NO180568B - Fremgangsmåte for å isolere en hovedsakelig ren anti-inflammatorisk faktor fra melk - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å isolere en hovedsakelig ren anti-inflammatorisk faktor fra melk, som er kjennetegnet ved: (i) fett fjernes fra melken fra et melkeproduserende dyr for fremstilling av skummet melk, (ii) kasein fjernes fra den nevnte skummede melk for fremstilling av myse, (iii) fra mysen fjernes makromolekyler med molekylvekt over 10.000 dalton, idet fjernelse av de nevnte makromolekyler med molekylvekt over 10.000 dalton omfatter ultrafiltrering gjennom en molekylsiktmembran som tilbakeholder molekyler større enn 10.000 dalton, (iv) lavmolekylvektproduktet fra det foregående trinn fraksjoneres ved hjelp av anionbytterkromatografi, idet eluering av produktet fra anionbytterkolonnen utføres med en saltløsning ved nøytral pH, (v) den antiinflammatoriske faktor fra det foregående trinn renses ytterligere ved hjelp av molekylsiktkromatografi, og

(vi) den antiinflammatoriske faktor isoleres.

Disse og andre trekk fremgår av de etterfølgende patentkrav.

Den anti-inflammatoriske faktor (AF)som fremstilles i hovedsakelig ren form ved fremgangsmåten i samsvar med den foreliggende oppfinnelse kan anvendes ved behandling av inflammasjon.

Inflammasjon, som definert i Dorland's Medical Dictionary, er "en lokalisert beskyttende respons utløst av skade eller ødeleggelse av vev som tjener til å ødelegge, fortynne eller avgrense både det skadelige middel og det skadede vev". Den er karakterisert ved åpning av mikrovaskulaturen, lekkasje av blodelementene inn i vevhulrommene og vandring av leukocytter inn i det inflammerte vev. I makroskopisk henseende følges dette vanligvis av de vanlige kliniske tegn som erytem, ødem, ømhet (hyperalgesi) og smerte. Under denne kompliserte respons blir kjemiske mediatorer som histamin, 5-hydroksytryp-tamin, forskjellige kjemotaktiske faktorer, bradykinin, leukotriener og prostaglandiner frigitt lokalt. Fagocyttiske celler vandrer inn i området og cellulære lysosomale membraner kan brytes og frigir lytiske enzymer. Alle disse forhold kan bidra til den inflammatoriske respons.

Inflammasjon i pasienter med revmatoid artritt involverer antagelig kombinasjonen av et antigen (gammaglobulin) med et antistoff (revmatoid faktor) og komplement som bevirker den lokale frigivelse av kjemotaktiske faktorer som tiltrekker leukocytter. Leukocyttene fagocytoserer kompleksene av antigen-antistoff og komplement og frigir også de mange enzymer som er inneholdt i deres lysosymer. Disse lysosomale enzymer bevirker så skade på brusk og annet vev og dette fremmer inflammasjonsgraden ytterligere. Celle-medierte immunreaksjoner kan også være involvert. Prostaglandiner frigis også under denne prosess.

Prostaglandiner, som gjerne vil bli utviklet ved inflammasjon, bevirker erytem og øker lokal blodstrøm. To viktige vaskulære virkninger av prostaglandiner deles vanligvis ikke av andre mediatorer ved inflammasjon - nemlig en langvarig vasodilator-virkning og en evne til å motvirke vasokonstriktor-virkningene av substanser som f.eks. norepinefrin og angiotensin.

Et antall mediatorer ved inflammasjon øker vaskulær permeabilitet (lekkasje) i de post-kapillære og samlende små vener. I tillegg er vandring av leukocytter inn i et inflammert område et viktig aspekt ved den inflammatoriske prosess. Mens prostaglandiner ikke gjerne vil være direkte involvert i den kjemotaktiske respons, er et annet produkt av metabolismen av arachidonsyre, leukotrien, en meget potent kjemotaktisk substans.

Den anti-inflammatoriske respons er en hvilken som helst respons karakterisert ved inflammasjon som definert i det foregående. Det er vel kjent for de medisinsk sakkyndige at den inflammatoriske respons bevirker mye av det fysiske ubehag, dvs. smerte og tap av funksjon som er blitt assosiert med de forskjellige sykdommer og skader. Det er følgelig vanlig medisinsk praksis å tilføre farmakologiske midler som har til virkning å nøytralisere den inflammatoriske respons. Midler med disse egenskaper er klassifisert som anti-inflammatoriske medikamenter. Anti-inflammatoriske medikamenter anvendes for behandling av et bredt spektrum av forstyrrelser, og de samme medikamenter anvendes ofte for behandling av forskjellige sykdommer. Behandling med anti-inflammatoriske medikamenter er ikke for sykdommen, men oftest for symptomet, dvs. inflammasjonen.

De anti-inflammatoriske, analgetiske og anti-pyretiske medikamenter er en heterogen gruppe av forbindelser, ofte kjemisk

ikke-beslektet, men som ikke desto mindre deler visse terapeutiske virkninger og bivirkninger. Kortikosteroider representerer den mest anvendte klasse av forbindelser for behandling av den anti-inflammatoriske respons. Proteolytiske enzymer representerer en ytterligere klasse av forbindelser som påstås å ha anti-inflammatoriske virkninger. Hormoner som direkte eller indirekte bevirker at den adrenale kortex produserer og utskiller steroider representerer en ytterligere klasse av anti-inflammatoriske forbindelser. Et antall ikke-hormonale •anti-inflammatoriske midler er blitt beskrevet. Blant disse er de mest anvendte salicylatene. Acetyl-salicylsyre, eller aspirin, er det mest hyppig forskrevne analgetisk-antipyre-tiske og anti-inflammatoriske middel. Eksempler på steroidale og ikke-steroidale anti-inflammatoriske midler er oppført i "Physician's Desk Reference", 1987 (se s. 207 og 208 for en oversikt over slike preparater).

