JP2834244B2

JP2834244B2 - 抗炎症因子、その単離方法、およびその使用

Info

Publication number: JP2834244B2
Application number: JP1503683A
Authority: JP
Inventors: ベック，リー・アール
Original assignee: SUTOORU RISAACHI ANDO DEV CORP ZA
Current assignee: SUTOORU RISAACHI ANDO DEV CORP ZA
Priority date: 1988-04-04
Filing date: 1989-03-20
Publication date: 1998-12-09
Anticipated expiration: 2013-12-09
Also published as: KR900700111A; FI895751A0; ATE124628T1; IL89741A0; IE69395B1; JPH02503802A; HK1007511A1; MX165968B; DK175473B1; DK610389D0; KR0131014B1; PH27076A; ES2073434T3; EP0336694B1; AU3343789A; AU620289B2; DK610389A; IL89741A; FI98269C; NO180568B

Description

【発明の詳細な説明】本出願は、1982年６月２日出願の米国出願第384,625
号（現在、放棄）の一部継続出願である1987年１月９日
出願の米国出願第001,848号の一部継続出願であり；そ
して、1983年10月27日出願の米国出願第546,162号、お
よび1983号１月１日出願の米国出願第576,001号（現
在、放棄）のファイルラッパー継続出願である1986年９
月17日出願の米国出願第910,297号の分割出願である。

発明の背景発明の分野本発明は、抗炎症因子（AF）、その実質的な純粋物の
製造法、および炎症処置におけるその使用に関する。

従来技術の説明炎症とは、ドーランド医学辞典の定義によれば、「組
織に傷害や破壊があったときにその傷害の原因と傷害組
織の両方を破壊、希薄化または隔離するような局在性の
保護応答」である。これは、微小血管の穿孔、血液成分
の間隙空間への漏出、および炎症組織への白血球の遊走
によって特徴付られる。巨視的には、これは、しばしば
よく見掛ける臨床徴候である紅斑、浮腫、圧痛（痛覚過
敏症）、および疼痛を伴なう。この複雑な応答時には、
ヒスタミン、５−ヒドロキシトリプタミン、種々の走化
因子、ブラジキニン、ロイコトリエン類、およびプロス
タグランジン類などのケミカルメディエーターが局所的
に遊離される。食作用細胞はその領域に移動し、細胞の
ライソゾーム膜を破壊して細胞溶解酵素を放出させ得
る。これらの事象のすべてが炎症反応の一因となり得
る。

リウマチ様関節炎に罹患した患者の炎症は、白血球を
引き付ける走化因子を局所的に放出させる抗体（リウマ
チ因子）および補体と抗原（γ−グロブリン）との結合
におそらくは関係している。白血球は、抗体−抗原およ
び補体の複合体を食菌し、さらにそれらのライゾームに
含まれた多くの酵素を放出させる。そして、これらのラ
イソゾーム酵素は軟骨および他の組織の損傷を誘発し、
炎症程度を増加させる。この過程においては、プロスタ
グランジン類も放出される。

炎症時に生成されると思われるプロスタグランジン類
は、紅斑を誘発し、局所血流を増大させる。プロスタグ
ランジン類の２つの重要な血管作用−長期の血管拡張作
用、およびノルエピネフリンおよびアンジオテンシンな
どの物質の血管収縮作用に対抗する力−は一般的には、
炎症時の他のメディエーターにはない。

炎症における幾つかのメディエーターは、後毛細血管
および集合細静脈の血管誘過性（漏出）を増大させる。
さらに、白血球の炎症領域への遊走は炎症反応において
重要な局面である。プロスタグランジンは走化性反応に
は直接関係していないようであるが、アラキドン酸のも
う１つの代謝産物であるロイコトリエンは非常に強力な
走化性物質である。

抗炎症応答は、上述した炎症にって特徴付られるあら
ゆる応答である。炎症応答が、種々の疾患および損傷を
伴った身体的不快感、すなわち疼痛、および機能低下の
原因であることは、当業者には周知である。したがっ
て、炎症応答を中和させる作用を有する薬理学的物質を
投与することは通例の医療処置である。これらの性質を
備えた物質は抗炎症薬として分類される。抗炎症薬は、
広範囲の障害を処理するために使用され、この同一薬物
が別の疾患の処置に使用されることは多い。抗炎症薬に
よる処置は疾患のためにではなく、徴候、すなわち炎症
のために為されることが非常に多い。

抗炎症性の鎮痛および抗解熱薬は、化学的には関連性
がないことの多い雑多な化合物群であるが、それにも拘
わらず、それらは特定の治療効果および副作用を共有し
ている。コルチコステロイド類は、抗炎症応答の処置
に、最も広範に使用されている化合物群である。タンパ
ク質分解酵素は、抗炎症作用を有すると主張されている
他のクラスの化合物群である。副腎皮質に直接的または
間接的に作用してステロイドを産生、分泌させるホルモ
ンは他のクラスの抗炎症性化合物である。多数の非−ホ
ルモン抗炎症物質が記載されている。これらの中で最も
広く使用されているものは、サリチル酸塩類（サリチレ
ート類）である。アセチルサリチル酸、すなわちアスピ
リンは最も広範に処方されている鎮痛性−解熱および抗
炎症薬である。ステロイド系および非−ステロイド系の
抗炎症薬の例は、フィジシャンズ・デスク・リファレン
ス（Physician's Desk Reference）,1987（このような
製剤のインデックスは207頁および208頁を参照）に挙げ
られている。

天然および合成のコルチコステロイド剤は、血圧の上
昇、塩および水の保持、ならびに増大したカリウムおよ
びカルシウム排泄などの幾つかの重大な副作用を引き起
こす。さらに、コルチコステロイドは感染の徴候を隠
し、感染性微生物を広く伝播させる。これらのホルモン
は妊婦への使用は安全でないと考えられ、また長期のコ
ルチコステロイド処置は、胃の過剰活性および／または
消化性潰瘍を引き起こす。これらの化合物による処置
は、高用量のインスリンが必要となることから糖尿病を
悪化させる場合があり、さらに精神障害を引き起こす場
合もある。間接的な内生コルチコステロイドの産生を増
大させるホルモン抗炎症薬は、有害な副作用について前
記と同じ可能性がある。

