KR100424403B1 - 항염증인자,분리방법및사용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 우유에서 분리된 항염증인자, 실질적으로 또는 고도로 정제된 제제를 생성하는 항염증인자의 정제방법 및 내피세포로부터 부착된 호중구를 제거하고, 혈관으로부터의 세포 유주를 방지하고 이종 항원에 대한 임파구의 반응을 억제하는데 상기 인자를 사용하는 방법에 관한 것이다.

Description

항염증인자, 분리방법 및 사용{Anti-Inflammatory Factor, Method of Isolation, and Use}

도를랜드 의학사전(Dorland's Medical Dictionary)에 정의된 바와 같이 염증은 손상을 주는 작용제(agent)와 손상된 조직 둘 다를 파괴, 희석 또는 차단하는데 도움이 되는 "조직 손상 또는 파괴에 의해 야기되는 국소적 방위 반응"이다. 이것은 미소혈관계의 유창, 간질 공간으로의 혈액성분 누출 및 염증을 일으킨 조직으로의 백혈구 이동을 특징으로 한다. 육안적 수준으로는 보통 홍반, 부종, 민감(통각과민) 및 동통이라는 잘 알려진 임상적 징후를 수반한다. 이 복잡한 반응 동안 히스타민, 5-히드록시트립타민, 여러 주화성 인자, 브라디키닌, 류코트리엔 및 프로스타글란딘과 같은 화학적 매개자가 국소적으로 유리된다. 또 그 부위로 식균세포가 이동하고 세포성 리소좀 막이 파열되어 용균효소를 방출할 수 있다. 이들 사건은 모두 항염증 반응의 한 원인이 될 수 있다.

류머티양 관절염 환자의 염증은 대개는 항원(감마 글로불린)-항체(류머티양 인자)와 보체의 조합을 수반하여 백혈구를 끄는 주화성 인자의 국소 방출을 야기한다. 백혈구는 항원항체와 보체의 복합체에 식균작용을 하고 또한 그것의 리소좀에 함유된 많은 효소를 방출한다. 그 다음 이들 리소좀 효소는 연골과 기타 조직에 손상을 주고 이것은 더 나아가 염증도를 상승시킨다. 세포 매개 면역반응도 또한 수반될 수 있다. 이 과정동안 프로스타글란딘도 또한 방출된다.

염증에서 생성될 것 같은 프로스타글란딘은 홍반을 야기하며 국소 혈류를 증가시킨다. 프로스타글란딘의 두가지 중요한 혈관 작용, 즉 장기 지속적인 혈관확장신경작용과, 노르에피네프린 및 안기오텐신과 같은 물질의 혈관수축신경작용에 반대로 작용하는 능력은 일반적으로 염증의 다른 매개자에 의해 공유되지 않는다.

염증 매개자의 다수는 후모세관과 집합 세정맥에서 혈관침투성(누출)을 증가시킨다. 또한 염증을 일으킨 부위로의 백혈구 이동은 염증과정의 중요한 양태이다.

아더스 반응은 항원이 그 항원에 대한 항체와 복합되는 피하 부위에서의 면역 복합체 형성에 의해 일어난다. 호중구는 특징으로서 피하주사 부위에서 형성되는 면역글로불린 복합체의 Fc 부분에 부착되어 거기서 분해효소를 방출함으로써 눈에 보이는 급성 염증을 일으킨다. 따라서 이 반응은 주로 호중구로 매개되며 이 반응의 전개를 가져오는 작용제는 이들 세포에 미치는 영향을 통해 그렇게 한다.

작용제가 혈관에서 염증부위로의 호중구 이동을 간섭하는 경로는 몇가지가 있다. 한가지 있을 법한 경로는 혈관벽의 내피세포 내층에 대한 염증세포의 가역적 "점착(sticking)"인 변연추향의 억제이다. 정상 상태에서는 호중구의 약 50%가 가역적으로 부착되나 급성염증반응 동안에는 부착이 훨씬 더 강해져 호중구 이동과정의 핵심단계가 된다. 프로스타글란딘은 주화성 반응에 직접 관련될 것 같지 않으나 아라키돈산 대사의 또 다른 산물인 류코트리엔은 매우 강력한 주화성 물질이다.

항염증 반응은 위에서 정의한 바와 같은 염증을 특징으로 하는 어떤 반응이다. 염증반응은 여러 가지 질환 및 손상과 관련되어 온 많은 신체적 불편, 즉 동통 및 기능상실을 가져온다는 것이 의술에 숙련된 자에게는 주지되어 있다. 따라서 면역반응을 중화시키는 효과를 나타내는 약제를 투여하는 것은 의학계의 공통 관행이다. 이러한 특성이 있는 약제는 항염증약으로 분류된다. 항염증약은 각양각색의 질병치료에 사용되며 또 이 약은 자주 다른 질환을 치료하는데 사용된다. 항염증약에 의한 치료는 질환에 대한 것이 아니고 증후, 즉 염증에 대한 것일 때가 매우 잦다.

항염증약, 진통약 및 해열약은 흔히 화학적으로 무관한 이종의 화합물군이지만 일정한 치료효과와 부작용을 공유한다. 코르티코스테로이드는 항염증반응의 치료에 가장 널리 사용된 화합물류를 대표한다. 단백질 분해효소는 항염증 효과를 나타낸다고 생각되는 또 다른 화합물류를 대표한다. 직접 또는 간접적으로 부신 피질이 생성되게 하고 스테로이드를 분비하는 호르몬은 또 다른 항염증 화합물류를 대표한다. 다수의 비호르몬성 항염증제가 기술되었다. 이들 가운데 가장 널리 사용되는 것은 살리실산염이다. 아세틸살리실산 즉 아스피린은 가장 널리 처방된 진통해열 및 항염증제이다. 스테로이드 및 비스테로이드 항염증제의 예는Physi- cian's Desk Reference,1987에 열거되어 있다(그러한 제제의 색인에 대해서는 207및 208 페이지 참조).

천연 및 합성 코르티코스테로이드 제제는 혈압상승, 염 및 물의 정체, 그리고 증가된 칼륨 및 칼슘 배출을 포함하여 많은 심한 부작용을 일으킨다. 또한 코르티코스테로이드는 감염 징후를 차폐하고 감염성 미생물의 전염을 증대시킬 수 있다. 이들 호르몬은 임산부용으로는 안전하다고 생각되지 않으며 장기의 코르티코스테로이드 요법은 위산과다증 및/또는 소화성 궤양과 관련되어 왔다. 이들 화합물에 의한 치료는 또한 진성당뇨병을 악화시켜 보다 많은 투여량의 인슐린을 요할 수 있고 정신병을 일으킬수 있다. 내인성 코르티코스테로이드의 생성을 간접적으로 증가시키는 호르몬 항염증제도 마찬가지로 해로운 부작용을 일으킬 가능성이 있다.

비호르몬 항염증제는 높은 용량에서 독성일 수 있고 각양각색의 바람직하지 않은 부작용이 있는 합성생화학적 화합물이다. 예를들면 살리실산염은 이러한 화합물류에 의한 중독을 특징으로 하는 심한 산염기 균형장해의 한 원인이 된다. 살리실산염은 호흡을 직접 간접적으로 자극한다. 독성용량의 살리실산염은 혈관운동 저하에 부수하는 순환성 쇽 뿐만 아니라 중추성 호흡마비도 일으킨다. 살리실산염의 섭취는 후장고통, 오심 및 구토를 가져올 수 있다. 살리실산염 유발 위출혈은 잘 알려져 있다. 살리실산염은 간손상을 일으키고 응혈시간의 연장을 가져올 수 있다. 그러므로 살리실산염에 의한 혈소판 지혈 억제는 출혈을 일으킬 수 있기 때문에 심한 간손상, 저프로트롬빈혈증, 비타민 K결핍 또는 혈우병 환자에서는 아스피린을 피해야 한다. 살리실산염 중독은 일반적인 것으로, 미국에서는 매년10,000건 이상의 심한 살리실산염 중독이 조사되는데 이 가운데는 치명적인 것도 있고 어린이에게 많이 발생된다. Goodman and Gilman'sThe Pharmacological Basis of Therapeutics, 7th Ed, 1985 참조. 따라서 현재 입수가능한 다수의 항염증제에도 불구하고 부작용과 해로운 반응이 없는 안전하고 유효한 항염증 제품이 아직도 요구되고 있다.

항염증효과가 있는, 예를들면 우유에서 유래되는 것과 같은 자연식품을 얻을 수 있다면 그것은 용이하게 투여할 수 있고 쉽게 입수할 수 있는 안전한 치료 조성물이 될 것이다.

종래에 여러 가지 치료 효과가 있는 우유를 제조하는 것이 공지되었다. 예를들면 벡크는 우식증 억제효과가 있는Streptococcus mutans에 대한 항체를 함유하는 우유를 개시하였다(미국특허 제4,324,782호). 이 우유는 암소를S. mutans항원으로 2단계로 면역시키고 그것으로부터 치료 우유를 얻음으로써 얻어진다.

스톨 등은 고도면역 상태로 유지되어 있는 암소로부터 채취한 우유를 동물에 투여하는 것으로 이루어지는, 동물에서 흡연과 관련된 혈관병 또는 폐병을 치료하는 방법을 개시하였다(미국특허 제4,636,384호). 벡크는 항염증인자 생성상태로 유지된 암소로부터 채취된 우유의 항염증 유효량을 동물에 투여하는 것으로 이루어지는 동물에서의 염증치료방법을 개시하였다(미국특허 제4,284,623호). 헤인배치(미국특허 제3,128,230호)는 암소에 항원성 혼합물을 접종시킴으로써 알파, 베타 및 감마 성분의 글로불린을 함유하는 우유를 기술하였다. 피터슨등(미국특허 제3, 376,198호), 홀름(미국출원(공개)일련번호 628,987), 터나 등(영국특허 제1,211,876호) 및 바이오크마 S.A. (영국특허 1,442,283)도 또한 항체 함유 우유를 기술하였다.

그러나 상기한 참조문헌 중 어느 것도 원하는 치료효과를 내는 치료우유의 성분 또는 성분들의 동정을 개시하고 있지 않다. 예를들면 벡크의 미국특허 제4,284,623호에서 치료수단으로 사용된 우유제품은 유체 전유나 유체 무지방 유장이나 전유분말로 구성되어 있다. 이들 우우제품은 각기 항염증성을 갖고 있으나, 실제로 치료상의 이점을 제공하는 인자 또는 인자들은 아직 동종에 대해 분리되거나 동정되거나 정제되지 않았다.

우유 항염증인자(들)(MAIF)의 고도로 정제된 제제를 얻는데 있어 특히 어려운 점은 현행의 정제법으로는 MAIF에서 단단히 결합된 염을 제거할 수 없다는 것이다. 많은 가운데 특히 본 발명이 다루는 문제중 하나는 MAIF제제에서 단단히 결합된 염을 제거하는 것을 포함시킴으로써 고도로 정제된 MAIF를 생성하는 MAIF의 대규모 제조이다. 이전에는 대량의 출발물질(예를들면 탈지유 90리터)로 시작할때 MAIF의 고순도 제조규모 제제를 얻는데 있어 문제가 발생하였다. 본 발명은 이들 문제에 대한 해결책을 제공한다.

본 발명은 항염증인자, 그것의 실질적으로 순수한 또는 고도로 순수한 형태로의 제조방법 및 그것의 염증치료에의 사용방법에 관한 것이다.

본 발명은 첨부 도면에 관하여 숙고할 때 이하의 상세한 설명을 참조하면 더 잘 알 수 있으므로 본 발명의 보다 완전한 이해와 많은 부수적인 이점은 쉽게 얻어질 것이다.

도 1은 DEAE-셀룰로오스 칼럼상의 이온교환 크로마토그래피에 의한 항염증인자의 분리.

도 2는 세파덱스 G-10 분자체 칼럼상의 DEAE-셀룰로오스 크로마토그래피(도 1)로부터 피크(두번째의 것)를 함유하는 항염증인자의 분별.

도 3은 쥐에서 카라기난 유발 부종에 미치는 면역 우유의 영향(발 무게%, %대조 발, 평균 ±sem, n=10).

도 4는 쥐에서 발바닥 부종에 미치는 항염증인자의 복강내 투여영향(㎕, 평균±SD, n=6).

도 5는 쥐 발부종 시험에서 항염증인자에 대한 복강내 용량-반응 곡선(%대조표준, 평균±SD, n=6).

도 6은 쥐에서 발바닥 부종에 미치는 고도면역 우유인자 대 위약(락토스)의 영향(%대조표준, 평균±SD, n=6).

도 7은 쥐에서 발바닥 부종에 미치는 정맥내 및 경구 MAIF의 영향(%대조표준, 평균±SD, n=6).

도 8은 쥐에서 발바닥 부종에 미치는 MAIF의 저 정맥내 투여의 영향(%대조표준, 평균±SD, n=6).

도 9는 쥐 발 부종 시험에서 MAIF에 대한 정맥내 용량-반응 곡선(%대조표준, 평균±SD, n=6).

도 10은 Run 1, 쌍둥이 소떼/한외여과 실험(%평균 대조 부종, 평균±SD,n=6).

도 11은 Run 2, 쌍둥이 소떼/한외여과 실험(%평균 대조 부종, 평균±SD, n=6).

도 12은 Run 3, 쌍둥이 소떼/한외여과 실험(%평균 대조 부종, 평균±SD, n=6).

도 13은 쥐에서 발바닥 부종 억제에 미치는 여러 가지 MAIF 처리의 영향(㎕ 발바닥 부종, 평균±SD, n=6).

도 14는 쥐에서 발바닥 부종 억제에 미치는 면역 wpc 및 MAIF 분획의 영향(㎕ 발바닥 부종, 평균±SD, n=6).

도 15는 쥐 발바닥에서 카라기난에 대한 반응에 미치는 5가지 상이한 마취제의 영향. 동일 동물에서 선택한 간격으로 부종 축적을 모니터하였다. 각 데이터 포인트에 대해 n=6임.

도 16은 쥐 발바닥에서 카라기난에 대한 반응의 2상 성질 입증. 각 데이터 포인트에 대해 n=5임. 에테르를 마취제로 사용하였다.

도 17a-b에서 쥐당 5mg(A)이나 쥐당 40mg(B)으로 투여한 MAIF는 에테르로 마취한 쥐에서 카라기난에 대한 염증반응을 억제하지 않는다. 모든 데이터 포인트에 대해 n=4임.

도 18은 카라기난 공격시(시간 0), 정맥내 주사한 MAIF 40mg에 의한 제2차 식균세포 매개 반응 동안의 카라기난 유발 부종 축적의 억제. 대조군에서는 각 데이터 포인트에 대해 n=12이고 MAIF 처리군에서는 각 데이터 포인트에 대해 n=10임.

도 19는 쥐 발바닥에서 카라기난에 대한 반응에 미치는, 여러 시간에서 쥐당 4mg으로 정맥내 부여한 MAIF의 영향. 모든 경우에 공격한지 4시간후에 부종을 평가하였다. 각 데이터 포인트에 대해 n=12임.

도 20은 역수동 아르튜스 반응에 미치는 정맥내 주사한 MAIF 20mg의 영향.

* = p<0.01; ** = p<0.05.

도 21은 호중구가 혈관계에서 피하이식된 멸균 스폰지로 이동하는 능력에 미치는 MAIF 용량 감소의 영향. * = p<0.01.

도 22는 이식시 또는 이식한지 120분후까지 투여할 때 염증성 세포가 피하이식된 스폰지에 축적되는 능력을 억제하는데 미치는, 쥐당 20mg의 용량으로 투여한 MAIF의 영향. * = p<0.01.

도 23은 정상 동물에서 피하이식된 스폰지속으로의 세포염증성 침윤의 시간경과.

도 24는 세정맥에 대한 호중구의 혈소판활성화인자(PAF) 유발 부착에 미치는 항염증인자 제제의 영향.

도 25는 PAF 유발 호중구 유주에 미치는 항염증인자 제제의 영향.

도 26은 세정맥을 통한 호중구의 PAF 유발 플럭스에 미치는 항염증인자 제제의 영향.

도 27은 항염증인자 제제에 의한 호중구 부착의 역전.

도 27a는 PAF에 대한 반응에서 세정맥에 부착하는 호중구수 감소에 미치는 MAIF 제제(40mg/쥐)의 영향을 도시한다.

도 27b는 새로운 호중구-내피세포 부착에 미치는 MAIF 제제(40mg/쥐)의 영향을 도시한다.

도 28은 세정맥내의 호중구 속도에 미치는 항염증인자 제제의 영향.

도 29는 세정맥내의 적혈구 속도에 미치는 항염증인자 제제의 영향.

도 30은 세정맥내의 백혈구 플럭스에 미치는 항염증인자 제제의 영향.

도 31은 주사후 24시간내에 순환하는 호중구 및 임파구수에 미치는 정맥내 투여한 MAIF 제제 40mg의 영향.

도 32는 MAIF 제제의 정맥내 투여와 순환하는 백혈구수간의 용량-반응관계 (p< 0.01).

도 33a-e는 임파구 기능의 여러 양태에 미치는 항염증인자의 영향.

도 33a는 이종 조직적합 항원에 대한 숙주 T임파구의 반응에 미치는 인자 투여전의 영향을 도시한다.

도 33b는 MAIF 처리 쥐로부터의 임파구를 무처리 쥐에 주사할 때 얻어지는 결과를 도시한다.

도 33c 및 도 33d는 쥐에서 비장무게 및 비장세포수에 미치는 MAIF 처리의 영향을 도시한다.

도 33e는 임파구의 콘카나발린 A 자극된 유사분열반응에 미치는 MAIF 처리의 영향을 도시한다.

도 34는 정맥내 주사한 MAIF 40mg에 의한 감염 유발 부종의 억제. 두 군의 평균치는 다음과 같았다: 대조군, 87±22㎕; MAIF, 45±17㎕; p<0.01.

도 35는 박테리아 복제 및 피하이식된, 대장균 감염 스폰지에 미치는, 쥐당 40mg으로 정맥내 부여한 MAIF의 영향.

도 36a-b는 MAIF(쥐당 40mg, 정맥내)에 의한 감염 스폰지로의 염증성 세포침윤의 억제.

도 37은 대장균 감염 스폰지에서 염증성 체액 축적의 중간상(4-16시간) 억제에 미치는 MAIF(쥐당 40mg, 정맥내)의 영향.

도 38은 실험적 신우신염의 발병학에 미치는, 공격시 및 48시간후에 정맥내 부여한 MAIF 40mg의 영향. 좌측 그래프상의 점선은 평균 백그라운드 신장 무게를 나타낸다. *=p<0.01; **=p<0.02.

도 39는 표준화된 고도면역과 대조 MAIF의 비교. 표준화된 방법으로 제조한 MAIF를, 염증부위로의 호중구 유주를 억제하는 능력에 대해 0.5, 1.5, 3, 5 및 8mg/ 120-150gm. 암컷 쥐의 용량으로 시험하였다. "시판용"이란 재고품이 있어서 곧 구할 수 있는 탈지유를 말한다.

도 40은 MAIF와 기타 우유성분의 비교. 고도면역 우유로부터 제조한 표준화된 MAIF의 활성을, 항염증 활성이 있다고 여겨지는 우유의 공지된 성분인 살리실산 및 오로트산과 비교하였다.

도 41은 고도면역 우유로부터의 표준화된 MAIF와 항염증약(인도메타신 및 아스피린)의 비교.

도 42는 크기 배제 HPLC에 의한 DEAE 유래 MAIF의 조성 분석.

도 43은 호중구 유주 억제 검정에서 건조된 아세트산에틸 분획의 분석은 강한 MAIF 활성을 입증하였다.

도 44a-b는 추출 전후의 아미노프로필 약 음이온 교환칼럼에 대한 MAIF 화합물의 분석. "전"(도 44a) 및 "후"(도 44b)란 유기분배 크로마토그래피 전후의 제제를 말한다. 도 44b의 이동한 용출 패턴에서 어깨부 "A"의 현저한 소실에 주목한다.

본 발명은 우유에 존재하는 항염증인자 및 우유에 존재하는 항염증인자의 사용을 수반하는 여러 가지 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 방법은 우유에서 지방을 제거하고; 우유를 여과하여 약 10,000달톤보다 큰 분자량을 갖는 분자를 제거하고; 작은 분자량의 분자를 함유하는 여액을 이온 교환에 의해 분별하고; 인자내의 이온교환 분획을 겔여과에 의해 더 강화하고 겔여과 분획을, 공면의 인접 시스 히드록실기에 대해 친화성을 갖는 크로마토그래피 매체를 이용한 친화성 크로마토그래피에 의해 더 강화함으로써 우유로부터 제조되는 항염증인자에 관한 것이다.

본 발명은 또한 특히 HPLC 크기배제 크로마토그래피 및 유기분배 추출법을 이용하여 우유의 항염증인자를 더 정제하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한 호중구가 세정맥의 내피에 부착하는 것을 방지하거나 또는 세정맥의 벽에 붙은 내피세포에 이미 부착된 호중구를 떼어내는데 우유 항염증인자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 이런 식으로 본 인자는 염증반응과 관련된 조직 손상을 감소시키는데 사용된다.

