JP2792973B2

JP2792973B2 - 抗高血圧過免疫ミルク、製法、組成物及び用途

Info

Publication number: JP2792973B2
Application number: JP1503112A
Authority: JP
Inventors: ベック、リー・アー; ストール、ローフ・ジェイ
Original assignee: SUTOORU RISAACHI ANDO DEV CORP ZA
Current assignee: SUTOORU RISAACHI ANDO DEV CORP ZA
Priority date: 1988-02-26
Filing date: 1989-02-23
Publication date: 1998-09-03
Anticipated expiration: 2013-09-03
Also published as: WO1989007948A1; AU3350089A; IE890607L; DE68906054T2; US4879110A; EP0330521A3; IL89352A0; AU621604B2; ATE88349T1; CA1339760C; IL89352A; EP0330521A2; ES2039847T3; MX168997B; IE63032B1; EP0330521B1; DK201590D0; DK201590A; HK1005013A1; JPH03505866A

Description

【発明の詳細な説明】関連文書に関する相互参照本出願は、1982年６月３日に出願され現在は放棄され
ている出願第384,625号の一部継続出願である、1983年1
0月27日に出願され現在アメリカ合衆国特許第546,162号
である出願第546,162号の分割出願である、1987年１月
９日に出願された出願第1,848号の一部継続出願であ
る。

発明の背景発明の分野本発明は、血圧を低下させる生物学的組成物の製造及
び患者の高い動脈圧を低下させるについてのかかる組成
物の使用に関する。

背景技術の記載高い動脈圧（即ち、高血圧、高血液圧）は、多分、先
進国における最も重要な公衆衛生問題であり、・・共通
の自覚症状のない、容易に見つけうる、そして処置しな
いままにした場合、しばしば致死の併合症に至らしめる
ものである。ウイリアムス，ジー・エッチ.,等，イン：
ハリソンズ・プリンシプルズ・オブ・インターナル・メ
ディシン,10ス・エド.,ペータースドルフ，アー．ジ
ー.,等，エズ.,マックグローヒル，ニューヨーク,1983,
キャプチャー247. 高血圧患者は、二つの大きなカテゴリーに分類され
る。比較的少ない部分の患者は、同一であると証明でき
且つ特別に処理しうる内在的原因、例えば好クローム性
細胞腫、腎動脈狭窄又は内分泌疾患の発現として高血圧
を発達させる。このような患者は、二次高血圧を示すも
のとして名付けられる。

持続する高い動脈圧を伴う80から95％の患者は、認識
しうる内在的原因となる因子を有しない。これらの患者
は、本質的又は一次又は特発性高血圧を有すると云われ
る。

本質的高血圧の病因は、ほぼ確実に多因子であるとい
える。このような因子は、交感並びに副交換神経系、圧
力受容器作用及び腎ナトリウム並びに水変化をコントロ
ールするレニン−アンジオテンシン−アルドステロン並
びに心房ナトリウム利尿性因子系を含む。加えて、遺伝
子並びに心血管性危険因子、例えば肥満症、高コレステ
ロール血症、糖尿病、食塩摂取量、職業及び巻きタバコ
喫煙が、本質的高血圧の発生に重要であるとずっと想定
されて来た。

病気の原因が何であれ、処理しない高血圧患者は、ほ
とんど共通して心臓疾患で、しかし搏動及び腎機能不全
をしばしばひんぱんに起こして早死にする。臨床試験の
結果として、中年患者で90mmHg以上である拡張期血圧を
下げることが心臓血管に関する疾病率並びに死亡率の減
少と関連しているという確かな証拠がある。ブラシュ
ク，ティー・エフ.,等，イン；グッドマン・アンド・ギ
ルマンズ・ザ・ファーマコロジカル・ベイシス・オブ・
セラピューティクス，ギルマン，エイ．ジー.,等，エ
ズ.,マクミラン，ニューヨーク,1980,チップター32. 高血圧の最近の処置は、一般調査と特別調査からな
る。一般調査は、心血管性危険因子、例えば体重過多、
巻タバコ喫煙，高食塩摂取，ストレス等の毎日のコント
ロールと排除を含む。

高血圧を処置するための特別の調査は、抗高血圧薬物
による治療よりなる。多くの臨床研究は、高血圧性心血
管性疾患のほとんど全ての例で、血圧は最近入手しうる
薬物の巧みな使用により首尾よくコントロールできるこ
とが証明された。即ち、抗高血圧薬物の有効使用は「あ
りきたり」ではなく、治療は、患者個人に合せ、そして
治療効果と現在使用される抗高血圧薬物に伴う公知の不
利な副作用との間の最適バランスを保つのに必要である
として適合させなければならない。ブラシュク等，上記
809。

最近使用されている、それぞれ異なる機械の疾患に向
けられた４つのクラスの高血圧薬物がある。これらのク
ラスは、利尿剤、抗アドレナリン作用剤、血管拡張剤及
びアンジオテンシンブロッカーを含む。各々は特定の患
者には治療効果があるが、それぞれひどい不利な副作用
を生じうる。全て高価である。