非−ホルモン抗炎症薬は、高用量では広い範囲の望ま
しくない副作用を伴った毒性を示し得る合成生化学化合
物である。たとえば、サリチレート類は、このような化
合物群による中毒の特徴である重篤な酸−塩基平衡障害
の一因となる。サリチレート類は呼吸を直接的および間
接的に刺激する。サリチレート類はその毒性用量では中
枢呼吸麻痺、および血管運動低下に伴う循環虚脱を引き
起こす。サリチレート誘発性の胃出血はよく知られてい
る。サリチレート類は肝傷害を生じさせ、全凝固時間を
長引かせ得る。したがって、重篤な肝傷害、低プロトロ
ンビン血症、ビタミンＫ欠乏症、または血友病の患者に
おいては、サリチレート類によって血小板止血作用が阻
害を受け、出血傾向が招来しかねないので、アスピリン
の使用な排除すべきである。サリチレート中毒の普通の
ことであり、毎年米国では、10,000症例以上の重篤なサ
リチレート中毒が確認されており、その幾つかは致死性
であり、多くは子供に起こっている。クッドマン（Good
man and Gilman's）,The Pharmacological Basis of Th
erapeutics,7版,1985を参照。したがって、現在市販さ
れている抗炎症薬は非常に多いにも拘わらず、副作用お
よび有害な反応が排除された、安全かつ有効な抗炎症性
生成物が依然として求められている。

たとえばミルクから得られるような天然食品産物が抗
炎症活性を有しているとしたなら、それは、投与が簡単
であり、容易に入手できる安全な治療用組成物となるで
あろう。

従来、種々の治療効果を有するミルクの調製が知られ
ている。たとえば、ベック（Beck）は、蝕阻害効果を有
するストレプトコッカス・ミュウタンス（Streptococcu
s mutans）に対する抗体を含有するミルクを開示してい
る［米国特許第4,324,782号］。このミルクは、乳牛（c
ow）をS.ミュウタンス抗原で２段階免疫して入手され、
それから治療用ミルクを得ている。

ストール（Stolle）らは、過免疫（hyperimmune）状
態下に維持された乳牛からの採取ミルクを動物に投与す
ることを特徴とする、動物の喫煙に伴う血管障害または
肺不全の治療法を開示している［米国特許第4,636,384
号］。ベックは、抗炎症因子産生状態下に維持された乳
牛から採取したミルクの抗炎症性有効量を動物に投与す
ることを特徴とする、動物の炎症を治療する方法を開示
している［米国特許第4,284,623号］。ハインバッハ（H
einbach）は、米国特許第3,128,230号において、乳牛を
抗原性混合物で接種することによって得られるグロブリ
ンのα、β、γ成分を含有するミルクを記載している。
ペターソン（Peterson）ら（米国特許第3,376,198
号）、ホルム（Holm）（米国出願（発行済）番号第628,
987号）、ツナッハ（Tunnah）ら（英国特許第1,211,876
号）およびバイオケマ（Biokema S.A.）（英国特許第1,
442,283号）にも、抗体−含有ミルクが記載されてい
る。

しかし、これらの文献はいずれも、所望の治療効果を
生み出す治療用ミルクの成分または成分群の本体につい
ては何等開示していない。たとえば、ベックの米国特許
第4,284,623号では、治療手段に用いたミルク産物は、
流動性全ミルク、流動性の脂肪不含乳清、または全ミル
ク粉末のいずれかから構成されている。これらのミルク
産物はいずれも抗炎症特性を有しているが、実際の治療
上の有益性を提供している因子または因子群はいまだに
単離も同定もされていない。

発明の要旨本発明は、単離され、精製された抗炎症性のミルク産
物が動物の抗炎症障害を処置するのに非常に有用である
のではないか、という本発明者らの考察に基づくもので
ある。

この点に関し、本発明者らは、過免疫したウシ（bovi
d）のミルク由来の抗炎症因子（以下、ミルク抗炎症因
子（MAIF）と呼ぶ）を単離し、部分的に精製し、特性化
した。

さらに研究を行い、このミルク産物が炎症における臨
床上の徴候を防ぎ、あるいは緩和することを証明した。
したがって、本発明は、特定の多価抗原群に対して前も
って過免疫したミルク産生動物由来のミルクから単離精
製された抗炎症因子が抗炎症効果を生じる程に十分な投
与計画および量で投与された場合に、該因子は炎症状態
に有効である、という発見に基づくものである。このよ
うな発見は、多価抗原ワクチン自身はMAIFを含有してい
ないことから、特に驚くべき事項である。過免疫したウ
シのミルク由来の活性因子を単離することにより、MAIF
は通常のウシミルクでは少量しか存在しないという意外
な知見が得られた。通常のウシミルク中のMAIFの濃度は
低下すぎるので感知できる程の抗炎症特性をミルクに付
与できないことから、このような発見が隠されていた。
しかし、通常ミルクのMAIFは、本発明の単離方法によっ
て濃縮することができ、次いで炎症の処置に有効に使用
することができる。

図面の簡単な説明添付の図面に関して考える場合は以下の詳細な説明を
参照することによって、本発明のより完全な理解および
それに伴う多くの利点が容易に得られ、それが良好に理
解できるようになるであろう：第１図．好ましい方法の工程２におけるDEAE−セルロ
ースのイオン交換クロマトグラフィーによるMAIFの単
離。

第２図．好ましい方法の工程３におけるセファデック
スＧ−10分子ふるいカラムのDEAE−セルロースクロマト
グラフィー（第１図）からのMAIFピーク（２番目）の分
画。

好ましい態様の詳細な説明本発明は、MAIFの単離および精製、ならびに抗炎症疾
患の処置を目的として該MAIFを動物に投与することから
なる。

「ミルク抗炎症因子（MAIF）」なる用語は、過免疫ミ
ルクまたは通常乳牛ミルクのいずれかから入手される因
子を意味する。「実質的に純粋なMAIF」なる用語は、本
発明の目的では、高分子量の物質群（＞10,000ダルト
ン）を除去し、イオン交換クロマトグラフィーによって
低分子量の負に帯電した種を単離した後、HPLCクロマト
グラフィーにおいて単一の主要な左右対称のピークとし
て溶出される抗炎症因子を意味する。通常ミルクおよび
過免疫ミルクの両者から、本明細書に記載された方法に
より加工することによって、MAIFを得ることができる。