본 발명은 또한 CD18 세포표면 항원과 기타 분자간의 상호작용을 방지하는데 우유 항염증인자를 사용하는 방법에 관한 것이다. 그러한 상호작용은 혈관계(맥관조직)로부터 세포가 빠져나가기 위해 필요하며 이러한 유주(遊走)는 염증 반응동안 동물의 조직 손상을 증가시키게 된다는 것이 공지되어 있다. CD18 항원은 또한 이종항원에 대한 숙주 유기체의 면역학적반응에 중요하다는 것이 공지되어 있다.

또한 본 발명은 혈관계로부터의 세포 유주를 방지하고 이종 항원에 대한 임파구의 유사분열촉진반응을 억제하기 위해 포유동물에서 항염증인자를 사용하는 것도 포함한다.

본 발명은 우유에서 항염증인자를 분리 및 정제하는 것과 항염증성 질병을 치료하기 위해 동물에 상기 인자를 투여하는 것을 포함한다. 달리 말할때를 제외하고는 이하의 정의를 적용한다.

"우유 항염증인자"라는 용어는 고도면역 우유나 정상 암소의 우유로부터 얻어지는 인자를 의미한다. "실질적으로 순수한 우유 항염증인자"라는 용어는 본 발명을 위해 고분자량의 물질(>10,000 달톤)을 제거하고 이온교환 크로마토그래피로 저분자량의 음전하를 띤 종을 분리한 후 HPLC 크로마토그래피상에 단일의 주요 대칭 피크로서 용출되는 항염증인자를 의미한다. "고도로 정제된" 또는"고도로 순수한"이란 용어는 아미노프로필 약음이온교환 칼럼상에서 용출패턴이 도 44b의 것과 유사하나 반드시 동일하지는 않은 항염증인자를 의미한다. 그러한 용출 프로필의 두드러진 특징은 도 4b의 이동된 프로필에서 보이는 바와 같은 어깨부 A(도 44a에서 보였던 것)의 소실이 현저하다는 것이다. 정상 우유와 고도면역 우유 둘다 여기에 기술된 방법으로 가공하여 항염증인자를 얻을 수 있다.

"고도면역 우유"라는 용어는 본 발명을 위해 고도면역 상태로 유지된 우유생산 동물로부터 얻어지는 우유를 의미하는데, 고도면역화에 대한 상세한 내용은 이하에서 보다 상세히 기술한다.

"유장"이라는 용어는 본 발명을 위해 크림을 제거한 우유를 의미한다.

"정상적인 우유"라는 용어는 본 발명을 위해 통상적인 수단과 낙농 관행에 의해 우유생산 동물로부터 얻어지는 우유를 의미한다.

"우유 생산 동물"이라는 용어는 본 발명을 위해 상업화 가능한 양으로 우유를 생산하는 포유동물, 바람직하게는 암소, 양 및 염소, 보다 바람직하게는Bos속(소과)의 젖소, 특히 홀스타인종 젖소와 같은 최고 수율의 우유를 제공하는 품종을 의미한다.

"박테리아 항원"이라는 용어는 본 발명을 위해 가열-살균된 박테리아 세포의 동결건조 제제를 의미한다.

"마이크로캡슐화된 형태"라는 용어는 본 발명을 위해 우유 생산 동물에 투여하기 위한 한가지 이상의 박테리아 항원을 캡슐화하는 중합체 미립자를 의미한다.

"염증"이라는 용어는 본 발명을 위해 조직 손상 또는 파괴에 의해 야기되는 국소적 방위 반응으로서, 손상을 주는 작용제와 손상된 조직 둘 다를 파괴, 희석 또는 차단하는데 도움이 되고, 급성 형태에서는 동통, 고열, 발적, 종창 및 기능 상실의 전형적 연속을 특징으로 하며, 조직학적으로는 증가된 침투성과 혈류에 따른 세동맥, 모관 및 세정맥의 확장을 포함한 복잡한 일련의 사건, 혈장 단백질을 포함한 유체의 삼출 및 염증성 병소로의 백혈구 이동을 수반하는 것을 의미한다.

"치료"라는 용어는 본 발명을 위해 질병의 증상 및/또는 질병의 발병원이 호전되거나 완전 배제되는 것을 의미한다.

"투여"라는 용어는 본 발명을 위해 경구, 비강내, 비경구(정맥내, 근육내 또는 피하), 또는 장내와 같은, 피험체를 일정 물질로 치료하는 방법을 의미한다.

"동물"이라는 용어는 본 발명을 위해 사람, 농장동물, 가축 또는 동물원 동물을 포함한, 염증이 걸리는 어떤 살아있는 생물을 의미한다.

본 발명의 분리 및 정제된 우유제품으로 치료될 수 있는 염증상태의 예는 급성 및 아급성 점액낭염, 급성 비특정 건염, 전신 홍반성 낭창, 전신 피부사상균증, 급성 류머티스성 심장염, 천포창, 수포성 피부염, 헤르페스포진, 심한 홍반, 다형 박탈성 피부염, 경변, 계절다년성 비염, 기관지 천식, 피부일소증, 혈청병, 각막염, 안염성 홍채염, 미만성 요독염, 성대염, 시신경염, 교감성 안염, 증후성 사르코이도시스, 뢰플러 증후군, 베릴륨 중독증, 용혈성 빈혈, 유선염, 유돌염, 접촉성 피부염, 알레르기성 결막염, 건선 관절염, 강직성 척추염, 급성 통풍성 관절염 및 대상포진으로 구성된 군에서 선택되는 상태이다. 또한 본 분리 및 정제된 우유제품은 잠재적 염증성 약제에 노출되는 개체를 치료하는데 사용할 수 있다.

본 발명은 소과와 같은 우유 생산 동물에 특정 상태의 고도면역화를 일으킬 때 그 동물은 초정상 수준의 매우 이로운 항염증인자를 갖는 우유를 생산하게 되며, 상기 인자는 사람과 기타 동물에서 염증 증상을 억제할 뿐만 아니라 수용체내 염증제 존재의 사전 예방제이기도 하다는 발견에 일부 의거하고 있다. "초정상 수준"이라는 용어는 고도면역화되지 않은 동물의 우유에서 발견되는 것을 초과하는 수준을 말한다. 비록 정상 암소가 암소 질병에 대한 정상 면역화 동안 및 환경에의 정상 노출 동안 여러 항원에 대해 감수성을 갖게 되었을 지라도 정상 암소의 우유는 이러한 초정상 수준을 갖지 않는다는 사실에 의해 증명되는 바와 같이, 면역 감수성을 유도하는 것만으로는 우유에서 초정상 수준의 MAIF가 나타나게 하기에 불충분하다. 우유가 원하는 초정상 수준을 갖는 것은 특정 고도면역 상태에서 뿐이다.

이 특정상태는 초기면역 후 충분히 높은 용량의 특이적 항원으로 주기적인 추가면역(booster)을 투여함으로써 얻을 수 있다. 바람직한 추가항원량은 소의 1차 면역을 일으키는데 필요한 양과 같거나 그 양의 50%를 초과하여야 한다. 따라서 비록 암소가 통상 면역상태라고 말할 수 있는 상태에 있을지라도 우유에는 한계 추가항원량이 존재하는데 이 양 이하에서는 우유에서 특성이 나타나지 않는다. 필수의 고도면역 상태를 얻기 위해서는 고도면역 우유를 시험하는 것이 필수적이다. 우유에 이로운 인자가 존재하지 않으면 우유에서 특성이 나타날때까지 많은 양의 추가항원을 더 투여한다.

초정상 수준의 항염증인자 함유 고도면역 우유의 제조방법은 1990년 9월 11일 출원된 공동계류중의 미국특허출원 일련번호 580,382에, 또한 1989년 5월 22일 출원된 미국일련번호 355,786 (현재 미국특허 제5,106,618호, 1987년 7월 2일 출원된 미국일련번호 069,139의 계속 출원) 및 1986년 9월 17일 출원된 미국일련번호 910,297 (현재 미국특허 제4,919,929호, 1983년 2월 1일 출원된 미국일련번호 576,001의 계속 출원)에 개시되어 있는데, 이들 모두 그 전부가 여기에 참조문헌으로 포함되어 있다. 요약하면 초정상 수준의 항염증인자 함유 고도면역 우유를 제조하는 한가지 방법은 다음 단계들로 이루어진다. 즉 (1)항원선택단계, (2)소의 1차면역화단계, (3)감수성 유도를 확인하기 위해 혈청을 시험하는 단계, (4)적당한 투여량의 추가항원에 의한 고도면역화단계, 및 선택적으로 (5)우유를 항염증성에 대해 시험하는 단계, (6)우유를 고도면역 소로부터 수집하는 단계, 그리고 (7)MAIF를 분리하기 위해 우유를 가공하는 단계.

단계 1: 어떤 항원 또는 항원의 조합을 사용할 수 있다. 항원은 박테리아, 바이러스, 원생동물, 균, 세포, 또는 우유 생산 동물의 면역시스템이 반응하게 되는 어떤 다른 물질일 수 있다. 이 단계의 중요한 점은 항원(들)이 우유 생산 동물에서 면역 및 고도면역 상태를 유도할 수 있을 뿐만 아니라 우유에서 초정상 수준의 항면역인자를 생산할 수 있어야 한다는 것이다. 어떤 항원이든 초정상 수준의 인자를 생산하는데 사용할 수 있다. 한가지 바람직한 백신은 이하의 실시예 1에 상세히 기술된, 시리즈 100 백신으로 칭한 다가 박테리아항원의 혼합물이다.

단계 2: 항원(들)은 감작을 일으키는 어떤 방법으로 투여할 수 있다. 한가지 방법으로는, 1×10⁶내지 1×10²⁰, 바람직하게는 10⁸내지 10¹⁰, 가장 바람직하게는 2×10⁸개의, 가열-살균된 박테리아로부터 유래된 항원으로 구성되는 백신을 근육내 주사로 투여한다. 그러나 정맥내 주사, 복강내 주사, 직장좌약 또는 경구투여와 같은 다른 방법을 사용할 수도 있다.

단계 3: 우유 생산 동물이 항원에 대해 감수성을 갖게 되었는지의 여부를 결정하는 것이 필요하다. 면역학의 분야에 숙련된 자에게는 감수성을 시험하는 방법이 다수 공지되어 있다(Methods in Immunology and Immunochemistry, William, C.A., 및 Chase, W.M., Academic Press, New York, vols. 1-5(1975)). 바람직한 방법은 항원으로서 다중 박테리아종을 포함하는 다가 백신을 사용하는 것과 백신에 의한 공격 전후에 동물의 혈청내 응집 항체의 존재에 대해 시험하는 것이다. 백신으로 면역화후의 우유 항체 출현은 감수성을 암시한다. 이러한 점에서 단계 4로 진행하는 것이 가능하다.

단계 4: 이 단계는 감작 동물에서의 고도면역 상태 유도 및 유지를 수반한다. 이 단계는 1차 감작을 이루는데 사용하였던 것과 동일한 다가 백신을 고정된 시간 간격으로 반복하여 추가 면역 투여하여 이루어진다. 다가 박테리아 항원에는 2주의 추가면역 간격이 최적이다. 그러나 동물이 고도면역상태에서 항원에 대한 면역내성상태로 가지 않도록 보장하는 것이 필요하다.

바람직한 구체예에서 소과의 고도면역화는 이하의 실시예 1B에 상세히 기술된 바와 같이 제조된, 마이크로캡슐화된 백신의 단일 투여를 이루어진다. 서방형 고도면역화의 이점은 항원에의 일정 노출로 동물이 고도면역상태에 확실히 유지된다는 것이다.

또 하나의 구체예에서는 상이한 면역화 방법을 조합하는 것도 또한 가능하다. 예를들면 마이크로캡슐화된 항원과 액체항원을 동시 투여하거나 1차 면역화를 위해 근육내 주사하고 추가항원량을 마이크로캡슐화 수단에 의해 경구 투여 또는 비경구 투여한다. 1차 면역 및 고도면역화의 많은 다른 조합이 본 기술분야에 숙련된 자에게 공지되어 있다.

단계 5: 우유를 항염증 활성 수준에 대해 시험하는 것이 필요하다. 이것은 염증에 미치는 고도면역 우유 또는 이것으로부터 유래되는 생성물의 영향을 시험하는 어떤 연구방법으로든 이루어질 수 있다. 쥐 발의 화학약품 유발 염증이 항염증약에 대한 표준 검정법이다.

단계 6: 이 단계는 우유의 수집 및 가공을 수반한다. 우유는 통상적인 방법으로 수집할 수 있다. 항염증인자를 분리하기 위해 우유를 가공하는 것은 이하에 기술한다.

항염증인자를 분리, 정제 및 시험하는 가장 간단한 방법은 다음 단계로 이루어진다.

1. 고도면역 우유를 탈지하여 탈지유를 제조하는 단계,

2. 탈지유에서 카세인을 제거하여 유장을 제조하는 단계,

3. 유장에서 한외여과에 의해 약 10,000달톤보다 큰 분자량의 거대분자를 제거하는 단계,

4. 단계 3으로부터의 생성물을 이온교환수지칼럼을 이용하여 분별해서 분자량 약 10,000달톤 미만의 음전하를 띤 항염증성 종을 분리하는 단계,

5. 단계 4로부터 음전하를 띤 종을 분자체 크로마토그래피로 분리하는 단계, 및

6. 단계 5로부터의 항염증인자 제제를 생물학적으로 정량하는 단계.

또 하나의 바람직한 구체예에서는 생물학적 활성을 갖는 분자체 크로마토그래피로부터의 분획을, 약 5000달톤보다 큰 분자량의 거대분자를 보유하는 막을 통한 여과로 더 정제한다.

또 다른 바람직한 구체예는 HPLC 크기 배제 크로마토그래피와 유기분배추출에 의한 MAIF의 추가 정제를 더 포함한다.

7. 우유인자의 항염증작용을 쥐의 발에 카라기난의 용액을 주사하여 야기되는 부종에 대해 시험한다. 쥐 발 시험은 항염증약에 대한 표준 동물 시험이다. Winter, C.A., Risley, G.A., Nuss, A.W., "Carrageenan-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs, "Proc. Soc. Exper. Biol. Med.3;544(1967). 대안으로 실시예 24에 기술된 바와 같은 흉막 호중구 이동 억제 검정법을 이용할 수도 있다. Vinegar et al., "Some Quanti- tative Characteristics of Carrageenan-induced Pleurisy in the Rat, "Proc. Soc. Exp. Biol. Med.143: 711-714(1973); Ammendola, G. et al. "Leukocyte Migration and Lysozomal Enzymes Release in Rat Carrageenan Pleurisy,"Agents and Actions 5:250-255(1975); Vinegar, R. et al. "Quantitative Studies of the Pathway to Acute Carrageenan Inflammation.".Fed. Proc. 35: 2447-2456(1976). 여러 가지 다른 시험이 이용될 수 있다. Wetnick, A.S., and Sabin, C., "The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats,"Jap. J. Pharm.22: 741 (1972). 그러나 쥐 발 시험이 가장 간단한 직접 시험으로서 모든 항염증약에 대해 이용가능하고 만족스럽다고 증명된 시험이다. 이 시험은 벡크의 미국특허 4,284, 623에 상세히 기술되었는데, 이것은 쥐 발 시험을 기술하는 한도까지 여기에 참조문헌으로 포함된다. 간단히, 이 시험은 성숙한 흰쥐의 발바닥에 소량의 카라기난을 주사하는 것을 수반한다. 이것은 염증 반응을 유발한다고 공지되어 있다. 얻어지는 팽화도는 정량화할 수 있다. 항염증인자 함유 샘플을 적당한 경로, 바람직하게는 복강내 주사로 쥐에 투여하고 염증 진행의 장애 또는 호전을 부피측정법이나 중량측정법으로 정량화한다.

요약하면, 우유를 탈지하고, 카세인을 제거하고, 10,000달톤보다 큰 거대분자를 제거한 다음 이온교환 및 분자체 크로마토그래피가 계속되는 이하의 방법으로 고도면역화된 우유에서 항염증인자를 분리할 수 있다. 항염증인자의 적당한 제제의 생물학적 활성은 여기에 기술된 바와 같이 쥐에 대해 용량-반응 실험을 행함으로써 시험할 수 있다.

본 발명의 추가의 바람직한 구체예에서, 고도면역화된 우유에 존재하는 항염증인자는 분자를 그 분자량을 기초로 하여 분리할 수 있는 막상의 여과, 이온교환 크로마토그래피, 분자 체 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피(실시예 15)를 수반하는 단계의 조합을 이용하여 정제한다. 바람직한 제1단계는 상기한 바와 같이 제조한 고도면역화된 탈지유를, 약 10,000달톤 이상의 분자량을 갖는 분자를 보유하는 막을 통해 여과하는 것으로 이루어진다. 막을 통과한 물질(즉 여액 또는 투과물)은 수집하여 정제단계에 사용한다. 이러한 여과를 실행하는 장치 및 막은 당업계에서 주지이다.

여과후의 바람직한 단계는 음이온 교환체상의 이온교환 크로마토그래피이다. 디에틸아미노에틸기를 가진 교환체가 양호한 분리를 이루는 것으로 발견되었으나다른 음이온 교환체도 물론 사용할 수 있다고 예상된다. 이온교환체의 고체 지지체는 높은 유량을 유지할 수 있는 것이 바람직하다. 세파로스가 이 목적에 적합함을 발견하였다.

이온교환 크로마토그래피후의 바람직한 단계는 겔여과 크로마토그래피이다. 이 단계에 대한 칼럼 패킹은 10,000달톤 미만의 분자량을 갖는 분자를 분별할 수 있는 선택된 것이어야 한다. 바람직한 패킹은 Toyopearl HW-40(Rohm and Hass)이나 당업계에 잘 알려진 다른 패킹도 물론 사용할 수 있다. 사용할 수 있고 시중에서 입수가능한 다른 패킹의 예는 중합체 탄수화물 기초 패킹, 예를들면 세파덱스 G-10 또는 G-25(Pharmacia) 또는 폴리아크릴아미드 기초 패킹, 예를들면 바이오겔 P-2, P-4, P-6, P-10 또는 P-30 (Bio-Rad)이다.

겔여과 크로마토그래피후의 바람직한 단계는 보로네이트 친화성 지지체상의 친화성 크로마토그래피이다. 이들 지지체는 시스-디올기를 갖는 저분자량 화합물을 분별하는데 효과적임을 발견하였다. 바람직한 지지체는 아피겔 601(Bio-Rad)이다. 이것은 폴리아크릴아미드 겔여과 지지체 바이오겔 P-6(역시 Bio-Rad제)의 보로네이트 유도체이다.

이온교환, 겔여과 또는 친화성 크로마토그래피 단계후의 제제에 대한 바람직한 저장형태는 동결건조 분말로서이다. 제1정제단계에서 수집된 여액은 사용할 때까지 냉각상태로 저장할 수 있다. 정제로 얻어지는 항염증인자의 활성은 상기한 쥐 발 시험을 이용하여 측정할 수 있다.

본 발명의 또 다른 바람직한 구체예에서, 고도면역화된 우유에 존재하는 항염증인자는 10,000달톤의 분자량 컷오프를 갖는 막에 의한 한외여과, 이온교환 크로마토그래피, 분별용 HPLC 칼럼상의 크기 배제 크로마토그래피 및 유기 분배 추출을 수반하는 단계의 조합을 이용하여 분석학적으로 또는 분별 정제한다.

바람직한 제1단계에서 다량(예를들면 90리터)의 탈지유를 10,000달톤 컷오프를 갖는 한외여과 막에 통과시킨다. 얻어지는 투과물 (<10K 투과물)을 추가의 정제단계를 위해 수집한다.

상기 한외여과후의 바람직한 단계는 전단계로부터의 투과물 다량을 이온교환칼럼에 적용하는 것이다. 다음에 용출액은 동결건조할 수 있다. 디에틸-아미노에틸(DEAE)-세파로스 패스트 플로우 교환수지가 양호한 분리를 이루는 것을 발견하였다.

상기 이온교환 크로마토그래피후의 바람직한 단계는 이온교환칼럼으로부터 정제된 제제 다량(예를들면 100mg)을 분별용 HPLC 칼럼상에 위치시키는 것이다. HPLC 칼럼상에서 각각 100mg의 다중 샘플을 분리하고 그것들을 같은 세트의 튜브에 수집함으로써 훨씬 더 다량을 얻을 수 있다. 그 다음에 튜브를 모아서 그 내용물을 동결건조시킬 수 있다.

그 다음의 바람직한 단계는 50-100mg의 동결건조된 HPLC 칼럼 샘플을 취하고 n-헥산으로 추출하여 중성 지질을 제거하고 산성화에 이어 아세트산에틸로 재추출하는 것을 수반하는 유기 분배 추출이다. 유기 분배 추출 전후의 아미노프로필 약음이온 교환 칼럼상에서의 제제 분석은 도 44에 도시되어 있다.

실시예 16에 기술된 실험결과로, 항염증인자 제제에 의한 동물의 예비처리는세정맥에 붙은 내피세포에 대한 호중구의 혈소판활성인자(PAF) 자극 부착을 감소시키고 또한 호중구가 세정맥으로부터 유주하는 비율을 감소시킨다는 것을 알 수 있다. 또한 PAF로 동물을 치료한 후의 항염증인자제제 투여는 내피 세포에 부착하는 호중구수를 감소시킴을 발견하였다. 환자 또는 동물이 이들 효과로 인해 이로울 수 있는 한도까지 본 발명은 항염증인자 제제의 사용을 포함한다. 이것은 수반되는 특정 질환과 관계없이 해당된다. 유사하게, 실시예 16의 데이터로, 본 항염증인자는 세포표면 CD18항원과 직접 상호작용하고 다른 분자가 이 글리코단백질 복합체와 상호작용하는 것을 방지함으로써 부착 및 유주에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 본 발명은 항염증인자제제의 이러한 용도에의 사용도 또한 포함한다.