De naturlige og syntetiske kortikosteroid-preparater bevirker et antall alvorlige bivirkninger, inkluderende økning av blodtrykket, salt- og vannretensjon, og øket utskilling av kalium og kalsium. Videre kan kortikosteroider maskere tegn på infeksjon og øke spredning av smittsomme mikroorganismer. Disse hormoner ansees ikke som sikre for bruk i gravide kvinner, og langtids kortikosteroid-behandling er blitt forbundet med gastrisk hyperaktivitet og/eller mavesår. Behandling med disse forbindelser kan også forverre diabetes mellitus som nødvendiggjør høyere doser av insulin, og kan frembringe psykotiske forstyrrelser. Hormonale anti-inf lammatoriske midler som indirekte øker produksjonen av endogene kortikosteroider har samme potensial for skadelige bivirkninger.

De ikke-hormonale anti-inflammatoriske midler er syntetiske biokjemiske forbindelser som kan være giftige ved høye doser med et bredt spektrum av uønskede bivirkninger. F.eks. bidrar salicylater til de alvorlige syre-base likevekts-forstyrrelser som karakteriserer forgiftning av denne klasse av forbindelser. Salicylater stimulerer respirasjonen direkte og indirekte. Giftige doser av salicylater bevirker sentral respirasjonsparalyse såvel som sirkulasjonskollaps sekundært til vasomotorisk depresjon. Inntagning av salicylat kan resultere i epigastriske forstyrrelser, kvalme og oppkast. Salicylat-indusert gastrisk blødning er velkjent. Salicylater kan frembringe leverskade og føre til en forlengelse av levringstiden. Aspirin bør derfor unngås i pasienter med alvorlig leverskade, hypoprotrombinemi, vitamin K mangel eller hemofili, på grunn av at inhibering av blodplate-hemostase av salicylater kan resultere i blødning. Salicylat-forgiftning er vanlig og over 10.000 tilfeller av salicylat-forgiftning sees i USA hvert år, idet noen av dem er dødelige, og mange forekommer i barn. Se Goodman og Gilman's "The Pharmaco-logical Basis of Therapeutics", 7. utgave 1985. Til tross for det store antall av anti-inflammatoriske midler som nå er tilgjengelige foreligger det følgelig fremdeles et behov for et sikkert, effektivt anti-inflammatorisk produkt som er fritt for bivirkninger og skadelige reaksjoner.

Hvis et naturlig næringsmiddel-produkt, slik som et som er avledet fra f.eks. melk, kunne oppnås med anti-inflammatoriske virkninger, ville dette da være et lett administrerbart, lett tilgjengelig, sikkert terapeutisk preparat.

Det er tidligere kjent å fremstille melk med en rekke forskjellige terapeutiske virkninger. Således har f.eks. Beck åpenbaret en melk inneholdende antistoff til Streptococcus mutans som har en dental karies-inhiberende virkning (US patentskrift nr. 4.324.782). Melken oppnås ved immunisering av en ku med S. mutans antigen i to trinn og oppnåelse av den terapeutiske melk derfra.

Stolle et al. har åpenbaret en fremgangsmåte for behandling av vaskulære forstyrrelser eller pulmonale forstyrrelser assosiert med røking i et dyr som omfatter at dyret tilføres melk samlet fra en ku som opprettholdes i en hyperimmun tilstand (US patentskrift nr. 4.636.384). Beck har åpenbaret en fremgangsmåte for behandling av inflammasjon i et dyr omfattende tilførsel til dyret av en anti-inflammatorisk effektiv mengde av melk samlet fra en ku opprettholdt i en anti-inflammatorisk faktor-produserende tilstand (US patentskrift nr. 4.284.623). Heinbach har i US patentskrift nr. 3.128.230 beskrevet melk inneholdende globuliner av alfa-, beta- og gamma-komponenter ved inokulering av en ku med antigene blandinger. Peterson et al. (US patentskrift nr. 3.376.198), Holm (US publisert patentsøknad med løpenr. 628.987), Tunnah et al. (britisk patentskrift nr. 1.211.876) og Biokema S.A.

(britisk patentskrift nr. 1.442.283) har også beskrevet antistoff-holdig melk.

Ingen av de ovennevnte referanser åpenbarer imidlertid identiteten av den eller de komponenter i terapeutisk melk som frembringer de ønskede terapeutiske virkninger. I f.eks. Beck, US patentskrift nr. 4.284.623, består melkeproduktene anvendt som et terapeutisk middel av enten flytende helmelk, flytende fettfri "myse", eller helmelkpulvere. Selv om hvert av disse melkeprodukter har anti-inflammatoriske egenskaper er den eller de faktorer som faktisk tilveiebringer de terapeutiske fordeler ennå ikke blitt isolert eller identifisert.

Den foreliggende oppfinnelse er basert på oppfinnernes betraktninger' om at et isolert og renset anti-inflammatorisk melkeprodukt ville være meget nyttig for behandling av anti-inf lammatoriske forstyrrelser i et dyr.

Med tanke på dette har oppfinnerne isolert og delvis renset og karakterisert en anti-inflammatorisk faktor fra hyperimmun bovid melk, i det følgende benevnt melk-anti-inflammatorisk faktor (MAIF).

Ytterligere undersøkelser viste at dette melkeprodukt for-hindret eller opphevet de kliniske symptomer ved inflammasjon. I den foreliggende oppfinnelses sammenheng er det følgelig funnet at anti-inflammatorisk faktor, isolert fra melk fra melkeproduserende dyr som på forhånd er hyperimmunisert mot spesielle polivalente antigener, er effektiv mot inflammatoriske tilstander når den nevnte isolerte og rensede anti-inf lammatoriske faktor tilføres i en mengde og under forhold tilstrekkelig til å frembringe anti-inflammatoriske virkninger. Denne erkjennelse er særlig overraskende med henblikk på det faktum at en polyvalent antigen-vaksine i seg selv ikke inneholder MAIF. Isolasjonen av den aktive faktor fra melk fra hyperimmuniserte kuer førte til det uventede funn at MAIF forekommer i små mengder i melken fra vanlige kuer. Denne erkjennelse er blitt skjult på grunn av det faktum at konsentrasjonen av MAIF i normal kumelk er for lav til å meddele påviselige anti-inflammatoriske egenskaper til melken. MAIF i normal melk kan imidlertid konsentreres ved hjelp av isolerings-fremgangsmåten i henhold til den foreliggende oppfinnelse og kan deretter anvendes effektivt for å behandle inflammasj on.