「過免疫ミルク（hyperimmune milk）」なる用語は、
本発明の目的では、過免疫状態下に維持されたミルク産
生動物から入手したミルクを意味する（過免疫の詳細に
関しては、以下により詳しく述べる）。

「乳清」なる用語は、本発明の目的では、クリームが
除かれたミルクを意味する。

「通常ミルク（normal milk）」なる用語は、本発明
の目的では、通常の手段と酪農処理によってミルク産生
動物から入手されたミルクを意味する。

「ミルク産生動物」なる用語は、本発明の目的では、
商業的に適した量のミルクを産する哺乳動物を意味し、
好ましくは乳牛、ヒツジ、およびヤギがあり、さらに好
ましくはウシ属（ウシ）の乳用牛であり、特に好ましく
は最も多い量でミルクを産する乳牛種、たとえばホルス
タインである。

「細菌抗原」なる用語は、本発明の目的では、熱殺菌
した細菌細胞の凍結乾燥調製物を意味する。

「マイクロカプセル剤」なる用語は、本発明の目的で
は、ミルク産生動物に投与するための１つまたはそれ以
上の細菌抗原がカプセル化されているポリマー性の微小
粒子を意味する。

「炎症」なる用語は、本発明の目的では、組織に傷害
や破壊があったときにその傷害の原因と傷害組織の両方
を破壊、希薄化または隔離するような局在性の保護応答
を意味し、その急性型は、古典的な一連の疼痛、熱、発
赤、膨潤および機能喪失によって特徴付られ、そして増
大した透過性および血流を伴った細動脈、毛細血管およ
び細静脈の膨張、血漿タンパク質などの体液の滲出、お
よび炎症巣への白血球の遊走などの一連の複雑な事象
が、組織学的には関連している。

「処置」なる用語は、本発明の目的では、傷害の徴
候、および／または傷害の病因源を改善し、または完全
に排除することを意味する。

「投与」なる用語は、本発明の目的では、経口、鼻腔
内、腸管外（静脈内、筋肉内、または皮下）、または直
腸などから物質で患者を処置するあらゆる方法を意味す
る。

「動物」なる用語は、本発明の目的では、炎症を受け
易いあらゆる生き物を意味し、ヒト、農場動物、家畜動
物、または動物園の動物などが挙げられる。

本発明の単離精製したミルク産物によって処置するこ
とのできる炎症症状の例としては、急性および亜急性滑
液嚢炎、急性の非特異的腱炎、全身性エリテマトーデ
ス、全身性皮膚筋炎、急性リウマチ性心臓炎、天疱瘡、
水泡性皮膚炎、ヘルペテホルミスherpeteformis）、重
篤な紅班、多形性剥脱性皮膚炎、肝硬変、季節的宿根鼻
炎（seasonal perennial rhinitis）、気管支喘息、異
所性皮膚炎、血清病、角膜炎、オプサルミクス（opthal
micus）虹彩炎、広汎性ウレイチス（diffuse ureiti
s）、コリジチス（choriditis）、視神経炎、交感性眼
炎、症候性サルコイドーシス、レフラー症候群、ベリリ
ウム症、溶血性貧血、乳腺炎、乳突炎、接触性皮膚炎、
アレルギー性結膜炎、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、急
性痛風関節炎、および帯状疱疹から選択される症状が挙
げられる。さらに、本発明の単離精製したミルク産物
は、炎症を起こす可能性のある起炎物質に暴露されてい
る個体を処置するのに使用することができる。

本発明の基礎として一部分寄与する発見は、ウシなど
のミルク産生動物を過免疫という特別な状態に置いた場
合に該動物が、ヒトおよび他の動物における炎症の徴候
を抑制するばかりか、受容動物の炎症原因の存在を予期
して使用される予防物質でもある非常に有益なMAIFを正
常域を越えたレベルで含有しているミルクを産生すると
いうことである。「正常域を越えたレベル（supranorma
l levels）」なる用語は、過免疫されてない動物から得
られたミルク中で見いだされるレベルよりも多いレベル
を意味する。免疫感受性のみの誘導は、ミルク中のMAIF
を正常域を越えたレベルで出現させるには十分でなく、
このことは、乳牛疾患に対する通常の免疫時および環境
への通常の暴露時に乳牛が種々の抗原に対して感作され
たとしても、通常の乳牛ミルクは正常域を越えたレベル
でないことによって明らかである。ミルクが正常域を越
えた所望のレベルを示すのは、特定の過免疫状態にある
時だけである。

このような特殊な状態にするには、初期免疫を投与し
た後、十分高用量の特定の抗原群で定期的にブースター
すればよい。ブースターの好ましい投与量は、ウシの一
次免疫を起こすのに必要な投与量の50％と等量である
か、またはそれ以上の投与量である。したがって、閾値
ブースター投与量というものが存在し、この値以下で
は、乳牛は通常、免疫状態と呼ばれているような状態に
ある場合でさえ、そのような性質がミルクに惹起されな
い。必要な過免疫状態にするためには、初期の一連のブ
ースター投与の後に、過免疫ミルクを試験することが必
要である。有益な因子がミルク中に存在していない場合
は、その性質がミルクに現れるまで高用量でさらにブー
スター投与する。

正常域を越えたレベルのMAIFを含有する過免疫ミルク
の製造方法は、1987年７月２日出願の同時係属出願第06
9,139号、および1983年２月１日出願の米国特許出願第5
76,001号のファイルラッパー継続出願である1986年９月
17日出願の同時係属出願第910,297号に開示されている
（これらを引用して本発明に包含させる）。要約すれ
ば、正常域を越えたレベルのMAIFを含有する過免疫ミル
クの１つの製造方法は、以下の工程からなることを特徴
としている：（１）抗原の選択、（２）ウシの一次免
疫、（３）感受性誘導を確認するための血清の試験、
（４）適当な投与量のブースターによる過免疫、そして
要すれば（５）抗炎症特性についてのミルクの試験、
（６）過免疫ウシのミルク採取、そして（７）MAIFを単
離するためのミルクの加工。