실시예 18에서 밝혀지는 바와 같이 항염증인자 제제를 동물에 투여하면 이식편 대 숙주 반응은 아니지만 숙주 대 이식편 반응이 억제되며 비장무게 및 비장 임파구수가 증가된다. 콘카나발린 A에 대한 임파구 반응도 또한 본 제제에 의해 종결됨을 발견하였다. 이들 데이터로 본 항염증인자는 조직파괴성 감염 과정의 억제와 임파구 기능의 억제가 바람직한 상황에 유효다는 것을 알 수 있다.

도 43에 도시된 바와 같이 MAIF (유기 분배 추출로 얻어짐)의 탈염은 유사한 수준의 쥐 흉막 백혈구 이동 억제를 얻는데 필요한 MAIF의 10,000배 정도 더 낮은 용량으로 알 수 있는 바와 같이 정제의 극적인 증가를 가져온다.

본 발명의 조성물은 항염증활성을 제공하는 어떤 수단으로 투여할 수 있다. 예를들면 투여는 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내 또는 경구일 수 있다.

경구투여용 고체 제형(dosage form)으로는 캡슐제, 정제, 환제, 산제, 과립제를 들 수 있다. 그러한 고체 제형에서는 활성 화합물을 수크로오스, 락토오스 또는 전분과 같은 적어도 한가지의 불활성 희석제와 혼합할 수 있다. 그러한 제형은 또한 통상의 관행대로 불활성 희석제 이외의 추가 물질을 포함할 수 있다. 캡슐제, 정제 및 환제의 경우 제형은 또한 완충제를 포함할 수 있다. 부가적으로 정제 및 환제는 장용피를 사용하여 조제할 수 있다.

경구투여용 액체 제형으로는 약학 분야에 공통으로 사용되는 불활성 희석제를 함유하는 약학적으로 허용되는 유액, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 들 수 있다. 불활성 희석제 이외에 그러한 조성물은 또한 습윤제, 유화·현탁제 및 감미제와 같은 보조제를 포함할 수 있다.

비경구 투여용의 본 발명에 따른 제제는 멸균 수성 또는 비수성 용액, 현탁액 또는 유액을 포함한다. 비수성 용매 또는 보조제의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성기름 및 올레산에틸과 같은 주사용 유기 에스테르이다.

본 발명의 조성물중 유효성분의 양은 다양할 수 있다. 그러나 유효성분의 양은 적합한 제형이 얻어질 정도이어야 하는 것이 필수적이다. 선택 제형은 원하는 치료효과, 투여경로 및 치료기간에 좌우된다.

투여량 및 횟수는 부작용이 일어날 가능성을 고려하여 환자의 연령 및 전반적 건강상태에 좌우될 것이다. 투여는 또한 다른 약물에 의한 동시 요법과 투여약물의 환자내성에도 좌우될 것이다.

현재 본 발명을 개괄적인 말로 기술하였으므로 몇가지 특정 실시예를 참조로본 발명을 더 기술하기로 하는데 이 실시예는 단지 설명을 위해 여기에 제공되는 것이며 달리 명시하지 않는 한 한정하도록 의도되지는 않는다.

(실시예 1A)

S-100 백신의 제조:

아메리칸 타입 컬춰 콜렉션으로부터 얻어진 바와 같고 하기 표 1 에 나타낸 범위의 박테리아를 함유하는 박테리아 배양액을 15 ml 의 배지로 재구성하여 37 ℃ 에서 밤새 인큐베이션하였다. 일단 양호한 성장이 이루어지면, 박테리아 현탁액의 대략 절반을 사용하여 1 리터의 육즙을 접종하고, 그 접종액을 37 ℃ 에서 인큐베이션하였다. 나머지 현탁액은 멸균 글리콜 튜브에 옮겨서 -20 ℃ 에서 6 개월 까지 보관하였다.

배양액에서 양호한 성장이 이루어진 것을 본 다음에, 현탁액을 20 분동안 원심분리하여 배지를 제거함으로써 박테리아 세포를 수확하였다. 얻어진 박테리아 펠릿을 멸균 식염수 용액에 재현탁하고, 박테리아 샘플을 3 회 원심분리하여 세포로부터 배지를 세척하였다. 세 번째로 멸균 식염수로 세척한 후에, 원심분리에 의해 얻어진 박테리아 펠릿을 소량의 이차 증류수에 재현탁시켰다.

배지가 없는 박테리아 현탁액을, 이 현탁액을 80 ℃ 의 수조에 있는 유리 플라스크에 밤새 넣어둠으로써 가열-살균시켰다. 육즙 배양액의 생존력을 소량의 가열-살균된 박테리아로 시험하였다. 육즙을 가열-살균된 박테리아로 접종하고, 이것을 5 일동안 37 ℃ 에서 배양하면서, 백신으로서 사용하기 위해서는 박테리아가 살균되어야 하기 때문에 매일 성장을 체크하였다.

가열-살균된 박테리아를 건조될 때까지 동결건조시켰다. 그런 다음 건조된 박테리아를 멸균 식염수 용액과 2.2×10⁸박테리아 세포/ml 식염수의 농도 (660nm 에서 읽었을 때 1.0 광학 밀도) 로 혼합하였다.

S-100 박테리아 목록

이름	배지	그람 + 또는 -	ATCC 번호
1. 스타필로코커스 아우레우스(녹농균)	BHI	+	11631
2. 스타필로코커스 에피더미디스	BHI	+	155
3. 스트렙토마이세스 피오게네스, A. 타입 1	APT	+	8671
4. 스트렙토마이세스 피오게네스, A. 타입 3	APT	+	10389
5. 스트렙토마이세스 피오게네스, A. 타입 5	APT	+	12347
6. 스트렙토마이세스 피오게네스, A. 타입 8	APT	+	12349
7. 스트렙토마이세스 피오게네스, A. 타입 12	APT	+	11434
8. 스트렙토마이세스 피오게네스, A. 타입 14	APT	+	12972
9. 스트렙토마이세스 피오게네스, A. 타입 18	APT	+	12357
10. 스트렙토마이세스 피오게네스, A. 타입 22	APT	+	10403
11. 에어로박터 에어로게네스	BHI	-	884
12. 어셔리쉬아 콜리 (대장균)	BHI	-	26
13. 살모넬라 엔테리티디스	BHI	-	13076
14. 슈도모나스 에어루기노사	BHI	-	7700
15. 클레브시엘라 뉴모니애	BHI	-	9590
16. 살모넬라 타이피뮤리움	BHI	-	13311
17. 헤모필루스 인플루엔자	BHI	-	9333
18. 스트렙토마이세스 미티스	APT	+	6249
19. 프로테우스 불가리스	BHI	-	13315
20. 시겔라 디센테리아	BHI	-	11835
21. 디플로코커스 뉴모니애	APT	+	6303
22. 프로피오니박터 아크네스	육즙	+	11827
23. 스트렙토마이세스 상귀스	APT	+	10556
24. 스트렙토마이세스 살리바리우스	APT	+	13419
25. 스트렙토마이세스 뮤탄스	BHI	+	25175
26. 스트렙토마이세스 아갈락티아	APT	+	13813

암소에게 매일 5 ml 씩의 다가 액체 백신 샘플을 주사하였다. 주사된 소에대한 항체 (IgG) 역가 수준을, 다가 항원에 대한 소 항체에 대하여 효소-결합된 면역검정을 사용함에 의해 주기적으로 측정하였다.

(실시예 1B)

면역화 과정

가열-살균된 박테리아를 상술한 바와 같은 방법으로 준비하였다. 얻어진 다가 항원 샘플 (S-100) 을 종래의 상-분리 방법에 의해 마이크로캡슐화하여 다가 항원-함유 마이크로입자 생성물을 제조하였다. 일반적으로, 항원-함유 형상 매트릭스 물질은 생체적합 물질의 중합체, 바람직하게는 생체분해성 또는 생체부식성 물질, 바람직하게는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 락트산과 글리콜산의 공중합체, 폴리카프로락톤, 코폴리옥살레이트, 콜라겐과 같은 단백질, 글리세롤의 지방산 에스테르, 및 셀룰로오스 에스테르들의 중합체로부터 형성된다. 이들 중합체들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있고, 예를 들면 미국 특허 제 3,773,919 호, 3,887,699 호, 4,118,470 호, 4,076,798 호에 기술되어 있다. 사용된 중합체 매트릭스 물질은 생체분해성 락타이드-글리콜리드 공중합체였다.

가열-살균된 박테리아 항원은 상기와 같은 매트릭스 물질, 바람직하게는 직경이 1 내지 500 마이크론, 보다 바람직하게는 10 내지 250 마이크론인 미소구에 캡슐화된다. 캡슐화 방법은 종래의 것을 따르는데, 그러한 것으로는 상 분리 방법, 계면 반응, 및 물리적 방법이 있다. 미소입자로부터 숙주의 신체로 박테리아 항원을 방출하는 최적의 속도를 제공하기 위하여 매트릭스의 많은 조합 및 분류된 항원의 많은 농축물이 사용될 수 있다. 그러한 조합은 과도한 실험없이도 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본 실시예의 미소입자들은 직경이 250 마이크론 미만의 것들이었다. 22 % (16.5 mg) 의 다가 항원을 함유하고 있는 대략 750 mg 의 미소입자를 약 3 cc 의 비히클 (물중의 1중량%의 트윈 20 과 2 중량 % 의 카르복시메틸 셀룰로오스) 에 현탁시켰다.

보다 큰 무리의 소 떼로부터 작은 그룹의 소를 선택하였다. 이들 무작위로 선택된 소들 중에서 5 마리를 대조표준으로서 선택하였다. 4 마리의 소에게는 다가 항원을 함유하고 있는 미소입자를 근육내로 주사하였다. 미소입자 샘플은 2.0 mRad 의 감마 방사선으로 멸균시켰다. 항체 (IgG) 역가 수준은 접종된 암소로부터 얻어지는 우유의 샘플로부터, 및 대조표준 암소로부터 얻어지는 우유 샘플로부터 주기적으로 측정하였다.

(실시예 2)

고도면역된 우유로부터 MAIF 인자의 분리

단계 1: 우유 여액 제조

고도면역된 암소로부터 얻은 신선한 우유 20 리터를 크림 분리기 (DeLavel Model 102) 를 통과시켜 지방을 제거하였다.

그 결과 얻어진 16 리터의 탈지유를 중공 섬유 다이아필트레이션/농축기 (Amicon DL-10L) 를 사용하여 한외여과함으로써 고분자량 단편들 (10,000 달톤 이상) 을 제거하였다. 농축기에는 2 개의 10,000 달톤 분자량 컷오프 카트리지(Amicon H₅P_10-43) 가 장착되어 있다. 탈지유는 계측기상에서 80 의 펌프 속도 및 각각 30 psi 와 25 psi 의 유입 및 유출 압력에서 여과되었다.

시간당 4 리터의 유속으로 카트리지를 통과해 나온 여액 (< 10,000 달톤) 12 리터를 보관 및 나중의 정제를 위하여 동결 또는 동결건조시켰다.

단계 2: 이온교환 크로마토그래피

먼저 여액안에 있는 우유 항염증인자를 음이온 교환 크로마토그래피 칼럼에 의해 분리하였다.

이 과정에서, DEAE-세파로스 CL-6B (Pharmacia) 를 사용하여 멸균 이차 증류수, pH 7.0 으로 평형화되어 있는 5 × 10 cm 유리 칼럼을 패킹하였다.

1 리터의 여액 (< 10,000) 을 칼럼에 적용하고 시간당 160 ml 의 유속으로 멸균 이차 증류수, pH 7.0 으로 용출시켰다. 10 ml 의 분획을 모아서 LKB 유비코드 (Uvicord) 4700 흡광계로 280 nm 에서 모니터하고, 광학 밀도를 연결되어 있는 기록기 (Pharmacia REC-482) 상에 출력시켰다.

양성 및 중성 전하를 가지고 있는 항염증인자외의 물질은 DEAE-세파로스 겔에 결합하지 않았다. 그것들은 폴쓰루우 (fallthrough) 피크 (첫번째 피크) 에서 용출된다. 음전하를 운반하는 항염증인자는 겔에 남아 있다.

인자를 용출하기 위하여, 칼럼을 멸균 생리 식염수, Ph 7.0 을 사용하여 단계식 구배로 용출하였다. 이 용출의 전형적인 프로필은 도 1 에 도시된다. 개개의 분획의 생물학적 검정 결과 두 번째 피크에 인자가 함유되어 있는 것으로 나타났다. 두 번째 피크와 그 주변의 것을 포함하는 분획들을 추가의 정제에 사용하였다. 회수 연구 결과는 8.8 그램의 건조 분말이 이 과정에 의하여 얻어졌음을 나타낸다.

단계 3: 겔 여과 크로마토그래피

상기 단계 2 로부터 얻어진 두 번째 피크는 항염증인자와 다른 음전하를 띤 분자들을 함유한다; 그러므로, 추가의 정제 단계가 필요하다. 추가의 정제를 이루기 위해서는 분자량을 토대로 하여 다양한 성분들을 분리하는 겔 여과 칼럼을 사용하는 것이 편리하다.

이 방법에서, 세파덱스 G-10 수지 (Pharmacia) 로 2.5 × 80 cm 의 유리 칼럼을 패킹하고, 멸균 이차 증류수, pH 7.0 으로 평형화시켰다. 단계 2 로부터 얻은 2 그램의 두 번째 분획을 멸균 이차 증류수에 재용해시키고 칼럼의 상부에 적용하였다. 칼럼은 시간당 30 ml 의 유속으로 용출하였다. 3.3 ml 씩의 분획을 모아서 254 nm 및 280 nm 에서 모니터하고 (Pharmacia Duo Optical Unit), 광학 밀도를 연결되어 있는 기록기 (Pharmacia REC-482) 상에 출력시켰다.

전형적으로 도 2 에 도시된 바와 같이, 용출 프로필에는 3 개의 피크가 나타난다. 첫 번째와 두 번째 피크가 항염증인자를 함유하였다.

첫 번째 피크는 G-10 칼럼상에서 형성되고 활성 인자를 함유하는 응집물이다.

두 번째 피크는 응집되지 않은 형태의 인자를 함유한다. 응집 형태 (피크 1) 와 비응집 형태 (피크 2) 는 둘다 쥐 생체 검정에서 생물학적으로 활성이다.

(실시예 3)

우유 항염증인자의 특성확인

상술된 바와 같은 방법에 의해 제조된 인자의 비응집 형태의 분자량은 10,000 달톤 미만인 것으로 나타났다. 이것은 유장으로부터의 인자의 분리에 있어 첫 번째 단계가 10,000 달톤 이상의 분자량을 가진 조각들은 통과되지 않는 막을 사용한 한외여과에 의한 것이었다는 사실로부터 추론된 것이다.

인자는 음전하를 갖는다. 이것은 우유의 한외여액을 DEAE 셀룰로오스 이온 교환 칼럼에 적용함으로써 측정되었다. 항염증 활성은 물로 칼럼을 용출할 때 용출되지 않는다. 용출 매질을 염화 나트륨 (0.9 % pH) 으로 바꾸면 여러 개의 피크의 용출이 유도되었다 (도 1). 중성 및 양성 전하를 띤 조각들은 이온 교환 수지에 고정되지 않고, 음전하의 조각들은 염 농도를 증가시킴에 의해 용출된다. 10,000 달톤 미만의 분자량을 가진 투과물을 DEAE 칼럼에 적용하면, 중성의 염과 당은 물로서도 용출되었다 (피크 1, 도 1). 세 개의 분명한 피크가 완충액을 식염수로 바꾸었을 때 용출되었다 (피크 2-4). 두 번째 피크와 그 주변의 것들은 쥐 검정에서 항염증 생물학적 활성을 함유하였다. 그러므로, 인자는 음전하를 가지고 있다고 결론지어진다.

인자의 다른 화학적 특성은 그것이 염을 제거하는 과정중에 응집체를 형성한다는 것이다. 이러한 성질은 10,000 달톤 미만의 분자량을 가진 투과물이 이차 증류수로 평형화되어 있고 pH 7 에서 물로 용출되는 세파덱스 G-10 칼럼을 통과할 때 분명해진다 (도 2). G-10 칼럼으로부터는 세 개의 피크가 용출된다: 첫 번째 피크는 분자량이 10,000 달톤과 같거나 또는 그 이상임을 나타내는 공극 부피로 용출되었다. 이것은 10,000 달톤 이상의 분자들이 이미 한외여과에 의하여 이 샘플로부터 제거되었기 때문에 예상하지 못했던 것이다. 두 번째 피크는 항염증인자에 대해 예상했던 위치에서 용출되었다. 첫 번째와 두 번째 피크는 모두 쥐의 발 검정에서 항염증성 생물학적 활성을 나타낸데 반해 세 번째 피크에는 활성이 없었다. 첫 번째와 두 번째 피크가 둘 다 항염증성 생물학적 활성을 가졌음을 발견한 것은 놀라운 것이었다. G-10 칼럼의 첫 번째 피크로부터 회수된 물질 (단계 3) 을 동결건조시키고 G-100 칼럼에 적용하였다; 공극 부피에서 단일 피크가 용출되었고, 이것은 분자량이 100,000 달톤 또는 그 이상임을 나타낸다. 단계 3 의 G-10 칼럼으로는 염이 제거됨과 동시에 상이한 분자량 조각들이 분리된다. 그러므로, G-10 칼럼을 통과하는 도중에 및 그 결과로 염을 제거한 후에 항염증인자가 큰 분자량 응집체를 형성하였다고 결론지을 수 있다. 응집도는 염 농도에 따라 달라졌다.

응집 성질은 항염증인자의 존재로 인하여 항염증성 생물학적 활성을 가지고 있는 넓은 분포 범위의 상이한 분자량 조각들이 형성될 수 있는 가능성을 시사한다. 이러한 성질의 발견은 최종 생성물의 응집도에 좌우되는 넓은 분포 범위의 상이한 생화학적 성질을 가지고 있는 우유 항염증인자의 생산 가능성을 시사한다. 예를 들면, 더 길거나 또는 더 짧은 생물학적 반감기를 가지는 제형들이, 더 크거나 더 작은 분자량 응집체를 사용함에 의해 제조될 수 있고, 이 때의 분자량 분포는 제조 과정중에 염 농도에 의해 조절된다. 본 실시예에서 설명된 칼럼 크로마토그래피 방법은 생물학적 활성을 가지면서 얻어질 수 있는 가장 작은 분자량 조각을산출한다 (즉, 단계 3 의 G-10 칼럼으로부터 얻어지는 피크 2). 이러한 관찰은 또한 응집체를 형성하는데 다른 방법을 사용할 수 있음을 시사한다. 예를 들면, 물을 이용한 희석은 응집이 일어나는 것을 유발한다. 염과 결합하는 화학 제제, 특히 칼슘은 응집체의 형성을 유발할 수 있다. 이런 발견을 이용하면, 응집체를 형성하고 인자를 분리하기 위한 다른 방법들이 당업자에게 명백할 것이다.

(실시예 4)

생물학적 활성 검정

정제된 항염증인자의 항염증성 작용을, 카라기난 용액을 쥐의 발바닥에 주사함으로써 유발된 부종에 대해 시험하였다. 우유 항염증인자 제제의 동결건조된 샘플을 적절한 비히클에 녹여서 실험용 쥐에 복강내로 투여하였다. 그런 다음 카라기난을 0.1 ml 의 1 % 식염수 용액으로 쥐의 각각의 뒷발바닥에 투여하였다. 두께 게이지를 사용하여 주사전에 발바닥을 측정하고, 주사후 2.5 시간이 지난후에 측정하였다. 그 결과는 하기 표 2 와 3 에 나타낸다. 이들 표에서, 약어 MAIF 는 상기 실시예 1 과 2 에서 설명된 과정을 사용하여 얻어진 우유 항염증인자 제제를 언급하는 것이다.

대조표준 및 고도면역된 우유로부터 얻어진 비응집 형태의 인자 (G-10 칼럼으로부터의 피크 2) 는 1 mg 과 0.25 mg 사이의 용량으로 투여했을 때 쥐 발의 염증을 감소시켰다 (표 2). 고도면역 우유 및 정상적인 우유는 둘 다 활성을 나타냈다; 그러나, 고도면역된 물질이 더 강력하였다. 따라서 본 발명자들은 이러한 사실로부터, 항염증인자가 고도면역된 소에서 얻어지는 우유에 더 큰 농도로 존재한다고 결론지었다.

DEAE 칼럼으로부터 얻어지는 두 번째 피크는 고도면역된 우유 또는 정상적인 우유로부터 분리되었을 때 활성을 나타냈다. 활성은 실질적으로 고도면역 우유에서 더 컸다 (표 3).

응집 형태의 인자인 G-10 칼럼으로부터의 첫 번째 피크도 쥐 발 시험에서 활성을 나타냈다 (표 2). 그러나, 응집 형태는 동일한 무게 기준에서 볼 때 비응집 형태만큼 강력하지 못하다.