En mer fullstendig anerkjennelse av oppfinnelsen og mange av de fordeler som følger av denne vil lettere oppnås når oppfinnelsen blir bedre belyst gjennom den etterfølgende detaljerte fremstilling når denne sees i forbindelse med de vedføyde tegninger, hvori: FIGUR 1 viser isolering av MAIF ved ionebytter-kromatografering på en kolonne av DEAE-cellulose, i trinn 2 av prosessen beskrevet i det etterfølgende. FIGUR 2 viser fraksjonering av MAIF-toppen (den andre topp) fra DEAE-cellulose-kromatografering (fig. 1) på en Sephadex G-10 molekylsiktkolonne, i trinn 3 av prosessen beskrevet i det etterfølgende.

Oppfinnelsen omfatter isolering og rensing av MAIF. Den nevnte MAIF kan tilføres til et dyr for å behandle anti-inflammatoriske forstyrrelser.

Med betegnelsen "melk-anti-inflammatorisk faktor (MAIF)" menes en faktor oppnådd fra enten hyperimmun melk eller vanlig kumelk. Med betegnelsen "hovedsakelig ren MAIF" menes for oppfinnelsens formål en anti-inflammatorisk faktor som eluerer som en enkel vesentlig symmetrisk topp ved HPLC-kromatografering, etter fjernelse av høymolekylvekt-substanser (>10.000 dalton) og isolering av de negativt ladete typer med lav molekylvekt ved hjelp av ionebytter-kromatografering. Både vanlig melk og hyperimmun melk kan behandles ved hjelp av metodene beskrevet heri for oppnåelse av MAIF.

Med betegnelsen "hyperimmun melk" menes for oppfinnelsens formål melk oppnådd fra melkeproduserende dyr opprettholdt i hyperimmun tilstand, idet detaljene ved hyperimmunisering er beskrevet mer detaljert i det følgende.

Med betegnelsen "skummet melk " menes for oppfinnelsens formål melk hvorfra fløte er blitt fjernet.

Med betegnelsen "myse" menes for oppfinnelsens formål, melk hvorfra fløte og kaseinholdig material er blitt fjernet.

Med betegnelsen "vanlig melk" menes for oppfinnelsens formål melk oppnådd fra melkeproduserende dyr ved hjelp av konvensjonelle midler og vanlig meieripraksis.

Med betegnelsen "melkeproduserende dyr" menes for oppfinnelsens formål, pattedyr som produserer melk i kommersielle mengder, foretrukket kuer, sauer og geiter, mer foretrukket melkekuer av slekten Bos (bovid), særlig de raser som gir de høyeste melkeutbytter, som f.eks. Holstein-rasen.

Med betegnelsen "bakterielt antigen" menes for oppfinnelsens formål et frysetørket preparat av varmedrepte bakterieceller.

Med betegnelsen "mikroinnkapslet form" menes for oppfinnelsens formål polymere mikropartikler som innkapsler ett eller flere bakterielle antigener for tilførsel til de melkeproduserende dyr.

Med betegnelsen "inflammasjon" menes for oppfinnelsens formål en lokalisert beskyttende respons utløst ved skade eller ødeleggelse av vev som tjener til å ødelegge, fortynne eller avgrense både det skadelige middel og det skadete vev, karakterisert i den akutte form av den klassiske sekvens med smerte, varmefølelse, rødhet, svelling og funksjonstap, og involverer histologisk en komplisert rekkefølge av begiven-heter, inkluderende dilatering av arteriolene, kapillarene og småvenene med økt permeabilitet og blodstrøm, utskilling av fluider inkluderende plasmaproteiner, og leukocytt-vandring inn i det inflammatoriske fokus.

Med betegnelsen "behandling" menes for oppfinnelsens formål at symptomene for forstyrrelsen og/eller den patogene opprinnelse av forstyrrelsen skal avhjelpes eller fullstendig fjernes.

Med betegnelsen "tilførsel" menes for oppfinnelsens formål en hvilken som helst metode for behandling av et individ med en substans, enten oralt, intranasalt, parenteralt (intravenøst, intramuskulært eller subkutant) eller rektalt.

Med betegnelsen "dyr" menes for oppfinnelsens formål en hvilken som helst levende skapning som er utsatt for inflammasjon, inkluderende mennesker, oppdrettsdyr, husdyr, eller dyr i zoologisk hage.

Eksempler på inflammatoriske tilstander som kan behandles med det isolerte og rensede melkeprodukt fremstilt ved fremgangsmåten i samsvar med oppfinnelsen er tilstander valgt fra gruppen bestående av akutt og subakutt bursitt, akutt ikke-spesifikk tendinitt, systemisk lupus erythematosus, systemisk dermatomyositt, akutt revmatisk karditt, pemphigus, bulløs dermatitt, herpetiform, alvorlig erytem, multiform eksfoliativ dermatitt, cirrhose, sesongmessig flerårig rhinitt, bronkial astma, ektopisk dermatitt, serum-syke, keratitt, oftalmisk iritt, diffus ureitt, choriditt, optikusneuritt, sympatisk oftalmi, symptomatisk sarkoidose, Loeffler's syndrom, beryl-liose, hemolytisk anemi, mastitt, mastoiditt, kontakt-dermatitt, allergisk konjuktivitt, psoriatisk artritt, ankylo-serende spondylitt, akutt giktisk artritt og herpes zoster. Videre kan det isolerte og rensede melkeprodukt anvendes for å behandle individer som er utsatt for potensielle inflammatoriske midler.