工程1:あらゆる抗原または抗原群の組合わせを使用す
ることができる。その抗原は、細菌、ウイルス、原生動
物、真菌、細胞、またはミルク産生動物の免疫系が反応
する他のあらゆる物質が考えられる。この工程で重要な
点は、抗原（群）がミルク産生動物の免疫および過免疫
状態を誘発するだけでなく、ミルク中に正常域を越えた
レベルのMAIFを製造できなければならない点である。ど
の抗原を使用しても正常域を越えたレベルのMAIFを製造
することができる。１つの好ましいワクチンは、100ワ
クチン系列と称される多価細菌抗原群の混合物であり、
これについては以下の実施例1Aで詳細に説明する。

工程2:抗原（群）は、感作を惹起させるあらゆる方法
で投与することができる。１つの方法では、熱−死滅細
菌１×10⁶から１×10²⁰、好ましくは10⁸から10¹⁰、最も
好ましくは２×10⁸から構成されるワクチンを筋肉内注
射によって投与する。しかし、静脈内注射、腹腔内注
射、直腸坐剤、または経口投与などの他の方法を使用す
ることもできる。

工程3:ミルク産生動物が抗原に対して感受性になった
か否かを決定することが必要である。感受性を試験する
ための幾つかの方法は当業者に既知である［メソッズ・
イン・イムノロジー・アンド・イムノケミストリー（Me
thods in Immnology and Immunochemistry），ウイリア
ム（William,C.A.）、およびチェイス（Chase,W.M.），
アカデミック・プレス（Academic Press），ニューヨ
ーク,1-5巻（1975）］。好ましい方法は、抗原として種
々の細菌種からなる多価ワクチンを使用し、ワクチンに
よるチャレンジの前および後にその動物の血清中の凝集
性抗体の存在について試験することである。そのワクチ
ンによって免疫した後のミルク抗体の出現は、感受性を
示すものであり、この時点で、工程４に進むことができ
る。

工程4:これは、感作された動物における過免疫状態に
誘発および維持に関する。このことは、感作させるため
に使用したものと同一の多価ワクチンによるブースター
投与を一定の時間間隔で繰り返すことによって行われ
る。２週間のブースター間隔が多価細菌抗原にとっては
最適である。しかし、動物を、過免疫状態から、その抗
原に対する免疫寛容状態にまで移行させないようにする
ことが必要である。

好ましい態様では、以下の実施例1Bに説明するように
調製したマイクロカプセル化ワクチンを１回だけ投与す
ることによってウシを過免疫状態にすることができる。
この過免疫の制御放出法の利点は、抗原に対する継続し
た暴露により、動物が過免疫状態のままでいられること
である。

他の態様では、別の免疫操作法、たとえばマイクロカ
プセル化抗原と液状抗原との同時投与、または一次免疫
としての筋肉内注射、およびマイクロカプセル化手段に
よる経口投与または腸管外投与に基づくブースター投与
などを組み合わせることもできる。一次および過免疫の
多くの異なる組合わせが当業者により知られている。

工程5:抗炎症活性のレベルについてミルクを試験する
必要がある。これは、過免疫ミルクまたはそれから誘導
された産物のいずれかの炎症に対する作用を試験するあ
らゆる研究法によって行うことができる。ラットの四肢
に化学的に誘発させた炎症が、抗炎症薬の標準的な検定
法である。

工程6:これは、ミルクの採取および加工に関する。ミ
ルクは通常の方法によって採取すればよい。MAIFを単離
するためのミルクの加工について、以下説明する。

MAIFを単離し、精製し、試験するための最も単純な方
法は下記の工程からなる： 1.過免疫ミルクを脱脂してスキムミルク（脱脂乳）を
調製し、 2.スキムミルクからカゼインを除去して乳清を調製
し、 3.限外濾過によって約10,000ダルトンよりも大きい分
子量の巨大分子を乳清から除去し、 4.イオン交換樹脂カラムを使用して工程３の産物を分
画し、約10,000ダルトンよりも小さい分子量の負に帯電
したMAIF種を単離し、 5.分子ふるいクロマトグラフィーによって負に帯電し
ている工程４の種を分別し、そして 6.工程５のMAIFを生物学的に検定する。

7.ラットの足にカラゲナン溶液を注射して誘発させた
浮腫によって、このミルク因子の抗炎症作用を試験す
る。このラット足試験は、抗炎症薬についての標準的な
動物試験である。ウインター（Winter,C.A.）、リスレ
イ（Risley,G.A.）、ヌス（Nuss,A.W.）のプロシーディ
ング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエン
ス USA（Proc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.），3:544（196
7），「抗炎症薬検定のためのラット後脚のカラゲニン
誘発性浮腫（Carrageenin-Induced Edema in the Hihd
Paw of the Rat as an Assay for Anti-inflammatory D
rugs）」。他の種々の試験も使用することができる。ウ
ェットニック（Wetnick,A.S.）およびサビン（Sabin,
C）のJap.J.Pharm.22:741（1972），「ラットにおける
アジュバント誘発性関節炎および実験アレルギー性脳脊
髄炎に対するクロニキシンおよびベサウレサソンの効果
（The Effects of Clonixin and Bethaurethasone on A
djuvant-Induced Arthritis and Experimental Allergi
c Encephalomyelitis in Rats）」。しかし、上記のラ
ット足試験は利用可能な最も簡単な直接試験であり、こ
れはすべての抗炎症薬について申し分ないことが示され
ている。本試験は、ベック（Beck）の米国特許第4,284,
623号に詳細に記載されており、そのラット足試験の記
載に限り、引用によって本発明に包含される。簡単に説
明すれば、本試験は、少量のカラゲニンを成熟白ラット
の足蹠（footpad）に注射する。このことにより、炎症
応答が誘発されることは知られている。得られた膨潤の
程度を測定することができる。AFを含有する試料を適当
な経路、好ましくは腹腔内注射によってラットに投与
し、容量分析法または重量分析法によって炎症過程の庶
断または改善を測定する。

