiin 37 0 C: ssa j atkuvalla lämpötilan kierrättä- ..li* jällä (Fisher Scientific, malli 80). Peräsuolen ja suoliliepeen lämpötilaa seurattiin sähkö- « · • · · ’· · lämpömittarilla. Suolilieve peitettiin lämmitetyllä bikarbonaatilla puskuroidulla suolaliuok- ^ *20 sella (pH 7,4). Elintensisäistä mikroskooppia (Nikon Optiphot-2, Japani), jossa oli X 25 i*\.

*... objektiivin linssi (Leitz Wetzlar L25/0,35, Saksa) ja X 10 okulaan, käytettiin suoliliepeen t : : mikrokierron havainnoimiseksi. Kuva heijastettiin mikroskooppiin kiinnitetyllä videoka- .. < meralla värimonitoriin ja kuvat nauhoitettiin jälkikäteen tehtävää analysointia varten käyt- • · · . ·: ·. täen videokasettinauhuria. Tutkimukseen valittiin yksittäisiä haarautumattomia laskimoita, • · · , *. 25 joiden läpimitta vaihteli välillä 25 - 40 pm. Laskimoiden läpimitta mitattiin suoraan videon • · · • · · mikrometriä käyttämällä. Kiinnittyneiden ja siirtyneiden neutrofiilien määrä määritettiin • * erikseen nauhoitettuja kuvauksia toistettaessa. Neutrofiilin tulkittiin olevan kiinnittynyt • « # • · · * *. laskimon endoteeliin, jos se pysyi paikallaan 30 sekuntia tai enemmän. Vieriviksi neutrofii-• · · ·» · · * ' leiksi määriteltiin ne valkoiset verisolut, jotka liikkuivat pienemmällä nopeudella kuin 1 erytrosyytit samassa suonessa. Leukosyyttien vierimisnopeus määritettiin sen ajan avulla, 52 jonka leukosyytti tarvitsi kulkeakseen tietyn välimatkan pikkulaskimon pituuden suuntaisesti.

Kokeen protokolla. Kun kaikki hemodynaamiset määreet olivat vakaassa tilassa, kuvia 5 suoliliepeestä nauhoitettiin 5 minuuttia. Suolilievettä alijäähdytettiin sitten 60 minuuttia 100 mM:llä PAF:ia joko 40 tai 5 mg/rotta MAIF-valmistetta ollessa läsnä (iv.). Edellä mainittujen määreiden mittaukset tehtiin jälleen 30 ja 60 minuutin PAF-alijäähdytyksen jälkeen. Kahdessa koeryhmässä suoliliepeen valmisteet altistettiin jälleen PAF:ille kuten edellä on kuvattu, mutta 30 minuutin kuluttua ne saivat MAIF-valmistetta joko 40 tai 5 10 mg/rotta. Kolmessa lisäkokeessa annettiin AIF-valmistetta joko esikäsittelynä tai jälkikäsittelynä.

Menetelmät in vitro:

Neutrofiilien eristäminen. Neutrofiilit terveistä luovuttajista puhdistettiin dekstraanisedi-15 mentoinnilla, mitä seurasi hypotoninen lyysaus ja Histopaque-sentrifugointi. Paitsi dekst- raanisedimentointivaihetta, joka tehtiin huoneenlämmössä, soluja pidettiin 4 °C:ssa koko • · • · : eristysmenettelyn ajan. Soluvalmisteet sisälsivät 95 % neutrofiilejä ja enemmän kuin 99 % • · · • · ·: näistä oli elinkykyisiä määritettynä trypaanisineä käyttämällä. Eristämisen jälkeen neutro- • · · ** * fiilit suspendoitiin uudelleen lopulliseen konsentraatioon 2 X 106 solua/ml fosfaatilla pus- • · ., 20 kuroituun suolaliuokseen (PBS). Yhteneviä määriä soluja inkuboitiin sitten 37 °C:ssa 20 I · · # minuuttia eri konsentraatioissa joko MAIF- tai AIF-valmistetta. Pesun jälkeen neutrofiilejä inkuboitiin pimeässä 4 °C:ssa 30 minuuttia saturoivissa konsentraatioissa fluoreskeiiniin :·. konjugoitua hiiren anti-ihmis- CD18:aa, ihmisen CD1 lb:tä, IGG:llä päällystettyjä mikro- • · · ; | : helmiä (Simply Cellular™ mikrohelmiä) tai hiiren negatiivista kontrollivasta-ainetta.

, \ 25 • · · • · · • · · · ,···. Immunofluoresenssivärjäys ja FACS-analyysi. Suoraimmunofluoresenssi CD18:n pin- • · · . taekspression mittana tehtiin analysoimalla FACScanissa (Becton Dickinson Systems Inc.

• · · • · · ! Mountain View, CA) käyttäen kanavan numeroa (log asteikko), joka edusti 10,000 solun • · · • · keskimääräistä fluoresenssi-intensiteettiä. Logaritmiset kanavanumerot muunnettiin lineaa- 1 lisiksi arvoiksi käyttäen alalla hyvin tunnettuja menetelmiä. Spesifinen keskimääräinen 53 fluoresenssi-intensiteetti soluille, jotka oli värjätty CD18-vasta-aineilla, laskettiin sen jälkeen, kun oli vähennetty negatiiviselle kontrollivasta-aineelle altistettujen solujen fluoresenssin intensiteetti. Elinkyvyttömät solut seulottiin käyttämällä propidiumjodidia.

5 Superoksidianalyysi. Superoksidin tuotanto eristetyistä neutrofiileistä määritettiin PMA-ja N-formyyli-Met-Leu-Phe ("fMLP") -stimulaation jälkeen eri konsentraatioiden MAIFria läsnäollessa. Aktivoitujen neutrofiilien aiheuttamaa sytokromi C:n pelkistymistä mitattiin käyttämällä spektrofotometriä (Hitachi U2000) 550 nm:ssä. Lyhyesti esitettynä näyte lisättiin kahteen kyvettiin ja yhtä kyvettiä käytettiin referenssinä. Jälkimmäinen sisälsi superok-10 sididismutaasia (superoksidin poistaja). Neutrofiilien annettiin tasapainottua 37 °C:ssa 5 min eri konsentraatioiden MAIF:ia läsnäollessa ja soluja stimuloitiin sitten joko PMA:lla tai fMLP:llä. Superoksidin tuotantoa mitattiin 3 min.

Proteaasin vapautuminen. Kaivot pinnoitettiin 125I:llä leimatulla albumiinilla ja annettiin 15 kuivua yli yön. Sitoutumaton albumiini pestiin ja PMA:lla stimuloituja neutrofiilejä inku-boitiin kaivoissa yksi tunti eri konsentraatioiden MAIF:ia läsnäollessa tai puuttuessa. Va- • · :.: : paa radioaktiivisuus kaivoj en supematantissa j aettiin kokonaisradioaktiivisuudella kussa- ... i kin kaivossa, jotta saatiin analysoitua proteolyysin taso.

• · · • · • · 20 Tulokset • · *... Tuloksista on esitetty yhteenveto kuvissa 24 - 30 ja taulukoissa 7-9. Kuviossa 24 osoite- taan, että PAF-alij äähdytys lisäsi neutrofiilien tarttumista hiussuonten j alkeisiin pikkulaski- ;·. moihin noin 6-kertaiseksi 60 min aikana. 40 mg MAIF-valmistetta kullekin rotalle vähensi • · · . ·: ·. PAF: in indusoimaa neutrofiilien tarttumista enemmän kuin 90 % 3 0 minuutissa j a enem- • · · * 25 män kuin 80 % 60 minuutissa. Kiinnostavaa oli, että MAIF-esikäsittely näytti myös vä- • · · • · · j '··. ’ hentävän tarttuvien neutrofiilien lukumäärää ennen altistusta PAF:ille. MAIF:in pienempi • · · konsentraatio (5 mg rottaa kohti) oli vähemmän tehokas, pienentäen leukosyyttien tarttu- • · · • · · I *. mistä 50 % 60 minuutissa. AIF-valmisteen konsentraationa 0,01 mg rottaa kohti havaittiin • · · • · · vähentävän leukosyyttien tarttumista noin 50 % 60 minuutissa. Kymmenkertaisesti 1 suuremmassa AIF-konsentraatiossa havaittiin hyvin suuri lisääntyminen leukosyyttien tart- 54 tuulisessa (tuloksia ei ole esitetty). Tarttuminen oli niin dramaattista, ettei videonauhaa voitu analysoida. Kuvio 25 esittää MAIF:in ja AIF:in vaikutuksen neutrofiilien kulkeutumiseen. MAIF:in konsentraationa 40 mg rottaa kohti 5 mg rottaa kohti ja AIF:in konsentraa-tiona 0,01 mg rottaa kohti havaittiin estävän neutrofiilien kulkeutumisen lisääntymisen täy-5 sin PAF-altistuksen aikana. Neutrofiilien vuoto ei näyttänyt muuttuvan merkitsevästi MAIF:illa käsitellyssä ryhmässä verrattuna käsittelemättömään ryhmään (kuvio 26). Kun annettiin AIF:ia, me havaitsimme aluksi enemmän vieriviä neutrofiilejä kuin tavallisesti, niiden lukumäärä kuitenkin pieneni ajan kuluessa.