よく用いられるチアジン利尿剤は速効性であるが、望
ましくない副作用、例えば低カリウム血症、低尿酸血症
及び炭水化物不耐症を生じうる。抗アドレナリン薬物
（即ち「ブータブロッカー」）は、ある型の高血圧に有
効である。即ち、心臓交感神経活性を増加するが、かか
る薬物は、うつ血性心臓不全及び喘息を生じさせ、糖尿
病患者には慎重に用いられなければならない。他の副作
用は、めまい、抑うつ症、はきけ、嘔吐、下痢及び便秘
を含む。静脈カパシタンスよりも動脈抵抗に主に作用す
る血管拡張剤は、高血圧に対して有効であるが、かかる
成分の効果は、不幸にも、心搏度数及び心臓血液搏出量
を上げる交感神経系放出における還流増加により無効と
なる。即ち、血管拡張剤は、ひどい冠動脈疾患に禁忌で
あり、又、望ましくない副作用、例えば頭痛、頻脈、狭
心症、酸素欠乏症、はきけ、嘔吐、下痢及び狼瘡様症候
群を生ずるも知られている。アンジオテンシンブロッカ
ーは、期待できるが、頻発な副作用は、白血球滅少症、
汎用球滅少症、蛋白尿、ネフローゼ症候群、皮疹熱及び
味覚の喪失を含む。ウイリアムズ等，上記1985。

利尿剤又はベーカブロッカーに有利に応答する全て
の、しかし軽度の高血圧患者において、薬物の組合せが
用いられる。うまく行った組合せは、その成分が相加的
又は相乗的治療効果を示し、最小の毒性しか起こさない
ものである。理想的には、治療は、患者にとって許容し
得なくなり、強要される養生法に従う、又は脳、心臓又
は腎臓の生体機能を危くするような副作用を起こすこと
なく、有効により低い血圧にする。

高血圧の薬物治療での非常に困難で重要な問題は、何
が「許容されうる」副作用を構成するかを決定すること
である。全ての有効な抗高血圧薬物は、臨床試験で、患
者は抗高血薬物よりもプラセポでよりよく感じると報告
した程度に、非常に有意に逆効果を生ずることができ
る。ブラシュク等，上記809。

これらの欠点を考慮して、先行技術で知られている抗
高血圧薬物の制限は容易に明らかである。従って、安価
で、容易に入手でき、天然源から導かれ、容易に投与さ
れ、高血圧に対して高度に有効で、望ましくない副作用
のない抗高血圧薬物を有することが非常に要望される。
本発明の過免疫ウシ科動物のミルクはかかる抗高血圧剤
である。

先行技術では、種々の治療効果を有するミルクを生成
することが知られている。例えばベックは、歯の齲触抑
制効果を有するスタフィロコッカス・ムタンスに対する
抗体を含んでいるミルクを明らかにした。（ベック，米
国特許第4,324,782号、英国特許第1,505,513号）。ミル
クはストレプトコッカス・ムタンス抗原によるウシの過
免疫及びそこから治療力を有するミルクの収集により得
られる。ベックは、又、抗関節炎の性質を有するミルク
を記載し（米国特許第4,732,757号）、過免疫したウシ
からのミルクを用いて炎症を処置する方法の特許を得た
（ベック、米国特許第4,284,623号）。ストールは、血
管及び肺系の疾病を処置するために過免疫したウシから
のミルクを用いる方法を明らかにした。（ストール等，
米国特許第4,636,384号）。ハインバック、米国特許第
3,128,230号は、抗９エン−ハプテンに対するアルフ
ァ、ベータ及びガンマグロブリンを含んでいるミルクを
明らかにした。サイン（米国特許第3,911,108等）ペタ
ーソン（米国特許第3,376,198号及びカナダ特許第587,8
49号）、ホーム（米国出願（公開された）番号第628,98
7号）、タナー等，（英国特許第1,211,876号）及びバイ
オケマ・エス・エー．（英国特許第1,442,876号）も、
抗体含有ミルクを記載している。ステフコフ等，ミネル
バ・メディカ（イタリー）56:4163−４（1965）、酸っ
ぱくしたミルクによる高血圧疾患の処置が記載されてい
る。

種々の抗体タイプ、例えばIgA.IgG.及びIgMを含んで
いる血清グロブリンフラクシュンが、対応する抗原を迎
撃し、それにより抗原の効果を中和するのに用いること
ができることは、免疫の分野における当業者によく知ら
れている。発癌性の、細菌、ウイルス及び植物並びに動
物起源の調整因子、及び毒素並びに毒物を含んでおり、
毒物が暴露されうるほとんど無数の有害抗原が存在す
る。

通常、外来抗原、例えば細菌に暴露されると、ホスト
の免疫系は、抗原の効果を中和する抗体を生成する。こ
のような外来抗原への暴露は、自然に、又はワクチン形
内の抗原の投与により故意に起こすことができる。後者
は、一般に、抗原に暴露されたホスト種の能動免疫と言
われる。このような予防接種に対応して生成した抗体
は、与えられた動物の種と同種であり、又、抗原に対し
エピトープである。