要約すれば、抗炎症因子は、過免疫したミルクから次
記の工程によって単離することができる：ミルクを脱脂
し、カゼインを除去し、10,000ダルトンよりも大きな巨
大分子を除去し、そしてイオン交換および分子ふるいク
ロマトグラフィーを続けて行う。抗炎症因子の適当な調
製物の生物活性は、本明細書で説明するようなラットの
用量−作用実験を行うことによって試験することができ
る。

本発明は、MAIFが単離、精製することができ、そして
それがヒトおよび動物における種々の炎症過程を処置す
るのに有効である、という予想外の発見に一部分基づく
ものである。好ましい態様では、MAIFは、細菌抗原ワク
チンでミルク産生動物を過免疫することによって産生さ
れる。動物の過免疫に使用されるワクチンは抗炎症活性
を有していない。したがって、混合細菌抗原ワクチンで
免疫した動物から単離し、精製して得られた因子によっ
て処置することが炎症過程を改善し、または消去する上
に有効であることは驚くべきことである。

このように本発明を一般的に説明してきたが、次ぎに
特定の特徴的な実施例に言及することによって本発明を
さらに詳述するが、これらは説明のみを目的とするもの
であって、特に明記しない限り、本発明の限定を意図す
るものでない。

ミルクの調製実施例1A Ｓ−100ワクチンの調製アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Am
erican Type Culture Collection）から入手される以
下の第１表に示す細菌スペクトルを含有する細菌培養物
を、培地15mlで再構成し、37℃で一晩インキュベートし
た。良好な成長が得られたなら、細菌懸濁液の約半量を
ブロス１リットルに接種し、得られた接種物を37℃でイ
ンキュベートした。残った懸濁液を滅菌グリコール管に
移し、６カ月まで−20℃で保存した。

この培養物中で良好な成長が観察された後、懸濁液を
20分間遠心して培地を除去することによって細菌細胞を
採取した。得られた細菌ペレットを滅菌生理食塩水に再
懸濁し、細菌試料を３回遠心して細胞から培地を洗い流
した。３回目の滅菌生理食塩水洗浄後、遠心して得られ
た細菌ペレットを少量の２回蒸留水（double distilled
water）に再懸濁した。

得られた培地不含の細菌懸濁液をガラスフラスコ中、
80℃の水浴中に一晩入れて加熱殺菌した。少量の加熱殺
菌した細菌を使用し、このブロス培養物の生存率を試験
した。細菌をワクチンに使用するためには殺菌しなけれ
ばならないので、ブロスに加熱殺菌した細菌を接種し、
37℃で５日間インキュベートし、増殖がないかを毎日チ
ェックした。

加熱殺菌した細菌を凍結乾燥して乾燥させた。次い
で、得られた乾燥細菌を滅菌生理食塩水と混合した（濃
度、2.2×10⁸細菌細胞/ml生理食塩水。これは660nmにお
ける光学密度値1.0である）。

5ml試料の多価液体ワクチンを毎日、乳牛に注射し
た。この注射した畜牛の抗体（IgG）力価のレベルを、
この多価抗原に対するウシ抗体に関して酵素結合免疫検
定法を行うことによって定期的に測定した。

実施例1B 加熱殺菌した細菌を上述のようにして調製した。得ら
れた多価抗原試料（Ｓ−100）を通常の相分離方法によ
ってマイクロカプセル化し、多価抗原を含有する微小粒
子製品を調製した。一般には、抗原を含有する成形マト
リックスの材料は、生体適合性の物質、好ましくは生体
分解性または生体減退性（bioerodable）の物質のポリ
マー、好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳酸お
よびグリコール酸のコポリマー（共重合体）、ポリカプ
トラクロン、コポリオキサレート類、コラーゲンなどの
タンパク質、グリセロールの脂肪酸エステル、およびセ
ルロースエステルのポリマーから形成される。これらの
ポリマーは、当業界では周知であり、たとえば米国第3,
773,919号、米国第3,887,699号、米国第4,118,470号、
米国第4,076,798号に記載されている（これを引用して
本発明に包含させる）。使用した重合マトリックス材料
は生体分解性のラクチド−グリコリド・コポリマーであ
った。

加熱滅菌した細菌抗原を、好ましくは、直径１−500
ミクロン、好ましくは10−250ミクロンのミクロスフェ
アなどのマトリックス材料中にマイクロカプセル化す
る。このカプセル化の方法は常法であり、相分離法、界
面反応、および物理学的方法からなる。微小粒子から宿
主体への細菌抗原の最適の放出率を得るためには、マト
リックスの多くの組合わせ、および適合抗原の種々の濃
度を使用することができる。これらの組合わせは、適度
の実験を行うことなく当業者ならば決定することができ
る。

本実施例の微小粒子は、直径が250ミクロンよりも小
さかった。次いで、22％多価抗原（16.5mg）を含有する
微小粒子約750mgをビヒクル（水中、１重量％Tween20お
よび２重量％カルボキシメチルセルロース）約3cc中に
懸濁した。

比較的大きな牛集団の中から小さい畜牛群を選択し
た。これらの中から５頭を無作為に選択した対照とし
た。４頭の牛に多価抗原を含有する微小粒子を筋肉内注
射した。微小粒子試料は、2.0mRadのガンマ放射線によ
って滅菌した。接種した乳牛、および対照乳牛から得た
乳牛ミルクにおける抗体（IgG）力価レベルを定期的に
測定した。

実施例２過免疫したミルクからMAIF因子の単離工程1:ミルク濾液調製物過免疫した乳牛由来の新鮮なミルク20リットルをクリ
ーム分離器［デラバル102型（DeLaval Model 102）］に
供し、脂肪を除去した。

得られたスキムミルク16リットルを中空ファイバー
（ホロファイバー）ジア濾過／濃縮器［アミコン（Amic
on）DL−10L］によって限外濾過し、高分子量（10,000
ダルトン以上）種を除去した。この濃縮器は10,000ダル
トンの分子量を遮断する２つのカートリッジ［アミコン
H₅P_10-43］が備えられている。得られたスキムミルクを
ポンプ速度80で計量器（インレットおよびアウトレット
の圧力それぞれ30psiおよび25psi）に供した。