10 Toisessa koesarjassa annettiin eri anti-inflammatorisia aineita sen jälkeen kun neutrofiilit olivat jo tarttuneet (kuvio 27). Tässä koesaqassa MAIF-annos 40 mg/rotta esti leukosyyttien tarttumisen, mutta annos 5 mg/rotta ei tehnyt sitä. AIF annoksena 0,01 mg rottaa kohti esti neutrofiilien tarttumista noin 25 %. Suuremman konsentraation MAIF:ia (40 mg/rotta) vaikutuksen analysoimiseksi tutkittiin tarttuvien neutrofiilien lukumäärä nauhoituksen 15 alussa j a uusien neutrofiilien, j otka tarttuivat yli 5 minuutiksi lukumäärä kussakin vaiheessa. Kuviossa 27a osoitetaan, että vähemmän neutrofiilejä oli tarttuvia 10 minuutin jälkeen * m i MAIF:in antamisesta osoittaen, että anti-inflammatorinen tekijä oli todellisuudessa "kuori- • · · ···· nut pois" tarttuvat neutrofiilit. Lisäksi kuvio 27b osoittaa selvästi, että MAIF esti uudet • · · ’· ; neutrofiili-endoteelisolutakertumiset. Se nopeus, jolla neutrofiilit kierivät pikkulaskimoita • ·

., 20 pituussuuntaan, ei vaihdellut ryhmien välillä tai ajan suhteen sillä poikkeuksella, että AIF

’... saattaa ollut lisännyt neutrofiilien kierimisnopeutta (kuvio 28). Tämä vaikutus oli melko kiinnostava sen tosiseikan valossa, että punasolujen nopeus pysyi muuttumattomana (kuvio 29). Tulokset antavat olettaa, että yksinkertainen hydrodynaamisten voimien lisääntyminen • · · . *: *. ei voi selittää neutrofiilien kierimisnopeuden lisääntymistä. MAIF ei vaikuttanut myöskään i *·. 25 neutrofiilien vuotoon, mutta AIF taas pienensi sitä (kuvio 30).

• i i • · · · • · · i : • ·· .*. Tulokset kokeista in vitro osoittavat, ettei anti-inflammatorinen tekijä häiritse neutrofiilien • · · • · · \ '. aktivaatiota per se. Superoksidiradikaalin poistaja, superoksididismutaasi esti täysin • · · PMA:n ja fMLP:n stimuloimien neutrofiilien aiheuttaman sytokromi c:n pelkistymisen, 1 antaen olettaa, että tämä on superoksidin välittämä prosessi. Äärimmäisen suuret MAIF- 55 konsentraatiot vaikuttivat sytokromi c:n pelkistymiseen vain minimaalisesti, antaen olettaa, ettei MAIF suoraan poista superoksidia (taulukko 7). MAIF ei vaikuttanut proteaasin vapautumiseen (tuloksia ei ole esitetty).

5 Havaittiin, että MAIF tai AIF pystyi vähentämään monoklonaalisen vasta-aineen anti-CD18 sitoutumista (taulukko 8). Tätä ei tapahtunut CD1 lb-vasta-aineen yhteydessä.

MAIF- tai AIF-valmisteet eivät myöskään vaikuttaneet CD18-vasta-aineen sitoutumiseen IgG:llä päällystettyihin mikrohelmiin, antaen olettaa, ettei anti-inflammatorinen tekijä vaikuttanut monoklonaalisen vasta-aineen anti-CD18 kykyyn sitoutua substraattiin, vaan vai-10 kutti todennäköisemmin ligandiin CD18. Sama kuvio havaittiin stimuloitujen neutrofiilien suhteen (taulukko 9). Tulisi huomata, että sitoutuminen CD18:aan vaihteli päivien välillä, koska kunakin päivänä käytettiin eri soluja. Sen vuoksi ei voida tehdä suoraa vertailua taulukon 8 ja taulukon 9 tulosten välillä.

15 _ TAULUKKO 7 MAIF:in vaikutus solujen superoksidin eritykseen : MAIF PMA-stimuloitu su- fMLP-stimuloitu su- ·:· peroksidin tuotanto peroksidin tuotanto • ♦ · · .·. : (nmol/min/107 solua) (nmol/min/107 solua) *:**: 0,0 mg/ml 153 55 I**·· 20 0,1 mg/ml 145 50 ; 1,0 mg/ml 143 40 5,0 mg/ml 140 32 **..1.1 10,0 127 *.1 1 mg/ml

i .1. I

·1.: : 25 taulukko 8

Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus solun pinnan antigeenien CD18 ja CD11 tarjolla oloon • · · • · ♦ • · · • · · • · 56

Stimuloimattomat Kanavan keskimaa- Kanavan keski- neutrofiilit räinen fluo- määräinen fluoresenssi resenssi

Anti-CD18 vasta- Anti-CDll vas-aine ta-aine

Vain neutrofiilit 314,24 1594,57 5 +0,1 mg/ml MAIF 234,26 1553,74 +1,0 mg/ml MAIF 262,78 1796,00_ + 0,1 μg/vcιl AIF 248,28 1577,04_ + 1,0 μg/ml AIF 188,93 1554,61_

Helmet + Anti- 60,03 10 CD18 vasta-aine + 1 mg/ml MAIF _88,61_ + 1 Mg/ml AIF__84,99_ taulukko 9 ··♦ 15 MAIF: in vaikutus solun pinnan antigeenien CD18 tar- jolla oloon stimuloiduilla ja stimuloimattomilla *· · neutrofiileillä, kanavan keskim. fluoresenssi

Stimuloimattomat neutro- 236,95 • ** fiilit | J ♦ *’ 1 20 + MAIF 1 mg/ml 216,08 + MAIF 5 mg/ml 251,51 • · _ _ .·;·. Stimuloidut neutrofiilit 266,69 • · · ____ - - - - _ . _ _ —---— + MAIF 1 mg/ml 158,68 • · · _ _ !···’. + MAIF 5 mg/ml 171,96 T 25 • · • · · • « I • · • · ♦ • · · ’ Tulosten tarkastelu 57

Edellä olevan esimerkin tulokset antavat olettaa, että anti-inflammatorinen tekijä estää neutrofiilien tarttumista ja kulkeutumista pikkulaskimoissa annoksesta riippuvalla tavalla. Tärkeämpää kuitenkin on, että anti-inflammatorinen tekijä voisi, lyhyenä ajanjaksona (10 min), kumota neutrofiilien tarttumisen näihin verisuoniin. Ainoat muut aineet, jotka saavat 5 tarttuvat neutrofiilit irrottamaan otteensa endoteelistä tällaisella tehokkuudella, ovat monoklonaaliset vasta-aineet, jotka on suunnattu CD1 l/CD18-glykoproteiinikompleksia vastaan neutrofiilissa. MAIF :illa ei näyttänyt olevan mitään vaikutusta veren virtaukseen yksittäisten verisuonten läpi tai systeemiseen verenpaineeseen, antaen olettaa, että hemodynaamiset tekijät, kuten leikkausstressi, eivät voineet vastata leukosyyttien tarttumisen peruuntumi-10 sesta. Vaikka leukosyyttien vieriminen näyttää olevan edellytyksenä leukosyyttien tarttumiselle, MAIF ei vaikuttanut leukosyyttien vierimisnopeuteen tai leukosyyttien vuotoon. Jälkimmäinen tulos antaa olettaa, että anti-inflammatorinen tekijä ei vaikuttanut niiden neutrofiilien lukumäärään, jotka vierivät suonen läpi ja sen vuoksi, että tarttuvien leukosyyttien väheneminen ei johtunut siitä, että vähemmän leukosyyttejä olisi ollut 15 vuorovaikutuksessa endoteelin kanssa. Se tosiseikka, että leukosyyttien vierimisnopeus, samoin kuin leukosyyttien vuoto pysyi muuttumattomana, antaa olettaa, että MAIF-valmis- • · • · ···* '· teessä oleva anti-inflammatorinen tekijä ei vaikuttanut neutrofiileissä ja endoteelissä ole- • · * ··'··' viin tarttumismolekyyleihin, jotka ovat vastuussa leukosyyttien vierimisestä (IL-selektiini, • · · * [ P-selektiini).

.! * 20 •; , On raportoitu, että leukosyytti voi säädellä omaa tarttumistaan vapauttamalla superoksidia I · · samoin kuin proteaaseja. Sen vuoksi oli mahdollista, että leukosyyttien tarttumisen puute MAIF:in ja AIF:in läsnäollessa johtui näiden valmisteiden kyvystä estää superoksidin tai ; * · *: proteaasien vapautuminen. Tämä mahdollisuus ei kestä sen tosiseikan valoa, että MAIF :illa i .·. 25 oli vain vähän vaikutusta superoksidin tai proteaasien vapautumiseen, eikä se ollut • · · • · · · , · · ·. vuorovaikutuksessa vapautuneiden proteaasien kanssa tai poistanut vapautunutta superok- .*. sidia. Sitä paitsi MAIF ei näyttänyt vaikuttavan neutrofiilien elinkykyyn arvioituna pro- • · · ; pidiumjodidilla, mikä teki anti-inflammatorisen tekijän suoran sytotoksisen vaikutuksen • · · • · neutrofiileihin epätodennäköiseksi.