同時係属関連特許出願、米国特許第4,636,384号及び1
987年１月９日出願の米国特許番号第001.848号に、死滅
細菌の混合物から誘導された多価の抗原の注射による過
免疫状態に保持した乳牛から得た、試験動物及びヒト抗
体含有ミルクを与えることによる、血液リピドの低下、
並びにリピド結合血管障害の処置及びマクロファージ関
連肺障害の処置方法が開示された。別の同時係属出願
（1987年７月２日出願の米国出願番号第069,139号）
に、消化器障害処置用に、過免疫乳牛から得た抗体含有
ミルクの使用が開示された。本発明は、前述の出願に開
示され、又、請求された発明を越えてさらに発展したも
のであり、これら出願の全開示を引用して明細書記載の
一部とする。

しかしながら、これら全ての引例は、種々の抗原に対
して作られた過免疫動物のイムノグロブリンからの分
離、及び診断手段、同種あるいは異種の受身免疫又は能
動免疫のため該抗原のその後の用途、にのみ関するもの
である。これらのいかなる引例にも、過免疫ウシ科動物
から得たミルクが動脈血圧を低下させるのに有用である
ことを示唆又は推論するものはない。

発明の概略本発明者らは、高炎症効果を示し、且つ血管、肺並び
に消化器の障害に対して有益な効果を示す過免疫ウシ科
動物ミルクを既に開示した。

過免疫ウシ科動物のミルクの有利な血管効果から、本
発明者らはヒト及び他の動物での高い動脈圧に関するミ
ルクの可能な効果を発明するに至った。

このことを考慮し、次いで本発明者らは、ある細菌抗
原に対して過免疫した乳牛から得たミルク（即ち本発明
の過免疫ミルク）が、高血圧の患者に経口投与すると、
血圧を正常値に低下させ、しかもいかなる検出可能な望
ましくない副作用もなくそれを行なうという予期しない
発見をなした。又、非過免疫乳牛のミルクも抗高血圧活
性を有するが、この活性は、ドナーの乳牛の過免疫によ
り非常に強化されることが発見された。

従って、本発明は、過免疫ウシミルクの製造方法、患
者への投与に適した該ミルクの組成物及び患者における
高い動脈圧を低下するための該組成物の用途に関する。

図面の簡単な説明本発明及び多くの付随する利点のより完全な理解は、
添付の図面と共に考慮して以下の詳細な説明を参照する
ことにより、さらに理解しやすいものとして容易に得ら
れるであろう。図面において、第１図は、コントロールミルク及び過免疫ミルクを飲
んでいるヒト患者の心収縮期血圧における平均パーセン
ト変化を示す。

第２図は、5mg用量の本質的に純粋なミルク抗高血圧
因子のバッカル内吸収以後の時間とヒト心収縮期血圧へ
の影響を示す。

第３図は、DEAE−セファロースCL−6Bイオン交換カラ
ム（ステップ２）からのミルク抗高血圧因子の塩勾配に
よる溶出のプロフィールを示す。

第４図は、セファデクスＧ−10分子ふるいカラム（ス
テップ３）からのミルク抗高血圧因子の水による溶出の
プロフィールを示す。

好ましい態様の詳細な説明発明は、抗高血圧性質を有する天然食物製品（ミル
ク）、同製品の製造法、高い動脈圧を有する患者を処理
する際の使用方法よりなる。本発明の製品は不利な副作
用がないので、本発明は、抗高血圧の薬理学の分野の状
態で明らかな利点を再現する。抗高血圧ミルクは、天然
食物製品であるので、副作用の恐れがなく動物及びヒト
の全ての疾病に関連する高血圧の処置に用いることがで
きる。抗高血圧ミルクで処置されうるヒト疾病条件の例
は、いかなる病因の一次又は二次高血圧を含む。用語
「高血圧」により、本発明の目的のために、少なくとも
90mmHgの高い心拡張期動脈圧が意図される。用語「抗高
血圧因子」により、動脈圧低下活性を有する過免疫ミル
ク中に得られる因子が意図される。ミルク生成動物の過
免疫は、ミルク中に治療に使用するのに適した超正常濃
度の抗高血圧因子を提供する。用語「過免疫ミルク」に
より、本発明の目的のために、過免疫状態に保持された
ミルク生成動物から得られるミルクが意図され、過免疫
の詳細は以下により詳細に記載される。用語「抗高血圧
因子の超正常濃度」により、非過免疫動物のミルク中に
存在するよりも大きな濃度が意図される。

用語「ミルク生成動物」により、本発明の目的のため
に、商業的に実施可能な量のミルクを生成する哺乳動
物、好ましくはウシ、ヒツジ及びヤギ、より好ましくは
属ボス（Bos）（ウシ科）の乳牛、好ましくは最高収量
のミルクを与えるこれらの種属、例えばホルスタインが
意図される。

用語「細菌抗原」により、本発明の目的のために、加
熱殺菌した細菌細胞の凍結乾燥標品が意図される。

用語「処置」は、本発明の目的のために、障害の症候
が好転し又は完全に除かれることを意図する。用語「投
与」により、本発明の目的のために、患者を物質で例え
ば経口で、鼻腔内に、非経口的に（静脈内で、筋肉内で
又は皮下で）又は直腸に、薬理学的に許容されうる溶剤
中で、処理する全ての方法が意図される。用語「動物」
により、本発明の目的のために、ヒト及び動物を含む、
高血圧にかかる全ての生き物が意図される。