이들 연구로부터 항염증인자는 소의 우유에서 자연적으로 발생한다고 결론지을 수 있다. 소의 고도면역화는 우유에서 더 높은 농도의 인자를 유발한다. 인자는 작고, 음전하를 띈 분자이며, 우유로부터 다양한 방법에 의해 분리될 수 있다. 인자는 우유에서 자연적으로 발생하지 않는, 그러나 처리 과정중에 형성되는 큰 분자량 응집체를 형성할 수 있다.

쥐에서 염증의 감소에 미치는 우유 항염증인자 (MAIF) 의 영향

고도면역 우유로부터 제조
발바닥 측정(mm)
MAIF 용량	주사 전	주사 후	차이	% 염증
2.0 mg/쥐	3.43	5.01	1.58	46
1.0 mg/쥐	3.49	5.39	1.90	54
0.5 mg/쥐	3.42	5.51	2.09	61
0.1 mg/쥐	3.43	5.86	2.43	71
대조표준/식염수	3.43	5.82	2.39	70
정상적인 암소의 우유로부터 제조
2.0 mg/쥐	3.30	5.24	1.94	59
1.0 mg/쥐	3.31	5.22	1.91	58
0.5 mg/쥐	3.32	5.33	2.01	61
0.25 mg/쥐	3.31	5.42	2.11	64

쥐에서 염증의 감소에 대한 MAIF 의 반정제된 분획 (고도면역 및 정상적인 우유로부터 제조) 의 비교

발바닥 측정(mm)
	주사 전	주사 후 2.5 시간	차이	% 염증
DEAE 칼럼두 번째 피크과잉면역 우유2 mg/쥐	3.25	5.04	1.79	55
DEAE 칼럼두 번째 피크정상적인 우유2 mg/쥐	3.30	5.24	1.94	59
G-10 칼럼첫 번째 피크2 mg/쥐	3.31	4.98	1.67	50
대조표준/식염수	3.34	5.63	2.29	69

(실시예 5)

항염증인자의 화학적 분석

항염증인자 샘플을 화학적으로 분석하였다. 인자는 X-선 회절 연구에 의해 측정되는 바, 결정 구조가 아니다. MAIF 제제는 탄수화물 조성과 일치하는 원소 분석을 나타냈다. C, H, O 비율은 일부의 카르비놀 기가 카르복실 기로 산화된 중합체 또는 올리고머 물질과 일치하였다. 염화물 이온을 초과하는 칼슘 동등물의 약간의 과잉은 부분적으로는 카르복실레이트 염으로서 설명될 수 있다. 그 나머지는 나트륨 또는 칼륨 염일 수 있다. 그러나, 용융 방식, 또는 오히려 비-용융 방식은 그것이 염과 유사하거나 및/또는 고분자량 조성물일 것으로 나타났다. 현 상태의 순도를 가지고 있는 물질은 분명히 가변량의 칼슘 염과 염화물, 아마도 CaCl₂를 함유한다.

어떠한 제제도 그것의 조성내에 어떠한 펩티드 성분을 방해하는 유의할 만한 양의 질소를 함유하지 않았다. 마찬가지로, 유의할 만한 양의 질소의 부재는 아미노 당과 다른 질소-함유 물질, 예컨대 다양한 복합 지질이 주요 성분(들)로서 존재하는 것을 배제할 수 있다.

열 분해 질량 스펙트럼은 유의할 만한 양의 18-탄소 지방산을 나타냈다. 이 사실은 미량의 N 과 P 를 함께 생각할 때, 제제중에 복합 지질이 존재함을 시사한다.

적외선 분광학은 카르비놀과 카르복실레이트 작용기와 일치하는 흡광도를 나타냈다. 자외선, 가시광선 및 형광 분광학은 적외선에 의해 나타난 것을 뛰어넘는 어떠한 유의할 만한 양의 발색단도 나타내지 않았다.

화학적 시험들은 카르보닐 작용기 (알데히드 또는 케톤) 가 하위단위체 결합으로 고정되어 있는 올리고머 카르복실레이트와 일치한다. 올리고머 카르복실레이트는 또한 카르복실레이트에 대하여 약간의 측쇄 산화를 함유한다.

MAIF 제제는 실질적으로 순수하다. 그러나 완전히 순수한 것은 아니다.

(실시예 6)

쥐 발 부종 시험 : 경구 투여

쥐의 카라기난 발바닥 검정을 사용하여 생체내 항염증제로서의 항염증인자의 효과를 시험하였다. 30 마리의 성숙한 쥐들을 각 군당 10 마리 씩의 3 군으로 무작위로 나누었다. 이들 군에게 연속해서 5 일동안 매일, 고도면역화된 동물로부터 얻은 탈지유 분말 10 mg, 또는 면역화되지 않은 동물로부터 얻은 탈지유 분말 10 mg 을 주거나 또는 아무 처리도 하지 않았다 (매일 20 ml 씩의 물만 줌). 분말은 20 ml 의 물에 넣어 경구 투여하였다. 5 일째 되는 날, 각 쥐의 오른 쪽 발에 0.1 ml 의 식염수중의 1 % 카라기난을 주사하였다. 이 과정은 급성 염증 (부종) 을 유발하는 것으로 알려져 있다. 주사후 24 시간이 지난 후, 쥐들을 희생시켜서, 발을 절단하여, 왼쪽 발 (대조표준) 과 오른 쪽 발 (부종) 의 무게를 비교하였다. 이 검정의 결과는 하기 표 4 (그램으로 무게로 표시함) 및 도 3 (대조 발의 평균 무게의 백분율로 표시함) 에 나타낸다.

쥐 발의 부종 시험 결과 (발의 무게, g, 평균 ± 편차, n = 10)

처리	카라기난발 (무게, g)	대조표준발 (무게, g)	차이 (g)
면역 우유	1.78 + 0.03	1.71 + 0.02	0.06 + 0.02
대조 우유	1.88 + 0.06	1.64 + 0.03	0.24 + 0.05
물	1.86 + 0.03	1.65 + 0.03	0.22 + 0.02

카라기난 주사에 대한 염증 반응은 비면역 우유와 물 대조 군과 비교할 때 면역 우유로 처리된 쥐에서 현저하게 감소되었다. 쥐들의 일반적인 건강에 미치는 부작용이나 역효과의 증거는 검출되지 않았다. 이들 데이터로부터 고도면역화된 동물로부터 얻어진 탈지유 분말의 매일 매일의 소비가 쥐의 발바닥에서 카라기난에의해 유도된 염증 반응을 거의 완전하게 차단하였다고 결론 지을 수 있다.

(실시예 7)

정량적인 쥐 발 부종 시험

고도면역 우유 분획에 대하여 일련의 실험을 수행하였다. 이 실험은 복강내로 투여되었을 때 우유 항염증인자의 항염증 활성을 확인하고, 용량 반응 곡선을 수립하고, 다른 투여 경로를 탐색하며, 추가의 연구에 대한 기초를 형성할 용량 섭생법을 연구하기 위하여 디자인하였다.

G-10 칼럼으로부터 얻어지는 첫 번째 피크 (Stolle Milk Biologics International 사에서 공급받음) 를 미국 특허 제 4,956,349 호에 기술된 방법을 따라 제조하였다. 시판되는 락토오스를 위약 (placebo) 으로서 사용하였다. 아스피린은 양성 대조표준으로서 사용하였다. 아스피린을 물에 녹여서, 검정에서 활성인 것으로 알려져 있는 용량인 200 mg/kg 의 비율로 위관 영양법에 의해 경구로 투여하였다. 카파 카라기난 (Sigma C-1263) 의 2 % 용액은 가장 재생가능한 결과를 낳는 것으로 알려져 있으므로 본 실험에서 사용하였다. 발바닥 검정은 카라기난-유발 병변에 위치하고 삼출물의 부피와 직비례하는 방사성 동위원소적으로 표지된 사람 혈청 알부민 (¹²⁵I-HSA) 을 사용하여 변형시켰다. 발바닥의 총 방사능 카운트를 측정하고 이것을 주사된 동물로부터 얻어진 혈장의 공지 부피중의 카운트와 비교함으로써, 혈장 동등물의 마이크로리터로 표시되는 부종의 직접적인 측정이 이루어진다.¹²⁵I-HSA 를 쥐 한 마리당 1.0 마이크로퀴리의 양으로 정맥내로 주사하였다. 암컷 다크 아고우티 쥐를 사용하였다. 쥐들은 대략 12 주 된 것들이었고, 체중이 160 내지 200 g 사이였으며, 한 집단안에서 동계 교배된 개체군으로부터 얻은 것들이었다.

카라기난 발바닥 검정을 수행하기 위하여, 0.1 ml 의 2 % 카라기난을 마취된 쥐의 각각의 뒷발바닥에 피하 주사하였다. 이 주사후에 즉시 0.5 ml 의 식염수중의 1.0 마이크로퀴리의¹²⁵I-HSA 를 꼬리 정맥에 주사하였다. 4 시간 후에, 각 쥐의 체중을 측정하고, 혈액 샘플을 얻고, 안락사시켰다. 그런 다음 뒷발을 절취하여 각 발의 방사능 수준과 200 ㎕ 혈장 표준의 방사능 수준을 자동 감마 카운터에서 측정하였다. 이들 측정으로부터 각 발의 부종의 부피를 계산하였고 마이크로리터로 표시하였다.

실험 1: 복강내 용량 반응

도 4 는 락토오스 (CON), 아스피린, 및 무처리 (No R_x) 와 비교한 MAIF 의 정제된 제제의 복강내 투여 효과를 도시한다. 모든 처리 (락토오스, 아스피린, MAIF) 는 카라기난 주사 30 분 전에 투여하였다.

카라기난 주사는 평균 250 ㎕ 의 부종 (No R_x) 을 유발하였다. 부종은 아스피린과 모든 용량의 MAIF 제제에 의해 억제되었으나, 락토오스에 의해서는 억제되지 않았다. 평균 대조 (무처리) 부종의 백분율로서 데이터를 표시함으로써 그려진, MAIF 제제로 얻은 복강내 용량-반응 곡선은 도 5 에 도시된다.

실험 2: MAIF 투여의 다양한 경로의 영향

도 6 은 발의 부종에 미치는, 락토오스 및 정제된 MAIF 제제의 경구 투여 (ORAL), 근육내 투여 (IM), 피하 투여 (SUB Q), 및 정맥내 투여 (IV) 의 영향을 도시한다. 또한 도 6 에는 양성 대조표준 (아스피린) 및 무처리 대조표준 (No Rx) 도 도시되어 있다.

카라기난 공격 전에 다음 스케쥴에 따라 제제를 투여하였다 : 아스피린: 경구, 30 분 전; 피하 MAIF: 1 시간 전; 경구 MAIF: 24, 16 및 1 시간 전; 근육내 MAIF: 30 분 전; 정맥내 MAIF: 공격과 동시에 (방사성 동위원소도 또한 주사함).

그 결과는 각각의 별도의 검정에서 평균 대조 부종의 백분율로 표시된 바와 같이, 항염증인자가 모든 투여 경로에 의해 부종 형성을 억제하였음을 나타낸다. 정맥내로 투여된 40 mg 의 MAIF 제제가 카라기난에 대한 염증 반응을 거의 완전하게 방해하였다. 이들 결과는 MAIF 의 항염증 활성을 증명하며, 상기 실험 1 의 결과의 견지에서 상이한 투여 경로의 효과의 순서가 IV > IP > IM > SUB Q > ORAL 임을 시사한다.

실험 3: 부종에 대한 정맥내 및 연장된 경구 투여의 영향 : 용량 반응

도 7 은 쥐에서 발바닥 부종에 미치는 정제된 항염증인자의 제제의 IV 및 경구 투여의 영향을 도시한다. MAIF 경구 처리 (40 mg/쥐/일) 는 6 일 동안 매일, 또한 카라기난 공격 (PO) 한 시간 전에 투여하였다. 정맥내 처리 (5, 10, 15 mg) 는 카라기난 공격과 동시에 투여하였다 (IV). 또한 도 7 에는 양성 대조표준 (아스피린) 과 음성 대조표준 (무처리) 이 도시된다.

도 7 에 도시된 결과는 모든 세가지 용량의 MAIF 제제가 검정에서 아스피린의 활성조차 초과하는 항염증 활성을 유도하는 한편, 연장된 경구 투여는 현저하지만 제한된 활성을 결과한다는 것을 나타낸다.

그러므로 항염증인자의 한층 더 감소된 용량의 효과를 조사하기 위하여 연구를 계속하였다. 락토오스 위약의 정맥내 용량을 대조표준으로 포함시켰다. 이들 연구의 결과는 도 8 에 도시된다. MAIF 제제의 2.5 및 1 mg 의 정맥내 용량 (IV) 은 아스피린에 의해 유도된 할성 범위의 항염증 활성을 유도하였다. 10 ml 의 정맥내 락토오스 위약 (10 mg PLAC IV) 은 그 범위로 활성을 유도하지 못하였다.

정맥내 용량-반응 곡선은, 실험 2 와 3 의 결과를 조합하여 이들 결과를 각각의 별도의 검정에서 % 평균 대조 부종 (무처리) 으로서 표시함으로써 유도하였다. 이 곡선은 도 9 에 도시된다.

정량적인 쥐 발 부종 시험으로부터 끌어낼 수 있는 결론은 다음과 같다 : 미국 특허 제 4,956,349 호에서 설명된 바와 같이 추출되고 정제된, G-10 칼럼으로부터 얻어진 우유 분획 피크 I 은 쥐 발 부종 모델에서 시험될 때 항염증 활성을 보인다. 카라기난이 주사될 때 정맥내로 투여되는 쥐당 4 mg 의 MAIF 제제의 용량은 부종을 극적으로 억제하기에 충분한 양이고, 따라서 추가의 실험에서 그것에 대하여 다른 제제와 비교될 표준으로서 선택된다.

(실시예 8)

동일한 쌍둥이 암소로부터 얻어진 고도면역 우유 제제의 항염증 성질

우유의 항염증 활성에 대한 예방접종의 효과를, 동일한 쌍둥이 암소로부터 얻어진 다양한 우유 분획의 생체내 활성을 시험함으로써 연구하였다. 미국 특허제 4,956,349 호에서 설명된 추출 방법을 토대로 한외 여과를 활용하는 추출 계획표를 고안하였다. 처리과정 순서는 다음과 같았다 :

생 우유

｜

탈지유

｜

저온 살균

｜

레넷막 - > ｜

｜ - > 카세인 (따라 버림)

유장

｜

한외여과 - > 보유물 (R₁)

｜

투과물 (P₁)

｜

1 : 4 로 희석

｜

한외여과 - > 투과물 (P₂)

｜

보유물 (R₂)

우유 샘플을 면역화된 쌍둥이 암소, 면역화되지 않은 대조 쌍둥이 암소로부터 제조하여 면역화된 암소로부터 미리 제조한 탈지유 분말을 재구성하였다. 샘플 군은 동일한 쌍둥이 암소 45 세트로 구성하였다. 각 쌍둥이 세트의 한 마리의 암소를 스톨 S100 혼합 박테린 (미국 특허 제 4,956,349 호에 기재됨) 으로 격주로 예방접종하였다. 다양한 분획의 생체활성을 상술된 바와 같은 쥐 카라기난 발 검정을 사용하여 정맥내 주사함으로써 시험하였다.

시험할 가설은 (a) 고도면역화가 상술된 항염증 활성의 원인이었다; (b) MAIF 가 한외여과에 의하여 상업적인 규모로 추출될 수 있다; 그리고 (c) 투과물의 희석이 항염증인자의 응집을 유도할 것이고, 그것이 30,000 분자량 한외여과 막에 의해 보유되는 것을 유도할 것이라는 세가지 것이었다.

도 10 은 예방접종되지 않은 대조 쌍둥이의 우유로부터 및 면역화된 암소로부터 얻어진 재구성된 우유 분말로부터 만들어진 다양한 분획의 생체 활성을 시험하기 위하여 디자인된 쌍둥이 소떼 한외여과 실험의 결과를 예시한다. 시험한 분획은 다음과 같았다 : 피크 I, G-10 칼럼 제제, 4 ml (OHIO MAIF STD); 예방접종되지 않은 쌍둥이로부터 얻어진 R₂최종 보유물 (CONTROL TWIN R₂); 재구성된 우유 분말로부터 얻어진 P2 최종 투과물 (RECON S100 P₂); 예방접종되지 않은 쌍둥이로부터얻어진 투석된 R2 최종 보유물 (CON DIALYZED R₂); 재구성된 우유 분말로부터 얻어진 투석된 최종 보유물 (S100 DIALYZED R₂).

항염증 활성은 예방접종되지 않은 암소로부터 제조된 R2 최종 보유물 분획에서는 투석 후에조차도 검출되지 않았다. 또한 재구성된 우유 분말로부터 제조된 최종 투과물 P₂분획에서도 항염증 활성은 검출되지 않았다. 재구성된 우유 분말 보유물 R2 분획은 투석 후에도 MAIF 표준의 활성 범위의 항염증 활성을 나타냈다.

도 11 은 예방접종된 및 예방접종되지 않은 쌍둥이 암소로부터, 및 면역화된 암소로부터 얻은 재구성된 우유 분말로부터 만들어진 다양한 우유 분획의 생체활성을 시험하기 위해 디자인된 쌍둥이 소떼 한외여과 실험 결과를 예시한다. 시험한 분획은 다음과 같았다 : 피크 I, G-10 칼럼 제제, 4 ml (OHIO MAIF STD); 예방접종되지 않은 쌍둥이로부터 얻어진 투석된 최종 보유물 R2 (CON DIALYZED R₂); 재구성된 우유 분말로부터 얻어진 최종 보유물 R₂(RECON S100 R₂); 예방접종된 쌍둥이로부터 얻어진 최종 보유물 R₂(IMMUNE TWIN R₂); 재구성된 우유 분말로부터 얻어진 최종 보유물 R₁, :1 에 대해 희석됨 (S100 DILUTED R₁).

예방접종되지 않은 대조 쌍둥이로부터 얻은 투석된 최종 보유물 R₂에서나 또는 예방접종된 쌍둥이로부터 얻은 투석되지 않은 보유물 R₂에서는 항염증 활성이 거의 검출되지 않았다. 약간의 활성이 분산 다이아그램에 의해 검출가능하다. 면역화된 암소로부터 얻은 재구성된 스톨 우유 분말로부터 투석 없이 제조된 R₂보유물은 강한 항염증 활성을 나타냈다. 그러나, 한외여과 전에 재구성된 우유의 희석에 의해 만들어진 제제는 오히려 우유로부터 만들어진 유장의 휘석액보다 단지 조금 더 활성을 나타냈을 뿐이었다. 이 결과는 항염증 활성이 유장 분획으로부터 보다 효과적으로 추출된다는 것을 나타낸다.

도 12 는 예방접종된 쌍둥이 암소로부터 얻어진 투석된 보유물의 생체활성을 시험하기 위해 디자인된 쌍둥이 암소 한외여과 실험의 결과를 예시한다. 시험한 분획은 다음과 같았다 : 피크 I, G-10 칼럼 제제 (OHIO MAIF STD); 예방접종된 쌍둥이로부터 얻어진 투석된 최종 보유물 R₂(IMM DIALYZED R₂); G-10 제제로부터 얻어진 투석된 최종 보유물 (DIALYZED OHIO MAIF). 결과는 항염증 활성이 투석된 후에 면역화된 쌍둥이로부터 얻어진 R₂분획에 존재함을 보여주었다. 투석된 MAIF 는 투석되지 않은 MAIF 표준보다 검정에서 더 활성적이었다. 이 결과는 투석이 항염증 활성에 기여하는 우유 인자를 한층 더 농축시키는 효과적인 수단임을 시사한다.

상기 도 10 내지 12 에 나타낸 결과들은 다음의 결론을 지지한다 : (1) 항염증 활성은 면역된 소로부터 얻어진 재구성된 우유로부터 희석된 투과물의 한외여과에 의하여 추출될 수 있다. (2) 항염증 활성은 면역되지 않은 암소의 우유로부터 만들어진 상기 제제들에서는 증명되지 않았다. (3) 항염증 활성은 면역된 암소의 우유로부터 제조된 희석된 투과물의 한외여과후에 얻어지는 최종 보유물 R₂에서 증명되었다. 그러나, 투석은 활성을 증명하기 위하여 필요하였다.

(실시예 9)

MAIF 의 안정성, 가열, 및 MAIF 의 단백질 가수분해 효소 처리

우유의 항염증성 인자가 화학적으로는 단백질이나 펩티드가 아니었다는 앞서 제시된 증거는, 크게는 거의 완전한 질소의 부재를 일관되게 보여준 화학적 분석을 토대로 한 것이었다. 항염증인자의 추가의 특성 확인을 위하여 여러 개의 제제를, 4 mg 의 피크 I, G-10 칼럼 제제를 표준으로서 정맥내로 사용하여 쥐 발 부종 검정법으로 시험하였다. 다음의 처리를 행하였다 : 6 시간 동안 단백질 가수분해 효소 (프로나제, pronase) 처리; 6 시간 동안 단백질 가수분해 효소로 처리하지 않은 대조표준; 처리되지 않은 양성 대조표준; 30 분 동안 100 ℃ 에서 가열.

이 검정의 결과는 도 13 에 도시된다. 이 연구로부터 유도된 결론은 항염증 활성이 단백질이나 또는 펩티드에 기인한 것이 아니고, 항염증인자는 끓임에 의하여 비활성화되지 않는다는 것이었다. 프로나제 처리의 효과는 유사한 프로나제 처리가 우유 단백질을 완전히 변성시켰다는 발견에 의하여 증명되었다.