30 58

Neutrofiilin tarttumiseksi ja kulkeutumiseksi sillä täytyy olla intakti CD1 l/CD18-glyko-proteiinikompleksi. Tarttumiskompleksin immunoneutralisaatio heikentää täysin neutrofiilin kyvyn tarttua pysyvästi endoteeliin ja siirtyä ympäröivään kudokseen. Koska neutro-fiilien tarttuminen ja siirtyminen on nopeutta rajoittava vaihe kudosvauriossa, johon liittyy 5 joukko tulehdustiloja, aine joka häiritsee näitä prosesseja estäisi myöskin todennäköisesti tulehdusreaktion. Tässä tutkimuksessa sekä MAIF että AIF kumosivat dramaattisesti neut-rofiilien tarttumisen ja estivät neutrofiilien kulkeutumisen, jota PAF indusoi. Koska AIFrn, MAIF:in ja anti-CD18-monoklonaalisen vasta-aineen välinen samanlaisuus indusoi neutrofiilien tarttumisen kumoutumista, näytti mahdolliselta, että anti-inflammatorinen tekijä 10 AIF rissa ja MAIF rissa käytti vaikutustaan suoralla vuorovaikutuksella CD18-glykoprote- iinikompleksin kanssa. Edellä esitetyt tulokset in vitro tukevat tätä näkemystä, että sekä AIF että MAIF estivät anti-CD 18-vasta-aineen kyvyn sitoutua CD18-glykoproteiinikom-pleksiin. Sitä vastoin AIF tai MAIF eivät vaikuttaneet CD1 lbrn sitoutumiseen sen vastaavaan monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Lopuksi, AIF-ja MAIF-valmisteet eivät häirin-15 neet monoklonaaliset! vasta-aineen anti-CDl 8 kykyä sitoutua IgGrllä päällystettyihin mik-rohelmiin. Näin ollen voidaan päätellä, että anti-inflammatorinen tekijä on vuorovaikutuk- • · • · · sessa CD 18-kompleksin kanssa suoraan ja estää CD 18 raa sitoutumasta eri ligandeihin, mu- • · · ·;·* kaanluettuna endoteelisoluj en tarttumismolekyylit.

• · · • · • · .. 20 Esimerkki 17 ! *·· •; · # MAIF: in vaikutus kiertäviin leukosyytteihin t · · •

Useat farmakologiset aineet voivat inhiboida neutrofiililien kulkeutumista. Kun jotkin niis- : *. tä, kuten syklofosfamidi, ovat sytoreduktiivisia j a toimivat inhiboimalla hemopoieesia luu- :' · ytimessä, toisilla aineilla, kuten steroideilla ja ei-steroidisilla anti-inflammatorisilla aineilla i .·. 25 on spesifiset vaikutuskohdat, ja ne eivät johda leukosytoosiin. Sen vuoksi oli tärkeää mää-• · · • · · · ,*··. rittää anti-inflammatorisen tekijän vaikutus verenkierrossa kulkevien valkosolujen luku- • · · määrään j a suhteisiin.

• · · • · • « • · · • · · • ·

Tehtiin kaksi koetta. Ensimmäisessä MAIF-valmiste annettiin intravenaalisesti annoksena 1 40 mg/rotta yhdelle 6 eläimen ryhmälle ja kontrolliryhmä injektoitiin suolaliuoksella. Ve- 59 rinäytteet otettiin perustasosta, 1,4 ja 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Tuloksista on esitetty yhteenveto kuviossa 31.

MAIF:in antaminen johti verenkierrossa kulkevien neutrofiilien lukumäärän lisääntymi-5 seen, maksimi 4 tunnin kuluttua, ja vastaavasti ääreisveren lymfosyyttien lukumäärän vähenemiseen. Tehtiin vielä annos-vaste-tutkimus, jossa ryhmä rottia injektoitiin intravenaa-lisesti suolaliuoksella, 5,10 tai 20 mg:lla MAIF-valmistetta. Kustakin rotasta oli otettu verta 7 vrk aikaisemmin, tarjoamaan perustason arvot, ja verta otettiin taas 4 tuntia MAIF-in-jektion jälkeen. Tulokset on esitetty kuviossa 32. Kaavioon on sisällytetty tulokset, jotka 10 on saatu näytteestä, joka on otettu 4 tuntia 40 mg MAIF-valmistetta antamisen jälkeen (katso kuvio 31).

MAIF-annokset johtivat veressä kiertävien neutrofiilien lukumäärän lisääntymiseen ja lymfosyyttien määrän vähenemiseen. Vaikka vaikutus lymfosyytteihin oli lineaarisesti riippu-15 vainen annoksesta, neutrofiilien lukumäärän lisääntyminen oli käyrän muotoinen, suurimman vaikutuksen ollessa havaittavissa niissä eläimissä, joille oli annettu 10 mg.

• · • · • · · • · · · »·· • · · :' Nämä tulokset tulevat sitä käsitystä, että anti-inflammatorinen tekijä muuntelee tulehdusta • · · ’* · vaikuttamalla neutrofiilien tarttumiseen endoteelisoluihin.

• · .. 20 » *· *·.. > Saatiin myös tulokset, jotka koskivat kolmen muun solukohdennetun, anti-inflammatori- I · · sen/immunomuuntelevan aineen vaikutusta verenkierrossa oleviin leukosyytteihin rotassa.

: ·. Steroidilääke metyyliprednisoloni aiheuttaa muutoksen lymfosyytti/neutrofiili -suhteessa • * * . * j ’; j oka on analoginen MAIF :in yhteydessä nähdyn kanssa. Temporaalinen suhde lääkkeen i \·' 25 antamisen ja vaikutuksen välillä on jokseenkin erilainen. Hylkimisenvastainen/anti- • · · • · · · , · · ·. inflammatorinen aine syklosporiini A aiheuttaa myös kiertävien neutrofiilien lukumäärän • · · . lisääntymistä, mutta lymfosyyttien lukumäärät joko lisääntyvät tai niihin ei ole vaikutusta • · · • · · annoksesta riippuen. Sitä vastoin sytotoksinen lääke syklofosfamidi poistaa sekä kiertävät • ·· • · lymfosyytit että neutrofiilit. Anti-inflammatorisen tekijän vaikutukset näyttäisivät yh- 1 tenevän läheisesti metyyli-prednisolonin vaikutuksen kanssa.

60

Esimerkki 18

Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus lymfosyyttien toimintaan

Anti-inflammatorisen tekijän kyky indusoida palautuva kierrossa olevien lymfosyyttien lukumäärän väheneminen (esimerkki 17) antoi aihetta lisätutkimuksiin tekijän vaikutukses-5 ta lymfosyyttien toimintaan. Siirros vastaan isäntä (GvH) ja isäntä vastaan siirros (HvG) -analyysejä käytettiin määrittämään tekijän vaikutus T-lymfosyyttien toimintaan.

HvG-analyysissä oleviin Dark Agouti -emorottiin ("DA") injektoitiin i.v. 20 mg MAIF-valmistetta 48,24 ja 3 tuntia ennen kuin lymfosyyttejä niiden Fl-hybridijälkeläisistä (DA x 10 Hooded Oxford -rotat) injektoitiin niiden polkuanturoihin. Täten määritettiin anti-inflam matorisen tekijän vaikutus intaktista isännästä (DA) peräisin olevien T-lymfosyyttien kykyyn reagoida F1-lymfosyyttien vieraisiin histokompatibiliteettiantigeeneihin. Tämä menetelmä sai aikaan reaktion erittäin merkitsevän vähenemisen (30 %) osoitettuna polvitaipeen imusolmukkeen painolla (kuvio 33A).

15

GvH-reaktiossa emon (DA) lymfosyytit saatiin MAIF:illa käsitellyistä emorotista (DA) ja • ♦ : injektoitiin niiden F1 (DA x Hooded Oxford) -jälkeläisten polkuanturoihin. Tällä kokeella • · · • ♦ ·! mitattiin arvioinnissa olevista isännistä, ts. MAIF: illa käsitellyistä rotista poistettuj en T- • · · ’· | lymfosyyttien reagointia arvioinnissa in vivo. MAIF-hoito-ohjelmalla ei ollut vaikutusta 20 GvH-reaktioon (kuvio 33B).

! ’·· • · * t · · • · ·

Edellä olevien esimerkkien aikana huomattiin pernan lymfosyyttien ilmeinen lisääntymi- ;·. nen MAIF:illa käsitellyissä eläimissä. Lisätutkimukset osoittivat sekä pernan painon että * · · * pernasolujen lukumäärän merkitsevän lisääntymisen (kuviot 33C ja 33D). Pernasolujen t 25 lukumäärän lisääntyminen vastasi suunnilleen verenkierrossa olevien solujen lukumäärän • · · * · · · t · · ·. vähenemistä, j osta kerrottiin aikaisemmin.

···* • · • · · • « · e I # *. Lopuksi määritettiin anti-inflammatorisen tekijän vaikutus eristettyjen pernan lymfosyyt- • 1« • · tien kykyyn reagoida mitogeeniin konkanavaliini A. MAIF-valmisteen antamisen havaittiin 61 melkein täysin estävän viljeltyjen lymfosyyttien mitogeenisen reaktion tähän lektiiniin (kuvio 33E).

Esimerkki 19 5 Anti-inflammatorisen tekijän aiheuttama suppressio infektion indusoimaan tulehdukseen

On toteutettu tutkimuksia sen määrittämiseksi, voitaisiinko muutoksia akuutin vaiheen reaktanttien (APRt) seerumissa olevissa tasoissa käyttää kvantifioitaessa anti-inflammatorisen tekijän anti-inflammatorista aktiivisuutta. APR:t ovat ryhmä proteiineja, 10 jotka syntetoidaan reaktiona tulehdusärsykkeeseen. Yksi näistä, alfa-2-makroglobuliini on yleinen sekä ihmisissä että rotissa, ja metodeja tämän tulehduskomponentin tutkimiseksi on saatavissa. Kaksi intravenaalista MAIF-valmisteen injektiota (0 ja 24 tuntia) ei pienentänyt alfa-2-makroglobuliinin huipun reaktiota (48 tuntia). Tämä tulos osoittaa, ettei tekijä vaikuta myöhäisempään tulehdusreaktioon.