本発明は、ウシ科動物を抗原の定期的ブースター投与
の手段により免疫の特殊状態とすると、ウシ科動物が高
血圧の処置に非常に有利な性質を有するミルクを生成す
るという発見に基づいている。免疫感受性のみの導入
は、たとえ乳牛疾病に対する正常免疫の間、乳牛を種々
の抗原に対し感作させたとしても、正常乳牛ミルクは過
免疫乳牛からのミルクよりも低レベルの活性を有すると
いう事実により示されるようにミルク内の抗高血圧性質
を強めるのに十分でない。

ミルクの抗高血圧性質は、ブースター注射により免疫
状態に維持されたウシ科動物により生成されたミルクで
最高となる。過免疫は、十分に高い用量の抗原又は抗原
の混合物で定期的にブースターを投与することにより達
成される。好ましい用量範囲は、ウシ科動物の一次感作
を起こすのに必要な供与量の50％に等しいかそれよりも
大であるべきである。即ち、たとえ乳牛が正常に免疫状
態と呼ばれる状態にあっても、それ以下で最大性質が乳
牛中に生成されないブースター供与量閾値が存在する。
過免疫状態に達するために、最初のシリーズのブースタ
ー投与後にウシ科動物のミルクを試験するのが必須であ
る。ミルク投与量が所望の性質を有しないときは、二次
の組の高供与量のブースターを投与しなければならな
い。本工程は、最大性質がミルクに現れるまで繰り返さ
れる。過免疫ミルクの製造工程は、ベックの米国特許第
4,284,623号に開示され、本特許を、過免疫ミルクの製
造の詳細を掲示することを限度に引用して明細書記載の
一部とする。要約すると、工程は以下のステップよりな
る。

1.抗原選択 2.一次免疫によるウシ科動物の感作 3.ウシ科動物の血清を試験して感受性誘導を確認するこ
と 4.適当供与量のブースターを投与して過免疫状態を誘発
させ維持すること 5.ミルクの抗高血圧性質を試験すること 6.過免疫の間にウシ科動物からミルクを収集すること。
本発明のミルクは、常套の方法で収集することができる
が、しかしながらミルクの生物学的性質を保護するため
に、特別のプロセシングが必要である。低温度の低温殺
菌が要求される。低温殺菌温度は、140℃を超えるべき
でない。低温殺菌に次いで、脂肪が標準的に手法により
除かれる。ミルクは濃縮されてスプレードライされる。
スキムミルクは、真空下、低温度で抗高血圧因子が死滅
しないように濃縮する。（例えば、コザコウスキ、エ
フ.,「チーズ・アンド・ファーメンテッド・ミルク・プ
ロダクツ」セカンド・エディション,1977参照）。最終
生成物は、抗高血圧性質を有するミルクパウダーであ
る。

もちろん、液体ミルクも、濃縮したミルク生成物又は
生物学的活性因子、例えば酸ホエーフラクションを含ん
でいるミルクのフラクションも使用できる。用語「ホエ
ー」により、本発明の目的のために、クリーム及びカゼ
イン状物質を分離したミルク意図される。

本発明ミルクは、動物の高血圧条件の低減に影響を及
ぼすどのような量でも提供することができる。高血圧及
び動物種の特別の状態に応じて、全液体ミルクの1mlか
ら10に対応して、一日量が提供できる。好ましい用量
は、体量kg当り0.5−1.0gのスキムミルクである。

もちろん、脂肪除去ミルクは、食物製品が、温度が高
すぎて製品の抗高血圧性質を不活性にする温度で処理さ
れない限りどのような食物製品にも加えることができ
る。140℃以下の低温度が好ましい。例えばプリン又は
ヨーグルトは抗高血圧ミルクから調製しうる。

さらに、脂肪除去ミルクをレンネットで処理してカゼ
インを沈殿後、分離した場合、スイート−ホエイ（swee
t−whey）上清フラクションが抗高血圧因子を含むこと
が判った。このスイート−ホエー因子も、シロップ、ア
イスクリームミックス、キャンディ、飲み物（beverag
e）、ウシ類飼料などに添加しうる。（コザコウスキ，
上記、446参照）。

超正常レベルの抗高血圧因子を含んでいる過免疫ミル
クの製造方法は以下の通りである。要約すると、超正常
レベルの抗高血圧因子を含んでいる過免疫ミルクの一製
造工程は、以下のステップよりなる：（１）抗原選択；
（２）ウシ科動物の一次免疫；（３）血清を試験して感
受性誘発を確認すること；（４）適当供与量のブースタ
ーによる過免疫；及び所望により（５）抗高血圧性質用
にミルクを試験すること；（６）過免疫ウシ科動物から
ミルクを収集すること；及び（７）ミルクをプロセシン
グして抗高血圧因子を分別すること。