保存のため、およびさらに精製するために、１時間当
たりに４リットルの流速でカートリッジから排出された
濾液（＜10,000ダルトン）12リットルを凍結または凍結
乾燥した。

工程2:イオン交換クロマトグラフィー上記濾液中のミルク抗炎症因子、MAIFを陰イオン交換
クロマトグラフィーカラムによってまず単離した。

この操作では、DEAE−セファロースCL−6Bゲル［ファ
ルマシア（Pharmacia）］を５×10cmのガラスカラムに
充填し、滅菌した２回蒸留水（pH7.0）で平衡化させ
た。

濾液１リトッル（＜10,000）をこのカラムに適用し、
流速160ml/時間で滅菌２回蒸留水（pH7.0）を用いて溶
出した。10mlのフラクションを採取し、280nmにおいて
モニターするに当たりウビコード（Uvicord）4700吸収
計を用い、接続した記録器（ファルマシアREC−482）に
よって光学密度を記録した。

MAIF以外の陽性および中性の電荷を有する物質はDEAE
−セファロースゲルに結合しない。これらは、素通りす
るピークとして溶出される（第１のピーク）。陰電荷を
有するMAIFはゲルに保持される。

MAIFを遊離させるため、カラムを滅菌生理食塩水（pH
7.0）で段階的勾配溶液で溶出した。典型的なプロフィ
ルを第１図に示す。得られた個々のフラクションをバイ
オアッセイ（生物検定）することにより、２番目のピー
クにMAIFが含まれることが判明した。２番目のピークお
よびそのショルダー（肩）部分からなるフラクション群
をさらに精製するために使用した。回収試験によって、
この工程から乾燥粉末8.8gが得られたことが示される。

工程3:ゲル濾過クロマトグラフィー工程２から得られた２番目のピークはMAIFおよび他の
陰電荷分子を含有しているので、さらに精製する工程が
必要であった。さらに精製するためには、ゲル濾過カラ
ムを使用して分子量に基づき各種成分を分離するのが常
法である。

この工程では、セファデックスＧ−10樹脂（ファルマ
シア）を2.5×80cmガラスカラムに充填し、滅菌した２
回蒸留水（pH7.0）で平衡化する。工程２から得られた
２番目のフラクション2gを滅菌２回蒸留水に再度溶解
し、カラム上に適用する。このカラムを１時間当たり流
速30mlで溶出する。フラクション（3.3ml）を採取し、2
54nmおよび280nmにおいてモニターし［ファルマシア Du
o Optical Unit］、接続した記録器（ファルマシアREC
−482）で光学密度を記録した。

通常は、第２図に示されるように、溶出プロフィルに
は３つのピークがあった。第１および第２のピークがMA
IF活性を含有していた。

この第１のピークは、活性MAIFを含有するＧ−10カラ
ムにおいて形成される凝集体である。

第２のピークは、MAIFの非凝集体を含有している。凝
集体（ピーク１）および非凝集体（ピーク２）の両者は
ラットバイオアッセイにおいて生物学的に活性である。

ミルク抗炎症因子の特性化上述の方法によって調製された非凝集体のMAIFの分子
量は10,000ダルトンよりも小さいことが判明した。これ
は、乳清からMAIFを単離する第１工程が＞10,000ダルト
ンの分子量種を通過させない膜を使用した限外濾過によ
るものであったことから推論されることであった。

MAIFは陰電荷を有している。これは、ミルク限外濾液
をDEAEセルロースイオン交換カラムに適用することに基
づいて決定された。MAIFは水を用いた場合、カラムから
溶出されなかった。溶出媒質を塩化ナトリウム（0.9％p
H）に変更することにより、幾つかのピークの溶出が得
られた（第１図）。中性および陽性の電荷を有している
種はこのイオン交換樹脂に結合せず、陰電荷を有する種
が塩濃度を高くすることによって溶出される。10,000ダ
ルトンよりも小さな分子量の透過物をDEAEカラムに適用
した場合、中性塩および糖類が水で溶出された（ピーク
１、第１図）。緩衝液を生理食塩水に変更したとき、３
つの際立ったピークが溶出した（ピーク２−４）。第２
のピークおよびそのショルダーはラットの検定において
MAIF生物活性を含有していた。したがって、MAIFは陰電
荷を有していると結論される。

MAIFの他の化学的特性は、それが塩の除去工程時に凝
集体になることである。この特性は、＜10,000ダルトン
の分子量の透過物を２回蒸留水（double distilled wat
er）で平衡化したセファデックスＧ−10カラムに通し、
pH7の水で溶出した場合に現れる（第２図）。３つのピ
ークがＧ−10カラムから溶出されたが、分子量が10,000
ダルトンと同じ、またはそれよりも大きいことを示す第
１のピークがわずかな容量ながらも溶出された。10,000
ダルトンよりも大きな分子は限外濾過によって既に除去
されたはずであったので、このことは予期していなかっ
た。２番目のピークは抗炎症因子について期待される位
置で溶出した。第１および第２のピークは共に、ラット
足検定において抗炎症生物活性を示したが、第３のピー
クは活性を欠いていた。意外なことに、第１および第２
の両ピークは抗炎症生物活性を有していることが見いだ
された。Ｇ−10カラムの第１のピークから回収された物
質（工程３）を凍結乾燥し、Ｇ−100カラムに適用し
た；単一のピークがわずかな量で溶出され、これは分子
量が10,000ダルトンと同じ、またはそれよりも大きいこ
とを示していた。工程３のＧ−10カラムは、異なる分子
量の種を分離すると同時に、塩を除去する。したがっ
て、結論されることは、Ｇ−10カラムの通過時および塩
の除去時に、抗炎症因子が大きな分子量の凝集体となる
ことである。凝集の程度は塩濃度によって種々異なる。