15

Esimerkki 20

Maidosta saadun anti-inflammatorisen tekijän arviointi in vitro ja in vivo (naudan nisän makrofaagianalyysi, infektiomallit hiiressä) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Naudan nisän makrofaagien inkubointi hyperimmuunimaitofraktion kanssa ei lisännyt ha 2 vaittavasti fagosytoosin määrää, mutta lisäsi makrofaagien kykyä tappaa fagosytoitua 3

Staphylococcus aureusta. Hiirissä, joihin oli injektoitu intraperitoneaalisesti 10 mg MAIF- 4 valmistetta kilogrammaa kohti, osoitettiin lisääntynyttä resistenssiä intraperitoneaaliselle 5 altistukselle letaalille Staphylococcus aureukselle.

6 7

Nisän sisäisessä Staphylococcus aureus mastitis -altistusmallissa MAIF:illa injektoiduissa 8 hiirissä näkyi merkitsevästi vähemmän nisätulehdusta ja surkastumista ja lisääntynyttä sel 9 viytymistä infektoivasta organismista. MAIF:illa käsitellyistä hiiristä olevan nisäkudok 10 sen kvantitatiivinen histologinen analyysi osoitti merkitsevästi enemmän ontelolta, vähem- 11 män keuhkorakkuloiden välistä sidekudosta ja vähemmän leukosyyttien infiltraatiota ver 62 rattuna kontrollihiiriin. Käsiteltyjen hiirten nisät sisälsivät myös vähemmän pesäkkeitä muodostavia yksiköitä kuin kontrollihiirten. Anti-inflammatorisuus näyttää käyttävän vaikutustaan ei-spesifiseen puolustusjärjestelmään muuntamalla leukosyyttien toimintaa.

5 Esimerkki 21

Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus kokeellisen infektion patogeneesiin

Ihmisen kohtaamat yleisimmän tulehduksen aiheuttajat ovat mikrobeja, ja on tärkeää määrittää minkä tahansa isännän puolustusta muuntelevan aineen teho infektiota vastaan. Kudosvaurion, joka yhdistyy moniin infektiosairauksiin, aiheuttaa itse asiassa isännän reaktio 10 infektioon, ennemmin kuin tunkeutuva organismi. Vaikka kyky muuntaa tulehdusreaktiota infektioon voi olla hyödyllinen kliininen tekniikka, tulee ymmärtää, että isännän reaktion inhiboiminen infektion aikana voi olla epäedullista. Tämä on erityisen totta neutrofiilien inhibition tapauksessa. Tutkimukset aineilla, jotka hillitsevät neutrofiilien osallistumista infektion varhaisiin vaiheisiin ovat osoittaneet, että samalla kun tulehdusta ja kudosvaurioi-15 ta voidaan suppressoida alun perin, lisääntynyt bakteerikuormitus, joka seuraa vähentyneestä solujen reaktiosta, johtaa lopulta kudosvaurion pahenemiseen. Näin ollen on olen-. j : naista arvioida maidon anti-inflammatorisen tekijän mahdollisuudet muuntaa infektiota, jotta (1) määritetään, voiko aine vähentää infektion indusoimaa kudosvauriota ja (2) ana- • · •. ’ i lysoidaan, yhdistyykö isännän reaktion mihinkään havaittuun suppressioon infektion vaka- ' ' 20 vuuden lisääntymistä.

• · i ·..

• ·· : : : * Määritettiin anti-inflammatorisen tekijän vaikutusta turvotuksen muodostumiseen sen jäl- .. keen kun oli injektoitu intradermaalisesti E. coli 075 :ttä. Käytettiin kahta 8 eläimen ryh- • · • «· ’...φ mää. Yksi ryhmä oli käsittelemätön ja toimi kontrollina, kun taas toisen ryhmän yksilöihin * * * ·_ 25 injektoitiin intravenaalisesti 40 mg MAIF-valmistetta 0,5 ml suolaliuoksessa. Välittömästi • · · • · · *".* MAIF:in antamisen jälkeen injektoitiin 100 μΐ E. coli 075:n yli yön kasvatettua viljelmää i : * I ’ intradermaalisesti kahteen nahan kohtaan rotan ajellussa selässä, mitä seurasi 100 μ1:η suo- • · • · · *·’·] laliuosta injektointi intradermaalisesti kahteen lisäkohtaan. Jotta mahdollistettaisiin turvo- i · i * tuksen tilavuuden arviointi infektoituneessa ihossa, 0,1 μΟΐ^ 125I-HSA:ta injektoitiin 1 intravenaalisesti altistuksen ajankohtana. Kuusi tuntia myöhemmin eläimet nukutettiin, 63 otettiin verinäyte, poistettiin selän nahka ja infektoidut ja suolaliuoksella injektoidut kohdat otettiin esiin. Turvotuksen tilavuus laskettiin liittämällä kudoslaskut plasmalaskuihin kuvatulla tavalla. Jotta saataisiin turvotuksen tilavuus joka kertyy E. colin läsnäolon seurauksena, suolaliuoksella injektoitujen kohtien turvotus/plasmatilavuus vähennettiin.

5 Tulokset on esitetty kuviossa 34.

MAIF:in antaminen johti turvotuksen muodostumisen inhibitioon 48 prosentilla. Tämä koe osoitti, että anti-inflammatorinen tekijä pystyi mukauttamaan infektion aikaansaamaa paikallista tulehdusreaktiota.

10

Yhteyksien tutkimiseksi anti-inflammatorisen tekijän antamisen, bakteerien replikaation, nesteen kertymisen ja tulehdussolujen infiltraation välillä käytettiin vaihtoehtoista infek-tiomallia. Polyuretaanisienet, jotka oli valmistettuja siirrostettu kuten aikaisemmin on kuvattu, infektoitiin suuruudeltaan määrätyllä näytteellä E. coli 075:ttä siirrostuksen ajankoh-15 tana. Sienet poistettiin määräaikaisin välein, punnittiin tihkuneen tulehdusnesteen tilavuu den määrittämiseksi ja puserrettiin sitten ravintoalustaan bakteereiden ja solujen poistami- • · ;.· · seksi sienistä. Bakteerien ja solujen lukumäärät arvioitiin käyttämällä alaan perehtyneiden tuntemia tekniikoita. Toteutettiin seuraava koe käyttämällä tätä mallia. Yhdeksänkymmen- • · « · · * · · tä eläintä jaettiin kahteen 45 eläimen ryhmään. Toista näistä ryhmistä ei käsitelty ja se pal- * * 20 veli kontrollina. Toiselle ryhmälle injektoitiin intravenaalisesti 40 mg MAIF-valmistetta.

Sienet siirrostettiin sitten subkutaanisesti ja siirrostuksen ajankohtana kukin sieni ympättiin i : : 105 E. coli 075 :llä. 6-8 eläimen ryhmät tapettiin sen jälkeen tietyin välein ja bakteriologi- .· # nen status ja tulehdussuodoksen määrä sienissä määritettiin. Tulokset on esitetty kuvissa • · · 35 -37.

i · · .**. 25 • « « • · · * * I. * Bakteerien replikaation taso oli paljon suurempi MAIF :illa käsitellyissä eläimissä kuin t · • · · kontrolleissa ja bakteerien lukumäärissä oli 10-, 1,000- ja 10,000-kertainen ero 4, 8 ja vas- • · · • · · * *. taavasti 16 tunnissa. Tämän jälkeen bakteerien määrä väheni, vaikka vielä 96 tunnin koh- • · · • · · dalla oli olemassa suuri ero (kuvio 35).

30 64

Varhainen reaktio infektioon on kriittinen määräävä tekijä infektiotapahtuman seurauksena. Tässä kokeessa solujen tihkuma 2,4 ja 8 tunnin kohdalla niissä eläimissä, joille oli annettu MAIF.ia, oli 27 %, 35 % ja vastaavasti 46 % kontrollitihkumasta (kuvio 36B). Solut, jotka kertyivät ensimmäisenä 24 tuntina altistuksen jälkeen ovat > 90-prosenttisesti 5 neutrofiilejä ja tämän solukomponentin suppressio tämän vaiheen aikana voi johtua bakteerien lukumäärän nopeasta lisääntymisestä. MAIF:in antaminen ei vaikuttanut nesteen kertymiseen 2 tunnin kohdalla, mutta se oli merkitsevästi vähäisempää 4, 8 ja 16 tunnin jälkeen altistuksesta. Tämä on yhtenevää aikaisemman havainnon kanssa, ettei anti-inflammatorinen tekijä suppressoinut primaarista, ei-sellulaarista vaihetta 10 turvotuksen muodostumisessa karrageenanilla tehdyssä polkuanturamallissa. Aikaisemmissa tutkimuksissa käyttäen immunomodulatorisia aineita syklosporiini A:ta ja metyyliprednisolonia osoitettiin samanlainen yhteys akuutin sellulaarisen tulehdus-tihkuman suppression ja bakteerien replikaation edistymisen välillä. Näissä tutkimuksissa lisääntynyt bakteerikuormitus edisti kuitenkin isännän reaktiota 24 - 48 tunnin välillä 15 altistuksen jälkeen, jolloin esiintyi massiivinen neutrofiilien tulva. Kun kudos osallistui, lisääntynyt tulehdusreaktio johti merkittävään kudosvaurion pahenemiseen ja arpimuo-dostukseen. Kiinnostavaa oli, että vaikka MAIF:in antaminen suppressoi varhaista tulehdusreaktiota ja liittyi 10,000 kertaiseen bakteerien määrän lisääntymiseen, ei esiintynyt neutrofiilien massiivista tulvaa 24 - 48 tuntia altistuksen jälkeen.