ステップ1:いかなる抗原又は抗原の組合せも適用しう
る。抗原は、ミルク生成動物の免疫系が反応する、細
菌、ウイルス原生動物、真菌、細胞又は他のいかなる物
質であることもできる。本ステップにおける重要点は、
抗原が、ミルク生成動物の免疫及び過免疫状態を誘発す
るだけでなく、ミルク内に超正常レベルの抗高血圧因子
を生成しなければならないことである。好ましくは、多
価の細菌物用物質が用いられる。一つの好ましいワクチ
ンは、以下実施例１に詳細に記載される、多価の細菌抗
原の混合物である。

ステップ2:抗原は、感作を起こすどのような方法でも投
与できる。一方法では、１×10⁶から１×10²⁰好ましく
は10⁸から10¹⁰、最も好ましくは２×10⁸、加熱死滅細菌
から由来する抗原から構成されるワクチンが、筋肉内注
射により投与される。しかしながら、他の方法、例えば
静脈内注射、腫腔内注射、直腸内座薬又は経口投与も用
いうる。

ステップ3:ミルク生成動物が抗原に感受性になったかど
うかを測定することが必要である。感受性は試験するた
めに、免疫の分野における当業者にとって数多くの既知
の方法がある（メソーズ・イン・イムノロジィ・アンド
・イムノケミストリィ，ウイリアムズ，シー・エー・
等，アカデミック・プレス，ニューヨーク，ボリウムス
１−５（1975））。好ましい方法は、抗原として多重細
菌種を含む多ワクチンを用い、且つワクチンによる攻撃
の前後に動物の血清中に抗原凝集の存在を試験すること
である。ワクチンによる免疫後のミルク抗体の現れるこ
とが、感受性を示し、この時点で、ステップ４に進むこ
とが可能である。

ステップ4:これは、感作動物における過免疫状態の誘発
及び維持を含む。これは、一次感作に達するのに用いた
同一の多価ワクチンの一定間隔時間でのブースター投与
を繰り返すことにより成しとげられる。２週間ブースタ
ー間隔は、多価細菌抗原には最適である。しかしなが
ら、動物が過免疫状態から抗原に対し免疫寛容の状態に
移らないことを保証することが必要である。

好ましい態様では、ウシ科動物の過免疫は、以下の実
施例18に詳細に記載したように調製したマイクロカプセ
ル化ワクチンの一回投与により達成しうる。

別の態様では、異なる免疫手段を組合せること、例え
ばマイクロカプセル化及び液体抗体又は一次免疫用の筋
肉内注射及びマイクロカプセル手段による経口投与又は
非経口投与によるブースター投与量を同時に投与するこ
とが可能である。一次及び過免疫の多くの異なる組合せ
は本分野の当業者にとって既知である。

ステップ5:抗高血圧活性レベルについてミルクを試験す
ることが必要である。これは、過免疫から由来する過免
疫ミルク又は生成物の効果を試験する全ての調査手段に
より達成できる。

ステップ6:これはミルクの収集とプロセシングを含む。
ミルクは、常套の方法により集めることができる。次い
で抗高血圧因子を得るためにミルクを分別することが実
施できる。

ステップ7:過免疫ミルクから抗高血圧因子を分離及び精
製する一般的方法は以下の通りである。（１）ミルクを
脱脂してスキムミルクを製造する：（ｂ）所望により、
スキムミルクからカゼインを除いてホエーを製造する：
（ｃ）分子量＞10,000ダルトンの高分子物質をホエーか
ら除く：（ｄ）先のステップからの生成物をイオン交換
カラムで分別して、分子量＜10,000ダルトンを有する除
電荷分子を得る：（ｅ）ミルク抗高血圧因子を含有す
る、＜10,000ダルトンフラクションを分子ふるいゲルで
サイズを分別できる：（ｆ）＜10,000ダルトンフラクシ
ョンのpHを約６−12、好ましくは10.5のアルカリ性値に
上げること及びミルク抗高血圧因子（略字（abbrev.）M
AF）を含む沈殿を収集すること：及び（ｇ）先のステッ
プからの沈殿を凍結乾燥すること。

本発明は、ミルクに通常見られるが、細菌抗原ワクチ
ンに対してミルク生成動物を過免疫とすることにより大
量に生産される、抗高血圧因子が、ヒト及び犬を含む動
物での種々の高血圧状態を処理するのに有効であるとい
う予期し得ない発見に一部基づいている。動物を過免疫
するのに用いられるワクチンは、抗高血圧活性を有しな
い。従って、混合死滅細菌抗原ワクチンに対して免疫し
た動物から得られた、ミルク因子による処置が、高血圧
状態を高めること（elevating）又は除去することに有
効であることは驚くべきことである。

今まで一般的用語で発明を記載して来たが、同様のこ
とをさらに幾つかの特別の実施例を引用することにより
記載するが、これら実施例は説明のための目的でここに
供されるのであって、特に明示していない限り限定する
ことを意図したものではない。

ミルクの調製実施例1A 混合細菌ワクチンの調製下記第１表に示される、アメリカン・タイプ・カルチ
ャー・コレクションから得られる細菌のスペクトルを含
む、細菌培養株を15mlの増殖培地で再構成し37℃で一夜
インキュベートした。良好な増殖が得られたとき、ほぼ
1/2の細菌懸濁液を１リットルのブロスに接種するのに
用いた。接種は37℃に保温した。残りの懸濁液を無菌グ
リコールチューブに移して−20℃で６ケ月間保存した。