Oppfinnelsen er delvis basert på det funn at når et melkeproduserende dyr som f.eks. et bovid bringes til en spesifikk tilstand med hyperimmunisering, vil dyret produsere melk som har supranormale innhold av det meget gunstige MAIF, idet det nevnte MAIF ikke bare undertrykker symptomene på inflammasjon i mennesker og andre dyr, men er også et profylaktisk middel i forventning av nærvær av inflammatoriske midler i resipienten. Med betegnelsen "supranormale innhold" menes innhold ut over dem som finnes i melk fra ikke-hyperimmuniserte dyr. Induk-sjonen av immunsensitivitet alene er utilstrekkelig til å bevirke tilsynekomst av supranormale innhold av MAIF i melk, som vist ved det faktum at vanlig kumelk ikke inneholder disse supranormale innhold, selv om kuene er blitt sensitivisert mot forskjellige antigener under normal immunisering mot ku-sykdommer og under normal eksponering for omgivelsene. Det er bare i spesifikke hyperimmune tilstander at melken har de ønskede supranormale innhold.

Denne spesielle tilstand kan oppnås ved etablering av en initial immunisering, etterfulgt av periodiske boostere med tilstrekkelig høye doser av spesifikke antigener. Den foretrukne booster-dosering bør være lik eller større enn 50 % av den dose som er nødvendig for å etablere primær immunisering av bovidet. Der er således en terskel-booster-dosering under hvilken egenskapene ikke frembringes i melken, selv om kua er i det som normalt ville betegnes som en immuntilstand. For å oppnå den nødvendige hyperimmun-tilstand er det avgjørende at den hyperimmune melk testes etter en første serie av booster-tilførsler. Hvis de gunstige faktorer ikke er tilstede i melken, tilføres ytterligere boostere med høy dosering inntil egenskapene kommer tilsyne i melken.

Prosessen med å fremstille den hyperimmune melk inneholdende

supranormale nivåer av MAIF er omhandlet i US patentsøknad med løpenr. 069.139, inngitt 2. juli 1977 og i US patentsøknad med løpenr. 910.297, inngitt 17. september 1986, som er en direkte fortsettelse av US patentsøknad med løpenr. 576.001, inngitt 1. februar 19 83, som det her refereres til. Oppsummert omfatter en prosess for fremstilling av den hyperimmune melk inneholde supranormale nivåer av MAIF følgende trinn: (1) antigen-seleksjon; (2) primær immunisering av bovidet; (3) testing av serum for å bekrefte sensitivitetsinduksjon; (4) hyperimmunisering med boostere av passende dosering; og eventuelt (5) testing av melken for anti-inflammatoriske egenskaper; (6) samling av melken fra det hyperimmune bovid, og (7) behandling av melken for å isolere MAIF.

Trinn 1: Hvilke som helst antigener eller kombinasjoner av antigener kan anvendes. Antigenene kan være bakterielle, virale, av protozoa-typen, fungale, cellulære eller hvilke som helst andre substanser overfor hvilke immun-systemet i det melkeproduserende dyr vil respondere. Det kritiske punkt i dette trinn er at antigenet eller antigenene må være i stand til ikke bare å indusere immun- og hyperimmun-tilstander i det melkeproduserende dyr, men også være i stand til å etablere supranormale innhold av MAIF i melken. Et hvilket som helst antigen kan anvendes for fremstilling av supranormale innhold av MAIF. En foretrukket vaksine er en blanding av polyvalente bakterielle antigener, benevnt som vaksine Series 100, beskrevet detaljert i eksempel IA i det følgende.

Trinn 2: Antigenet eller antigenene kan tilføres ved en hvilken som helst metode som bevirker sensitivisering. Ved en metode tilføres en vaksine sammensatt av antigen avledet fra lxlO<6> til lxlO<20>, foretrukket IO<8> til 10<10>, mest foretrukket 2xl0<8>, varme-drepte bakterier ved intramuskulær injeksjon. Andre metoder som f.eks. intravenøs injeksjon, intraperitoneal injeksjon, rektal stikkpille, eller oral tilførsel kan anvendes .

Trinn 3: Det er nødvendig å bestemme hvorvidt det melkeproduserende dyr er blitt sensitivt overfor antigenet. Der er et antall metoder kjent for den fagkyndige på området immuno-logi for testing for sensitivitet (Methods in Immunology and Immunochemistry, William, CA. og Chase, W.M. , Academic Press, New York, vol 1-5 (1975)). Den foretrukne metode er å anvende en polyvalent vaksine omfattende multiple bakterietyper som antigenet og teste for nærvær av agglutinerende antistoffer i serum av dyret før og etter eksponering for vaksinen. Tilsynekomst av melke-antistoffer etter immunisering med vaksinen indikerer sensitivitet. Ved dette punkt er det mulig å fortsette til trinn 4.

Trinn 4: Dette trinn involverer induksjon og opprettholdelse av den hyperimmune tilstand i den sensitiviserte dyr. Dette oppnås ved gjentatt booster-tilførsel ved bestemte tidsinter-valler av den samme polyvalente vaksine som ble anvendt for å oppnå den primære sensitivisering. Et 2 ukers booster-inter-vall er optimalt for flerverdige bakterielle antigener. Det er imidlertid nødvendig å sikre at dyret ikke passerer fra en hyperimmun tilstand til en tilstand med immuntolerans overfor antigenet.

Ved en foretrukket utførelsesform kan hyperimmunisering av bovider oppnås ved hjelp av en enkel tilførsel av mikroinnkapslet vaksine, fremstilt som beskrevet detaljert i eksempel IB i det følgende. Fordelen med den styrte frigivelsesform for hyperimmuniseringen er at den konstante eksponering for antigenet sikrer at dyret forblir i den hyperimmune tilstand.