20

Esimerkki 22

Anti-inflammatorisen tekijän vaikutus kokeelliseen pyelonefriittiin

Aineella, joka pystyy suppressoimaan tulehdusta infektiossa aiheuttamatta jälkitilana lisääntynyttä kudosvauriota, olisi huomattavia mahdollisuuksia. Kliinisesti asiallinen 25 infektiosairauden malli taijoaisi kokeellisen perustan tällaisten mahdollisuuksien todistamiseksi.

Pyelonefriitti on infektiosairaus, joka osoittaa paikallista tulehdusta, kudosvauriota ja arpi-muodostusta pääasiallisina histologisina piirteinä. Sairaudesta on saatavilla hyvin karakte-30 risoitu malli, joka jäljittelee sairauden pääasiallisia patologisia piirteitä ihmisessä. Pyelonefriitti indusoidaan rottaan siirrostamalla suoraan kirurgisesti paljastettuun munuaiseen 65 ennalta määritetty määrä E. coli 075:ttä. Altistuksen jälkeen bakteerien lukumäärä nousee nopeasti ja saavuttaa huipun 3-4 päivää myöhemmin. Normaaleissa eläimissä infektion taso vähenee seuraavien 5 - 6 päivän jälkeen ja saavuttaa tasangon noin 10 päivää altistuksen jälkeen. 21 päivässä leesiot ovat laskeneet ja läsnä uurteisen arpikudoksen pesäkkeinä.

5 Anti-inflammatorisen tekijän vaikutuksen arvioimiseksi tässä tulehdusmallissa 26 eläimen molempiin munuaisiin indusoitiin pyelonefriitti. Puolet eläimistä hoidettiin MAIF-valmis-teella suonensisäisesti annoksella 40 mg/rotta altistuksen hetkellä ja uudelleen 48 tuntia myöhemmin. Seitsemän eläintä tapettiin 4 päivää sen jälkeen kun pyelonefriitti oli indusoituja kaksi j älj elle j äävää kuuden eläimen ryhmää 21 päivän j älkeen. Munuaiset poistettiin 10 aseptisesti ja punnittiin tulehdusnesteen suhteellisen tilavuuden määrittämiseksi. Pintaleesi-on kokoa arvioitiin suoraan visuaalisesti ja munuainen homogenisoitiin bakteerimäärien laskemiseksi. Tulokset on esitetty kuviossa 38.

Neljä päivää altistuksen jälkeen tulehdusvaste vaimeni MAIF:in antamisen jälkeen, mitä 15 todisti nesteen keräytymisen estyminen ja munuaisten pinnalla olevien leesioiden koko.

Kuten aikaisemmin oli havaittu tutkimuksissa, jotka koskivat infektoituja, ihonalaisesti • · ϊ.: : istutettuja sieniä, tulehduksen vaimeneminen varhain aiheutti bakteerien lukumäärän li- ..sääntymisen logaritmisesti MAIFrilla hoidetuissa eläimissä. 21 päivän kuluttua taudin pa-• · • « · *· · tologiassa ei ollut mitään eroa, kun mitattiin munuaisen paino, bakteerien lukumäärä tai 20 munuaisten pinnan leesioiden koko. Siten samalla kun varhaisen tulehdusvasteen vaimenit'*..

*,taminen MAIF:illa ei aiheuttanut vähenemistä kudoksen tuhoutumisessa pyelonefriitin »· · • · kroonisessa (21 päivän) vaiheessa, se ei myöskään edistänyt patologisten leesioiden j·. kehitystä kuten muut anti-inflammatoriset ja immunomodulatoriset aineet ovat tehneet.

I ·· 0 » · · • · · « . 25 Esimerkki 23 • · · • · ·

Yhteenveto tutkimustiedoista : : ·«·

Kehitettiin menetelmä, joka mahdollisti karrageenan-injektoidun polkuanturan turvotuksen • · · • · » 1 *. kerääntymisen jatkuvan tarkkailun.

r *·* o · 66

Anti-inflammatorinen tekijä ei vaikuttanut tulehdusvasteen varhaiseen, ei-fagosyyttiseen vaiheeseen, kun taas myöhempi, solujen aikaansaama reaktion vaihe inhiboitui merkitsevästi. Lisäkokeet, joissa MAIF:ia annettiin jaksoittain ennen tai jälkeen karrageenan-injek-tion, antoi lisätodisteita siitä, että MAIF antoi anti-inflammatorisen vaikutuksensa modu-5 loimalla sekundääristä, neutrofiilien välittämää tulehdusvastetta.

Anti-inflammatorisen tekijän puoliintumisajan osoitettiin olevan 1 - 2 tuntia suonensisäisen injektion jälkeen, ja tulehduksen kehittymistä voitiin vaimentaa kun tekijää annettiin 30 minuuttia altistuksen jälkeen. Tämä tulos on tärkeä anti-inflammatorisen tekijän mahdolli-10 selle terapeuttiselle käytölle.

Neutrofiili on tärkein solu, joka osallistuu akuuttiin tulehdusvasteesen. Arthusin reaktion aikana havaittiin MAIF:in antamisen jälkeen > 80 % väheneminen neutrofiilien kertymisessä, mihin puolestaan liittyi erittäin merkitsevä tulehdusreaktion sekundaaristen ominai-15 suuksien, nimittäin turvotuksen ja verenvuodon, inhiboituminen. Tämä tulos antoi lisäosoi- • , ·. tuksen siitä, että neutrofiilit ovat kohteena MAIF :in indusoimassa tulehduksen suppressios- • · · •M · sa.

• · · · • · • · • « *: 1 2 1: Yksi avainvaiheista tulehduksen kehittymisessä on neutrofiilien kulkeminen verisuonistos- • ♦ • 1·· 20 ta kudoksiin. Anti-inflammatorisen tekijän antamisen intravenaalisesti osoitettiin johtavan *·· V · neutrofiilien kulkemisen selvään ja annoksesta riippuvaan inhibitioon. Kun anti-inflamma torisen tekijän vaikutusta tutkittiin ääreisveren leukosyytteihin, havaittiin merkittävä veren- • · • « 1 ’ kierrossa olevien neutrofiilien määrän lisääntyminen, johon liittyi vastaava lymfosyyttien ·♦· ♦ · · 2 1 lukumäärän väheneminen. Tämä vaikutus oli myöskin annoksesta riippuvainen, mutta • · : 25 neutrofiilien määrän lisääntymisen tapauksessa se ei ollut lineaarinen.

• · · • · • · • · ♦ • ·

Maidon anti-inflammatorisen tekijän antamisen havaittiin sekä estävän neutrofiilien ad- • · V·· heesiota endoteeliin, että edistävän antamisen ajankohtana tarttuneina olevien isännän neut rofiilien dissosiaatiota. Tämä vaikutus on todennäköisesti tulosta anti-inflammatorisen te-30 kijän kyvystä estää vuorovaikutusta solupinnan CD18-antigeenien ja muiden molekyylien 67 välillä. Tekijän aiheuttama CD18:n sitoutumisen inhibitio näyttää olevan spesifinen siinä suhteessa, että tekijä esti CD18:n vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumisen soluihin, mutta ei estänyt samalla tavalla CD1 lb:n vastaisen monoklonaalisen vasta-aineen sitoutumista.

5

Niiden molekyylien välisten vuorovaikutusten estäminen, joihin CD18-solupinta-antigeeni osallistuu, voi johtua myöskin siitä havainnosta, että tekijä kykeni inhiboimaan isännän lymfosyyttien kykyä reagoida vieraisiin histokompatibiliteettiantigeeneihin. Toisissa tutkimuksissa anti-inflammatorisen tekijän havaittiin estävän konkanavaliinin indusoimaa mito-10 geenistä reaktiota lymfosyyteissä.

Lopuksi tekijä suppressoi merkitsevästi varhaista solureaktiota infektioon, vaikutusta, joka johti bakteerien lukumäärän logaritmiseen nousuun subkutaanisen infektion mallissa. Tämä infektion paheneminen ei johtanut tulehdusreaktion elpymiseen, kuten on nähty toisten ai- 15 neiden suhteen, jotka suppressoivat akuuttia tulehdusta infektiossa. Toinen koe, jossa käy- ’ tettiin kliinisesti käyttökelpoista infektiomallia, pyelonefriittiä, osoitti myöskin suppressii- • · · · • · · vista vaikutusta tulehdukseen, mikä liittyi bakteerien lukumäärän lisääntymiseen. Jälleen ei ·»·· : * · : havaittu mitään palautumisvaikutusta, eikä esiintyneen kudosvaurion määrässä ollut eroa ’ · * *: MAIF:illa käsitellyissä ja kontrolliryhmässä.

f’·· 20 * ·· • · · ’ · * * Tästä koesaij asta voidaan vetää seuraavat j ohtopäätökset: • · • · *' 1. Anti-inflammatorinen tekijä, annettuna intravenaalisesti, suppressoi sekundääristä, neut- • » · • · ♦ *. rofiilien välittämää vaihetta karrageenanilla indusoidussa tulehdusreaktiossa.