良好な増殖が培養中にみえた後、20分間、懸濁液を遠
心分離して細菌細胞を取り、増殖培地を除いた。得られ
た細菌のペレットを無菌生理食塩溶液に再び懸濁して細
菌試料を３回遠心分離して細胞から培地を洗った。第３
回の無菌生理食塩水洗浄後、遠心分離により得られた細
菌のペレットを少量の２回蒸留水に再び懸濁した。

培地が存在しない細菌懸濁液を、グラスフラスコ中の
懸濁液を80℃の水浴中に一夜置くことにより加熱死滅し
た。ブロス培養の生存度は、少量の加熱死滅細菌で以下
のように試験した。：ブロスを加熱死滅細菌と、37℃に
５日間保温してインキュベートし、毎日、増殖をチェッ
クした。乳牛の安全のため、細菌はワクチンに使用する
ために死滅すべきである。

加熱死滅細菌を乾燥するまで凍結乾燥した。次いで乾
燥細菌を生理食塩溶液と混合して約2.2×10⁸細菌細胞/m
l生理食塩水（660nmで1.0吸光度単位）の濃度とした。

乳牛には、多価の液体ワクチンの5ml試料の注射が毎
日与えられた。注射したウシに対する抗体（IgG）タイ
ターレベルは、ウシのミルクから得た抗体含有液体試料
の410nmで読み取られる吸光度を取ることにより定期的
に測定した。

実施例 1B コントロールした遊離混合細菌ワクチンの調製加熱死滅細菌を上述した手法で調製した。得られた多
価抗原を常套の相分離工程によりマイクロカプセル化し
て多価抗原含有微粒子製品を調製した。一般に、抗原含
有形状化マトリックス材料は、生物適合性材料、好まし
くは生物学的に分解可能又は生物学的に破壊可能材料の
ポリマー、好ましくはポリ乳酸、ポリグリコール酸、乳
酸とグリコール酸のコポリマー、ポリカプロラクトン、
コポリシュウ酸エステル、蛋白、例えばコラーゲン、グ
リセリンの脂肪酸エステル及びセルロースエステルから
形成される。これらのポリマーは、当分野でよく知られ
ており、例えば米国特許第3,773,919号、米国特許第3,8
87,699号、米国特許第4,118,470号、米国特許第4,076,7
98号に記載され、全てを引用して明細書記載の一部とす
る。適用されるポリマーマトリックス材料は、生物学的
に分解可能なラクチドーグリコリドコポリマーであっ
た。

加熱死滅細菌抗原は、好ましくは１−500ミクロン
径、好ましくは10−250ミクロンの小球形のようなマト
リックス材料でカプセル化される。カプセル化工程は、
常套で、相分離法、界面反応及び物理的方法よりなる。
微粒子からホストの体への細菌抗原の放出最適速度を与
えるために、材料の多くの組合せ及び選別した抗原の多
くの濃度が適用されうる。これらの組合せは、本分野の
当業者により、過渡の実験を要することなく決定するこ
とができる。

本実施例での微粒子は、径が250ミクロン以下であっ
た。22％（16.5mg）の多価抗原を含有するに約750mgの
微粒子を、次いで約3ccの溶剤（水中１重量％ツイーン2
0及び２重量％カルボキシメチルセルロース）に懸濁し
た。

ウシの小グループをより大きな群れのウシから選ん
だ。５匹のこれら無作為に選んだウシをコントロールと
して選択した。４匹のウシを上述のように調製した微粒
子含有溶液の注射により処置した。

４匹の乳牛に生理食塩水に懸濁した多価抗原含有微粒
子を筋肉内注射した。抗原の投与量は、ml当り２×10⁸
細菌細胞以上であった。抗体（IgG）タイターレベル
は、接種した乳牛及びコントロールの乳牛から得たウシ
のミルクの試料から定期的に測定した。

実施例 1C 未知の抗原組成物のワクチンの調製我々は、ハチのみつが種々のグループの抗原を含有し
ており、その組成が未知であることを発見した。はちみ
つ中の抗原は、乳牛に注射すると、過免疫状態を起こ
し、その結果ミルクの最大高血圧性質を生じる。

例えば、水中1:5に希釈した1mlのはちみつの投与量
を、５乳牛に１週に１度、５連続週間次いで２週間各に
１度、２ヵ月間注射した。ミルクを第３月と第６月の
間、試験用に収集した。

本実施例は、抗原の正確な組成が本発明を実施するた
めに既知である必要がないこと、及び既知あるいは未知
の全ての抗原又は抗原の組合せが、抗高血圧因子の生成
用に乳牛を免疫するのに用いうることの点を示すために
入れられる。

抗高血圧活性のための過免疫ミルクの試験実施例２これは、７人のヒトボランティア患者の１実験グルー
プに過免疫ミルク生成物を与え、そして７人の患者の第
２のコントロールグループに過免疫しない乳牛から生成
したミルクを与える二重盲検調節研究であった。心収縮
期血圧を処置前及び処置中の両方で測定した。