Som en alternativ utførelsesform er det også mulig å kombinere forskjellige immuniseringsprosedyrer, f.eks. samtidig til-førsel av mikroinnkapslet og flytende antigen, eller intramuskulær injeksjon for primær immunisering og booster-doser ved oral tilførsel eller parenteral tilførsel ved hjelp av mik-roinnkapslingsmidler. Mange forskjellige kombinasjoner av primær immunisering og hyperimmunisering er kjent for den fagkyndige på området.

Trinn 5: Det er nødvendig å teste melken for anti-inflammatoriske aktivitets-nivåer. Dette kan utføres ved hjelp av en hvilken som helst forsknings-teknikk som tester virkningene av enten den hyperimmune melk eller produkter avledet derfra på inflammasjon. Kjemikalie-indusert inflammasjon i rotte-labber er en standard assay for anti-inflammatoriske midler.

Trinn 6: Dette involverer samling og behandling av melken. Melken kan samles ved hjelp av konvensjonelle metoder. Behandling av melken for å isolere MAIF er beskrevet i det følgende.

Den enkleste prosess for isolering, rensing og testing av MAIF omfatter de følgende trinn: 1. avfetting av den hyperimmune melk for å fremstille skummet melk, 2. fjernelse av kasein fra den skummede melk for å fremstille myse, 3. fjernelse fra mysen av makromolekyler med molekylvekt over 10.000 dalton ved ultrafiltrering, 4. fraksjonering av produktet fra trinn 3 under anvendelse av en ionebytterharpiks-kolonne for å isolere en negativt ladet MAIF type med molekylvekt mindre enn 10.000 dalton, 5. separering av den negativt ladete type fra trinn 4 ved hjelp av molekylsiktkromatografering, og

6. biologisk assay av MAIF fra trinn 5,

7. den anti-inflammatoriske virkning av melkefaktoren testes på ødem bevirket ved injeksjon av en oppløsning av karragenin inn i labbene på rotter. Rottelabb-testen er den standard dyretest for anti-inflammatoriske medikamenter. Winter, C.A., Risley, G.A., Nuss, A.W., "Carrageenin-Induced Edema in the Hind Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory Drugs", Proe. Soc. Exper. Biol. Med. 3:544 (1967). En rekke andre tester kan anvendes. Wetnick, A.S. og Sabin, C, "The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on Adjuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergic Encephalomyelitis in Rats", Jap. J. Pharm. 22:741 (1972). Rottelabb-testen er imidlertid den enkleste og mest direkte test som er tilgjengelig og er blitt vist å være tilfredsstillende for alle anti-inflammatoriske medikamenter. Denne test er beskrevet detaljert i Beck, U.S. patentskrift nr. 4.284.623 som det her vises til i den ut-strekning at den beskriver rottelabb-testen. Kort sagt

involverer testen injeksjon av en liten mengde karragenin inn i fotputen av voksne hvite rotter. Dette er kjent å indusere en inflammatorisk respons. Den resulterende grad av svelling kan kvantifiseres. Prøver inneholdende et AF tilføres rotter på en passende måte, foretrukket ved intraperitoneal injeksjon, og blokkade eller forbedring av den inflammatoriske prosess kvantifiseres ved hjelp av enten volumetriske eller gravimetriske metoder.

Oppsummert kan man isolere den anti-inflammatoriske faktor fra hyperimmunisert melk ved å følge en fremgangsmåte med avfetting av melken, fjernelse av kasein, fjernelse av makromolekyler på mer enn 10.000 dalton, og fortsette med ione-byttings- og molekylsikt-kromatografering. Den biologiske aktivitet av passende preparater av anti-inflammatorisk faktor kan testes ved å foreta et dose-respons-forsøk med rotter som beskrevet heri.

Oppfinnelsen er delvis basert på det uventede funn at en MAIF kan isoleres og renses og er effektiv for behandling av en rekke forskjellige inflammatoriske prosesser i mennesker og dyr. Ved en foretrukket utførelsesform produseres MAIF av melk fra melkeproduserende dyr som er hyperimmunisert mot en bakteriell antigen-vaksine. Vaksinen anvendt for hyperimmunisering av dyrene inneholder ikke anti-inflammatorisk aktivitet. Det er derfor overraskende at behandlingen med en isolert og renset faktor, oppnådd fra dyr immunisert mot en blandet bakteriell antigen-vaksine, er effektiv ved avhjelping eller fjernelse av inflammatoriske prosesser.

Oppfinnelsen skal ytterligere beskrives med henvisning til spesifikke eksempler som er anordnet heri i illustrerende hensikt.

FREMSTILLING AV MELKETYPER

Eksempel IA

Fremstilling av S- 100 vaksine

En bakterie-kultur inneholdende det spektrum av bakterier som er vist i tabell 1 i det følgende som oppnådd fra American Type Culture Collection ble rekonstituert med 15 ml media og inkubert over natten ved 37°C. Etter at god vekst var oppnådd ble omtrent halvparten av bakterie-suspensjonen anvendt for inokulering av 1 1 dyrkingsvæske, idet inokulatet ble inkubert ved 37°C. Den resterende suspensjon ble overført til sterile glykolrør og lagret ved -2 0°C i opptil 6 mndr.

Etter at god vekst var synlig i kulturen ble bakterie-cellene høstet ved sentrifugering av suspensjonen i 20 min. for å fjerne media. Bakterie-pelleten som oppnådd ble resuspendert i steril saltløsning og bakterieprøven ble sentrifugert tre ganger for å vaske media fra cellene. Etter den tredje sterile saltløsningsvasking ble bakterie-pelleten oppnådd ved sentrifugering resuspendert i en liten mengde dobbelt-destillert vann.

Den media-fri bakterie-suspensjon ble varme-drept ved å anbringe suspensjonen i en glasskolbe i et 80°C vannbad over natten. Levedyktigheten av dyrkingsvæske-kulturen ble testet med en liten mengde varme-drepte bakterier. Dyrkingsvæske ble inokulert med varme-drepte bakterier, inkubert ved 3 7°C i 5 døgn og kontrollert daglig med hensikt på vekst, ettersom bakteriene må være drept for anvendelse i vaksinen.