• « • ♦ · ·*♦: : 25 «·· f · • · · * 2. Arvioituna karrageenan-polkuanturakokeella anti-inflammatorisen tekijän puoliintumis- ♦ · V aika on 1 - 2 tuntia ja se on tehokas jopa annettuna sen jälkeen kun tulehdus on indusoitu.

• · *· *: Tämän jälkeen tehdyt tutkimukset osoittavat, että tehokas puoliintumisaika riippuu sekä käytetyistä annoksesta että tulehdusärsykkeestä.

30 68 3. Anti-inflammatorinen tekijä inhiboi neutrofiilien kulkemista in vivo.

4. Anti-inflammatorisen tekijän antaminen johtaa verenkierrossa olevien neutrofiilien lukumäärän lisääntymiseen ja vastaavasti lymfosyyttien lukumäärän vähenemiseen.

5 5. Anti-inflammatorinen tekijä suppressoi isännän puolustusreaktioita infektiota vastaan, luultavasti vaikuttamalla neutrofiilien kulkeutumiseen.

6. Anti-inflammatorinen tekijä estää vuorovaikutuksia solupinnan CD18-antigeenien ja 10 muiden molekyylien välillä.

7. Anti-inflammatorinen tekijä estää neutrofiilien tarttumista endoteeliin.

8. Anti-inflammatorinen tekijä edistää tarttuvien neutrofiilien erottamista endoteelistä.

15 * ;'. 9. Anti-inflammatorinen tekijä estää isännän lymfosyyttien kykyä reagoida vieraisiin ··· · •: · histokompatibiliteettiantigeeneihin.

• * ·· • · • · · • · • · “"· 10. Anti-inflammatorinen tekijä estää lymfosyyttien mitogeenista reaktiota.

!**·· 20 • ·· * · · V · Näistä tutkimuksista saadut tutkimustulokset osoittavat selvästi, että maidon anti-inflam- matorisella tekijällä on huomattavaa vaikutusta sekä neutrofiileihin että lymfosyytteihin.

• · # | f ( <i Havaitut vaikutukset voivat johtua anti-inflammatorisen tekijän vaikutuksesta suoraan so- « « · * ♦ * *. luihin per se. tai jonkin muun solun välittäjäaineen tai liukoisen välittäjäaineen suppres- • · • · · :·· : 25 siosta (tai stimulaatiosta), mikä muuttaa epäsuorasti solujen biologista aktiivisuutta. On • · ·

| J

•; · * myöskin yleisesti tunnustettua, että useimmilla farmakologisilla aineilla on monia toimin- • · toja ja on mahdollista, että anti-inflammatorisen tekijän havaitaan vaikuttavan joukkoon • · • · · muita, vielä tunnistamattomia biologisia prosesseja. 1

Esimerkki 24 69

Menetelmä hyvin puhdistetun MAlF:in saamiseksi

Samanlaiset standardimenetelmät MAIF-valmisteen saamiseksi, kuin tässä hakemuksessa on kuvattu aikaisemmin, saavat aikaan kuoritusta maidosta peräisin olevan MAIF :in tietyn tasoisen puhdistumisen. Seuraava protokolla tuottaa kuitenkin paremmin puhdistetun 5 MAIF-valmisteen kuin aikaisemmin on ollut saatavissa.

Materiaalit. Kaikki kemikaalit olivat puhtaudeltaan reagenssilaatua. Suuren mittakaavan preparatiivisiin menettelyihin käytetty vesi oli steriiliä injektoitavaksi tarkoitettua vettä.

10 Standardoitu MAIF-valmiste. Jotta verrattaisiin MAIF-aktiivisuuksia hyperimmuunileh-mistä tai kontrollilehmistä peräisin olevissa eri maitoerissä, otettiin käyttöön standardoitu menettelytapa, joka käsittää ultrasuodatuksen ja ioninvaihtokromatografian, jotta valmistettaisiin osittain puhdistettu, erittäin aktiivinen näyte. Sopiva määrä (3-100 litraa) tuoretta, kylmää, kuorittua maitoa ultrasuodatettiin Minisette-yksikön läpi (Omega-membraani) 207 15 kPa:lla, kunnen kerätyn suodoksen tilavuus vastasi 2/3 maidon aloitustilavuudesta. Sopiva • ;\ tilavuus standardoitua, < 10,000 daltonia (< 10 K daltonia) permeaattia (250 ml, 500 ml, ··· i • · · jne) lisättiin DEAE-pylvääseen, joka oli 26,7 % permeaatin tilavuudesta. Pylväs pestiin • · · ·

:*· : ioninpoistovedellä tilavuudella, joka oli 2 kertaa permeaatin tilavuus, ja eluoitiin 0,15 M

’·*.' NaCklla tilavuudella, joka vastasi 58,3 % permeaatin tilavuudesta. MAIF-aktiivisuus • « : ’·· 20 standardoiduissa DEAE-valmisteissa määritettiin neutrofiilien kulkeutumisen inhibition • ·· * määrityksellä (katso jäljempää), ja aktiivisuus määritettiin annoksen 3 mg/120 -150 g rot taa kohti indusoiman neutrofiilien kulkeutumisen inhibitioksi prosentteina.

• · • · • Il • · · i : : *. Hyvin puhdistettu MAIF-valmiste « · • · « ·*·: · 25 Ultrasuodatus. 90 litraa hyperimmunisoiduista lehmistä peräisin olevaa tuoretta, kylmää • · · | · ·;·* (4 °C) pastöroimatonta kuorittua maitoa pumpattiin 25 °C:sen in-line lämmityshauteen • · :läpi ja vietiin sitten Murisette (Filtron) -ultrasuodatuskasetin läpi, joka sisälsi Omega (malli • · *. *: nro OS010C01) -membraanin,jonka molekyylipainon katkaisuraja (cut-off) on < 10K dal tonia. Sisääntulopaine pidettiin 207 kPa:ssa. Saatua permeaattia (< 10K-permeaatti) kerät-30 tiin jäihin, kunnes oli kertynyt 60 litran tilavuus. < 10K-permeaatti käytettiin välittömästi 70 lisäpuhdistukseen ioninvaihtokromatografialla tai se jäädytettiin ja varastoitiin -20 °C:seen tai lyofilisoitiin.

Ioninvaihtokromatografia. 60 litraa kylmää, tuoretta < 10K-permeaattia lisättiin suoraan 5 37 cm x 15 cm pylvääseen (Pharmacia, malli KS 370/15), joka sisälsi 16 litraa dietyy- liaminoetyyli (DEAE)-Sepharose Fast Flow -ioninvaihtohartsia (Pharmacia nro 17-0709- 05) virtausnopeudella 4,8 litraa/tunti käyttäen matalapaineista peristalttista pumppua. Pylväästä ulos virtaavaa nestettä seurattiin 280 ja 254 imussa Pharmacia Dual Path UV-moni-torilla (malli 19-24217-01). Ladattu pylväs pestiin 120 litralla steriiliä deionisoitua vettä, 10 jotta eluoitaisiin sitoutumaton materiaali, kunnes ulos viilaavan nesteen 280 nm:n absor-banssi palautui perustasolle. Sitoutuneet aineosat elutoitiin 35 litralla 0,15 M NaCkia. Pylvään eluaatti lyofilisoitiin ja varastoitiin meripihkan ruskeisiin lasipulloihin pimeään. MAIF-aktiivisuus pylvään eluaateissa määritettiin neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määri-15 tyksellä (katso jäljempää).

• · • · • I » • t · · •) · Kokoekskluusiokromatografia. Osittain puhdistetut DEAE-valmisteet MAIF :ista erotel- • · ·· : 1 · : tiin prepratiivisessa TSK G2500PW (21.5 x 600 mm) kokoekskluusio-HPLC-kromatogra- *:1" fiakolonnissa (TosoHaas, Montgomeryville, PA), joka oli tasapainotettu 0,15 M NH4OAc:- • · Ϊ 1·· 20 11a Hewlett-Packard Model 1090 HPLCdlä, jossa oli automaattinen injektori ja diodirivi- • 2 V : detektori. Lyofilisoitu DEAE-MAIF (100 mg) liuotettiin 0,25 ml:aan 0,15 M NH4OAc:ia ja injektoitiin kolonniin. Kolonnia eluoitiin 0,15 M NH4OAc:lla virtausnopeudella 5 ml/min.

• · ’ 1 ’ Effluenttia tarkkailtiin 220 ja 280 nm:ssa, diodirivitiedot kuitenkin talletettiin kaikista • · · • · · *. aallonpituuksista välillä 190 - 600 nm. Fraktiot (9 ml) kerättiin LKB-ultrorac -fraktionke- ♦ · • · · t: : 25 rääjällä. Jotta valmistettaisiin suuret määrät MAIF:ia, useita näytteitä, kukin 100 mg, ero-• ♦ « · -' teltiin TSK-kolonnissa ja kerättiin samaan koeputkisaijaan. Koeputket, jotka sisälsivät ak- 2 • · :: tii visen tekij än, yhdistettiin, lyofilisoitiin j a punnittiin.