研究は、14週の全期間で２相に分けた。第１相は、４
週処置相で、１週及び４週の終りに心収縮期血圧を測定
した。第２相は10週処置期間よりなり、その間患者は、
２、４、６、８及び10週の終りになされる血圧測定を伴
いつつ毎日、水中に懸濁した50gの粉末スキムミルクを
飲食した。

本研究の結果は、第１表と第１図に示され、第１表は
先のデータを提供し、第１図は、実験及びコントロール
グループ間の心収縮期血圧での平均変化の皮革を提供す
る。過免疫ミルク生成物を摂取している患者の心収縮期
血圧は、10週処置期間終了時、5.3％から8.4％の間の範
囲の低下で、減少した。対称的に、非過免疫ミルク生成
物を与えられたコントロールグループでは、変化は、10
週処置期間を終えて１％と3.92％の間の範囲で、非常に
小さかったが、これらの変化は又、処置の長さに関係し
た。

実施例３本実施例では、5mgの部分的に精製したMAF試験材料
（MAFの分離及び精製の詳細については実施例４参照）
は、ヒトボランティア患者の舌の先に直接置き、そし
て、心収縮期血圧測定を10から15分の間隔で次の時間を
終えて行なった。一つのかかる実験の結果は第２図に示
される。心収縮血圧低下効果は、即時で且つ有意であ
り、30分以内に圧力で30−40％低下起こした。本実験
は、異なる抗原（第1A−1C図参照）で処置した乳牛から
得られたミルクMAFで数回繰り返した。各ケースの結果
は類似した。

本手順はMAF活性に関して種々のミルクフラクション
の急速スクリーニングに用いうる。

ミルクの抗高血圧因子の分離及び精製実施例４ステップ1:ミルク濾過物調製正常又は過免疫乳牛からの20リットルの新鮮なミルク
はクリームセパレータ（デラベルモデル102）を通過
させて脂肪を除いた。残っている16リットルの脱脂した
ミルク（skimmed milk）の中空糸ダイアフイルトレーシ
ョン／濃縮器（アミコンDL−10L）を用いて限外濾過し
高分子量種（＞10,000ダルトン）を除いた。濃縮器は２
個の10,000ダルトン分子量切断カートリッジを備えてい
た。脱脂したミルクをメーターで80のポンプ速度で、入
口及び出口圧それぞれ30psi及び25psiで流し込んだ。時
間当り４リットルの流速でカートリッジから出て来た12
リットルの濾液（＜10,000ダルトン）を、貯臓のため又
はさらに精製のため凍結又は凍結乾燥した。

ステップ2:イオン交換クロマトグラフィー濾液中のミルク抗高血圧因子、MAFをアニオン交換ク
ロマトグラフィカラムによりまず分離した。

本手順中、DEAE−セファロースCL−6Bゲル（ファルマ
シア）を用いて無菌２回蒸留水pH7で平衡化した５×10c
mガラスカラムに充填した。

１リットルの濾液（＜10,000ダルトンフラクション）
をカラムに適用して無菌２回蒸留水、pH7で時間当り160
mlの流速で溶出した。10ミリリットルフラクションを集
めて、LKBユビコード4700吸光光度計中280nmで、接続し
た記録器（ファルマシアREC−482）にプリントアウトさ
れる吸光度でモニターした。

陽及び中性電荷を有するMAF以外の物質は、DEAE−セ
ファロースゲルに結合しなかった。それらはフォール・
スルー（fall−through）ピーク（一次ピーク）で溶出
した。陰電荷を持っているMAFは、ゲルにより保持され
た。

MAFを溶出するため、カラムを無菌NaCl溶液、pH7.0を
用いる階段勾配で溶出した。典型的プロフィールは第３
図に示される。二次ピーク及びその肩はMAF及びその他
の陰電荷種を含有した。二次ピーク及びその肩を含んで
いる20mlフラクションをプールし、貯臓用及び次の精製
用に凍結乾燥した。回収の研究は７グラムの乾燥粉末が
得られたことを示した。

ステップ3:ゲル濾過クロマトグラフィステップ２から得られたフラクションはMAF及びその
他の陰電荷成分から構成され、それゆえ、付加的精製ス
テップが必要であった。分子サイズ及び形状を基に次の
精製を達成するため、ゲル濾過カラムを用いてこれらの
陰電荷成分を分離することが必要であった。

本工程で、セファデックスＧ−10樹脂（ファルマシ
ア）を2.5×80cmガラスカラムに充填して無菌２回蒸留
水、pH7.0で平衡化した。ステップ２からの２グラムのM
AFフラクションを無菌２回蒸留水に再び溶解し、カラム
のトップに適用した。カラムを時間当り30mlの流速で溶
出した。3.3mlのフラクションを集めて254nm及び280nm
（ファルマシアズオ（DuO）光学単位）で、連続した記
録器（ファルマシアREC−482）にプリントアウトされる
吸光度でモニターした。

第４図に示されるように、溶出プロフィール中３つの
ピークがあった。大きな陰電荷物質が取り除かれた最後
のピークは、MAFを含有した。回収の研究は、全工程か
ら260mgの乾燥粉末の収量を示した。

ここに本発明を一般的に記載したが、多くの変更及び
修飾が、本発明の精神又は範囲に影響を及ぼすことなく
なすことができることは、当分野の当業者にとって容易
に明らかとなるであろう。