(실시예 10)

추가로 정제된 MAIF 의 항염증 활성 및 면역된 암소로부터 얻어지는

유장 단백질 농축물

아미콘 YM5 막을 사용한 한외여과로부터 얻어진 보유물 및 투과물을, 쥐 발 부종 검정에서 정맥내 투여를 사용하여 생물학적 활성에 대하여 시험하였다. 이 방법에서, 미국 특허 제 4,956,349 호에 따라 제조된 G-10 칼럼의 피크 I 의 MAIF 를 아미콘 YM5 막상에서의 한외여과에 의하여 추가로 정제하였다. 이 막은 5000분자량 또는 그 이상의 분자를 보유한다. 유장 단백질 농축물 (WPC) 을 또한 면역된 동물의 우유로부터 제조하여 YM5 막을 통하여 여과하였다. 표준으로서 4 mg 의 피크 I, G-10 칼럼 제제를 정맥내로 사용하여 다음의 샘플을 검정에서 시험하였다 : 아미콘 YM5 한외여과로 얻어지는 투과물; 아미콘 YM5 한외여과로부터 얻어지는 보유물; 면역된 소의 WPC, 30 mg/쥐; 시판되는 (면역되지 않은 소의) WPC, 30 mg/쥐.

이 검정의 결과는 도 14 에 예시한다. 이들 결과로부터 모든 활성이 YM5 필터에 적용되는 분획의 총 중량의 약 0.5 % 를 포함하는 보유물에 있음이 분명하다. 이 실험에서 볼 수 있는 부종의 감소는 20 내지 25 ㎍ 의 물질을 투여한 후에 이루어졌다.

WPC 의 활성에 관해서는, 고도면역된 동물로부터 만들어진 WPC 가 예상했던 바의 항염증 활성을 분명하게 보여주었다. 흥미롭게도, 면역되지 않은 동물로부터 만들어진 WPC 도 또한 항염증 활성을 나타냈다. 면역되지 않은 소의 우유에 존재하는 항염증 활성은 그것이 천연 물질이기 때문에 놀라운 것이 아니다. 그것의 검출은 생물학적 검정의 민감도를 반영하는 것이다.

(실시예 11)

카라기난으로 유도된 발 부종의 지속적인 모니터링

카라기난 주사와 동시에 정맥내로 투여된 4 mg 의 MAIF 제제가 발바닥의 부종을 40 % 내지 50 % 사이에서 감소시킨 것으로 수립되었다. 이런 결과가 비록 물질이 항염증성 부분을 함유하였다는 증거를 제공하긴 하지만, MAIF 의 작용 부위나또는 약리학적 프로필에 대해서는 거의 정보가 없다. 그러한 데이터를 얻기 위하여, 카라기난에 대한 반응의 처음부터 끝까지 발의 부종을 지속적으로 모니터링하는 것을 가능하게 하는 방법을 수립하는 것이 필요하다. 이것은 쥐의 발을 분리되어 있는 감마 방사선 검출기에 잡아 둠으로써 이루어졌다. 이 과정은 4 시간 까지 동물이 마취되는 것을 필요로 하는데, 마취는 염증 반응을 억제하는 것으로 알려져 있기 때문에, 먼저 카라기난-유도된 부종에 미치는 마취의 효과를 측정하는 것이 필요하였다. 그러므로 쥐의 마취를 유도하기 위해 통상 사용되는 5 가지의 제제를 평가하였다; 그것들은 에테르, 포수클로랄, 인노바르-베트, 넴부탈 및 우레탄이다. 그 결과는 도 15 에 나타낸다.

이들 결과로부터 염증 반응이 상기 기법에 의해 평가되는 것이었을 때 에테르가 가장 좋은 마취제였음이 명백하였다. 에테르가 사용되었을 때 얻어진 곡선의 모양은 그것이 2상 (biphasic) 반응임을 나타냈다. 반응을 보다 상세하게 설명하기 위하여 부종의 부피를 5 시간 기간에 걸쳐 12 시간 점에서 측정하는 추가의 실험을 수행하였다. 그 결과는 2상 반응을 확증하였다. 초기 반응은 공격 후 0 시간에서 1 시간 사이에 일어나며, 후기 상 반응은 1.5 시간과 2 시간 사이에 일어났다 (도 16).

다른 연구자들에 의해서도 얻어진 두 개의 상은 각각 비-식균성 (non- phagocytic) 염증 반응 (NPIR) 및 식균성 염증 반응 (PIR) 으로 언급되었다.

손상에 대한 반응에서, NPIR 은 히스타민과 브라디키닌과 같은 가용성 매개자에 의해 개시되는 한편, PIR 은 호중성 백혈구의 참여에 좌우된다. 그러므로 프로토콜은 MAIF 를 투여하고, 제제의 항염증 성질이 초기 비-세포성 (NPIR) 또는 후기 세포성 (PIR) 상에 미치는 효과의 결과인지 아닌지를 측정하기 위한 노력으로 부종의 축적 (커짐) 을 지속적으로 모니터하는 것이었다. 쥐 한 마리당 5 mg 또는 40 mg 의 MAIF 제제를 카라기난 공격과 동시에 정맥내 투여하고, 부종의 축적을 4 시간 기간에 걸쳐 규칙적인 시간 간격을 두고 모니터하였다. 어느 상중에서도 상기 투여가 부종의 축적에 영향을 미치지는 않았다 (도 17).

상기 결과는, 카라기난으로 유발된 부종에 미치는 정제된 MAIF 제제의 영향이 공격 후 4 시간 후에 측정된 많은 선행 분석들이 분획에 상당한 항염증 활성이 있음을 증명하였기 때문에 놀라운 것이었다. 그러므로, 생체내에서 에테르에 대한 지속적인 노출은 활성 항염증 성분을 억제하거나 비활성화하는 것 같다.

선행 연구들은 에테르에 대한 단기간의 노출이 항염증인자의 활성에 영향을 미치지 않음을 나타냈다. 그러므로, 점진적인 부종 축적에 대한 MAIF 의 효과를 단지 4시점, 즉, 0, 1, 3 및 4 시간째에 측정하고, 그로써 에테르에 대한 동물의 노출을 제한하는 실험을 행하였다. 초기 비-식균성 염증 반응에 대한 효과를 평가하기 위해서는 1시점을 선택하는 한편, 후기 식균성 염증 반응에 대한 효과를 정량하기 위해서는 3 및 4시점 측정을 선택하였다. 이 실험에서, 40 mg 으로 투여된 MAIF 제제는 이차의 식균세포 매개 상중에 부종의 축적의 감소를 유발하였지만, 일차의 가용성 매개자에 의해 유도된 상에는 유의할 만한 영향을 미치지 않았다 (도 18).

다음의 결론들을 상기 일련의 실험으로부터 유도하였다 :

1. 에테르는 카라기난에 대한 염증 반응이 지속적으로 모니터되어야 하는 경우에 실험에 사용하기에 바람직한 마취제이다.

2. 지속적인 에테르 마취는 카라기난 발 검정에서 항염증인자의 생체내 항염증 활성을 억제한다.

3. MAIF 는 카라기난에 대한 염증 반응의 후기 식균세포 매개된 상을 억제함으로써 염증을 호전시킨다.

(실시예 12)

카라기난으로 유도된 발 부종에 대한 MAIF 의 효과의 시간 경과

제제를 공격과 동시에 투여하기보다는 카라기난의 주사전 또는 후의 선택된 시간점에서 투여한 추가의 일련의 실험을 수행하였다. 이 연구의 목적은

(a) 염증성 자극과 관련하여 MAIF 의 투여에 가장 효과적인 시간;

(b) 항염증 부분의 생물학적 반감기;

(c) MAIF 에 의해 영향을 받는 염증 반응의 발생 시간점

에 대한 정보를 제공하는 것이었다. 이 연구는 세 부분으로 수행하였다. MAIF 제제는 한 번에 4 mg/쥐의 용량으로 카라기난을 주사하기 전 150 분 전으로부터 주사후 150분에 이르는 시간 범위내의 11시점에서 정맥내로 투여하였다. 이 실험의 결과를 도 19 및 하기 표 5 에 나타낸다.

실험	도전과 관련한 A 의 시간(분)	대조군의 평균 발 크기(㎕±SD)	MAIF 군의 평균 발 크기 (㎕±SD)	MAIF 에 의한 부종의 억제(대조 부피±SD 의 %)
3	-150	311±65	246±52	79±17
2	-90	304±71	211±33	73±11
2	-60	304±71	186±34	61±11
1	-30	391±63	261±49	67±13
3	-15	311±65	152±41	49±13
1,2,3	0	336±78	184±42	55±13
3	15	311±65	218±30	70±10
1	30	391±63	218±30	56±8
2	60	304±71	212±40	69±13
2	90	304±71	216±37	70±12
3	150	311±65	261±42	84±14

연구된 모든 시간점에서 부종의 상당한 억제가 관찰되었다; 그러나, 억제 수준은 양극 밖 (±150 분) 에서 덜하였다. MAIF 투여에 대한 흥미로운 순환성 반응은 공격점에 가깝게 처리된 군들에서 볼 수 있었다. MAIF 가 공격 후 15 분 후에 투여될 때보다는 공격 후 30 분 후에 투여될 때 더 효과적이라는 사실은 반응의 이차, 식균 세포 매개된 상이 제제에 의해 억제된다는 개념을 지지해준다. MAIF 제제는 공격 전 15 분 전에 또는 공격시에 투여될 때 카라기난에 대한 반응을 강하게 억제하였다. 더욱이, 제제는 혈청에서 상대적으로 긴 반감기 (1 내지 2 시간) 을 가지며, 그것의 효력은 공격 시간과 염증 반응의 역학 성질에 관련이 있음이 분명하다.

그러므로 항염증 효과는 호중구와 같은 염증성 세포에 대한 효과에 기인하는 것으로 추측된다.

(실시예 13)

역 수동 아더스 반응에 미치는 MAIF 의 영향

항염증인자가 호중구 관련에 영향을 미칠 것이라는 가능성은 역 수동 아더스 반응 (RPA) 을 조절하는 물질의 능력을 평가함으로써 연구하였다. 이 면역 복합체-유도된 반응은 주로 호중구가 매개하며, 이 반응의 발생에 영향을 미치는 제제들은 이들 세포에 대한 영향을 경유하여 그렇게 한다. RPA 를 유도하기 위하여, 쥐들에게 오브알부민에 대한 토끼 항체를 피부내로 및 천연 오브알부민을 정맥내로 주사하였다. 오브알부민/오브알부민-항체 면역 복합체가 피부 혈관 벽안에 및 주변에 형성되며, 숙주의 호중구는 항체의 FC 부분에 결합하고 강력한 염증 반응이 개시된다. 비록 반응이 면역-복합체에 의해 개시되긴 하지만, 그것은 숙주의 면역 시스템과는 무관하게 일어난다는 것을 주지하여야 한다.

RPA 를 정량하기 위하여 3 가지 매개변수를 사용한다. 그것들은 (1) 부종 -¹²⁵I-HSA 의 축적을 사용하여 측정함; (2) 출혈 -⁵⁹Fe 로 RBC 를 생체내에서 사전에 표지화함으로써 평가함; (3) 호중구 축적 - 호중구 특이적 효소 미엘로페록시다제 (MPO) 의 조직내 수준을 측정함으로써 측정함. 이들 검정은 당업자들에게 알려져 있는 것들이다.

18 마리의 쥐들을 각 6 마리씩의 3 군으로 나누었다. 토끼 항-오브알부민 (40 ㎕) 을 각 동물의 뒤쪽 4 군데에 피내 주사하고, 그런 다음 즉시 2 mg 의 오브알부민을 정맥내로 주사하였다. 한 군의 동물들에게는 다른 처리를 하지 않고 대조표준으로서 이용하였다. 두 번째 군에는 20 mg 의 락토오스 제제를 정맥내로 주사하였고, 마지막 군에는 20 mg 의 정제된 MAIF 제제를 정맥내 주사하였다. 락토오스와 MAIF 는 둘다 오브알부민과 함께 투여하였다. 반응의 심각성은 공격후 3.5 시간 후에 평가하였다. MAIF 제제를 RPA 반응 개시전에 20 mg/쥐의 용량으로 정맥내 투여하였을 때 반응을 측정하기 위하여 사용한 세 개의 매개변수들이 매우 많이 억제되었다 (하기 표 6, 도 20). 락토오스 대조 물질은 또한 그리 심하지 않고 적은 양의 유의할 만한 호중구 축적 및 출혈의 억제를 유발하였다. 이것은 정상적인 우유에 소량의 항염증 활성이 있음을 나타낸다.

군	호중구 축적:MPO 의 유니트	부종의 ㎕	출혈:RBC 의 ㎕
대조표준	0.30±.157	107±29	4.8±3.1
락토오스	0.214±.176**	104±23	3.0±1.5**
MAIF	0.056±.013	60±27*	1.5±1.7*
* = p < 0.01* = p < 0.05

호중구가 RPA 의 일차 매개자이기 때문에, 상기 결과는 MAIF 가 호중구의 기능에 미치는 영향을 통하여 염증성 반응을 억제할 수 있다는 추가의 증거를 제공하였다.

(실시예 14)

호중구 이동에 미치는 MAIF 의 효과

염증성 반응에 효과적으로 참여하기 위하여, 호중구는 먼저 맥관구조(혈관계)로부터 염증 부위로 이동하여야 한다. 항염증인자가 호중구 이동을 방해하는 지 여부를 측정하기 위하여, 멸균 폴리우레탄 스폰지의 피하 이식을 사용하는 염증 모델을 사용하였다. 이식후 간격을 두고 스폰지를 제거하여 스폰지의 무게를 측정한 후, 세포를 추출하고 여액의 세포수를 계수함으로써, 반응의 체액상 및 세포상 둘다를 정량할 수 있었다. 이식후 24 시간 후에 스폰지에서 발견된 세포의 95 % 이상이 호중구였다.

두가지 실험을 수행하였다. 먼저, 동물들을 스폰지를 이식할 때 5, 10, 20 또는 40 mg 의 정제된 MAIF 제제로 처리하였다. 스폰지를 이식후 24 시간 후에 제거하였다. 각 군을 5 마리 내지 8 마리씩으로 나누어 각 동물에 두 개의 스폰지를 이식하였다. 그 결과는 도 21 에 나타낸다.

스폰지를 이식할 때 정맥내로 투여된 20 또는 40 mg 의 MAIF 제제가 염증 세포의 이동 능력에 현저한 영향을 나타냈다. 덜 현저하지만, 동등하게 중요한 체액 축적의 억제가 또한 나타났다. 두가지 더 낮은 용량의 MAIF 는 이 염증 모델에서 뚜렷한 효과를 보이지 않았다.

두 번째 실험은 염증 공격 (스폰지 이식) 과 MAIF 투여 사이의 상호 관계를 설명하기 위하여 디자인하였고, 그것을 수행하였다. 이 연구에서 20 mg 의 MAIF 를 스폰지 이식후 30, 60 또는 120 분후에 정맥내로 투여하였다. 네 번째 군은 대조군으로 무처리상태로 남겨두었다. 각 군은 5 마리의 동물로 구성하였다. 각 동물에 2 개의 스폰지를 이식하고, 24 시간후에 그것들을 제거하였다. 그 결과는 도 22 에 나타낸다. 이 도면에 도시된 그래프에 포함되는 것은 이식시에 20 mg 의 MAIF 제제를 투여받은 쥐들의 샘플군으로부터 얻어진 결과이다 (도 21 참조).

카라기난-유도된 발 부종에 대한 MAIF 의 효과의 시간 경과로부터의 결과는 MAIF 가 공격후 60 분 또는 그 후에 투여될 때는 비교적 비효과적임을 보여준다.스폰지 이식과 관련된 염증을 억제하기 위해서는 20 mg 의 MAIF 제제가 필요한 반면, 카라기난-유도된 부종을 억제하기 위해서는 4 mg 이면 충분하였음은 주목할 만하다. 이러한 설명에 구애받음 없이, 이러한 불일치는 두가지 자극에 의해 숙주에 제공된 유인의 상이한 수준에 관련될 것이다. 스폰지 이식은 느린 염증 반응을 유도하는 상대적으로 양성의 자극이고, 세포의 대부분은 이식후 8 내지 16 시간 사이에 축적된다 (도 23). 다른 한편으로 카라기난의 피하 주사는 상대적으로 짧은 기간에 걸쳐 상응하는 강한 반응을 유도하는 매우 강한 자극이다 (도 16).

(실시예 15)

우유로부터 항염증인자를 정제하는 대체 방법 (제제 "AIF")

하기 실시예는 가장 작은 분자량, 즉 비응집 형태로 우유로부터 항염증인자를 정제하는 방법을 설명한다. 본 실시예에 기술된 정제 단계로부터 얻어지는 제제는 실시예 2 에서 설명된 과정을 사용하여 얻어진 제제와 구별하기 위하여 "AIF" 로 표시하였다. 본 실시예에서 및 다음 실시예 (즉 실시예 16) 에서 제제내에 있는 활성 인자는 간단히 "항염증인자"로 언급한다. 모든 정제 단계는 박테리아 또는 발열성 물질로의 가능한 오염을 최소화하도록 수행하였다. 용액을 제조하기 위해서는 멸균수를 사용하였고, 모든 유리제품은 발열물질을 제거한 것이었다.

단계 1: < 10,000 분자량 ("MW") 한외여과

신선한 S100 면역 탈지유 (면역 우유로부터 얻는데 사용되는 과정의 설명은 실시예 1 참조) 를 10,000 MW 컷오프 한외여과막 (Filtron) 을 통하여 30 psi 의 압력에서 펌프하였다. 투과물을 얼음위에서 유지된 발열원이 제거된 병에 수집하였다. < 10,000 MW 투과물은 저분자량의 펩티드, 올리고당 및 다량의 락토오스뿐만이 아니라 우유 항염증인자를 함유한다. 투과물에 존재하는 항염증 활성은 저분자량의 비응집형태에서 일어난다.

단계 2: DEAE-세파로스 크로마토그래피

항염증 활성의 초기 분별은 DEAE-세파로스 상에서 수행하였다. 1 리터의 DEAE-세파로스를 함유하고 있는 5 × 50 cm 칼럼을 투과물 완충액으로 평형화하였다. 투과물 완충액은 벌크 우유에서 발견되는 확산성 이온을 적절한 농도로 함유하고 있는 멸균되고 내독소가 없는 용액이다. 투과물 완충액은 CaCl₂, MgCl₂, NaCl, Na시트레이트 및 NaH₂PO₄를 함유한다. 전형적으로, 약 8 리터의 < 10,000 MW 투과물을 DEAE-세파로스 칼럼 상에 약 500 ml/시간의 유속으로 펌프한다. 칼럼 용출액을 280 nm 에서 모니터하였다. 칼럼을 280 nm 흡광도가 바탕값으로 되돌아갈 때까지 증류수로 세척하였다 (전형적으로 대략 6 내지 8 리터의 증류수가 필요하다). 항염증 활성은 칼럼에 결합되었고, 약 4 리터의 물중의 0.5 M 암모늄 아세테이트, pH 7.4 로 용출하였다. 용출물을 건고상태로 동결건조시키고 무게를 측정하였다. 8 리터의 투과물로부터 얻어진 회수 물질의 무게는 전형적으로 15 내지 20 그람이다. 암모늄 아세테이트는 동결건조중에 완전히 휘발되기 때문에 잔여 무게는 결합된 물질의 무게를 나타낸다. 항염증 활성을 마우스 호중구 이동 억제 검정으로 평가하였다.

단계 3: H-40 크로마토그래피

DEAE-세파로스 칼럼으로부터 용출된 물질을, 다른 저분자량 성분으로부터 항염증 활성에 기여하는 인자를 분리하기 위하여 크기 분류 칼럼상에서 추가로 분류하였다. 8 그람의 DEAE 샘플을 50 ml 의 증류수에 녹여서, 물로 평형화되어 있는 Toyopearl HW-40 (Rohm and Hass) 을 함유하고 있는 2.5 × 150 cm 의 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 증류수로 시간당 40 ml 의 유속으로 전개시키고, 용출물을 280 nm 에서 모니터하였다. 분획들을 모아서 마우스 호중성 백혈구 이동 억제 검정법으로 항염증 활성에 대해 검정하였다. 활성을 보이고 280 nm 에서 최소 흡광도를 보이는 분획들을 모아 동결건조시켰다. 8 리터의 투과물로부터 항염증 활성을 함유하고 있는 물질을 약 80 mg 회수하였다.

단계 4: AffiGeL 601 크로마토그래피

최종 정제 단계는 공면의 인접한 시스 히드록실기에 대하여 친화성을 갖고 있는 보로네이트-유도된 폴리아크릴아미드 기초 매질 (AffiGel 601, Bio-Rad) 로 패킹되어 있는 칼럼에서 활성 인자의 친화성 크로마토그래피를 수행하는 것을 포함하였다. 40 mg 의 저분자량 HW-40 유도된 물질을 10 ml 의 0.25 M 암모늄 아세테이트, pH 7.0 으로 평형화하고, 0.25 M 암모늄 아세테이트로 또한 이미 평형화되어 있는 AffiGel 칼럼에 적용하였다. 용출물을 280 nm 에서 모니터하였다. 칼럼을 280 nm 흡광도가 바탕값으로 감소될 때까지 400 ml 의 0.25 M 암모늄 아세테이트로 50 ml/시간의 유속으로 세척하였다. 그런 다음 AffiGel 칼럼을 1600 ml 의 0.1 M 포름산, pH 2.8 로 용출하였다. 용출물을 마우스 호중구 이동 억제 검정법으로 활성에 대해 시험하고 건고상태로 동결건조시켰다. 9 리터의 투과물로부터 항염증활성을 함유하고 있는 결합 물질을 약 8 내지 10 mg 회수하였다.