De varme-drepte bakterier ble frysetørket til tørr tilstand. De tørre bakterier ble så blandet med steril saltoppløsning til en konsentrasjon på 2,2 x IO<8> bakterie-celler/ml saltløsn-ing (1,0 optisk densitet-avlesning ved 660 nm).

Kuer ble daglig tilført injeksjoner av 5 ml prøver av den polyvalente flytende vaksine. Antistoff (IgG) titer-innhold for det injiserte kveg ble bestemt periodisk ved å anvende en enzym-forbundet immunoassay for bovint antistoff mot det polyvalente antigen.

Eksempel IB

Varme-drepte bakterier ble fremstilt på den måte som er beskrevet i det foregående. Den polyvalente antigen-prøve (S-100) som var oppnådd ble mikroinnkapslet ved hjelp av en konvensjonell faseseparerings-prosess for å fremstille et polyvalent antigenholdig mikropartikkel-produkt. Generelt tildannes de antigenholdige formede matriks-materialer fra polymerer av bioforlikelig material, foretrukket bio-nedbrytbare eller bioeroderbare materialer, foretrukket polymelkesyre, polyglykolsyre, kopolymerer av melkesyre og glykolsyre, polykaptolakton, kopolyoksalater, proteiner som kollagen, fettsyreestere av glyserol, og celluloseestere. Disse polymerer er velkjent på området og er beskrevet f.eks. i US patentskrifter nr. 3.773.919, 3.887.699, 4.118.470 og 4.076.798 som det alle her vises til. Det anvendte polymere matriksmaterial var en bionedbrytbar laktid-glykolid-ko-polymer.

Varme-drepte bakterielle antigener innkapsles i disse matriks-materialer, foretrukket som mikrokuler med diameter mellom 1 og 500 (im, og foretrukket 10 - 250 |i.m. Innkapslingsprosessene er konvensjonelle og omfatter fasesepareringsmetoder, grense-flate-reaksjoner og fysikalske metoder. Mange kombinasjoner av matrikser og mange konsentrasjoner av forskjellige antigener kan anvendes for å tilveiebringe de optimale hastigheter for frigivelse av bakterielle antigener til vertskroppen fra mikropartiklene. Disse kombinasjoner kan bestemmes av de fagkyndige på området uten unødvendig eksperimentering.

Mikropartiklene i eksemplet hadde diametre mindre enn 2 50 (lm. Omtrent 750 mg av mikropartiklene inneholdende 22 % (16,5 mg) av polyvalent antigen ble så suspendert i omtrent 3 ml av en bærer (1 vekt% Tween 20 og 2 vekt% karboksymetylcellulose i vann).

En liten gruppe kveg ble selektert fra en større kvegbestand. Fem av dette tilfeldig valgte kveg ble selektert som kontrol-ler. Fire av kveget ble injisert intramuskulært med mikropartikler inneholdende polyvalent antigen. Mikropartikkel-prøver ble sterilisert med 0,2 mRad gammastråling. Antistoff (IgG) titer-nivåer ble bestemt periodevis fra prøver av kumelk oppnådd fra de inokulerte kuer, såvel som fra kontrol1-kuene.

Eksempel 2

Isolering av MAIF faktor fra hyperimmunisert melk.

Trinn 1: Melkefiltrat- fremstilling

2 0 1 frisk melk fra hyperimmuniserte kuer ble kjørt gjennom en fløteseparator (DeLaval Model 102) for å fjerne fettet.

De resulterende 16 1 skummet melk ble ultrafiltrert for å fjerne typer med høy molekylvekt (over 10.000 dalton) under anvendelse av en hulfiber-diafiltrering/konsentrator (Amicon DL-10L). Konsentratoren er utstyrt med to 10.000 dalton molekylvekt-fjerningspatroner (Amicon <H>5<P>10_43). Den skummede melk ble kjørt med pumpehastighet 80 på måleren og innløps-trykk og utløpstrykk på henhv. 207 og 172 kN/m<2>. 12 1 av filtratet (<10.000 dalton) som kom ut fra patronene med strømningshastighet 4 1 pr. time ble frosset eller fryse-tørket for lagring og for ytterligere rensing.

Trinn 2: Ionebytter- kromatografering

Melk-anti-inflammatorisk faktor, MAIF, i filtratet ble først isolert ved hjelp av en anionbytter-kromatograferingskolonne.

Ved denne prosedyre ble DEAE-Sepharose CL-6B gel (Pharmacia) anvendt for fylling av en 5x10 cm glasskolonne som var ekvilibrert med sterilt dobbelt-destillert vann, pH 7,0. 1 1 filtrat (<10.000) ble tilført til kolonnen og eluert med sterilt dobbelt-destillert vann, pH 7,0 med strømnings-hastighet 160 ml pr. time. 10 ml fraksjoner ble samlet og overvåket ved 2 80 nm i et LKB Uvicord 4700 absorpsjonsmeter med en optisk densitet skrevet ut på en tilkoblet opptager (Pharmacia REC-482).

Andre substanser enn MAIF med positive og nøytrale ladninger bindes ikke til DEAE-Sepharose-gelen. De elueres ved gjennom-falls-toppen (den første topp). MAIF som bærer en negativ ladning tilbakeholdes av gelen.

For å frigi MAIF blir kolonnen eluert med en trinnvis gradient under anvendelse av en steril fysiologisk saltløsning, pH 7,0. En typisk profil er vist i fig. 1. Bioassay av de enkelte fraksjoner viste at den andre topp inneholder MAIF. Fraksjoner omfattende den andre topp og dens skulder anvendes for ytterligere rensing. Utbytte-undersøkelser viser at 8,8 g tørket pulver ble oppnådd ved denne prosess.