この凝集の性質は、抗炎症因子の存在に帰因して抗炎
症生物活性を有する広いスペクトルの種々の分子量種が
形成され得る可能性を示唆するものである。この性質の
発見は、最終産物の凝集程度に応じて広いスペクトルの
種々の生化学的性質を有するミルク抗炎症因子群を製造
することができることを示唆している。たとえば、加工
時に分子量の分配を塩濃度によって制御し、比較的大き
なまたは比較的小さな分子量の凝集体を使用することに
よって、比較的長いまたは比較的短い生物学的寿命を有
する製剤を調製することができるであろう。本明細書に
記載しているカラムクロマトグラフィー法によって、生
物活性を有する最も小さな分子量種から得られる（すな
わち、工程３のＧ−10カラムからのピーク２）。この観
察も、凝集体を形成するための他の方法の使用を示唆す
るものである。たとえば、水による希釈によって、凝集
が誘発される。塩類、特にカルシウムと結合する化学物
質は、凝集体の形成を誘発することができる。この発見
がなされたことによって、凝集体を形成させ、MAIFを分
離するための他の方法が当業者により明白となるであろ
う。

実施例３生物学的活性検定カラゲニンの溶液をラットの足蹠（footpad）に注射
することにより誘発させた浮腫について、MAIFの抗炎症
作用を試験した。MAIFの凍結乾燥しに試料を適当なビヒ
クルに溶解し、実験動物に腹腔内投与した。次いで、各
後脚足蹠に１％生理食塩溶液0.1ml量中カラゲニンをラ
ットに投与した。注射する前、および注射の2.5時間
後、隙間ゲージを使用して足蹠を計測した。得られた結
果を第２表および第３表に示す。

対照および過免疫ミルク由来の非−凝集型のMAIF（Ｇ
−10カラムのピーク２）により、投与量1mgから0.25mg
でラットの足の炎症が減少した（第２表）。過免疫ミル
クおよびレギュラーミルク（regular milk）共に活性を
示した。しかし、過免疫の物質のほうが高い活性であっ
た。このことから、MAIFは、過免疫乳牛由来のミルクに
比較的高い濃度で存在すると結論された。

DEAEカラム由来の２番目のピークは、過免疫ミルクま
たはレギュラーミルクのいずれかから単離した場合も活
性を示した。この活性は、比較すれば過免疫ミルクにお
いて実質的に高い（第３表）。

凝集型のMAIFである、Ｇ−10カラムからの第１のピー
クはラット足試験で活性を示した（第２表）。しかし、
その凝集体は、同重量を基準とした非凝集体と比較すれ
ば、同程度には高い活性でない。

これらの試験から、MAIF因子は乳牛ミルク中に天然で
存在していると結論される。乳牛を過免疫することによ
り、ミルク中のMAIF濃度が高くなる。MAIFは、種々の方
法によってミルクから分離することができる小さな負電
荷の分子である。このMAIF因子は、ミルク中で天然に存
在していないが加工時に形成される大きな分子量の凝集
体になることができる。

抗炎症因子の化学分析抗炎症因子の試料を化学的に分析した。MAIFは、Ｘ線
回折実験から決定されるように、結晶構造を示さない。
MAIF調製物は、炭水化物組成と一致した元素分析値を示
した。そのＣ、Ｈ、Ｏ比率は、酸化されてカルボキシ基
になる幾つかのカルビノール基を含有するポリマー性ま
たはオリゴマー性物質に対応していた。塩素イオンより
も若干過剰のカルシウム当量は一部、カルボン酸塩に由
来するものと考えられる。残りはナトリウム塩またはカ
リウム塩であるかもしれない。しかし、融解する態様、
というよりも非−融解の態様は、塩−様のおよび／また
は高分子量の組成物であることを示していた。現在の精
製状態の物質は、明らかに種々の量のカルシウムと塩素
との塩、おそらくはCaCl₂を含有している。

いずれの調製物も、その組成中にペプチド成分が存在
することを示唆する有意な量で窒素を含有していない。
同様に、このような窒素が存在しないことにより、アミ
ノ糖、および種々の複合脂質などの他の窒素含有物質を
その主要な成分（群）として存在する可能性を排除する
ことができる。

熱分解の質量スペクトルにより、18炭素の脂肪酸の有
意なトレースが示された。このことは、ＮおよびＰのト
レースとも考え合わせ、本因子中に複合脂質が存在する
ことを示唆するものである。

赤外吸収スペクトル分析により、カルビノールおよび
カルボキシレート基と一致した吸収が見いだされた。紫
外部、可視部、および蛍光分析では、赤外吸収によって
示された以上の発色団は有意な量として示されなかっ
た。

これらの化学試験は、カルボニル官能基（アルデヒド
またはケトン）がサブユニット連鎖に関与しているオリ
ゴマー性炭水化物と矛盾がない。このオリゴマー性炭水
化物もカルボキシレートへの酸化側鎖を幾つか含有して
いる。

MAIF調製物は実質的に（完全にではない）純粋であ
る。

上記のように本発明を一般的に説明してきたが、本発
明の思想または範囲に影響を与えることなく、これらに
多くの変化および改良を施すことができることは、当業
者にとっては容易に知れるところであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 35/20