이 방법으로 얻어진 제제를 "AIF" 로 표시한다. 이 제제를 항염증인자와 관련하여 충분히 정제하였지만, 동종은 아니다. 이 제제는 마우스 호중구 이동 억제 검정에서, 쥐 발 부종 검정에서, 쥐 귀 팽창 검정에서 항염증 활성을 억제하며, 쥐의 장간막 세정맥 내피에 대한 호중성 백혈구 결합을 차단한다 (생체내 현미경에 의해 가시화됨). 마우스 호중성 백혈구 이동 억제 검정에서의 비교되는 분석을 토대로, AIF 는 원래의 탈지유 < 10,000 MW 투과물보다 대략 55,000 배 더 정제된 것이다.

(실시예 16)

내피 세포에 대한 호중구의 부착 및 맥관조직으로부터 호중구의 유주 에 미치는 항염증인자 제제의 영향

내피 세포에 대한 호중구의 부착 및 맥관조직으로부터 호중구의 유주에 미치는 항염증인자의 영향을 시험하였다. 항염증인자의 2 개의 상이한 제제를 사용하였다. 한 제제는 실시예 2 의 정제 과정을 사용하여 만들었다. 본 실시예의 목적을 위해, 이 제제는 간단히 "MAIF" 로 언급한다. 다른 항염증인자의 제제는 실시예 15 에서 설명된 정제 과정을 사용하여 만들었고 상기 실시예 및 본 실시예에서 "AIF" 로 언급한다. MAIF 및 AIF 는 둘다 그것들 안에 상이한 순도 상태로 항염증인자를 함유하고 있는 것으로 이해되어야 한다.

화학약품:

사람 혈청 알부민, 트립신, 혈소판-활성화 인자 (PAF), 포르볼 미리스테이트아세테이트 (PMA), 프로피디움 요오드화물, 및 히스토파크 (Histopaque) 는 미국 미조리주 세인트 루이스에 있는 시그마 케미칼 사로부터 얻었다. 사람 호중구 엘라스테이트는 캘바이오켐사 (Calbiochem) 로부터 구입하였다. 네가티브 대조 항체로서 사용한 쥐의 항-사람 CD18 단클론성 항체 (IgG1-하위단위; FITC 포합체) 및 쥐의 항-키호울 림펫 헤모시아닌 (IgG1-하위단위; FITC 포합체) 는 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰에 소재한 벡톤 딕킨슨 시스템사 (Becton Dickinson Systems Inc.) 로부터 구입하였다. 간단한 셀룰라^TM마이크로비드는 미국 노오쓰 캐롤리나주 리서취 트라이앵글 파크에 소재한 플로우 사이토메트리 스탠더즈 코포레이션 (Flow Cytometry Standards Corp.) 으로부터 구입하였다. 다른 시약들은 최상급의 시판되는 것들이었고 추가의 정제없이 사용하였다.

생체내 방법:

생체내 현미경 실험: 24 마리의 수컷 위스타 쥐 (180-250 g) 를 정제된 실험실용 식이요법을 유지시켰다가 수술전 24 시간전부터 단식시켰다. 동물들을 먼저 펜토바르비탈 (12 mg/100 g 체중) 로 마취시키고, 우측 경동맥 및 경정맥에 카뉼레를 연결하여 각각 전신 동맥압을 측정 (Statham P23A 압력 변환기 및 유리 생리 기록기) 하고 약물을 투여하였다. 복부 중심선을 절개하고 동물을 반듯이 눕혀 놓았다. 공장 (jejunum) 의 중간 부분의 단편을 복부 절개를 통하여 일시적으로 몸 밖으로 노출시키고, 모든 노출된 조직을 식염수를 흡수시킨 거즈로 덮어서 조직의 탈수를 최소화하였다. 2 cm 의 조직 단편에 빛을 통과시키는 것을 가능하게 하는 광학적으로 투명한 가시화 주각위에 장간막을 조심스럽게 놓았다. 주각의 온도는 일정한 온도 순환계 (Fisher Scientific, model 80) 를 이용하여 37 ℃ 로 유지시켰다. 직장 및 장간막 온도를 전기온도계를 사용하여 모니터하였다. 장간막을 가온된 중탄산염-완충된 식염수 (pH 7.4) 로 가득 채웠다. X25 대물렌즈 (Leitz Werzlar L25/0.35, Germany) 와 X10 접안렌즈가 부착된 생체내 현미경 (Nikon Optiphot-2, Japan) 을 사용하여 장간막의 미소순환계를 관찰하였다. 현미경에 장착되어 있는 비디오 카메라로 영상을 칼라 모니터에 영사시켜서 그 영상을 비디오 카세트 레코더를 사용하여 재생 분석을 위해 기록하였다. 직경이 25 내지 40 ㎛ 인 하나의 분지되지 않은 세정맥을 선택하여 연구하였다. 세정맥의 직경은 비디오 캘리퍼를 사용하여 온 라인으로 측정하였다. 부착되고 이동한 호중구의 수를 비디오테이프에 담긴 영상의 재생중에 오프-라인으로 측정하였다. 호중구는 만일 그것이 정지상태로 30 초 또는 그 이상 유지된다면 세정맥 내피에 부착하는 것으로 간주되었다. 회전하는 호중구는 동일한 맥관내의 적혈구보다는 느린 속도로 이동하는 백혈구인 것으로 규정하였다. 백혈구의 흐름 속도는 백혈구가 세정맥의 길이를 따라 주어진 거리를 지나가는 데 필요한 시간으로 측정하였다.

실험 프로토콜: 모든 혈류역학 매개변수들을 정지상태로 놓은 후, 장간막으로부터의 영상을 5 분동안 기록하였다. 그런 다음 장간막에 60 분동안 100 nM 의 PAF 를 40 또는 5 mg/쥐의 MAIF 제제의 존재하에 부었다 (iv.). 상기 언급한 매개변수들의 측정을 다시 PAF 주입 후 30 분 및 60 분 후에 수행하였다. 두 개의 실험 군에서 장간막 제제를 다시 상술한 바와 같이 PAF 에 노출시키되, 단 30 분에상기 군에는 40 또는 5 mg/쥐의 MAIF 제제를 투여하였다. 세 개의 추가의 실험에서는 AIF 제제를 예비처리로서 또는 후처리로서 투여하였다.

시험관내 방법:

호중구의 분리: 건강한 공여자로부터의 호중구를 덱스트란 침강과 계속해서 저삼투압 용해 및 히스토파크 원심분리에 의해 정제하였다. 실온에서 수행되는 덱스트란 침강 단계를 제외하고는 세포들은 전 분리 과정을 통해 4 ℃ 로 유지하였다. 세포 제제는 95 % 의 호중구를 함유하였고 이들 중 99 % 이상이 트립판 블루를 사용하여 측정되는 바 가시화되었다. 분리후, 호중구들을 인산염 완충된 식염수 (PBS) 중에 2 × 10⁶세포/ml 의 최종 농도로 재현탁시켰다. 그런 다음 일정액의 세포를 37 ℃ 에서 20 분동안 MAIF 또는 AIF 제제의 농도를 달리해가면서 인큐베이션하였다. 이것을 세척한 다음 호중구를 암실에서 4 ℃ 에서 30 분동안, 포화 농도의 플루오레세인-포합된 쥐 항-사람 CD18, 사람 CD11b, IGG 코팅된 마이크로비드 (간단하게 셀룰라^TM마이크로비드) 또는 쥐 네가티브 대조 항체와 함께 인큐베이션하였다.

면역형광 염색 및 FACS 분석: CD18 표면 발현의 척도로서 직접 면역형광을 10,000 세포의 평균 형광 강도를 나타내는 채널 넘버 (로그 규모) 를 사용하여 FACScan (Becton Dickinson Systems Inc., Mountain View, CA) 상에서의 분석에 의하여 측정하였다. 로그 채널 넘버들은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 선형 값으로 전환시켰다. CD18 항체에 의하여 얼룩진 세포에 대한 비평균 형광 강도를, 네가티브 대조 항체에 노출된 세포들의 평균 형광 강도를 뺀 후에 계산하였다. 비-생육 세포들은 프로피디움 요오드화물을 사용하여 스크리닝하였다.

초산화물 검정: 분리된 호중구로부터의 초산화물 생성을, 다양한 농도의 MAIF 의 존재하에 PMA 및 N-포르밀-Met-Leu-Phe ("fMLP") 자극후에 측정하였다. 활성화된 호중구에 의한 시토크롬 C 의 환원은 550 nm 에서 분광계 (Hitachi U2000) 를 사용하여 측정하였다. 이것을 간단히 설명하면, 샘플을 2 개의 큐벳에 넣고 한 큐벳을 대조표준으로서 사용하였다. 후자에는 초산화물 디스뮤타제 (초산화물 스캐빈저) 가 포함되어 있다. 호중구를 다양한 농도의 MAIF 의 존재하에 37 ℃ 에서 5 분동안 평형시킨 후, PMA 또는 fMLP 로 자극시켰다. 초산화물 생성을 3 분동안 측정하였다.

프로테아제 방출: 125I-표지된 알부민을 웰에 코팅시키고 밤새 건조시켰다. 결합되지 않은 알부민은 세척하여 제거한 후, PMA 로 자극된 호중구를 웰안에서 한 시간동안 다양한 농도의 MAIF 의 존재 또는 부재하에 인큐베이션하였다. 웰의 상층액에 있는 유리 방사능을 각 웰내에 있는 총 방사능으로 나누어 단백질 가수분해 수준을 평가하였다.

결과 :

결과는 도 24 내지 30 및 표 7 내지 9 에서 요약한다. 도 24 는 PAF 를 붓는 것이 모세관 뒤쪽의 세정맥에 대한 호중구의 부착을 60 분의 기간에 걸쳐 약 6 배 증가시켰음을 증명한다. 40 mg/쥐의 MAIF 제제는 PAF-유도된 호중구 부착을 30분에서는 90 % 이상, 60 분에서는 80 % 이상 감소시켰다. 흥미롭게도, MAIF 예비처리 또한 PAF 노출전의 부착하는 호중구의 수를 감소시키는 것 같다. 더 낮은 농도의 MAIF (5 mg/쥐) 는 덜 효과적이었으며, 백혈구 부착을 60 분에서 50 % 감소시켰다. 0.01 mg/쥐 농도에서의 AIF 제제는 백혈구 부착을 60 분에서 약 50 % 감소시키는 것으로 발견되었다. 10 배 더 높은 AIF 의 농도에서, 매우 큰 백혈구 부착의 증가가 관찰되었다 (데이터는 제시하지 않음). 부착은 비디오테잎이 분석될 수 없을 정도로 극적이었다. 도 25 는 호중구 유주에 미치는 MAIF 및 AIF 의 영향을 도시한다. 40 mg/쥐 및 5 mg/쥐의 농도에서의 MAIF 및 0.01 mg/쥐의 농도에서의 AIF 는 PAF 노출시간에 따라 호중구 유주의 감소를 완전히 방지하는 것으로 밝혀졌다. 호중구 플럭스는 처리되지 않은 군과 비교하여 MAIF 로 처리된 군에서 유의할 만하게 변화한 것으로 나타나지 않았다 (도 26). AIF 가 주어졌을 때 본 발명자들은 초기에는 더 많은 호중구들이 보통때보다 회전하는 것을 관찰하였는데, 그 수는 시간이 지남에 따라 감소하였다.

두 번째의 일련의 실험에서는, 호중구가 이미 부착된 후에 다양한 항염증제들을 투여하였다 (도 27). 이 일련의 실험에서, 백혈구 부착은 5mg/쥐의 용량이 아닌 40 mg/쥐의 용량의 MAIF 에 의하여 역으로 되었다. 0.01 mg/쥐의 용량의 AIF 는 약 25 % 만큼 호중구 부착을 역전시켰다. 추가로 MAIF 의 고농도 (40 mg/쥐) 의 효과를 평가하기 위하여 기록 과정의 출발시의 부착된 호중구의 수와 각 시간점에서 5 분에 걸쳐 부착된 새로운 호중구의 수를 조사하였다. 도 27a 는 MAIF 의 투여후 10 분 후에 부착하는 호중구의 수는 더 적었고, 이것은 항염증인자가 실제로 부착하는 호중구를 "벗겨낸다"는 것을 가리킨다는 것을 증명한다. 더욱이, 도 27b 는 분명하게 MAIF 가 새로운 호중구-내피 세포 부착을 차단함을 증명한다. 호중구가 세정맥의 길이를 따라 회전하는 속도는 군과 군사이에서 또는 시간에 따라 변하지 않았는데, 단 예외적으로 AIF 는 호중구 회전 속도를 증가시켰다 (도 28). 이런 효과는 적혈구 속도가 변하지 않고 유지된다는 사실의 견지에서 오히려 흥미로왔다 (도 29). 상기 결과는 유체역학적 힘의 단순한 증가가 호중구 회전 속도의 증가를 설명할 수 없다는 것을 나타낸다. 호중구 플럭스는 또한 MAIF 에 의해 영향을 받지 않았지만, 다시 AIF 에 의해 감소되었다 (도 30).

시험관내 데이터는 항염증인자가 호중구의 활성화를 그 자체로 간섭하지는 않음을 나타낸다. 초산화물 라디칼 스캐빈저인 초산화물 디스뮤타제는 PMA 와 fMLP-자극된 호중구에 의한 시토크롬 c 환원을 완전히 차단하였으며, 이것은 이것이 초산화물-매개된 과정임을 시사한다. 극히 높은 농도의 MAIF 만이 시토크롬 c 환원에 단지 최소한의 영향을 미쳤는데, 이것은 MAIF 가 직접적으로 초산화물을 제거하지 않음을 나타낸다 (표 7). 프로테아제 방출은 MAIF 에 의해 영향을 받지 않는다 (데이터는 제시하지 않음).

항-CD18 단클론성 항체의 결합이 MAIF 또는 AIF 로 감소될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (표 8). 이것은 CD11b 항체로는 일어나지 않는다. IgG 로 코팅된 마이크로비드에 대한 CD18 항체의 결합도 또한 MAIF 나 AIF 제제에 의해 영향을 받지 않았는데, 이것은 항염증인자가 항-CD18 단클론성 항체의 기질에 결합하는 능력에는 영향을 미치지 않지만, 보다 그럴듯하게 리간드 CD18 에 대해서는 작용을 하는것 같음을 나타낸다. 동일한 패턴을 자극된 호중구로도 관찰하였다 (표 9). CD18 에 대한 결합은 경과일에 따라 변화되었는데, 이것은 상이한 세포들이 각 날에 사용되었기 때문임을 주지하여야 한다. 그러므로, 하기 표 8 에 있는 결과를 하기 표 9 에 있는 결과와 직접 비교할 수는 없다.

세포에 의한 초산화물 분비에 미치는 MAIF의 영향

MAIF	PMA-자극된 초산화물생성 (mmole/107 세포)	fMLP-자극된 초산화물생성 (mmole/107 세포)
0.0 mg/ml	153	55
0.1 mg/ml	145	50
1.0 mg/ml	143	40
5.0 mg/ml	140	32
10.0 mg/ml	127	-

CD18 과 CD11 세포 표면 항원의 활용성에 미치는 항염증인자의 영향

자극되지 않은 호중구	평균 채널 형광	평균 채널 형광
	항-CD18 항체	항-CD11 항체
호중구 단독	314.24	1594.57
+ 0.1 mg/ml MAIF	234.26	1553.74
+ 1.0 mg/ml MAIF	262.78	1796.00
+ 0.1 ㎍/ml AIF	248.28	1577.04
+ 1.0 ㎍/ml AIF	188.93	1554.61
비드 + 항-CD18 항체	60.03
+ 1 mg/ml MAIF	88.61
+ 1 ㎍/ml AIF	84.99

자극된 및 자극되지 않은 호중구상에서의 CD18 세포 표면 항원의 활용성 에 미치는 MAIF 의 영향

	평균 채널 형광
자극되지 않은 호중구	236.95
+ MAIF 1 mg/ml	216.08
+ MAIF 5 mg/ml	251.51
자극된 호중구	266.69
+ MAIF 1 mg/ml	158.68
+ MAIF 5 mg/ml	171.96

논의 :

상기 실시예의 데이터는 항염증인자가 세정맥에서 용량-의존 방식으로 호중구 부착과 유주를 방지함을 나타낸다. 그러나 보다 중요한 것은 항염증인자가 짧은 시간 (10 분) 이내에 이들 맥관에 대한 호중구 부착을 역전시킨다는 것이다. 부착된 호중구가 그러한 효율로 내피위에서의 고정상태에서 방출되는 것을 유발하는 다른 유일한 제제들은 호중구상에서의 CD11/CD18 당단백질 복합체에 대해 특정된 단클론성 항체들이다. MAIF 는 개개의 맥관을 통한 혈류에 대해 또는 전체적인 혈압에 대해 어떠한 효과도 나타내는 것같지 않았고, 이것은 전단 응력과 같은 혈류역학 인자가 백혈구 부착의 역전을 설명할 수 없음을 의미한다. 비록 백혈구 회전이 백혈구 부착의 선행조건인 것으로 나타나지만, MAIF 는 백혈구 회전 속도 또는 백혈구 플럭스에 영향을 미치지 못하였다. 후자의 결과는 항염증인자가 맥관을 통하여 회전하는 호중구의 수에 영향을 미치지 못하였고, 그러므로 부착된 백혈구의 감소는 더 적은 수의 백혈구가 내피와 상호작용한 결과가 아니었음을 의미한다. 백혈구 플럭스 뿐만 아니라 백혈구 회전 속도가 변화하지 않은 상태로 유지된다는 것은, 백혈구 회전의 원인이 되는 호중구 및 내피상에 부착된 분자들 (IL-셀렉틴, P-셀렉틴) 이 MAIF 제제에 있는 항염증인자에 의해 영향을 받지 않았음을 나타낸다.

백혈구가 프로테아제 뿐만이 아니라 초산화물을 방출함으로써 그 자체의 부착을 조절할 수 있는 것으로 보고되었다. 그러므로 MAIF 와 AIF 의 존재하에 백혈구가 부착되지 않는다는 것은 이들 제제가 초산화물 또는 프로테아제 방출을 차단하는 능력에 기인하는 것으로 생각되었다. 이런 가능성은 MAIF 가 초산화물 또는 프로테아제 방출에 거의 영향을 미치지 못하고 방출된 프로테아제와 상호작용하지 못하거나 또는 방출된 초산화물을 제거하지 못한 사실의 견지에서 보면 지지받을 수 없다. 더욱이, MAIF 는 있을 것같지 않은 호중구에 대한 항염증인자의 직접적인 세포독성 효과를 만드는 프로피디움 요오드화물로 평가되는 바 호중구 생존력에 영향을 미치는 것같지 않았다.

호중구가 부착하고 유주하기 위해서는 CD11/CD18 당단백질 복합체가 반드시 있어야 한다. 부착 복합체의 면역중성화는 호중구가 영구적으로 내피에 부착하고 주변 조직안으로 유주하는 능력을 완전히 손상시킨다. 호중구 부착 및 유주는 많은 염증성 질환과 관련된 조직 손상에서 속도 한정 단계이기 때문에, 이들 과정을 간섭하는 제제는 또한 유사하게 염증 반응을 차단할 것이다. 본 연구에서, MAIF 와 AIF 는 둘다 극적으로 호중구 부착을 역전시켰고, PAF 에 의해 유도된 호중구 유주를 차단하였다. AIF-, MAIF- 및 항-CD18 단클론성 항체 유도된 호중구 부착의 역전들 사이의 유사성 때문에, AIF 및 MAIF 내에 있는 항염증인자는 직접 CD18 당단백질 복합체와 상호작용함으로써 그것의 효과를 발휘하는 것이 가능하게 보인다. 시험관내 데이터는 AIF 및 MAIF 둘다 항-CD18 항체가 CD18 당단백질 복합체에 결합하는 능력을 차단했다는 점에서 상기 견해를 지지한다. 대조적으로, AIF 나 MAIF 는 어느 것도 CD11b 가 그것의 각각의 단클론성 항체에 결합하는 것에 영향을 미치지 않았다. 마지막으로, AIF 및 MAIF 제제는 항-CD18 단클론성 항체의 IgG-코팅된 마이크로비드에 결합하는 능력을 간섭하지 못하였다. 그러므로, 항염증인자가 CD18 복합체와 직접 상호작용하며, CD18 이 내피 세포 부착 분자를 포함한 다양한 리간드에 결합하는 것을 방지한다고 결론지을 수 있다.

(실시예 17)

순환하는 백혈구에 미치는 MAIF 의 영향

여러 가지 약리학적 제제들은 호중구 이동을 억제할 수 있다. 예컨대 시클로포스파미드와 같은 일부 제제는 세포환원성이고 골수에서의 조혈을 억제함으로써 작용하고, 스테로이드와 같은 다른 제제들 및 비-스테로이드성 항염증 약물들은 특이한 작용 부위를 가지며 백혈구 증가를 초래하지 않는다. 그러므로 순환하는 백혈구의 수 및 비율에 대한 항염증인자의 효과를 측정하는 것이 중요하였다.