Trinn 3: Gelfiltrerings- kromatografering

Den andre topp oppnådd fra trinn 2 inneholder MAIF og andre negativt ladete molekyler. Et ytterligere rensetrinn var derfor nødvendig. For å oppnå ytterligere rensing er det fordelaktig å anvende en gelfiltreringskolonne for å separere forskjellige komponenter på basis av molekylvekt.

Ved denne prosess ble Sephadex G-10 harpiks (Pharmacia) fylt inn i en 2,5x80 cm glasskolonne og ekvilibrert med sterilt dobbelt-destillert vann, pH 7,0. 2 g av den andre fraksjon fra trinn 2 ble oppløst på nytt i sterilt dobbelt-destillert vann og tilført til toppen av kolonnen. Kolonnen ble eluert med strømningshastighet 30 ml pr. time. Fraksjoner (3,3 ml) ble samlet og overvåket ved 254 nm og 280 nm (Pharmacia Duo Optical Unit) med optisk densitet skrevet ut på en tilkoblet opptager (Pharmacia REC-482).

Typisk var der 3 topper vist i elueringsprofilen som il-lustrert i fig. 2. Første og andre topp inneholdt MAIF-aktivitet.

Den første topp er et aggregat som dannes på G-10 kolonnen og som inneholder den aktive MAIF. Den andre topp inneholder den ikke-aggregerte form av MAIF. Både aggregatformen (topp 1) og den ikke-aggregerte form (topp 2) er biologisk aktiv ved rotte-bioassay.

KARAKTERISERING AV MELK- ANTI- INFLAMMATORISK FAKTOR

Molekylvekten av den ikke-aggregerte form av MAIF fremstilt ved metoden beskrevet i det foregående ble funnet å være mindre enn 10.000 dalton. Dette ble utledet fra det faktum at det første trinn ved isoleringen av MAIF fra myse var ved ultrafiltrering under anvendelse av en membran som ikke tillater passering av molekylvekt-typer >10.000 dalton.

MAIF har en negativ ladning. Dette ble bestemt ved å tilføre melk-ultrafiltrat til en DEAE cellulose-ionebytterkolonne. MAIF eluerte ikke fra kolonnen med vann. Endring av elue-ringsmedia til natriumklorid (0,9 % pH) bevirket eluering av flere topper (fig. 1). Nøytrale og positivt ladete typer fik-seres ikke til ionebytter-harpiksen og negativt ladete typer elueres ved økende saltkonsentrasjon. Når det <10.000 dalton molekylvekt-permeat ble tilført til DEAE-kolonnen eluerte nøy-trale salter og sukkere med vann (topp 1, fig. 1). Tre tydelige topper eluerte når bufferen ble endret til salt-løsning (topper 2-4). Den andre topp og dens skulder inneholdt MAIF biologisk aktivitet ved rotteassay. Det konkluderes derfor at MAIF har en negativ ladning.

En ytterligere kjemisk egenskap av MAIF er at den danner et aggregat under prosessen med å fjerne salt. Denne egenskap blir tydelig når <10.000 dalton molekylvekt-permeat ble ført over en Sephadex G-10 kolonne, ekvilibrert med dobbelt-destillert vann og eluert med vann med en pH 7 (fig. 2). Tre topper eluerte fra G-10 kolonnen. Den første topp eluerte med tomvolumet og antydet en molekylvekt lik eller over 10.000 dalton. Dette var uventet på grunn av at molekyler på mer enn 10.000 dalton tidligere var blitt fjernet fra denne prøve ved ultrafiltrering. Den andre topp eluerte i posisjonen for-ventet for den anti-inflammatoriske faktor. Både den første og andre topp fremviste anti-inflammatorisk biologisk aktivitet ved rottelabb-assay, mens den tredje topp manglet aktivitet. Det var overraskende å finne at både den første og andre topp hadde anti-inflammatorisk biologisk aktivitet. Materialet isolert fra den første topp fra G-10 kolonnen (trinn 3) ble frysetørket og tilført til en G-100 kolonne. En eneste topp ble eluert med tomvolumet og antydet en molekylvekt på 10.000 dalton eller mer. Trinn 3 G-10 kolonnen fjerner salt samtidig som den separerer de forskjellige molekylvekt-typer. Det konkluderes derfor at under passe-ringen over G-10 kolonnen og med den resulterende fjernelse av salt dannet den anti-inflammatoriske faktor et aggregat med høy molekylvekt. Aggregasjonsgraden varierte med saltkonsentrasjonen.

Aggregasjons-egenskapen antyder den mulighet at et bredt spektrum av forskjellige molekylvekt-typer kan dannes med anti-inflammatorisk biologisk aktivitet som skyldes nærvær av den anti-inflammatoriske faktor. Oppdagelsen av denne egenskap antyder muligheten av å fremstille melk-anti-inflammatoriske faktorer med et bredt spektrum av forskjellige biokjemiske egenskaper avhengig av aggregasjonsgraden av sluttproduktet. Preparater med lengre eller kortere biologiske halveringstider kan f.eks. fremstilles ved å anvende aggregater med større eller mindre molekylvekt, idet molekylvekt-fordelingen styres av saltkonsentrasjonen under behandlingen. Kolonne-kromatograferingsmetoden beskrevet heri resulterer i oppnåelse av typen med den minste molekylvekt og som har biologisk aktivitet (dvs. topp 2 fra trinn 3 G-10 kolonnen). Denne iakttagelse antyder også anvendelse av andre metoder for å danne aggregatene. F.eks. bevirker fortynning i vann at aggregasjon opptrer. Kjemiske midler som binder salter, særlig kalsium, kan bevirke dannelse av aggregatet. Etter å ha gjort denne oppdagelse vil andre metoder for å danne aggregatet og separere MAIF være nærliggende for de fagkyndige på området.