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）ミルク産生動物のミルクから脂肪を
除去してスキムミルクを調製し、（ii）該スキムミルクからカゼインを除去して乳清を調
製し、（iii）約10,000ダルトンよりも大きな分子量の巨大分
子を該乳清から除去し、（iv）イオン交換クロマトグラフィーによって、前工程
で得られた低分子量の産物を分画し、（ｖ）分子ふるいクロマトグラフィーによって、前工程
で得られた抗炎症因子をさらに精製し、そして（vi）該抗炎症因子を採取する、ことを特徴とする方法によって調製される、実質的に純
粋な形態にある抗炎症因子。
【請求項２】該ミルク産生動物がウシである請求項１に
記載の抗炎症因子。
【請求項３】該ミルク産生動物がヒツジである請求項１
に記載の抗炎症因子。
【請求項４】該ミルク産生動物が過免疫状態にある請求
項１に記載の抗炎症因子。
【請求項５】スタフィロコッカス・アウレウス、スタフ
ィロコッカス・エピデルミディス、ストレプトコッカス
・ピオゲネス A.タイプ１、ストレプトコッカス・ピオ
ゲネス A.タイプ３、ストレプトコッカス・ピオゲネス
A.タイプ５、ストレプトコッカス・ピオゲネス A.タイ
プ８、ストレプトコッカス・ピオゲネス A.タイプ12、
ストレプトコッカス・ピオゲネス A.タイプ14、ストレ
プトコッカス・ピオゲネス A.タイプ18、ストレプトコ
ッカス・ピオゲネス A.タイプ22、アエロバクター・ア
エロゲネス、エシェリシア・コリ、シュードモナス・ア
エルギノーザ、クレブシエラ・ニューモニエ、サルモネ
ラ・チフィムリウム、ヘモフィルス・インフルエンザ、
ストレプトコッカス・ミチス、プロテウス・ブルガリ
ス、シゲラ・ディセンテリエ、ディプロコッカス・ニュ
ーモニエ、プロピオニバクター・アクネス、アクチノマ
イセス（アナエローブ）、ストレプトコッカス・ミュー
タンス、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプトコ
ッカス・サリバリウム、またはストレプトコッカス・ア
ガラクチエからなる細菌抗原群の多価混合物を投与することによっ
て該過免疫状態を誘発させる請求項４に記載の抗炎症因
子。
【請求項６】該多価細菌抗原を該動物に経口投与する請
求項５に記載の抗炎症因子。
【請求項７】該多価ワクチンを腸管外投与する請求項５
に記載の抗炎症因子。
【請求項８】分子量が約10,000ダルトンよりも大きな該
巨大分子の除去を、約10,000ダルトンの分子を保持する
分子ふるい膜に該乳清を通す限外濾過により行う請求項
１に記載の抗炎症因子。
【請求項９】分子量が約10,000ダルトンよりも大きな該
巨大分子を分子ふるいクロマトグラフィーによって除去
する請求項１に記載の抗炎症因子。
【請求項１０】該因子が相対分子量０から10,000ダルト
ンを有している請求項１に記載の抗炎症因子。
【請求項１１】（ｉ）ミルク産生動物のミルクから脂肪
を除去してスキムミルクを調製し、（ii）該スキムミルクからカゼインを除去して乳清を調
製し、（iii）約10,000ダルトンよりも大きな分子量の巨大分
子を該乳清から除去し、（iv）イオン交換クロマトグラフィーによって、前工程
で得られた低分子量の産物を分画し、（ｖ）分子ふるいクロマトグラフィーによって、前工程
で得られた抗炎症因子をさらに精製し、そして（vi）該抗炎症因子を採取する、ことを特徴とする、実質的に純粋な形態にある抗炎症因
子をミルクから単離する方法。
【請求項１２】該ミルク産生動物が過免疫状態にある請
求項11に記載の方法。
【請求項１３】スタフィロコッカス・アウレウス、スタ
フィロコッカス・エピデルミディス、ストレプトコッカ
ス・ピオゲネス A.タイプ１、ストレプトコッカス・ピ
オゲネス A.タイプ３、ストレプトコッカス・ピオゲネ
ス A.タイプ５、ストレプトコッカス・ピオゲネス A.タ
イプ８、ストレプトコッカス・ピオゲネス A.タイプ1
2、ストレプトコッカス・ピオゲネス A.タイプ14、スト
レプトコッカス・ピオゲネス A.タイプ18、ストレプト
コッカス・ピオゲネス A.タイプ22、アエロバクター・
アエロゲネス、エシェリシア・コリ、シュードモナス・
アエルギノーザ、クレブシエラ・ニューモニエ、サルモ
ネラ・チフィムリウム、ヘモフィルス・インフルエン
ザ、ストレプトコッカス・ミチス、プロテウス・ブルガ
リス、シゲラ・ディセンテリエ、ディプロコッカス・ニ
ューモニエ、プロピオニバクター・アクネス、アクチノ
マイセス（アナエローブ）、ストレプトコッカス・ミュ
ータンス、ストレプトコッカス・サンギス、ストレプト
コッカス・サリバリウム、またはストレプトコッカス・
アガラクチエからなる細菌抗原群の混合物を投与することによって該
過免疫状態を誘発させる請求項12に記載の方法。
【請求項１４】該多価細菌抗原を該動物に経口投与する
請求項12に記載の方法。
【請求項１５】該多価ワクチンを腸管外投与する請求項
12に記載の方法。
【請求項１６】分子量が約10,000ダルトンよりも大きな
該巨大分子の除去を、約10,000ダルトンよりも大きな分
子を保持する分子ふるい膜を介する限外濾過によって行
うことを特徴とする請求項12に記載の方法。
【請求項１７】約10,000ダルトンよりも大きい該巨大分
子を分子ふるいクロマトグラフィーにより除去する請求
項12に記載の方法。
【請求項１８】オリゴマー性炭水化物を含有する、ミル
ク由来の実質的に純粋な形態にある抗炎症因子。
【請求項１９】該炭水化物のカルボニル官能基がサブユ
ニット連鎖に関与している請求項18に記載の抗炎症因
子。
【請求項２０】該炭水化物がカルボキレートイオンへの
酸化側鎖を含有する請求項18に記載の抗炎症因子。
【請求項２１】該炭水化物がカルシウムイオンと複合体
化している請求項18に記載の抗炎症因子。
【請求項２２】該炭水化物が脂肪酸と複合体化している
請求項18に記載の抗炎症因子。
【請求項２３】該炭水化物が窒素化合物を伴う請求項18
に記載の抗炎症因子。
【請求項２４】該炭水化物がリン化合物を伴う請求項18
に記載の抗炎症因子。
【請求項２５】該炭水化物が複合脂質を伴う請求項18に
記載の抗炎症因子。
【請求項２６】該炭水化物がイオウ化合物を本質的に欠
いている請求項18に記載の抗炎症因子。
【請求項２７】該炎症が、急性および亜急性滑液嚢炎、
急性非特異的腱炎、全身性エリテマトーデス、全身性皮
膚筋炎、急性リウマチ性心臓炎、天疱瘡、水泡性皮膚
炎、ヘルペテホルミス、重篤な紅班、多形性剥脱性皮膚
炎、肝硬変、季節的宿根鼻炎、気管支喘息、異所性皮膚
炎、血清病、角膜炎、オプサルミクス虹彩炎、広汎性ウ
レイチス、コリジチス、視神経炎、交感性眼炎、症候性
サルコイドーシス、レフラー症候群、ベリリウム症、溶
血性貧血、および乳腺炎の中から選択される症状によっ
て引き起こされるものである請求項１に記載の抗炎症因
子。