この発明の実施態様を例示すれば次の通りである： 1.（ｉ）過免疫した動物からミルクを得ること（ii）約10,000ダルトン以上の分子量を有する高分子物
質をミルクから除くこと。

（iii）ステップ（ii）の10,000ダルトン以下の生成物
をイオン交換クロマトグラフィーにより分別して約10,0
00ダルトン以下の低分子量の陰電荷生成物を得ること。

（iv）ステップ（iii）からの陰電荷生成物を分子ふる
いクロマトグラフィーにより分別すること、及び（ｖ）
ステップ（iv）において分別された抗高血圧生成物を等
電点沈殿により分離することよりなる工程により生成された、本質的に純粋形の、抗
高血圧因子。

2.等電点沈殿を約９以上で約12以下のpH値で行なう、１
（ｖ）のミルク抗高血圧因子。

3.等電点沈殿を約10.5のpHで行なう、１（ｖ）のミルク
抗高血圧因子。

4.（ｉ）荷免疫した動物からミルクを得ること（ii）10,000ダルトン以上の分子量の高分子物質をミル
クから除くこと（iii）ステップ（ii）の10,000ダルトン以下の分子量
の生成物をイオン交換クロマトグラフィーにより分別し
て約10,000以下の分子量の陰電荷生成物を得ること（iv）ステップ（iii）からの陰電荷生成物を分子ふる
いクロマトグラフィーにより分別すること、及び（ｖ）
ステップ（iv）において分別された抗高血圧生成物を等
電点沈殿により分離することよりなる、本質的に純粋なミルク抗高血圧因子の分離方
法。

5.等電点沈殿を約９以上で約12以下のpH値で行なう、４
（ｖ）の方法。

6.等電点沈殿を約10.5のpHで行なう、４（ｖ）の方法。

7.動物に抗高血圧の有効量の、１又は４のどれか一つの
ミルク抗高血圧因子を投与することよりなる、動物にお
ける高血圧処置方法。

8.ミルク抗高血圧因子が全ミルクを含む、７の方法。

9.ミルク抗高血圧因子が全ミルク粉を含む、７の方法。

10.ミルク抗高血圧因子がスキムミルクを含む、７の方
法。

11.ミルク抗高血圧因子がスキムミルク粉を含む、７の
方法。

12.ミルク抗高血圧因子がミルクホエーを含む、７の方
法。

13.ミルク抗高血圧因子がミルクホエーのサブフラクシ
ョンを含む、７の方法。

14.ミルク抗高血圧因子が約10,000ダルトン以下の分子
量の本質的に純粋な分子を含む、７の方法。

15.動物がヒトである、７の方法。

16.ミルク抗高血圧因子を動物に定時に投与する、７の
方法。

17.ミルク抗高血圧因子の投与が経口、非経口又は鼻腔
内の手段の中から選択される、７の方法。

18.経口手段が薬理学的に許容されうる溶剤中、因子の
形の懸濁液を含む、17の方法。

19.経口手段が、カプセル形が時限放出及びエンテリッ
クコーチングカプセル形の中から選ばれた、因子のカプ
セル形を含む、17の方法。

20.非経口手段が静脈内、腹腔内、筋肉内及び皮下の手
段の内から選ばれた、17の方法。

21.ミルク抗高血圧因子が薬理学的に許容されうる溶解
中で非経口的に投与される、17の方法。

22.ミルク抗高血圧因子が薬理学的に許容されうる溶剤
中で鼻腔内に投与される、17の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) A61K 37/02 A61K 35/20 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＢＩＯＴＥＣＨＡＢＳ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ｉ）過免疫した動物からミルクを得るこ
と、（ii）上記ミルクから約10,000ダルトン以上の分子量を
有する高分子物質を除くこと、（iii）ステップ（ii）で得られた約10,000ダルトン以
下の物質をイオン交換クロマトグラフィーにより分別し
て約10,000ダルトン以下の低分子量の陰電荷物質を得る
こと、（iv）ステップ（iii）で得られた陰電荷物質を分子ふ
るいクロマトグラフィーにより分別すること、及び（ｖ）ステップ（iv）において分別された抗高血圧生成
物を等電点沈殿により分離することよりなる工程により得られうる、本質的に純粋状態の、
抗高血圧因子。
【請求項２】ステップ（ｖ）における等電点沈殿を９以
上で12以下のpH値で行なう、請求項１のミルク抗高血圧
因子。
【請求項３】ステップ（ｖ）における等電点沈殿を10.5
のpHで行なう、請求項１のミルク抗高血圧因子。
【請求項４】請求項１のミルク抗高血圧因子を有効成分
として含有する、高血圧処置剤。
【請求項５】ミルク抗高血圧因子が全ミルクを含む、請
求項４の処置剤。
【請求項６】ミルク抗高血圧因子がスキムミルクを含
む、請求項４の処置剤。
【請求項７】ミルク抗高血圧因子がミルクホエーを含
む、請求項４の処置剤。
【請求項８】ミルク抗高血圧因子が約10,000ダルトン以
下の分子量の本質的に純粋な分子を含む、請求項４の処
置剤。