• « • 1 « • · · • ·

Orgaaninen partitiouutto. MAIF eristettiin selektiivisesti sitoutuneista suoloista orgaani-30 sen partitiouuton menetelmällä, jossa puoliksi puhdistettu TSK-MAIF-näyte liuotettiin tis- 71 lattuun veteen, alkalisoitiin, uutettiin n-heksaanilla neutraalien lipidien poistamiseksi, ha-potettiin ja sen jälkeen uutettiin etyyliasetaatilla. 50 - 100 mg TSK-MAIF:ia liuotettiin 2 ml:aan deionisoitua vettä taarattuun uuttoastiaan. Liuoksen pH säädettiin 8,0:aan 4 pisaralla 0,02 n NH4OH:ta. Lisättiin kaksi millilitraa n-heksaania ja seosta ravisteltiin voimak-5 kaasti. Heksaanin sisältävä yläfaasi poistettiin, kuivattiin ja punnittiin. Jäljelle jäänyt vesiliuos hapotettiin pH 3,5:teen 100 pisaralla sitruunahappoa. Lisättiin viisi millilitraa etyyliasetaattia ja seosta ravisteltiin voimakkaasti ja sentrifugoitiin 1,000 rpm kerrosten erottamiseksi. Etyyliasetaattikerros siirrettiin taarattuun astiaan. Uutto toistettiin toisella 5 ml tilavuudella etyyliasetaattia. Etyyliasetaattikerrokset yhdistettiin, kuivattiin typen alla ja 10 punnittiin.

Heikon anionin vaihtokromatografia. Käytettiin Supelcosil (Supelco) -aminopropyyli-HPLC-kolonnia erottelemaan heikosti ionisoituneet negatiivisesti varautuneet MAIF-kom-ponentit, jotka oli vapautettu sitoutuneista suoloista etyyliasetaattiuutolla. Aminosidottu 15 kolonni, j oka toimii heikkona anioninvaihtajana vesipuskureiden kanssa, tasapainotettiin * j*. 78-prosenttisella ACN/H20:lla. 50 mg TSK-MAIF-näytettä liuotettiin 25-prosenttiseen • ·· · • · · ACN/3 mM NH4OAc:iin ja lisättiin kolonniin. Kolonni kehitettiin kolmiosaisella eluointi- • · · · : · : jäijestelmällä, joka käsitti 78 % ACN/H20 - 69 % ACN/3 mM NH4OAc 0-15 min, mitä seurasi 69 % ACN/3 mM NH4OAc - 65 % ACN/3 mM NH4OAc 15 - 30 min virtausno- #« ! ’·· 20 peudella 1 ml/min. Kolonnin eluaattia seurattiin 220 ja 280 nm:ssa. Valituista fraktioista • ·· • ♦ · * ·' * testattiin MAIF-aktiivisuus neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määrityksellä (katso jäl jempää).

• · • · · • · · • · · • ♦ ·

Neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määritys. MAIF:in anti-inflammatorinen aktiivi- • · • · · : 25 suus mitattiin määrittämällä keuhkopussin neutrofiilien kulkeutumisen inhibitiota. Naaras-| ; ·;·’ puolisiin, valkoisiin laboratoriorottiin, jotka painoivat 120 - 150 g, injektoitiin keuhkopus- • · sin sisään 1,0 ml 1-prosenttista kappa-karrageenania PBS:ssä, jotta indusoitaisiin neutrofii- • · · *· *· lien migraatiota keuhkopussionteloon. Rottiin injektoitiin välittömästi intraperitoneaalisesti 0,5 ml.n annokset MAIF-näytettä PBS.ssä. PBS.ää käytettiin kontrollina. Neljän tunnin 72 kuluttua rotat tapettiin, kerättiin keuhkopussin tulehdusneste ja laskettiin ulos kulkeutuneiden neutrofiilien määrä.

Tulokset 5 Preparatiivisten menetelmien standardointi. Erittäin aktiivisten MAIF-valmisteiden tuottamiseksi vakiinnutettiin toistettavissa olevat menetelmät, joihin kuuluivat ultrasuoda-tus ja DEAE-pylväskäsittelyt ja vertailukelpoisten näytteiden analyysi rotan neutrofiilien kulkeutumisen määrityksellä. Standardoitujen puhdistusmenetelmien omaksuminen teki mahdolliseksi kvantifioida MAIF-aktiivisuutta spesifisissä maitotuotteissa ja suuren mitta-10 kaavan tuotantoerissä. Standardoidun menetelmän arvioimiseksi MAIF valmistettiin hype-rimmuunimaidosta, kontrollimaidosta, joka saatiin immunisoimattomista lehmistä ja kaupallisesta maitojauheesta, ja näitä testattiin sokkotestillä neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määrityskokeessa. MAIF-näytteiden kyky inhiboida neutrofiilien kulkeutumista tulehduskohtiin testattiin annoksina 0,5,1,5,3,5 ja 8 mg/120 - 150 g rottaa kohti (kuvio 15 39). Hyperimmuunimaidosta peräisin oleva MAIF sai aikaan suurimman neutrofiilien inhi- : bition, joka oli enemmän kuin 70 % 3 mg annoksella. Tuore kontrollimaito ja kaupallinen ··· · ' j * kontrollimaito saivat kumpikin aikaan ainoastaan 18 prosentin inhibition 3 mg annoksena.

• · :: Hyperimmuunimaidosta valmistetun standardoidun MAIF :in aktiivisuutta verrattiin siaali- ’ · ” · hapon j a oroottihapon aktiivisuuksiin, maidon tunnettu] en komponenttien, j oilla uskotaan • · • * * 20 olevan anti-inflammatorista aktiivisuutta (kuvio 40) ja kahden anti-inflammatorisen lääk-• · · 1 ; ; • keen aktiivisuuteen (kuvio 41). Siaalihappo tai oroottihappo eivät osoittaneet mitään inhiboivaa aktiivisuutta rotan neutrofiilien kulkeutumiseen testatuilla annoksilla. Indometasiini « · • · · osoitti 35 prosenttista inhiboivaa aktiivisuutta annoksena 0,5 mg/120 - 150 g rottaa, inhibi- • · · • · · tio putosi kuitenkin 30 prosenttiin annoksena 3 mg/120 - 150 g rottaa ja pieneni vakaasti • · • · · •"φ: 25 suurempia annoksia käytettäessä. Aspiriini, annettuna rotan annoksina, jotka vastasivat ih-misen annoksia, osoitti vähemmän kuin 10-prosenttista inhibitiota ja saavutti korkean inhi- • · • · · ’·' bitiotason ainoastaan annoksina, jotka lähenivät 100 kertaista ihmisen annosta vastaavaa • · • · · rotan annosta.

73 MAIF:in puhdistaminen preparatiivisella HPLCtllä. DEAE-ioninvaihtokromatografian käyttö MAIF:in valmistamiseksi johti anti-inflammatorisen aktiivisuuden puhdistumiseen 25-kertaisesti verrattuna <10K-permeaattiin. DEAE:sta saadun MAIF:in koostumuksen analyysi kokoekskluusio-HPLC: llä (kuvio 42) osoitti kahden pääkomponentin läsnäolon 17 5 ja 25 minuutin kohdalla ja kuuden tai useamman vähäisemmän komponentin läsnäolon, jotka eluoituivat välillä 30 - 60 minuuttia. Yhdistettyjen fraktioiden analyysi neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määrityksessä osoitti, että MAIF-aktiivisuuden pääkonsentraatio esiintyi 25 minuutin huipussa. Nämä tulokset antavat olettaa, että preparatiivinen kokoerot-teluvaihe mahdollistaisi paremmin puhdistetun MAIF-valmisteen tuottamisen. Yritykset 10 saavuttaa vertailukelpoisia tuloksia preparatiivisessa nestekromatografiaväliaineessa eivät tuottaneet riittävää erottelua. Preparatiivinen HPLC TSK2500PW -kolonni, eluoituna 0,15 M NH4OAc.Ha, sai aikaan 25 minuutin MAIF-huipun erottumisen erinomaisesti. DEAE-MAIF erotettiin HPLC-kolonnissa 100 mg ajoissa ja yhdistetty 25 minuutin huippu lyofi-lisoitiin. 0,15 M NH4OAc-eluointipuskuri valittiin sen vuoksi, että kaikki puskurin suolat 15 olisivat täysin poistettavissa eristetyn MAIF.in näytteistä lyofilisoinnin aikana. Kun * DEAE-MAIF:in toistettuja 100 mg:n ajoja fraktioitiin preparatiivisella HPLC:llä, tai-··· · •: · teenotetun 25 minuutin huipun painot osoittivat kuitenkin ainoastaan 10 prosentin vähene- • · · · : / j misen painossa. MAIF-huipun alkuaineanalyysi osoitti, että enemmän kuin 40 % painosta ': * *: voitiin lukea suolan osuudeksi. Testattiin useita suoloja, mukaanluettuna natriumkloridi, • *** 20 natriumasetaatti ja magnesiumkloridi, jotta määritettäisiin niiden eluoitumisasema TSK *·· I * · ·* * 2500PW-pylväässä. Kukin suola eluoitui välillä 35 - 40 minuuttia. Tämä tulos osoitti, että suola oli erityisesti sitoutunut MAIF-yhdisteeseen, joka eluoitui 25 minuutin kohdalla.