두가지 실험을 수행하였다. 처음에는, MAIF 제제를 6 마리의 한 군에는 40 mg/쥐의 용량으로 정맥내로 투여하였고, 대조 군에게는 식염수를 주사하였다. 혈액 샘플을 기준 시간, 처리후 1, 4, 및 24 시간 후에 취하였다. 그 결과를 도 31 에서 요약한다.

MAIF 투여는 순환하는 호중구수를 4 시간 째에 증가시켰고, 이에 상응하여 말초혈 임파구 수는 감소시켰다. 쥐들의 군에 식염수, 5, 10 또는 20 mg 의 MAIF 제제를 정맥내로 주사하는 추가의 용량-반응 연구를 수행하였다. 각 쥐로부터의혈액을 7 일전에 취하여 기준값을 정하였고, 다시 MAIF 주사후 4 시간에 혈액을 취하였다. 그 결과를 도 32 에 도시한다. 그래프에 포함된 것은 40 mg 의 MAIF 제제를 투여하고 4 시간후에 취한 샘플로부터 얻어진 결과들이다 (도 31 참조).

모든 용량의 MAIF 는 순환하는 호중구의 수의 증가와 임파구 수의 감소를 초래하였다. 공격에 대한 효과가 용량에 대하여 선형으로 관련된 한편, 호중구 수의 증가는 곡선 형태였고, 가장 큰 효과는 10 mg 을 투여받은 동물에서 관찰되었다.

이들 결과는 항염증인자가 호중구의 내피세포에 대한 부착을 변화시킴으로써 염증을 조절한다는 개념을 지지한다.

쥐에서 순환하는 백혈구에 미치는 세 개의 다른 세포-표적화된 항염증성/면역 조절성 제제들의 효과와 관련하여 데이터를 또한 얻었다. 스테로이드성 약물인 메틸프레드니솔론은 MAIF 로 볼 수 있었던 것과 유사한 임파구/호중구 비율의 변화를 초래한다. 약물 투여와 효과 사이의 일시적인 관계는 다소 상이하다. 항거부/항염증 제제인 시클로스포린 A 는 또한 순환하는 호중구 수의 증가를 초래하지만, 임파구 수는 증가되지 않거나 또는 용량에 좌우되어 영향을 받지 않는다. 대조적으로, 세포독성 약물인 시클로포스파미드는 순환하는 공격 및 호중구 둘 다를 고갈시킨다. 항염증인자의 효과들은 메틸-프레드니솔론의 작용과 가장 평행한 것 같았다.

(실시예 18)

공격 기능에 미치는 항염증인자의 영향

순환하는 공격의 수의 가역적인 감소를 유도하는 항염증인자의 능력 (실시예17) 은, 공격 기능에 미치는 인자의 영향에 대한 추가의 연구를 촉진시켰다. 이식편 대 숙주 (GvH) 및 숙주 대 이식편 (HvG) 분석을 T 임파구 기능에 대한 인자의 효과를 측정하기 위하여 사용하였다.

HvG 분석에서, 양친의 다크 아고우티 쥐들 ("DA") 을, 그들의 F1 교배 자손 (DA × Hooded Oxford 쥐들) 으로부터 얻은 임파구를 그들의 발바닥에 주사하기 48, 24 및 3 시간 전에 20 mg 의 MAIF 제제로 정맥내 주사하였다. 그래서, 무상 숙주 (DA) 로부터의 T 공격가 F1 공격의 외래 조직적합성 항원에 반응하는 능력에 미치는 항염증인자의 효과를 측정하였다. 이 프로토콜은 슬와근 (popliteal) 림프절 무게의 감소에 의해 증명되는 바, 반응의 매우 상당한 감소 (30 %) 를 초래하였다 (도 33A).

GvH 반응에서는, 양친 (DA) 공격를 MAIF 처리된 양친 쥐 (DA) 로부터 얻어서 그들의 F1 자손 (DA × Hooded Oxford) 의 발바닥에 주사하였다. 이 검정은 평가대상이 된 숙주로부터, 즉 MAIF 로 처리된 쥐들로부터 얻은 T 공격의 생체내 반응도를 측정하였다. MAIF 요법은 GvH 반응에 아무런 영향도 미치지 않았다 (도 33B).

선행 실험중에, MAIF 로 처리된 동물에서 비장 공격수가 외관상으로 증가된 것이 주지되었다. 추가의 실험은 비장 무게와 비장 세포수가 상당히 증가한 것을 보여주었다 (도 33C 및 33D). 비장 세포수의 증가는 앞서 보고된 순환하는 세포수의 감소와 대략 동일하였다.

마지막으로, 유사분열 촉진물질인 콘카나발린 A 에 대하여 반응하는 분리된비장 공격의 능력에 미치는 항염증인자의 효과를 측정하였다. MAIF 제제의 투여는 이 렉틴에 대한 배양된 공격의 유사분열 촉진성 반응을 거의 총체적으로 방해하는 것으로 밝혀졌다 (도 33E).

(실시예 19)

감염 유도된 염증의 항염증인자에 의한 억제

급성 상 반응물 (APR) 의 혈청 수준의 변화가 항염증인자의 항염증 활성을 정량할 수 있는지의 여부를 측정하기 위한 실험을 수행하였다. APR 은 염증성 자극에 대하여 합성된 단백질 군이다. 이들 중 하나인 알파 2 마크로글로불린은 사람과 쥐에 모두 공통적이며, 이 염증성 성분을 측정하는 방법도 활용가능하다. 2 회에 걸친 MAIF 제제의 정맥내 주사 (0 및 24 시간) 는 알파 2 마크로글로불린의 피크 반응 (48 시간) 을 감소시키지 못하였다. 이 결과는 인자가 후기 염증 반응에 영향을 미치지 못함을 나타낸다.

(실시예 20)

우유로부터 유도된 항염증인자의 시험관내 및 생체내 평가

(소 유방 마크로파지 검정, 마우스에서의 감염 모델)

소 유방 마크로파지를 고도면역된 우유 분획과 함께 인큐베이션하는 것은 식균 작용 정도를 검출가능할 정도로 증가시키지는 못하였지만, 식균 작용된 녹농균 (Staphylococcus aureus) 을 사멸하는 마크로파지의 능력은 증가시켰다. 킬로그램당 10 mg 의 MAIF 제제가 복강내로 주사된 마우스들은 치명적인 녹농균으로 인한 복강내 공격에 대한 증가된 저항성을 증명해주었다.

유방내 녹농균 유선염 공격 모델에서, MAIF 가 주사된 마우스들은 또한 상당히 적은 유방 염증과 위축을 보였고 감염된 기관의 정화 부분이 증가된 것을 보여주었다. MAIF 처리된 마우스로부터 얻은 유방 조직의 정량적인 조직학적 분석 결과, 대조 마우스에 비교하여 상당히 더 많은 루멘, 더 적은 선방내 연결 조직, 및 더 적은 백혈구 침윤이 있는 것으로 나타났다. 처리된 마우스들의 유선은 또한 대조 마우스보다 더 적은 수의 콜로니 형성 유니트를 함유하고 있었다. 항염증성은 백혈구 기능의 조절에 의하여 비-특이적 방어 시스템에 대한 효과를 발휘하는 것으로 여겨진다.

(실시예 21)

실험 감염의 발병학에 미치는 항염증인자의 영향

사람이 가장 통상적으로 마주치게 되는 염증 유발원은 미생물이고, 따라서 감염에 대한 숙주의 방어를 조절하는 어떠한 제제의 효과를 측정하는 것이 중요하다. 많은 감염성 질병을 수반하는 조직 손상은 실제로는 침입해온 유기체에 의해서이기보다는 오히려 감염에 대한 숙주의 반응에 의해 유발된다. 감염에 대한 염증 반응을 조절하는 능력이 유용한 임상적 기법일 수 있는 한편으로, 감염 도중 숙주 반응의 억제가 불리할 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 이것은 특히 호중구 억제의 경우 사실이다. 감염의 초기 단계에 호중구의 참여를 억제하는 제제들을 사용한 연구 결과는, 감염 및 조직 손상이 초기에 억제될 수 있는 한편으로 감소된 세포 반응의 결과로서 일어나는 증가된 박테리아 부하가 궁극적으로는 조직 손상의 악화를 유도한다는 것을 증명하고 있다. 그러므로, (1) 제제가 감염-유도된 조직손상을 감소시킬 수 있는지를 측정하고 (2) 숙주 반응의 어떠한 관찰된 억제가 감염의 심각성의 증가에 수반되는 것인지의 여부를 평가하기 위해서는, 우유 항염증인자의 감염을 조절하는 능력을 평가하는 것이 본질적이다.

대장균 075 의 피내 주사에 뒤따르는 부종 형성에 미치는 항염증인자의 효과를 측정하였다. 8 마리씩의 두 개의 군을 사용하였다. 한 군은 처리하지 않고 대조표준으로서 활용한 한편, 두 번째 군의 각 동물에게는 0.5 ml 의 식염수중의 40 mg 의 MAIF 제제를 정맥내 주사하였다. MAIF 를 투여한 직후에, 100 ㎕ 의 대장균 075 의 밤샘 배양액을 쥐의 털을 깎은 등의 두군데의 피부 부위에 피내 주사하고, 이어서 두군데의 추가의 부위에 100 ㎕ 의 식염수를 피내 주사하였다. 감염된 피부의 부종 크기를 평가하기 위해서, 공격과 동시에 0.1 μCi 의 125I-HSA 를 정맥내 주사하였다. 6 시간 후에 동물을 마취시키고, 혈액 샘플을 얻은 다음, 등의 피부를 제거하고 감염되고 식염수가 주사된 부위를 떼어냈다. 부종의 크기는 설명된 바와 같이 조직의 카운트를 혈장 카운트에 대비시킴으로써 계산하였다. 대장균의 존재의 결과로서 축적되는 부종의 크기를 얻기 위해서, 부종/식염수-주사된 부위의 혈장 부피를 뺐다. 그 결과를 도 34 에 도시한다.

MAIF 투여는 부종 형성의 48 % 의 억제를 초래하였다. 이 실험은 항염증인자가 감염에 대한 국소적인 염증 반응을 조절할 수 있다는 것을 입증하였다.

항염증인자 투여, 박테리아 복제, 체액의 축적과 염증 세포의 침윤사이의 관계를 연구하기 위하여 대체 감염 모델을 사용하였다. 상술한 바와 같이 제조되고 이식된 폴리우레탄 스폰지를 이식과 동시에 대장균 075 의 정량화된 샘플로 감염시켰다. 시간 간격을 두고 스폰지를 제거하고 체액의 삼출물의 부피를 측정하기 위하여 무게를 측정한 다음, 배지를 짜내어 박테리아와 세포를 스폰지로부터 유리시켰다. 박테리아와 세포수는 당업자에게 공지되어 있는 기법을 사용하여 개산하였다. 다음 실험은 이 모델을 사용하여 수행하였다. 90 마리의 동물들을 45 마리씩의 두 군으로 나누었다. 이들 군 중 하나는 처리하지 않고 대조표준으로서 활용하였다. 두 번째 군에는 40 mg 의 MAIF 제제를 정맥내로 주사하였다. 그런 다음 스폰지를 피하 이식하고, 이식과 동시에 각각의 스폰지를 105 대장균 075 로 접종하였다. 그런 다음 6 내지 8 마리씩의 군들을 시간간격을 두고 죽여서 스폰지내의 세균 상태와 염증성 침윤물의 크기를 측정하였다. 그 결과를 도 35 내지 37 에 예시한다.

박테리아 복제 속도는 대조표준에서보다 MAIF 로 처리된 동물들에서 훨씬 더 컸고, 박테리아 수에 있어서는 4, 8 및 16 시간에 각각 10, 1000 및 10,000 배의 차이가 있었다. 그런 다음, 박테리아 수는 96 시간째에도 여전히 큰 차이가 있었지만 감소되었다 (도 35).

감염에 대한 초기 반응은 감염 사건의 결과에서 결정적인 결정요소이다. 이 실험에서 MAIF 를 투여받은 동물에서 2, 4 및 8 시간째의 세포 침윤물은 각각 대조 침윤물의 27 %, 35 % 및 46 % 였다 (도 36B). 공격 후 처음 24 시간 이내에 축적되는 세포들은 호중구의 90 % 이상이었고, 이 상중의 세포 성분의 억제는 아마도 박테리아 수의 급속한 증가를 설명할 수 있을 것이다. 2 시간 째의 체액의 축적은 MAIF 의 투여에 의해 영향을 받지는 않았지만, 공격후 4, 8 및 16 시간째에는 상당히 줄어들었다. 이것은 항염증인자가 카라기난 발 모델에서 부종 형성의 일차의 비-세포상을 억제하지 못했던 선행 발견과 일치한다. 면역조절제인 시클로스포린 A 와 메틸프레드니솔론을 사용하는 앞선 연구들에서, 급성 세포성 염증 침윤물의 억제와 박테리아 복제의 촉진사이에서 유사한 관계가 나타났다. 그러나, 이들 실험에서, 증가된 박테리아 부하는 호중구의 최대 유입이 있는 시간인 공격 후 24 시간과 48 시간 사이에 숙주 반응을 촉진하였다. 조직이 포함되는 경우에는, 증가된 염증 반응은 조직 손상 및 반흔 형성의 현저한 악화를 초래하였다. 흥미롭게도, 비록 MAIF 의 투여가 초기 염증 반응을 억제하였고 박테리아 수의 10,000 배 증가와 관련되어 있지만, 공격후 24 시간 내지 48 시간에는 많은 양의 호중구의 유입은 없었다.

(실시예 22)

실험적인 신우신염에 미치는 항염증인자의 영향

증가된 조직 손상의 후유증을 초래하는 일 없이 감염의 염증을 억제할 수 있는 제제는 상당한 잠재력을 가질 것이다. 감염성 질병의 임상적으로 관련된 모델은 그러한 잠재력을 증명하는데 실험적인 기초를 제공할 수 있을 것이다.

신우신염은 중요한 조직학적 특징으로서 국소적인 염증, 조직 파괴 및 흉터 형성을 보이는 감염성 질병이다. 이 질병의 특성확인이 잘 되어 있는 모델은 활용가능하며, 그것은 사람의 질병의 중심적인 병리학적 특징을 재생한다. 신우신염은 쥐에서 수술에 의해 노출된 신장을 예정된 수의 대장균 075 로 직접 접종함으로써 유도된다. 공격후에, 박테리아 수는 급속하게 증가하여 3 내지 4 일후면 피크에도달한다. 정상적인 동물에서 감염 수준은 그 후의 5 일 내지 6 일에 걸쳐 감소하며, 공격후 약 10 일 후면 평평한 상태에 이른다. 21 일째에는 병변은 사라지며, 톱니 모양의 연흔 조직의 국소적인 영역으로서 존재한다. 이 감염 모델에 미치는 항염증인자의 효과를 평가하기 위하여, 신우신염을 26 마리의 동물의 양쪽 신장에서 유도하였다. 이들 동물중 반은 공격시에 및 48 시간 후에 40 mg/쥐의 용량의 MAIF 제제로 정맥내로 처리하였다. 각 군으로부터 7 마리씩의 동물을 신우신염 유도 후 4 일후에 죽이고 6 마리 씩의 나머지 두 개의 군은 21 일째에 죽였다. 무균적으로 신장을 취하여 무게를 달아 체액 삼출물의 상대적인 부피를 측정하였다. 표면 병변 크기의 범위는 직접 눈으로 봄으로써 평가하였고, 신장은 균등화하여 박테리아 수를 하나하나 세어 보았다. 그 결과를 도 38 에 도시한다.

공격 후 4 일 후 염증 반응은 체액 축적의 억제 및 신장 표면의 병변의 크기에 의해 증명되는 바, MAIF 의 투여에 의해 억제되었다. 감염되고 피하 이식된 스폰지를 포함하는 연구에서 이미 관찰된 바와 같이, 염증의 초기 억제는 MAIF-처리된 동물에서 박테리아 수의 로그상 증가를 초래하였다. 21 일째에는 신장의 무게, 박테리아 수 또는 신장 표면의 병변의 크기에 의해 측정되는 바, 질병의 병리학에 차이는 없었다. 그러므로, MAIF 로 초기 염증 반응을 억제하는 것은 신우신염의 만성 (21 일) 상에서 조직 파괴의 감소를 초래하지 못한 한편, 다른 항염증제 및 면역조절제들이 그러한 것처럼 병리학적 병변의 발생을 촉진하지 못하였다.

(실시예 23)

실험 데이터의 요약

카라기난 주사된 발의 부종의 축적이 지속적으로 모니터되어야 할 방법을 개발하였다.

초기의 비-식균성 상의 염증 반응은 항염증인자에 의해 영향을 받지 않은 한편, 후기의 세포-구동되는 반응 상은 상당히 억제되었다. MAIF 가 카라기난 주사 전 또는 후에 시간 간격을 두고 투여된 추가의 실험은 MAIF 가 자신의 항염증 효과를 이차의 호중구-매개된 염증 반응을 조절함에 의해 발휘하였다는 추가의 증거를 제공하였다.

항염증인자는 정맥내 주사후 1 내지 2 시간의 반감기를 가지는 것으로 나타났고, 염증의 발생은 인자가 공격 후 30 분후에 투여되었을 때 억제될 수 있었다. 이 결과는 항염증인자의 잠재적인 치료적 용도와 관련된다.

호중구는 급성 염증 반응에 포함되는 기본적인 세포이다. 아더스 반응중에, 80 % 이상의 호중구 축적의 감소가 MAIF 투여후 관찰되었고, 이것은 염증 반응의 이차적인 특징, 즉 부종 및 출혈의 매우 큰 억제와 관련이 있다. 이 결과는 나아가 호중구를 염증의 MAIF-유도된 억제에서 표적으로서 생각하게 한다.

염증의 발생에 있어서 주요 단계들 중 하나는 호중구의 맥관구조로부터 조직으로의 이동이다. 항염증인자의 정맥내 투여는 호중구 이동의 완전하고 용량 의존적인 억제를 유발하는 것으로 나타났다. 말초형 백혈구에 미치는 항염증인자의 효과를 연구하였을 때, 순환하는 호중구 수의 현저한 증가가 관찰되었고, 임파구 수의 상응하는 감소를 수반하였다. 이 효과는 또한 용량-의존적이었지만, 호중구 수의 증가의 경우에는 선형이 아니었다.

우유 항염증인자의 투여는 호중구의 내피에의 부착을 차단하고 투여시 부착되어 있는 숙주 호중구의 분리를 촉진하는 것으로 발견되었다. 이 효과는 아마도 세포 표면 CD18 항원과 다른 분자들간의 상호작용을 차단하는 항염증인자의 능력의 결과이다. 인자에 의한 CD18 결합의 억제는 인자가 세포에 대한 항-CD18 단클론성 항체의 결합을 차단하였지만, 항-CD11b 단클론성 항체의 결합은 유사하게 차단하지 못하였다는 점에서 특이적인 것으로 여겨진다.

CD18 세포 표면 항원을 포함하는 분자간 상호작용의 차단은 또한 인자가 외래 조직적합성 항원에 반응하는 숙주 공격의 능력을 억제할 수 있었다는 관찰을 설명할 수 있을 것이다. 다른 실험에서, 항염증인자는 공격의 콘카나발린-유도된 유사분열 촉진 반응을 차단하는 것으로 밝혀졌다.

마지막으로, 인자는 감염에 대한 초기 세포성 반응을 상당히 억제하였고, 이런 효과는 피하 감염 모델에서 박테리아 수의 로그상 증가를 유발하였다. 이러한 감염의 악화는 감염의 급성 염증을 억제하는 다른 제제들로 볼 수 있는 것과 같은 염증 반응의 반발을 초래하지 못하였다. 임상적으로 관련이 있는 감염 모델, 즉 신우신염을 사용하는 두 번째 실험은 또한 염증에 대한 억제 효과가 박테리아 수의 증가와 관련이 있음을 증명하였다. 다시 반발 효과는 관찰되지 않았고, MAIF 처리된 군과 대조 군에서 일어난 조직 손상의 정도에 차이는 없었다.

다음의 결론들을 이 일련의 실험에서 끌어낼 수 있다 :

1. 정맥내로 투여된 항염증인자는 카라기난-유도된 염증 반응의 이차적인 호중구-매개된 상을 억제한다.

2. 카라기난 발바닥 검정으로 평가될 때, 항염증인자는 1 내지 2 시간의 생물학적 반감기를 가지며, 염증이 유도된 후에 투여되는 경우에도 효과적이다. 계속되는 실험은 효과적인 반감기가 용량 및 사용되는 염증성 자극 둘다에 의존적임을 나타낸다.

3. 항염증인자는 생체내에서 호중구 유주를 억제한다.

4. 항염증인자의 투여는 순환하는 호중구 수의 증가 및 임파구 수의 상응하는 감소를 초래한다.

5. 항염증인자는 아마도 호중구 유주에 미치는 효과를 경유하여 감염에 대한 숙주의 방어를 억제한다.

6. 항염증인자는 세포 표면 CD18 항원과 다른 분자들 사이의 상호작용을 차단한다.

7. 항염증인자는 호중구의 내피에의 부착을 차단한다.

8. 항염증인자는 부착된 호중구의 내피로부터의 분리를 촉진한다.

9. 항염증인자는 외래 조직적합성 항원들에 반응하는 숙주 공격의 능력을 차단한다.

10. 항염증인자는 또한 공격의 유사분열 촉진성 반응을 차단한다.