Eksempel 3

Biologisk aktivitets-assay

Den anti-inflammatoriske virkning av MAIF ble testet på ødem bevirket ved injeksjon av en oppløsning av karragenin inn i fotputene på rotter. En frysetørket prøve av MAIF ble oppløst i passende bærer og tilført forsøksrotter intraperitonealt. Karrageninet ble så tilført rottene i en mengde på 0,1 ml av en 1 % saltoppløsning i hver venstre fotpute. Fotputene ble målt før injeksjonene ble gitt og 2,5 timer etter injeksjonene, under anvendelse av en tykkelses-måler. Resultatene er vist i tabellene 2 og 3.

Den ikke-aggregerte form av MAIF (topp 2 fra G-10 kolonnen) fra kontrollmelk og hyperimmun melk bevirket reduksjon i inflammasjon av rottelabben ved doser mellom 1 mg og 0,25 mg (tabell 2). Både den hyperimmune melk og den vanlige melk fremviste aktivitet. Det hyperimmune material var imidlertid mer potent. Det ble fra dette konkludert at MAIF opptrer i større konsentrasjon i melken fra hyperimmune kuer.

Den andre topp fra DEAE-kolonnen fremviste aktivitet etter isolering fra hyperimmun melk eller vanlig melk. Aktiviteten er vesentlige større i den hyperimmune melk (tabell 3).

Den første topp fra G-10 kolonnen, som er den aggregerte form av MAIF, fremviste aktivitet ved rottelabb-testene (tabell 2). Den aggregerte form er imidlertid ikke så potent som den ikke-aggregerte form på lik vektbasis.

Det konkluderes fra disse undersøkelser at MAIF-faktoren forekommer naturlig i kumelk. Hyperimmunisering av kuene bevirker høyere konsentrasjon av MAIF i melken. MAIF er et lite, negativt ladet molekyl som kan separeres fra melken ved hjelp av en rekke forskjellige metoder. MAIF-faktoren kan danne aggregater med høy molekylvekt og som ikke forekommer naturlig i melk, men dannes under behandlingen.

KJEMISK ANALYSE AV ANTI- INFLAMMATORISK FAKTOR

Anti-inflammatorisk faktor-prøver ble analysert kjemisk. MAIF er ikke krystallinsk i struktur, som bestemt ved hjelp av røntgendiffraksjons-undersøkelser. MAIF-preparater ga ele-mentær-analyser i samsvar med karbohydrat-sammensetning. De forholdsvise mengder av C, H og 0 var i samsvar med et poly-mert eller oligomert material hvor noen karbinol-grupper var oksydert til karboksyl. Det lille overskudd av kalsium-ekvivalenter over klorid-ioner kan delvis skyldes karboksylatsalter. Resten kan være natrium- eller kalium-salter. Smelteegenskapene, eller snarere ikke-smelte-egenskapene, antydet imidlertid saltlignende sammensetninger og/eller sammensetninger med høyere molekylvekt. Materialet i den foreliggende renhetstilstand inneholder øyensynlig en variabel mengde salter av kalsium og klorid, sannsynligvis CaCl2.

Ikke noe preparat inneholdt en betydelig mengde nitrogen, noe som utelukker enhver peptid-komponent i sammensetningen. Likeledes kan fraværet av nitrogen utelukke nærvær av amino-sukkerarter og andre nitrogenholdige materialer som forskjellige komplekse lipider som hovedkomponent eller -komponenter.

Pyrolytiske massespektra viste tydelige spor av fettsyrer med 18 karbonatomer. Dette forhold, tatt sammen med spor av N og P, antyder nærvær av et komplekst lipid i faktoren.

Infrarød spektroskopi viser absorbsjoner i samsvar med karbinol- og karboksylat-funksjonaliteter. Ultrafiolett, synlig og fluorescerende spektroskopi åpenbarte ikke noen tydelig mengde kromoforer utover dem som er indikert ved infrarød spektroskopi. De kjemiske tester er i samsvar med et oligomert karbohydrat, hvori karbonylfunksjonen (aldehyd eller keton) er bundet til subenhet-leddene. Det oligomere karbohydrat inneholder også noe sidekjedeoksydasjon til karboksylat.

MAIF-preparatet er hovedsakelig, men ikke fullstendig, rent.

Claims (14)

1. Fremgangsmåte for å isolere en hovedsakelig ren anti-inflammatorisk faktor fra melk, karakterisert ved: (i) fett fjernes fra melken fra et melkeproduserende dyr for fremstilling av skummet melk, (ii) kasein fjernes fra den nevnte skummede melk for fremstilling av myse, (iii) fra mysen fjernes makromolekyler med molekylvekt over 10.000 dalton, idet fjernelse av de nevnte makromolekyler med molekylvekt over 10.000 dalton omfatter ultrafiltrering gjennom en molekylsiktmembran som tilbakeholder molekyler større enn 10.000 dalton, (iv) lavmolekylvektproduktet fra det foregående trinn fraksjoneres ved hjelp av anionbytterkromatografi, idet eluering av produktet fra anionbytterkolonnen utføres med en saltløsning ved nøytral pH, (v) den antiinflammatoriske faktor fra det foregående trinn renses ytterligere ved hjelp av molekylsiktkromatografi, og (vi) den antiinflammatoriske faktor isoleres.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det melkeproduserende dyr er et bovint dyr.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det melkeproduserende dyr er et ovint dyr.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at faktoren har en relativ molekylvekt under 10.000 dalton.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det melkeproduserende dyr er i en hyperimmunisert tilstand.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at faktoren omfatter et oligomert karbohydrat.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at karbonyl-funksjonen i karbohydratet er bundet i subenhetsledd.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at karbohydratet inneholder sidekjedeoksydasjon til karboksylationer.

9. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at karbohydratet er kom-pleksdannet til kalsiumioner.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at karbohydratet er kom-pleksdannet med alifatiske syrer.

11. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at karbohydratet er assosiert med nitrogenholdige forbindelser.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at karbohydratet er assosiert med en fosforforbindelse.

13. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at karbohydratet er assosiert med komplekst lipid.

14. Fremgangsmåte som angitt i krav 6, karakterisert ved at karbohydratet hovedsakelig er uten innhold av svovelforbindelse.