• · • ·· • * · • · · • · ·

Kontaminoivan suolan poistaminen. Jotta vapautettaisiin MAIF-yhdiste sitoutuneista • ♦ • · ♦ *·· · 25 suoloista, käytettiin orgaanista partitiouuttomenetelmää, jossa HPLC:llä puhdistettu MAIF-»***: *; * valmiste tehtiin emäksiseksi negatiivisesti varautuneiden ryhmien esiin saamiseksi, ja uu- • · * · *. * tettiin heksaanilla siihen liukoisten kontaminanttien poistamiseksi. Vesifaasi tehtiin sitten • · • · · *· *: happamaksi negatiivisten varausten protonoimiseksi, uutettiin etyyliasetaatilla ja punnit tiin. Uutetun jäännöksen painon väheneminen oli enemmän kuin 96 %. Kuivatun etyy-30 liasetaattifraktion analyysi neutrofiilien kulkeutumisen inhibition määrityksessä osoitti voi- 74 makasta MAIF-aktiivisuutta ja edellytti niin huomattavasti kuin 10,000 kertaa vähentyneen annoksen hyvin puhdistettua MAIF:ia, jotta saatiin aikaan sama neutrofiilien kulkeutumisen inhibition taso kuin MAIFiilla, joka saatiin ennen orgaanista partitiouuttoa (kuvio 43). MAIF-yhdisteen analyysi heikon anioninvaihtajan aminopropyylipylväässä ennen ja jäl-5 keen uuton osoitti jäljelle jääneiden komponenttien eluoitumisaseman merkitsevää siirtymistä ja olakkeen poistumista profiilista (kuvio 44). Nämä tulokset osoittivat, että partitio-uuttomenetelmä johti kontaminoivien sitoutuneiden suolojen poistumiseen ja se tekee mahdolliseksi paremmin puhdistetun MAIF-valmisteen tuottamisen kuin mitä aikaisemmin oli saatavissa.

10

Standardoitu MAIF-menetelmä saa aikaan erittäin aktiivisen, osittain puhdistetun muodon MAIF:ista määrinä, jotka ovat riittävät, jotta voidaan tehdä tutkimuksia sen koostumuksesta ja rakenteesta. Tällä menetelmällä tuotettu MAIF osoittaa suurta aktiivisuutta verrattuna kontrollimaidosta peräisin olevaan MAIF:iin tai oletettuihin tai tunnettuihin anti-inflamma-15 totisiin lääkkeisiin. Preparatiivisen TSK HPLCrn käyttö MAIF:in fraktioimiseksi on teho- ‘ kas tuottamaan puhdistetumman MAIF:in; suolat kuitenkin jäävät sitoutuneiksi MAIF-yh- ··· · disteeseen odottamattomalla tavalla. MAIF -yhdisteen orgaaninen partitiouutto etyy- • · · liasetaattiin antaa mahdollisuuden kontaminoivien suolojen poistolle, tehden siten mahdol- *: ”: liseksi hyvin puhdistetun MAIF: in valmistamisen suuressa mittakaavassa.

• · .1 1·· 20 • · · I · · ·1 ’ Kaikki tässä esitetyt viitteet sisällytetään kokonaan tähän selitysosaan kirjallisuusviitteiksi.

• · • · * · · *... Kun tämä keksintö on nyt kuvattu yleisesti, alan ammattilaisille tulee ilman epäilystä il- • · · • · · meiseksi, että keksintöön voidaan tehdä monia muutoksia ja muunnelmia vaikuttamatta sen « · • · · ·; 25 henkeen tai puitteisiin. Tällaisia muutoksia ja muunnelmia pidetään myös keksinnön näkö- T kohtina.

• · • · · • · · • · · • · · • ·· • ·

Claims (22)

1. Menetelmä anti-inflammatorisen tekijän puhdistamiseksi kuoritusta maidosta, tunnettu siitä, että menetelmässä 5 (i) ultrasuodatetaan mainittu maito läpi suodattimen, jonka molekyylipainon katkaisuraja on 10,000 daltonia; (ii) kerätään < 10,000 permeaatti vaiheesta (i) (iii) lisätään mainittu permeaatti ensimmäiseen ioninvaihtopylvääseen ja pestään mainittu pylväs deionisoidulla vedellä; 10 (iv) kerätään vaiheesta (iii) saatu eluaatti; (v) erotetaan vaiheesta (iv) saatu eluaatti preparatiivisessa kokoekskluusio-HPLC-kromato-grafiakolonnissa ja kerätään eluaatti ja (vi) tehdään mainitusta preparatiivisesta kokoekskluusio-HPLC:stä saadulle eluaatille orgaaninen partitiouutto ja saadaan vesiuute mainitusta uutosta. 15

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää lisäksi mainitun vesiuutteen heikon anionin vaihtokromatografian.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että hartsi mainitussa l m-m 20 ensimmäisessä ioninvaihtopylväässä on dietyyli-aminoetyyli (DEAE) Sepharose -no- • · · • ·· · ,·. peavirtausioninvaihtohartsi. ···· • · ♦ ♦ * • ··

4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu preparatii- i*. vinen kokoekskluusio-HPLC-kolonni on TSK G2500PW kokoekskluusiokolonni. • ·· 25 • · ·

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu orgaani- :*♦*: nen partitiouutto käsittää lisäksi seuraavat vaiheet: (i) uutetaan heksaanilla ja NH4OH:lla; : (ii) uutetaan uudelleen vaiheesta (i) saatu vesifaasi etyyliasetaatilla ja • · · • · .*··. 30 (iii) kerätään talteen mainittu etyyliasetaattiuute.

··· • · • · · • · · **’ 6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että menetelmässä li- • · · säksi (i) lisätään mainittu etyyliasetaattiuute heikon anionin vaihtopylvääseen ja (ii) kehitetään mainittu pylväs kolmiosaisella eluointijärjestelmällä.

7. Hyvin puhdistetussa muodossa oleva anti-inflammatorinen tekijä, tunnettu siitä, että se on tuotettu menetelmällä, jossa 5 (i) ultrasuodatetaan mainittu maito läpi suodattimen, jonka molekyylipainon katkaisuraja on 10,000 daltonia, (ii) kerätään < 10,000 permeaatti vaiheesta (i) (iii) lisätään mainittu permeaatti ioninvaihtopylvääseen ja pestään mainittu pylväs dei-onisoidulla vedellä ja kerätään eluaatti, 10 (iv) erotetaan vaiheesta (iii) saatu eluaatti preparatiivisessa kokoekskluusio-HPLC-kroma-tografiakolonnissa, (v) uutetaan vaiheesta (iv) saadut näytteet heksaanilla ja hfflUOHdla, (vi) uutetaan uudelleen vaiheesta (v) saatu vesifaasi etyyliasetaatilla ja saadaan vesifaasi ja (vii) kerätään talteen eluaatti mainitusta pylväästä. 15

8. Olennaisesti tai hyvin puhdistettu anti-inflammatorinen tekijä, tunnettu siitä, että se on tuotettu minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-6 mukaisella menetelmällä.

9. Menetelmä anti-inflammatorisen tekijän puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että mai- . 20 nittu tekijä saadaan olennaisesti tai hyvin puhdistetussa muodossa minkä tahansa pa- • · · ’* V tenttivaatimuksista 1-6 mukaisella menetelmällä, jolloin ultrasuodatusvaihe alkaa noin ···· # .·. j 90 - 225 litrasta kuorittua maitoa ja lonmvaihtovaihe alkaa noin 60 - 150 litrasta per- • · meaattia. • · • » • · • ··

10. Menetelmä anti-inflammatorisen tekijän puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että mai- nittu tekijä saadaan olennaisesti tai hyvin puhdistetussa muodossa patenttivaatimuksen 9 ;*·*; mukaisella menetelmällä, jolloin HPLC-kokoekskluusiokromatografia aloitetaan 100 « :***: mg:lla DEAE-ioninvaihtovaiheesta saatua MAIF:ia. ··♦ • · • · · • ·· • ♦ .···. 30

11. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen anti-inflammatorisen tekijän käyttö lääkkeen • « ··· . *. valmistamiseksi neutrofiilien kulkeutumisen estämiseen. • · · • · · • · · ♦ • · * · · • · ·

12. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen anti-inflammatorisen tekijän käyttö lääkkeen valmistamiseksi tulehdusreaktion inhiboimiseen.

13. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen anti-inflammatorisen tekijän käyttö lääkkeen valmistamiseksi neutrofiilien takertumisen endoteeliso luihin estämiseen nisäkkäässä.

14. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen anti-inflammatorisen tekijän käyttö lääkkeen valmistamiseksi endoteeliso luihin nisäkkäässä takertuneiden neutrofiilien irrottamiseen.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainitut neutrofiilit ovat takertuneet mainittuihin endoteeliso luihin reaktiona verihiutaleita aktivoivaan 10 tekijään.

16. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen anti-inflammatorisen tekijän käyttö lääkkeen valmistamiseksi nisäkkäässä olevien CD18-solupinta-antigeenien ja mainittuihin antigeeneihin sitoutumaan kykenevien molekyylien vuorovaikutuksen estämiseen. 15

17. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen anti-inflammatorisen tekijän käyttö lääkkeen valmistamiseksi leukosyyttien kulkeutumisen ulos nisäkkään verisuonijärjestelmästä estämiseen. . . 20

18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen käyttö, t u n n e 11 u siitä, että mainitut leukosyytit • · · * * ’. * ovat neutrofiilejä. • · · ···· • · • · · • · · • ·

19. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukaisen anti-inflammatorisen tekijän käyttö lääkkeen • · :*. valmistamiseksi lymfosyyttien mitogeenisen reaktion vieraita antigeenejä vastaan tukah- • · · 25 duttamiseen nisäkäsisännässä. • * I

20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainitut antigeenit : ’ * *: ovat solun pinnalla. • · · • · • · · • · · • · .···. 30

21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainitut solut ovat • · • · · . *. leukosyyttejä. • · · • · · • · · · • φ • · · • · ·

22. Patenttivaatimuksen 21 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainitut solut ovat lymfosyyttejä.