이들 연구에서 얻어진 실험 데이터들은 분명하게, 우유 항염증인자가 호중구 및 임파구 둘 다에 현저한 영향을 미치는 것을 입증한다. 관찰된 효과는 항염증인자가 세포 자체에 미치는 직접적인 효과의 결과일 수도 있고, 또는 세포의 생물학적 활성을 직접적으로 변경시키는 일부의 다른 세포성 또는 가용성 매개자의 억제(또는 자극) 의 결과일 수도 있다. 가장 약리학적인 제제들이 다중 작용을 하며 항염증인자가 아직 확인되지는 않았지만 많은 다른 생물학적 과정에 영향을 미치는 것으로 발견될 가능성이 있다는 것이 또한 널리 인식되고 있다.

(실시예 24)

고도로 정제된 MAIF 를 얻는 방법

본 출원의 서두에서 설명된 것과 유사한 MAIF 제조에 대한 표준 방법들은 탈지유로부터 특정한 정도의 순도를 가지고 있는 MAIF 를 생성한다. 그러나 다음의 프로토콜이 앞서 얻을 수 있는 것보다 더 많이 정제된 MAIF 제조를 초래한다.

재료: 화학약품은 모두 시약 등급이었다. 대규모 제조 과정에 사용한 물은 주사용 멸균수였다.

표준화된 MAIF 제조: 고도면역된 암소 또는 대조 암소로부터 얻어지는 우유의 상이한 배치의 MAIF 활성을 비교하기 위하여, 한외여과 및 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는 표준화된 과정을 적용하여 부분적으로 정제되고 활성이 높은 샘플을 제조하였다. 편리한 부피 (3 내지 100 리터) 의 신선하고 차가운 탈지유에 대해 미니세트 유니트 (Minisette unit, Omega membrane) 를 통해 30 psi 에서, 수집된 여액의 부피가 우유의 출발 부피의 2/3 과 같아질 때까지 한외여과를 수행하였다. 표준화된 편리한 부피, < 10,000 달톤 (< 10 K 달톤) 을 투과물 부피의 26.7 % 인 DEAE 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 투과물의 2 배 부피의 탈이온수로 세척하고 투과물 부피의 58.3 % 와 동등한 부피의 0.15 M NaCl 로 용출하였다. 표준화된 DEAE 제제에서의 MAIF 활성은 호중구 이동 억제 검정으로 측정하였고 (하기참조), 3 mg/120 - 150 g 쥐 용량에 의해 유도된 호중구 이동의 % 억제로서 규정하였다.

고도로 정제된 MAIF 제조

한외여과: 고도면역된 암소로부터 얻은 90 리터의 신선하고 차가운 (4 ℃) 저온살균되지 않은 탈지유를 25 ℃ 인-라인 가온 배쓰를 통해 펌프한 다음 분자량 컷오프가 < 10 K 달톤인 오메가 막 (모델 #OS010C01) 을 함유하는 미니세트 (Filtron) 한외여과 카세트를 통하여 통과시켰다. 유입 압력은 30 psi 에서 유지시켰다. 그 결과의 투과물 (< 10K 투과물) 을 부피가 60 리터가 될 때까지 얼음위에서 수집하였다. < 10K 투과물을 이온 교환 크로마토그래피에 의해 추가의 정제에 직접 사용하거나 또는 동결시켜 -20 ℃ 에서 보관하거나 또는 동결건조시켰다.

이온 교환 크로마토그래피: 60 리터의 차갑고 신선한 < 10K 투과물을 16 리터의 디에틸-아미노에틸 (DEAE)-세파로스 패스트 플로우 이온 교환 수지 (Pharmacia #17-0709-05) 를 함유하고 있는 37 ×15 cm 칼럼 (Pharmacia, Model KS 370/15) 에 4.8 리터/시간의 유속으로, 저압 연동 펌프를 사용하여 직접 적용하였다. 칼럼 유출물을 280 및 254 nm 에서 파마시아 듀얼 패쓰 UV 모니터 (Model 19-24217-01) 를 사용하여 모니터하였다. 280 nm 에서의 유출물의 흡광도가 바탕값으로 될 때까지 부하된 칼럼을 120 리터의 멸균 탈이온수로 세척하여 결합되지 않은 물질을 용출시켰다. 결합된 성분들은 35 리터의 0.15 M NaCl 로 용출하였다. 칼럼 용출액을 동결건조시켜서 호박색 유리 바이알에 넣어 어두운 곳에서 보관하였다. 칼럼 용출액에 들어 있는 MAIF 활성을 호중구 이동 억제 검정법으로 측정하였다 (하기 참조).

크기 배재 크로마토그래피: 부분적으로 정제된 MAIF 제제를 0.15 M NH₄OAc 로 평형화되어 있고 자동 주입기 및 다이오드 배열 검출기가 부착되어 있는 휴렛-팩커드 모델 1090 HPLC 상에 있는 분별용 TSK G2500PW (21.5 × 600 mm) 크기 축출 HPLC 크로마토그래피 칼럼 (TosoHaas, Montgomeryville, PA) 상에서 분리하였다. 동결건조된 DEAE-MAIF (100 mg) 를 0.25 ml 의 0.15 M NH₄OAc 에 녹여서 칼럼위에 주입하였다. 칼럼을 0.15 M 의 NH₄OAc 로 5 ml/분의 유속으로 용출하였다. 유출물을 220 및 280 nm 에서 모니터하였으나, 다이오드 배열 데이터는 190 과 600 nm 사이의 모든 파장에 대하여 보관하였다. 9 ml 씩의 분획들을 LKB 울트랙 분획 수집기상에서 수집하였다. 다량의 MAIF 를 제조하기 위하여, 각 100 mg 의 다중 샘플을 TSK 칼럼상에서 분리하여 동일한 세트의 튜브에 수집하였다. 활성 인자들을 함유하고 있는 튜브들을 모아 동결건조시키고 무게를 측정하였다.

유기 분배 추출: 반정제된 TSK-MAIF 샘플을 증류수에 녹이고, 알칼리화한 후, n-헥산으로 추출하여 중성 지질을 제거한 다음, 산성화하고, 에틸 아세테이트로 추출하는 유기 분배 추출법에 의해 MAIF 를 결합된 염으로부터 선택적으로 분리하였다. 50 내지 100 mg 의 TSK-MAIF 를 포장무게를 뺀 추출 용기에서 2 ml 의 탈이온수에 녹였다. 용액의 pH 를 4 방울의 0.02 N NH₄OH 로 조정하였다. 2 ml 의 n-헥산을 첨가하고 혼합물을 격렬하게 흔들었다. 헥산으로 구성된 상부층을 제거하고 건조시킨 후, 무게를 측정하였다. 남아 있는 수용액을 100 방울의 시트르산으로 pH 3.5 로 산성화하였다. 5 ml 의 에틸 아세테이트를 첨가하고 그 혼합물을 격렬하게 흔든 다음 1000 rpm 에서 원심분리하여 층들을 분리하였다. 에틸 아세테이트 층을 포장 무게를 뺀 용기에 옮겼다. 두 번째로 5 ml 의 에틸 아세테이트를 사용하여 추출을 반복하였다. 에틸 아세테이트 층을 조합하여 질소하에 건조시키고 무게를 측정하였다.

약 음이온 교환 크로마토그래피: 아미노프로필 수펠코실 (Supelco) HPLC 칼럼을 사용하여, 에틸 아세테이트 추출 과정에 의해 결합된 염으로부터 유리된 약하게 음이온으로 하전된 MAIF 성분을 분리하였다. 수성 완충제로 약한 음이온 교환기로서 작용하는 아미노-결합된 칼럼을 78 % 의 ACN/H₂O 로 평형화하였다. 50 mg 의 TSK-MAIF 샘플을 25 % 의 ACN/3 mM NH₄OAc 에 녹여서 칼럼에 적용하였다. 칼럼을 78 % 의 ACN/H₂O 내지 69 % 의 ACN/3 mM NH₄OAc 로 0 내지 15 분동안, 그 다음에는 69 % 의 ACN/3 mM NH₄OAc 내지 65 % 의 ACN/3 mM NH₄OAc 로 15 내지 30 분동안으로 구성되는 세 부분 용출 시스템으로 1 ml/분의 유속에서 전개시켰다. 칼럼 용출액을 220 및 280 nm 에서 모니터하였다. 선택된 분획을 호중구 이동 억제 검정법으로 MAIF 활성에 대해 시험하였다 (하기 참조).

호중구 이동 억제 검정: MAIF 항염증 활성을 흉막의 호중구 이동 억제 검정법으로 측정하였다. 체중이 120 내지 150 g 인 암컷의 백색 실험용 쥐에게 PBS 중의 1 % 카파 카라기난 1.0 ml 을 흉막내로 주사하여 흉막강안으로의 호중구의 이동을 유도하였다. 그런 직후에, 쥐들에게 PBS 중의 MAIF 샘플 0.5 ml 을 복강내로주사하였다. PBS 는 대조표준으로서 사용하였다. 4 시간 후에 쥐들을 희생시키고, 흉막의 삼출물을 수집하여 이동된 호중구 수를 계수하였다.

결과

제조 방법의 표준화: 한외여과 및 DEAE 칼럼 과정과 쥐 호중구 이동 억제 검정법의 비교되는 샘플의 분석을 포함하는 재생가능한 방법들을 고도로 활성인 MAIF 제제의 제조를 위하여 수립하였다. 표준화된 정제 방법들의 적용은 특이한 우유 생성물 및 대규모의 제조 배치에서의 MAIF 활성의 정량화를 가능하게 한다. 표준화된 방법을 평가하기 위해서, 고도면역 우유로부터, 면역되지 않은 소의 대조 우유로부터 및 시판되는 분말 우유로부터 MAIF 를 제조하여 호중구 이동 억제 검정법으로 블라인드 시험하였다. MAIF 샘플을 0.5, 1.5, 3, 5, 및 8 mg/120-150 g 쥐의 용량에서, 염증 부위로 호중구가 이동하는 것을 억제하는 능력에 대하여 시험하였다 (도 39). 고도면역 우유로부터의 MAIF 는 3 mg 용량에서 70 % 이상의 최대 호중구 억제를 나타냈다. 신선한 대조 우유 및 시판 대조 우유는 3 mg 용량에서 각각 단지 18 % 의 억제를 나타냈다. 고도면역 우유로부터 제조된 표준화된 MAIF 의 활성을, 항염증 활성을 가지고 있는 것으로 여겨지는 우유의 공지 성분인 시알산과 오로트산 (도 40) 및 2 가지의 항염증 약물 (도 41) 과 비교하였다. 시알산이나 또는 오로트산 어느 것도 시험된 용량에서 쥐의 호중구의 이동에 대해 억제 활성을 나타내지 못하였다. 인도메타신은 0.5 mg/120-150 g 쥐의 용량에서 35 % 의 억제 활성을 나타냈지만, 3 mg/120-150 g 쥐의 용량에서는 30 % 로 억제가 떨어졌고, 더 높은 용량에서는 꾸준히 감소되었다. 아스피린은 사람 용량과 같은 쥐용량에서 10 % 미만의 억제를 보였고, 쥐용량과 동등한 사람 용량의 거의 100 배의 용량에서 가장 높은 억제 범위에 도달하였다.

분별용 HPLC 에 의한 MAIF 정제: MAIF 를 제조하기 위하여 DEAE 이온 교환 크로마토그래피를 사용함으로써 < 10K 투과물과 관련하여 항염증 활성의 25 배 정제가 초래되었다. 크기 배제 HPLC 에 의한 DEAE-유도된 HPLC 의 조성의 분석 결과 (도 42), 17 및 25 분에서 두 개의 주요 성분 및 30 분과 60 분 사이에 6 개 이상의 소량 성분이 용출됨을 알 수 있다. 호중구 이동 억제 검정에서 모아진 분획들의 분석결과는 MAIF 활성의 주요 성분이 25 분 피크에서 일어났음을 나타냈다. 이들 결과는 분별용 크기 분리 단계가 보다 고도로 정제된 MAIF 의 제조를 가능하게 한다는 것을 나타낸다. 0.15 M NH₄OAc 로 용출된 분별용 HPLC TSK2500PW 칼럼은 25 분 MAIF 피크의 우수한 분리를 제공하였다. DEAE-MAIF 는 HPLC 칼럼상에서 100 mg 을 적용하여 분리하였고, 모아진 25 분 피크를 동결건조시켰다. 0.15 M NH₄OAc 용출 완충제는 모든 완충 염이 동결건조 중에 분리된 MAIF 샘플로부터 완전하게 제거될 수 있기 때문에 선택하였다. 그러나, DEAE-MAIF 의 100 mg 의 부하를 반복하여 분별용 HPLC 에 의해 분획화할 때는 25 분 피크의 회수된 무게가 단지 10 % 의 무게의 감소를 나타냈다. MAIF 피크의 원소 분석은 40 % 이상의 무게가 염에 기인하는 것으로 나타났다. 염화나트륨, 아세트산나트륨 및 염화마그네슘을 포함하여 여러 가지 염들에 대해 TSK 2500PW 상에서의 그것들의 용출 위치를 측정하기 위하여 시험하였다. 각각의 염들은 35 분과 40 분 사이에 용출되었다. 이 결과는 염이25 분에서 용출하는 MAIF 성분에 의해 특이하게 결합되었음을 나타낸다.

오염화 염의 제거: 결합된 염으로부터 MAIF 를 자유롭게 하기 위하여, HPLC 정제된 MAIF 제제를 알칼리화하여 음으로 하전된 기들을 노출시키고 헥산으로 추출하여 헥산 가용성 오염물들을 제거하는 유기 분배 추출 방법을 사용하였다. 그런 다음 수성 층을 산성화하여 음전하에 양성자를 보태고, 에틸 아세테이트로 추출하고 무게를 측정하였다. 추출된 잔류물은 96 % 이상의 무게의 감소를 나타냈다. 호중구 이동 억제 검정법에서 건조된 에틸 아세테이트 분획의 분석은 강한 MAIF 활성을 증명해주었고, 유기 분배 추출에 앞서 얻어진 MAIF 와 같은 수준의 호중구 이동 억제를 얻기 위해서는 고도로 정제된 MAIF 의 10,000 배 만큼이나 많은 감소된 양이 필요하였다 (도 43). 추출 전 및 추출 후의 아미노프로필 약 이온 교환 칼럼상에서의 MAIF 화합물의 분석은 나머지 성분들의 용출 위치에 상당한 쉬프트가 있으며, 프로필에서 그 주변이 손실되었음을 입증하였다 (도 44). 이들 결과는 분배 추출법이 오염시키는 결합된 염의 제거를 초래하였고, 앞서 얻어질 수 있는 것보다 더 많이 고도로 정제된 MAIF 제조를 가능하게 함을 나타낸다.

표준화된 MAIF 방법은 조성 및 구조적 연구가 수행되기에 충분한 양으로 MAIF 의 고도로 활성이고 부분적으로 정제된 형태를 제조한다. 이 방법에 의해 제조된 MAIF 는 대조 우유로부터 얻어진 MAIF 또는 가정된 또는 공지의 항염증 약물과 비교할 때 높은 활성을 나타낸다. MAIF 를 분획화하기 위하여 분별용 TSK HPLC 를 사용하는 것은 보다 정제된 MAIF 를 제조하는데는 효과적이지만, 염은 예상하지 못했던 방식으로 MAIF 화합물에 결합된 상태로 남아 있다. MAIF 화합물의 에틸 아세테이트 안으로의 유기 분배 추출은 오염시키는 염의 제거를 가능하게 하고, 그로써 고도로 정제된 MAIF 의 대규모 제조를 가능하게 한다.

본 발명을 일반적으로 설명하였으며, 많은 수정 및 변형이 본 발명의 사상 및 범주에 영향을 주지 않으면서 본 발명에 대해 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 그러한 수정 및 변형도 또한 본 발명의 다른 측면들로 간주된다.

Claims (22)

1. 탈지유에서 항염증인자를 정제하는 방법에 있어서,

   (i) 10,000달톤의 분자량 컷오프를 갖는 필터를 통해 상기 탈지유를 한외여과하는 단계,

   (ii) 단계(i)로부터의 10,000미만의 투과물을 수집하는 단계,

   (iii) 상기 투과물을 제1이온교환칼럼에 적용하고 그 칼럼을 탈이온수로 세척하는 단계,

   (iv) 단계(iii)으로부터의 용출액을 수집하는 단계, 및

   (v) 단계(iv)로부터의 용출액을 분별용 크기 배제 HPLC 크로마토그래피 칼럼상에서 분리하고 용출액을 수집하는 단계, 및

   (vi) 상기 분별용 크기 배제 HPLC 크로마토그래피로부터 얻어진 용출액의 유기 분배 추출을 실행하고 그 추출로부터 수성 추출물을 얻는 단계

   로 이루어지는 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 상기 수성 추출물의 약 음이온 교환 크로마토그래피 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 제1이온교환칼럼내의 수지가 디에틸-아미노에틸 (DEAE)-세파로스 패스트 플로우 이온교환수지인 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 분별용 크기 배제 HPLC 칼럼이 TSK G2500PW 크기 배제 칼럼인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 유기 분배 추출 단계가

   (i) 헥산 및 HN4OH로 추출하는 단계,

   (ii) 단계(i)로부터의 수상을 아세트산에틸로 재추출하는 단계, 및

   (iii) 상기 아세트산에틸 추출물을 수집하는 단계

   를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제 5 항에 있어서,

   (i) 상기 아세트산에틸 추출물을 약음이온교환칼럼에 적용하는 단계, 및

   (ii) 상기 칼럼을 3부분 용출 시스템으로 전개시키는 단계

   를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. (i) 10,000달톤의 분자량 컷오프를 갖는 필터를 통해 상기 탈지유를 한외여과하는 단계,

   (ii) 단계(i)로부터의 10,000미만의 투과물을 수집하는 단계,

   (iii) 상기 투과물을 이온교환칼럼에 적용하고 그 칼럼을 탈이온수로 세척하고 용출액을 수집하는 단계,

   (iv) 단계(iii)으로부터의 용출액을 분별용 크기 배제 HPLC 크로마토그래피 칼럼상에서 분리하는 단계,

   (v) 단계(iv)로부터의 샘플을 헥산 및 HN4OH로 추출하는 단계,

   (vi) 단계(v)로부터의 수상을 아세트산에틸로 재추출하고 수상을 얻는 단계, 및

   (vii) 상기 칼럼으로부터 용출액을 수집하는 단계

   로 이루어지는 방법에 의해 제조되는 고도로 정제된 형태의 항염증인자.
8. 제 1 항 및 제 2 항 내지 제 6 항중 어느 한항의 방법에 의해 제조되는 실질적으로 또는 고도로 정제된 형태의 항염증인자.
9. 항염증인자의 정제방법에 있어서, 항염증인자를 제 1 항 및 제 2 항 내지 제 6 항중 어느 한항의 방법에 의해 실질적으로 또는 고도로 정제된 형태로 얻고, 한외여과 단계를 약 90 내지 약 225리터의 탈지유로 시작하고, 이온교환단계를 약 60 내지 약 150리터의 투과물로 시작하는 방법.
10. 항염증인자의 정제방법에 있어서, 항염증인자를 제9항의 방법에 의해 실질적으로 또는 고도로 정제된 형태로 얻고, HPLC 크기 배제 크로마토그래피를 DEAE 이온 교환 단계로부터의 MAIF 100mg으로 시작하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제 1 항, 제 2 항 내지 제 6 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한항에 의해 얻어진 우유 항염증인자(MAIF)를 포함하는 것을 특징으로 하는 호중구 이동을 억제하기 위한 약제.
12. 제 1 항, 제 2 항 내지 제 6 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한항에 의해 얻어진 MAIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증 반응을 억제하기 위한 약제.
13. 제 1 항, 제 2 항 내지 제 6 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한항에 의해 얻어진 MAIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물에서 내피세포에 호중구가 부착하는 것을 억제하기 위한 약제.
14. 제 1 항, 제 2 항 내지 제 6 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한항에 의해 얻어진 MAIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물에서 내피세포에 부착한 호중구를 떼어내기 위한 약제.
15. 제 14 항에 있어서, 상기 호중구가 혈소판 활성화인자에 응답하여 상기 내피세포에 부착한 것을 특징으로 하는 약제.
16. 제 1 항, 제 2 항 내지 제 6 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한항에 의해 얻어진 MAIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물에 존재하는 CD18 세포표면항원과 이 항원에 결합할 수 있는 분자간의 상호작용을 억제하기 위한 약제.
17. 제 1 항, 제 2 항 내지 제 6 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한항에 의해 얻어진 MAIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 동물의 정맥계로부터 백혈구 유주를 억제하기 위한 약제.
18. 제 17 항에 있어서, 상기 백혈구가 호중구인 것을 특징으로 하는 약제.
19. 제 1 항, 제 2 항 내지 제 6 항, 제 9 항 또는 제 10 항 중 어느 한항에 의해 얻어진 MAIF를 포함하는 것을 특징으로 하는 이종 항원에 대한 숙주 동물내 임파구의 유사분열반응을 억제하기 위한 약제.
20. 제 19 항에 있어서, 상기 항원이 세포표면에 있는 것을 특징으로 하는 약제.
21. 제 20 항에 있어서, 상기 세포가 백혈구인 것을 특징으로 하는 약제.
22. 제 21 항에 있어서, 상기 세포가 임파구인 것을 특징으로 하는 약제.

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